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Bioqumica I Mini-relatrio Reaes caractersticas dos Glcidos

2 de Maio de 2014Licenciatura em BioqumicaBioqumica I Alexandra Teixeira N 45667Lcia Prados N 44760PL 2 Grupo 4

1. Resumo

Esta atividade experimental teve como objetivo a verificao de algumas reaes coradas dos glcidos que se baseiam no seu carter redutor e/ou na sua estrutura qumica. Pretendemos ainda determinar o contedo em glcidos redutores de farinhas alimentares atravs da aplicao do mtodo do 3,5-dinitrosalicilato (DNS).Nos resultados finais do teste de Benedict, que identifica glcidos redutores, conclui-se que a xilose, a glucose, a frutose e a lactose apresentam resultados positivos, ou seja, possuem glcidos redutores.O teste de Barfoed, que permite distinguir oses de disidos redutores, apresentou resultados positivos para a xilose, a glucose e a frutose, comprovando que se tratam de oses redutoras.Por ltimo, o teste do iodo apresentou resultados positivos apenas para a presena de glucognio no caso do amido e do glucognio. Os restantes tubos de ensaio no apresentaram qualquer reao.Por fim, determinamos o contedo em glcidos redutores da farinha alimentar, aplicando para tal o mtodo de DNS, que se baseia na reao do 3,5-dinitrosalicilato com glcidos redutores, formando um composto corado que pode ser doseado espetrofotometricamente a 540 nm. Conclumos que a percentagem de glcidos redutores na farinha alimentar de 82,2 %.

2. Apresentao e Discusso de Resultados

2.1 Testes de Identificao de GlcidosComo sabemos, existem diversas reaes coradas dos glcidos que se baseiam no seu carcter redutor e/ou na sua estrutura qumica. Estas reaes permitem identificar diversos tipos de glcidos atravs da realizao de vrios testes (Benedict, Barfoed e Iodo). De seguida apresentada , de forma esquematizada, uma chave dicotmica de identificao de glcidos que apresenta os glcidos que cada teste identifica, o resultado positivo caracterstico de cada teste e os glcidos ou grupo de glcidos que do um resultado negativo no respetivo teste.

Aps a realizao dos diferentes testes, e de forma a resumir os resultados obtidos elaboraram-se trs quadros (cada um referente a um dos trs testes realizados) onde so apresentadas as diferentes observaes e resultados de cada soluo de glcidos testada.

Quadro 1 Resultados referentes ao teste de Benedict TesteSoluo EstudadaObservaesResultado

