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Ahora mismo, si se consultase a la comunidadde microbiólogos sobre cuál es el ámbito de la

microbiología más influyente en el inicio del nuevomilenio, al margen de preferencias individuales,existiría un amplio consenso en uno de estos dostemas: el análisis de los genomas bacterianos y elproceso de formación de biofilms. No cabe dudaque la disponibilidad de la secuencia completa decientos de genomas microbianos está influyendoenormemente sobre todos los aspectos de estudiode la microbiología. Sin embargo, no es menoscierto que el convencimiento general, sorprenden-temente reciente, de que las bacterias en su medionatural se desarrollan formando comunidades demicroorganismos afecta a nuestro concepto de lasbacterias como seres unicelulares individuales yjustifica el desarrollo de una nueva disciplinadedicada a estudiar cómo se forman estas comu-nidades y qué nuevos fenotipos diferenciales pre-senta la comunidad con respecto a cada bacteriaindividual.

Definición

Los biofilms se definen como comunidades demicroorganismos que crecen embebidos en

una matriz de exopolisacáridos y adheridos a unasuperficie inerte o un tejido vivo (Figura 1). La pri-mera reflexión que surge respecto a los biofilms espor qué han pasado desapercibidos durante tantotiempo para las excelentes generaciones de micro-biólogos que hemos tenido. Alguno de los lectoresquizás este pensando que probablemente los bio-films se encuentran en ambientes muy reducidosque hasta ahora no han llamado demasiado laatención del mundo científico. Nada más lejos dela verdad. La presencia de biofilms es ubicua en lanaturaleza, convivimos cotidianamente con ellos,tanto que quizás sea precisamente su ubicuidadla que les ha restado protagonismo. Quién no haobservado el material mucoso que recubre unjarrón en el que hemos tenido depositadas flores,el material resbaladizo que recubre las piedras delos lechos de los ríos, los cascos de los barcos o lasuperficie interna de una tubería. Otro ejemplocotidiano de biofilm lo constituye la placa dental,cada día nos esforzamos por combatir la películade bacterias que recubre la superficie de los dien-tes para evitar un desarrollo excesivo de microor-

ganismos que puede provocar un deterioro delesmalte dental. La capacidad de formación de bio-film no parece estar restringida a ningún grupoespecífico de microorganismos y hoy se consideraque bajo condiciones ambientales adecuadastodos los microorganismos son capaces de formarbiofilms.

Aunque la composición del biofilm es variableen función del sistema en estudio, en general, elcomponente mayoritario del biofilm es el agua,que puede representar hasta un 97% del conteni-do total. Además de agua y de las células bacte-rianas, la matriz del biofilm es un complejo for-mado principalmente por exopolisacáridos secre-tados por las propias células que forman parte delmismo. En menor cantidad se encuentran otrasmacromoléculas como proteínas, DNA y productosdiversos procedentes de lisis de las bacterias.

En los primeros trabajos sobre la estructuradel biofilm, una de las cuestiones que surgía conmayor reiteración era cómo las bacterias del inte-rior del biofilm podían tener acceso a los nutrien-tes o al oxígeno. Estudios realizados utilizandomicroscopia confocal han mostrado que la arqui-tectura de la matriz del biofilm no es sólida y pre-senta canales que permiten el flujo de agua,nutrientes y oxígeno incluso hasta las zonas másprofundas del biofilm. La existencia de estos cana-les no evita, sin embargo, que dentro del biofilmpodamos encontrarnos con ambientes diferentes

Biofilms bacterianosÍñigo Lasa Uzcudun

Instituto de Agrobiotecnología y Recursos Naturales y Departamento de Producción Agraria.Universidad Pública de Navarra.

E-mail: ilasa@unavarra.es

Figura 1. Fotografía de microscopia de barrido de unbiofilm de Salmonella enteritidis.

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en los que la concentración de nutrientes, pH uoxígeno es diferente. Esta circunstancia aumentala heterogeneidad sobre el estado fisiológico en elque se encuentra la bacteria dentro del biofilm ydificulta su estudio.

