CITOGENÉTICA CLÁSICA

Y

CITOGENÉTICA MOLECULAR

PROF. EDUARDO JAIME VANEGAS LONDOÑO

¿ QUE ES LA CITOGENÉTICA?

-Disciplina que tiene por objeto estudiar alteraciones numéricas y estructurales que pueden producirse en los cromosomas.

- Estas alteraciones pueden ser congénitas o adquiridas.

- Pueden producirse en todas las células del organismo o solo en algunas.

-La citogénetica se remonta al año 1956 cuando Tijo y Levan describen el número de 46 cromosomas.

- En 1959 Lejeune describe a la trisomía 21.

-En 1971 Caspersson describe el primer método de bandeo cromosómico, el bandeo Q.

-El bandeo Q y otras técnicas de bandeo (GTG, CBG) descritas posteriormente han facilitado la identificación de cada uno de los cromosomas.

-Actualmente existe el ISCN 1995.

-Cromosomas 1 – 22 X e Y.

-Grupos A(1-3), B(4-5), C(6-12,X), D(13-15), E(16-18), F(19-20), G(21-22,Y)

-Brazos largos y cortos.

¿ QUE ES UN CARIOTIPO?

-El conjunto de cromosomas de una célula se denomina cariotipo.

- Se mantiene inalterable en todas las células de un individuo asi como en los individuos de una misma especie.

-A veces se producen alteraciones que son estudiadas con técnicas de citogenética clásica.

¿CÓMO OBTENEMOS UN CARIOTIPO?

CICLO CELULAR

-La transición desde interfase a división celular (mitosis) y volver a interfase.

-Se reconocen 4 fases en el ciclo celular: G1 (gap one); S(síntesis); G2(gap two); M(mitosis).

MITOSIS

En la fase S cada cromosoma se replica y la célula llega ser 4n. Durante la mitosis cada una de las dos copias se deriva a cada una de las células hijas.

La mitosis puede dividirse en cuatro etapas: profase, metafase, anafase, telofase.

En metafase los cromosomas se encuentran en su máxima compactación.

CULTIVO CELULAR

-El análisis citogenético se puede realizar en células de diferentes tejidos como, linfocitos de sangre periférica, fibroblastos, amniocitos, trofoblastos, células tumorales y germinales.

-Por la facilidad de la obtención de la muestra, los exámenes de rutina se realizan en linfocitos de sangre periférica.

-Dependiendo del diagnóstico existen variaciones a la técnica standard.

-Incubar la muestra en un medio de cultivo líquido adecuado (RPMI 1640).

-Una vez alcanzado el crecimiento adecuado se detiene el ciclo celular en metafase (colcemid).

-Se realiza la cosecha de las mitosis.

-Se gotea la solución en un portaobjeto limpio y los cromosomas fijados al vidrio se someten luego a técnicas de tinción y bandeo.

BANDEO CROMOSÓMICO

-Se someten los cromosomas a diferentes agentes denaturantes del DNA (calor, tripsina, soluciones alcalinas).

-El bandeo GTG (tripsina) se usa de rutina y se complementa con otros bandeos (CBG o RBG)

ANÁLISIS MICROSCÓPICO

-Se realiza en un mínimo de 35 mitosis bandeadas, más una fotografía y el montaje del cariotipo completo de cada una de ellas.

- Este recuento debe ser aumentado a 50 o 100 mitosis en presencia de dos o más lineas celulares y en X frágil.

DESCRIPCIÓN DEL CARIOTIPO

La descripción del cariotipo normal o con alteraciones como traslocaciones, deleciones, inversiones, rearreglos estructurales complejos, fragilidades, duplicaciones, se realiza con la nomenclatura indicada por el ISCN (1995)

CITOGENETICA MOLECULAR

-Las limitaciones de la citogenética clásica y de la genética molecular por si solas, han sido superadas por la implementación de la citogenética molecular que utiliza las ventajas de ambas

-A esta metodología se le denomina FISH.

-Se basa en la hibridación in situ, detección y localización de secuencias específicas de ácidos nucleicos en estructuras biológicas morfológicamente conservadas.

-Utiliza sondas complementarias a un segmento de DNA.

-Estas sondas son biotiniladas no radioactivas.

TECNICA DE FISH

-PREPARACION PREVIA DE LA MUESTRA-PREPARACION DE LAS PLACAS-PREPARACION DE LAS SONDAS-HIBRIDACION-LAVADOS POST-HIBRIDACION-DETECCION-TINCION DE CONTRASTE (yoduro de propidium o DAPI)-VISUALIZACION (microscopio de epifluorescencia)

TIPOS DE SONDAS

PAINTING o COATING

SONDAS REPETITIVAS DE DNA ALFA SATELITE

SONDAS DE DNA DE SECUENCIA UNICA

GEN SRY EN CROMOSOMA X

CROMOSOMA X: SONDA ROJACROMOSOMA Y: SONDA VERDECROMOSOMA 18: SONDA CELESTE

SONDA DELECION CROMOSOMA 15

DELECION EN EL CROMOSOMA 15

DELECION DEL LOCUS KAL EN EL CROM. X

EL FISH NOS PERMITE RESPONDER PREGUNTAS

IMPOSIBLES DE RESOLVER CON TÉCNICAS DE

CITOGENÉTICA CLÁSICA, ES MENOS LABORIOSO

Y MAS RÁPIDO QUE LOS BANDEOS DE ALTA

RESOLUCIÓN, ES UNA TÉCNICA FACTIBLE Y

PODEROSA EN RESOLUCIÓN.

CITOGENETICA CLASICA Y MOLECULAR EN REPRODUCCION

APLICACIONES:

-Determinar la prevalencia de anomalias y de variantes cromosómicas en parejas con esterilidad e infertilidad.

-Determinar presencia de alteraciones numéricas( aneuploidias).

-Determinar presencia de alteraciones estructurales (translocacionesdeleciones, microdeleciones, inversiones, duplicaciones,etc.)

-Determinar presencia de variantes cromosómicas (sitios fragiles, variaciones satelitales, heterocromatina centromérica aumentada, etc.)

-Diagnóstico prenatal: (anomalias genéticas y defectos del tubo neural.

-FISH permite la evaluación de aberraciones numéricas en células de líquido amniótico directamente sin cultivar.(trisomía 21, trisomía 13, trisomía 18, S. de Turner o S. De Klinefelter.)

-Diagnóstico genético preimplantatorio: Posibilidad de analizar la presencia de alteraciones cromosómicas (FISH) y genéticas (P.C.R.)en embriones antes de ser transferidos al útero. (biopsia embrionaria).

-Translocaciones, determinar el sexo de embriones en enfermedades ligadas al sexo (hemofilia, distrofia muscular de Duchenne).-Determinar enfermedades genéticas (Fibrosis quística, Enf. De Tay-Sachs, Sindrome de Marfan, Beta-talasemia, Anemia falciforme, etc.

LOS PROBLEMAS DE ESTERILIDAD O INFERTILIDAD

SIN CAUSA DEFINIDA, PUEDEN TENER UN ORIGEN

CROMOSÓMICO Y REFUERZAN LA NECESIDAD DE

ESTUDIAR A UN MAYOR NÚMERO DE PAREJAS CON

PROBLEMAS DE REPRODUCCIÓN PARA UNA

EVALUACIÓN CITOGENÉTICA, UNA VEZ EXCLUIDAS

OTRAS CAUSAS.