Benedictgua Soluo de cor azul (sem precipitado)Negativo

XiloseSoluo avermelhada com formao de precipitadoPositivo

GlucoseSoluo avermelhada com formao de precipitadoPositivo

FrutoseSoluo cor de laranja-avermelhada com formao de precipitadoPositivo

SacaroseSoluo de cor azul (sem precipitado)Negativo

LactoseCor Laranja avermelhado LmpidaCom precipitadoPositivo

AmidoSoluo de cor azul (sem precipitado)Negativo

GlucognioSoluo de cor azul (sem precipitado)Negativo

O reagente de Benedict uma soluo alcalina de CuSO4 com Na2CO3 e citrato de sdio, que permite identificar glcidos redutores. O io citrato forma um complexo com o io Cu2+, impedindo assim que este precipite da soluo sob a forma de Cu(OH)2 (de cor azul) ou CuO (de cor preta). O Cu2+ do reagente de Benedict oxida os glcidos redutores presentes numa soluo, reduzido a Cu+ e precipita sob a forma de Cu2O (xido cuproso), dando origem a um precipitado de cor vermelha.O facto de um glcido ser ou no redutor est relacionado com a extremidade do carbono anomrico (carbono que esteja envolvido numa ligao osdica) estar livre ou no para reduzir o cobre do reagente de Benedict.Foram ento testadas 7 solues de glcidos. O tubo 1, que continha gua e reagente de Benedict (cor azul) foi usado como controlo, visto que o prprio reagente de Benedict preparado em gua destilada. Como seria de esperar, o resultado foi negativo (a gua no contm qualquer glcido).Os tubos que apresentaram um resultado positivo foram apenas os da xilose, glucose, frutose e lactose (onde se observou uma cor vermelho-alaranjada com formao de precipitado). Deste modo podemos afirmar que este glcidos so de facto redutores. A xilose, frutose e glucose so consideradas monossacridos, ou seja, no esto ligadas a nenhuma outra ose. Deste modo, o seu carbono anomrico est livre para poder reagir com o Cobre, reduzindo-o a Cu+. devido reduo do cobre que se observa a mudana de cor de azul para laranja/vermelho (e a formao de precipitado).Tambm a lactose deu um resultado positivo,visto que apesar de ser um disido (constituda por glucose e galactose), o carbono anomrico da glucose est livre para reagir com o cobre do reagente de Benedict.A sacarose um disido e apresentou um resultado negativo, como seria de esperar, visto que os carbonos anomricos, quer da glucose quer da frutose participam na ligao glicosdica. Deste modo no vo estar disponveis para reagir com o cobre do reagente.Nos restantes tubos no se apresentaram qualquer alteraes, o teste foi negativo e no houve formao de precipitado.O amido e o glucognio so ambos polisidos com estruturas em forma de hlice, logo os seus grupos redutores esto virados para o interior desta mesma hlice o que vai impedir o cobre de ser reduzido. Deste modo o resultado foi negativo para ambos os polisidos.

TesteSolues testadasObservaesResultado

BarfoedguaAzul translcidoSem precipitadoNegativo

XiloseAzul Translcido com formao de precipitado vermelhoPositivo

GlucoseAzul Translcido com formao de precipitado vermelhoPositivo

FrutoseAzul Translcido com formao de precipitado vermelhoPositivo

SacaroseAzul translcidoSem precipitadoNegativo

LactoseAzul translcidoSem precipitadoNegativo

AmidoAzul translcidoSem precipitadoNegativo

GlucognioAzul translcidoSem precipitadoNegativo

Quadro 2 Resultados referentes ao teste de Barfoed

O teste de Barfoed permite distinguir oses de disidos, a partir da sua velocidade de reao numa soluo de acetato de cobre em cido actico, isto , os disidos apresentam uma velocidade de reao muito inferior quando em contacto com o reagente de Barfoed. Tal como no Teste de Benedict, as oses so oxidadas, e o Cu2+ presente no reagente de Barfoed reduzido a Cu+, precipitando sob a forma de Cu2O de cor vermelha. Verifica-se uma diminuio da capacidade redutora de oses e dos disidos redutores que provocada pelo meio cido, ao contrrio do que acontece no teste de Benedict. Foram testadas novamente as 7 solues de glcidos usadas no teste anterior, e o tubo 1 foi usado como controlo (continha gua e reagente de Barfoed), dando um resultado negativo, visto que mais uma vez a gua no contm nenhum glcido.Dos restantes tubos, apenas trs deram um resultado positivo, o da glucose, o da xilose e o da frutose. Isto aconteceu tal como previsto, visto que j sabemos que tanto a glucose, como a xilose e frutose so oses redutoras (tal como foi comprovado pelo teste anterior) capazes de reagir com o reagente de Barfoed, ocorrendo a formao de um precipitado de cor vermelha. Nos tubos da sacarose e da lactose obtiveram-se resultados negativos e no se observou formao de precipitado tal como seria de esperar, uma vez que se tratam de disidos e o seu carbono anomrico est menos disponvel para reagir que o das oses redutoras. No entanto, sendo a lactose um disido redutor, se tivssemos aquecido a soluo durante mais tempo poderamos obter um falso positivo, visto que ocorreria a reduo do cobre do reagente de Barfoed e a formao do precipitado de cor vermelha. Nos tubos do amido e do glicognio no se verificou qualquer alterao, como seria de esperar visto que so ambos polisidos e tendo em conta a sua estrutura os seus carbonos anomricos no esto disponveis para reagir, portanto no h reduo do Cu2+.TesteSolues testadasObservaesResultado