Biofilms bacterianos e infección

Las enfermedades infecciosas agudas que hanocupado la atención de los microbiólogos

durante el siglo pasado estaban causadas porbacterias patógenas especializadas con mecanis-mos específicos de patogenicidad, como la difteria,la tuberculosis, el cólera o la tos-ferina. Los anti-bióticos y vacunas desarrollados frente a estasbacterias han tenido una eficacia remarcable ensu control. En la actualidad, el primer plano queocupaban estas bacterias patógenas especializa-das ha sido usurpado por bacterias ubicuas,capaces de producir infecciones de tipo crónico,que responden pobremente a los tratamientosantibióticos y no pueden prevenirse mediante

inmunización. Ejemplos de estas infecciones sonlas relacionadas con los implantes médicos y otrasinfecciones crónicas como otitis media, neumoníaen pacientes con fibrosis quística, infecciones uri-narias crónicas, infecciones de próstata y osteo-mielitis (Tabla 1). El análisis directo de los implan-tes y tejidos de estas infecciones muestra clara-mente que la bacteria responsable de la infeccióncrece adherida sobre el tejido o el implante produ-ciendo biofilms. Dentro del biofilm, las bacteriasestán protegidas de la acción de los anticuerpos,del ataque de las células fagocíticas y de los trata-mientos antimicrobianos.

La característica que mejor distingue las infec-ciones crónicas relacionadas con biofilms de lasinfecciones agudas es su respuesta a tratamientosantibióticos. Mientras que las infecciones agudaspueden ser eliminadas tras un breve tratamientoantibiótico, las infecciones por biofilms normal-mente no consiguen ser completamente elimina-das, producen episodios recurrentes y la mayoríade las veces deben resolverse sustituyendo el

Tabla 1. Lista parcial de infecciones humanas en las que están involucrados biofilms bacterianos (Costerton et al.,1999)

Infección o enfermedad Especie bacteriana formadora de biofilm

Caries dental Cocos gram-positivos acidogénicos (ej. Streptococcus)Periodonditis Bacterias anaeróbicas orales gram-negativasOtitis media Cepas no tipables de Haemophilus influenzaeInfecciones del músculo-esqueleto Cocos gram-positivos (ej. Staphylococcus)Fascitis necrotizante Streptococos Grupo AOsteomelitis Varias especies bacterianas y fúngicas, generalmente mezcladasProstatitis bacteriana Escherichia coli y otras bacterias gram-negativasEndocarditis de la válvula nativa Streptococcus del grupo “viridans”Neumonía por fibrosis quística Pseudomonas aeruginosa y Burkholderia cepaciaMeloidosis Pseudomonas pseudomalleiInfecciones nosocomiales:Neumonía (cuidados intensivos) Bacilos gram-negativosSuturas Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus aureusOrificios de salida S. epidermidis y S. aureusVías arteriovenosas S. epidermidis y S. aureusBucles esclerales Cocos gram-positivosLentes de contacto P. aeruginosa y cocos gram-positivosCistitis por catéteres urinarios E. coli y otros bacilos gram-negativosPeritonitis por diálisis peritoneal Una variedad de bacterias y hongosDIU Actinomyces israelli y muchos otros microorganismosTubos endotraqueales Una variedad de bacterias y hongosCatéteres hickman S. epidermidis y Candida albicansCatéteres centrales venosos S. epidermidis y otrosVálvulas mecánicas del corazón S. epidermidis y S. aureusInjertos vasculares Cocos gram-positivosBloqueo del conducto biliar Una variedad de bacterias entéricas y hongosDispositivos ortopédicos S. epidermidis y S. aureusPrótesis del pene S. epidermidis y S. aureus

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implante. Esto se debe a que las bacterias del bio-film pueden ser hasta 1000 veces más resistentesa los antibióticos que esas mismas bacterias cre-cidas en medio líquido. ¿Cuáles son las razones deesta mayor resistencia a los antibióticos? Entrelos mecanismos responsables de la resistencia seincluyen: (i) la barrera de difusión física y químicaa la penetración de los antimicrobianos que cons-tituye la matriz de exopolisacáridos; (ii) el creci-miento ralentizado de las bacterias del biofimdebido a la limitación de nutrientes; (iii) la exis-tencia de microambientes que antagonizen con laacción del antibiótico; y (iv) la activación de res-puestas de estrés que provocan cambios en lafisiología de la bacteria y la aparición de un feno-tipo específico del biofilm que activamente comba-ta los efectos negativos de las sustancias antimi-crobianas (Mah y O'Toole, 2001). Por otro lado,hay que tener en cuenta que los antibióticos queutilizamos rutinariamente han sido seleccionadospor su actividad frente a bacterias planctónicas.Así mismo, los ensayos de sensibilidad a los anti-microbianos (antibiogramas) que se realizan ruti-nariamente en la clínica están diseñados paramedir la susceptibilidad frente al antimicrobianode la bacteria crecida de forma planctónica, sintener en cuenta que los resultados obtenidos pue-den no ser extrapolables a esa misma bacteriacuando está creciendo en el interior de un biofilm.Parece urgente que se introduzcan nuevos méto-dos de selección de antimicrobianos y se desarro-llen protocolos sencillos diseñados para medir lasusceptibilidad de una bacteria en biofilm a losantimicrobianos.