IodoguaAmarelo-alaranjadoNegativo

XiloseAmarelo-alaranjadoNegativo

GlucoseAmarelo-alaranjadoNegativo

FrutoseAmarelo-alaranjadoNegativo

SacaroseAmarelo-alaranjadoNegativo

LactoseAmarelo-alaranjadoNegativo

AmidoCastanho EscuroPositivo

GlucognioCastanho-avermelhadoPositivo

Quadro 3 Resultados referentes ao teste do Iodo

O teste do Iodo deteta a presena de polisidos em soluo, visto que quando tratados com uma soluo de iodo em KI originam uma cor caracterstica. O amido, um polisido ramificado, produz uma cor azul intensa que devida formao de um complexo amido-iodo. Deste modo, os polisidos ramificados que apresentam hlices interrompidas originam complexos de cores menos intensas; enquanto que os polisidos muito ramificados, formam complexos castanho-avermelhados pouco intensos. O controlo usado foi novamente gua com soluo de Iodo, que apresentou um resultado negativo. Neste teste, tal como seria de esperar, os nicos tubos que apresentaram um resultado positivo foram os do amido e do glucognio, visto que ambos so polisidos. No entanto o amido um polisido menos ramificado pelo que supostamente vai apresentar uma colorao menos intensa, enquanto que o glucognio (um polisido muito ramificado) vai apresentar uma colorao mais intensa. Porm, o observado aps a realizao do teste foi o contrrio e o amido apresentava uma colorao mais intensa que o glucognio. Isto pode ter ocorrido devido a erros sistemticos, tais como erros de medio ou talvez devido ao uso de uma pipeta ou soluo contaminadas.

De seguida so apresentadas as estruturas de alguns dos glcidos testados.

Figura 1 Estruturas de alguns dos glcidos estudados

2.2 Doseamento de glcidos redutores numa farinha alimentarFluxograma Comentado

A adio de NaOH tem como finalidade neutralizar o meio, que se encontra cido devido presena de H2SO4. Fornece tambm a basicidade necessria para que ocorra a reao do DNS com os glcidos redutores presentes em soluo;Aquecendo a amostra a filtrao far-se- mais rapidamente, permitindo a recolha de oses redutoras, enquanto que os polisidos no hidrolisveis ficam retidos no papel de filtro.A farinha reduzida a p fino de forma a maximizar a rea de superfcie e assim facilitar a reao de hidrlise, e tambm a permitir uma pesagem mais rigorosa;A massa da farinha reduzida a p deve ser registada at ao dcimo de mg, de modo a permitir o clculo rigoroso da concentrao de glcidos redutores presentes na farinha alimentar;A adio de cido sulfrico tem um papel importante na hidrlise cida dos polisidos, obtendo-se assim oses redutoras. Promove tambm a desnaturao das protenas, biomolculas que neste caso no pretendemos estudar e que podero interferir com as leituras de absorvncia;O aquecimento do tubo de ensaio tem tambm como objetivo promover a hidrlise dos polisidos.

Pretendemos determinar o contedo em glcidos redutores na farinha alimentar atravs da aplicao do mtodo do 3,5-dinitrosalicilato. Em meio bsico, e quando aquecido na presena de glcidos redutores, o DNS forma um produto de reduo castanho-avermelhado, o 3-amino-5-nitrosalicilato, que pode ser doseado espetrofotometricamente a 540 nm. Tal como mostra a seguinte reao qumica:

Figura 2 - Reao do 3,5-dinitrosalicilato (DNS) com a glucose

Curva de calibrao do mtodo do DNS

Tubo N

0123456789

0,0000,0200,0400,0600,0800,1000,1400,0390,0560,104

Abs540nm0,0010,0090,0260,0660,0990,1120,1520,0390,0580,115

Quadro 1 - valores de absorvncia registados para cada tubo de ensaio e respetivas concentraes de glucose calculadas

A fim de determinar a curva de calibrao, calculmos a concentrao de glucose para os tubos de ensaio 1 a 6, aos quais foi adicionada soluo padro de glucose de concentrao 5 mg/mL. Exemplificaremos os clculos efetuados unicamente para o tubo de ensaio 1, procedendo-se de forma semelhante para os restantes tubos de ensaio, variando apenas o volume de soluo padro adicionado. ci Concentrao da soluo padro de glucose (5mg/mL)cf Concentrao de glucose no balo volumtricoVi volume da soluo padro de glucose adicionado ao tubo de ensaio

Vf volume total contido no balo volumtrico (25 mL)Tubo de ensaio 1Vi = 0,1 mL

Em seguida, apresentamos o grfico de disperso que relaciona os valores de concentrao de glucose dos tubos de ensaio 0 a 6 com os respetivos valores de absorvncia registados. Desta forma, determinmos a equao da reta que melhor se ajusta aos pontos experimentais que definem o grfico.

Figura 3 - grfico que relaciona a concentrao de glucose com os valores de absorvncia dos tubos de ensaio 0 a 6. Encontra-se representada a reta que melhor aproxima os pontos experimentais representados e sua respetiva equao. O valor de R2 encontra-se bastante prximo de 1, indicando uma boa aproximao da reta aos pontos experimentais

Tendo em conta a equao da reta, y = 1,1727x - 0,0073, possvel calcular a concentrao de glucose no hidrolisado adicionado aos tubos de ensaio 7 a 9. Os clculos efetuados sero exemplificados apenas uma vez para o tubo de ensaio 7, procedendo-se de forma semelhante para os restantes tubos de ensaio.Tubo de ensaio 7Abs540 nm 0,039

Volume = 25 mL Volume de hidrolisado adicionado = 1,3 mL

Volume inicial = 50 mL de hidrolisado de glcidos redutores no hidrolisado inicial

Tubo de ensaio 8m = 43,75 mg de glcidos redutores no hidrolisado inicialTubo de ensaio 9m = 65 mg de glcidos redutores no hidrolisado inicialDevido ao facto de este ltimo valor da massa de glcidos redutores presentes no hidrolisado apresentar um grande desvio dos restantes, conclumos que provavelmente foram cometidos erros na preparao das amostras com o hidrolisado. O erro determinante ter sido aquando da lavagem do tubo de ensaio que continha o hidrolisado com NaOH. Parte desta soluo foi derramada enquanto estava a ser transferida para um erlenmeyer, resultando na perda de algum do hidrolisado que ainda se encontrava nas paredes do tubo de ensaio, e consequentemente tambm de algum hidrxido de sdio indispensvel para manter o meio bsico e garantir que o DNS reage com os glcidos redutores.Decidimos ento desprezar este ltimo valor obtido, realizando apenas os clculos com as massas obtidas dos tubos de ensaio 7 e 8.Mdia da massa de glcidos redutores

Percentagem de glcidos redutores na soluo preparadamamostra = 0,0494 gmglcidos redutores = 0,0406 g%(m/m) = x 100 %= x 100% =82,2 %% (m/m) registada na embalagem da farinha alimentar = 84,7%

O valor da percentagem (m/m) obtido experimentalmente foi bastante prximo do valor que se encontra registado na embalagem da farinha alimentar utilizada para preparar as amostras. No entanto, no podemos afirmar que a experincia decorreu sem erros, visto que j alguns foram referidos anteriormente, tais como: perda de volumes significativos tanto de hidrolisado como de solues durante a atividade, nomeadamente na transferncia de uns recipientes para outros.3. Bibliografia

QUINTAS Alexandre, PONCES Ana Freire, HALPERN Manuel J., Bioqumica Organizao Molecular da Vida, LIDEL 2008, Lous, pp. 321 (acedido a 8/05/2014 pelas 16:07) http://pt.wikipedia.org/wiki/Carbono_anom%C3%A9rico (acedido a 8/05/2014 pelas 13:04) Protocolo das aulas prticas de Bioqumica http://www.ebah.com.br/content/ABAAAA8XgAE/acucar-redutor (acedido a 8/05/2014 pelas 14:50) Lehninger, Principles of Biochemistry, Fifth Edition (acedido a 8/05/2014 pelas 17:09) http://www.fat.uerj.br/intranet/disciplinas/Processos%20Bioquimicos/APOSTILA%20PR%C1TICA%20DE%20PROCESSOS%20BIOQU%CDMICOS_vers%E3o2.pdf (acedido a 8/05/2014 pelas 16:07)

4. Questes a desenvolver

4.1. A forma predominante da glucose em soluo a estrutura em anel representada pela projeo de Haworth. Porque que a glucose d um resultado positivo, reagindo completamente, nas reaes caractersticas da sua forma em cadeia aberta?A ciclizao da glucose uma reao rpida em gua, existindo um equilbrio entre a forma linear e a forma cclica, no entanto, a forma mais abundante da glucose em soluo aquosa a cclica que deriva de uma reao intramolecular entre um hidroxilo e o grupo aldedo, podendo gerar um anel de cinco ou seis membros. A forma cclica dos glcidos encontra-se representada por projees de Haworth.Durante a atividade experimental obtivemos resultados positivos para a glucose nos testes de Benedict e de Barfoed. A ocorrncia de reaes inerentes aos dois testes comprova a existncia de glucose na sua forma de cadeia aberta. A introduo de um reagente especfico no sistema (reagente de Benedict e de Barfoed) leva a um consumo de estruturas em cadeia aberta. Segundo o Princpio de Le Chtelier, o sistema vai reagir contrariando o consumo de glucose na sua forma linear, promovendo a abertura dos anis da glucose cclica. Este processo repetir-se- at que toda a glucose tenha reagido.

4.2. Apesar de possurem uma extremidade redutora, o amido e o glucognio do um resultado negativo nos testes de deteo de glcidos redutores. JustifiqueO amido constitudo por dois polissacardeos: amilopectina e amilose. A amilopectina, a amilose e o glucognio so polisidos constitudos por resduos de glucose. A amilose constituida por 250 a 300 resduos de D-glicopiranose, ligados por ligaes glicosdicas do tipo -1,4. Estas ligaes conferem molcula uma estrutura helicoidal.A amilopectina um polmero ramificado constitudo por cerca de 1400 resduos de -glucose ligadas entre si por ligaes glicosdicas do tipo -1,4. A estrutura do glucognio idntica deste polmero, sendo ainda mais ramificada.Podemos concluir ento que estes polisidos diferem apenas nas ligaes estabelecidas entre os resduos de glucose. Estas ligaes so efetuadas pela extremidade redutora de cada resduo. Deste modo, cada polisido apresenta apenas uma extremidade redutora livre correspondente ao ltimo resduo de monossacardeo. No entanto, este resduo final encontra-se virado para o interior da hlice estrutural, tornando-se inacessvel aos agentes oxidantes. Sendo assim os agentes oxidantes apenas tm acesso aos grupos no redutores que se encontram orientados para o exterior da hlice. Para alm disso, preciso ter em conta que estes polisidos possuem dimenses elevadas, existindo uma quantidade elevada de resduos de glucose. E dadas as concentraes reduzidas de amido e glucognio utilizadas, as extremidades redutoras presentes em soluo no foram suficientes para obter um resultado positivo nos testes.4.3. Como explica a obteno de um falso resultado positivo se efetuar um aquecimento prolongado de algumas solues de glcidos no teste de Barfoed?Ao efetuarmos um aquecimento prologando das solues de glcidos pode ocorrer rutura das ligaes osdicas, deste modo os disidos iriam dar origem a oses. As oses tm ento as suas extremidades redutoras disponveis para reagir, sendo oxidadas. Assim, so reconhecidas pelo teste de Barfoed apresentando um resultado positivo. No entanto, o teste de Barfoed indicando para detetar a presena de oses, e no especfico para disidos e polisidos, pelo que estaramos a obter um falso-positivo. Pode ainda ocorrer alterao da conformao da estrutura dos glcidos se estes forem sujeitos a grandes variaes de temperatura. Deste modo o amido e o glucognio podem sofrer alteraes na sua estrutura, ficando os grupos redutores voltados para o exterior e podendo reagir. 4.4. Porque foi necessrio proceder hidrlise cida da farinha alimentar previamente aplicao do mtodo do DNS?

Foi necessrio proceder hidrlise cida da farinha alimentar para quebrar as ligaes osdicas, formando-se uma molcula de gua. A farinha alimentar constituda por amido que devido hidrlise cida vai dar origem a oses que ficam com o seu carbono anomrico livre para reagir com o DNS, e deste modo h uma quantificao mais eficaz dos glcidos.

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