Crecimiento planctónico frente a crecimientoen biofilm

Dependiendo de las condiciones ambientales,una misma bacteria puede crecer sésil, adhe-

rida a una superficie o crecer de forma planctóni-ca nadando libremente en el medio líquido. Conun mismo genotipo, la bacteria expresa un distin-to patrón de genes y presenta un distinto fenotipo.En los últimos cinco años muchos grupos deinvestigación han orientado sus esfuerzos a iden-tificar tanto los genes responsables de la transi-ción biofilm↔planctónica como de los genes nece-sarios para mantener la estructura del biofilm.Para la identificación de estos genes, casi todos losgrupos han utilizado un ensayo de biofilm enplaca de ELISA inicialmente descrito por el grupode Christensen, pero que fue popularizado por elgrupo de Roberto Kolter (O'Toole y Kolter, 1998).En este ensayo se produce una colección demutantes en una cepa formadora de biofilm de la

especie que se este estudiando y se identifican losmutantes que han perdido la capacidad de produ-cir biofilm sobre los pocillos de una placa deELISA. El ensayo se puede automatizar de formamuy fácil y permite el análisis de un gran núme-ro de mutantes de una forma rápida y sencilla.Más recientemente, el desarrollo de la genómica yproteómica ha hecho que muchos grupos esténutilizando técnicas de microarrays o proteómicapara identificar los genes que se expresan deforma diferente en condiciones planctónicas o debiofilm. Alternativamente, otros grupos han opta-do por utilizar nuevos métodos de selección demutantes deficientes en la formación de biofilmcomo son las placas de calcofluor, la morfologíacolonial en placas con rojo congo, etc. (Solano etal., 2002). Aunque existe una variación considera-ble entre los distintos ensayos, estos estudiosmuestran que hasta el 30% de los genes puedenestar diferencialmente expresados entre una bac-teria crecida en condiciones planctónicas o de bio-film. Entre estos genes, de forma reiterada seencuentra una gran proporción de genes cuyafunción es desconocida, lo que indica que haygenes específicos del estilo de vida en biofilm, cuyofenotipo hasta ahora no había podido ser visuali-zado.

La adherencia primaria y el desarrollo del bio-film

La etapa inicial del proceso de formación delbiofilm es la adherencia sobre la superficie. Enbacterias gram-negativas (Pseudomonas aerugino-sa, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Salmonellaenteritidis) se ha visto que los flagelos, las fimbriasde tipo I, IV y los curli son importantes para laetapa de adherencia primaria. La motilidad pare-

Íñigo Lasa Uzcudun fue premio extraordinariode la licenciatura en Biología por la

Universidad de Navarra. Realizó su trabajo deTesis doctoral en el Centro de Biología Molecular“Severo Ochoa” de la Universidad Autónoma deMadrid desarrollando herramientas de manipu-lación genética para bacterias termófilas. Ha rea-lizado estancias postdoctorales en el InstitutoMax-Plank de Colonia y el Instituto Pasteur deParis, donde realizó un estudio sobre el procesode movilidad intracelular mediado por actina deListeria monocytogenes. Desde 1998, es ProfesorTitular de Microbiología y realiza su actividadinvestigadora en el Instituto de Agrobiotecnologíay Recursos Naturales (UPNA-CSIC) sobre el aná-lisis genético del proceso de formación de bio-films bacterianos.

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ce que ayuda a la bacteria a alcanzar la superficiey contrarrestar las repulsiones hidrofóbicas. Sinembargo, aunque la motilidad ayuda al proceso noparece ser un requisito esencial, pues muchasbacterias gram-positivas inmóviles, como estafilo-cocos, estreptococos y micobacterias son capacesde formar biofilm. En el caso de las bacteriasgram-positivas se ha descrito la participación deproteínas de superficie (AtlE, Bap, Esp) en estaprimera etapa de adherencia primaria (Cucarellaet al., 2001; Toledo-Arana et al., 2001). Una vezque la bacteria se ha adherido a la superficie,comienza a dividirse y las células hijas se extien-den alrededor del sitio de unión, formando unamicrocolonia similar a como ocurre durante elproceso de formación de colonias en placas deagar.

En una etapa posterior la bacteria comienza asecretar un exopolisacárido que constituye lamatriz del biofilm y forma unas estructuras simi-lares a setas (mushrooms) entre las cuales seobserva la presencia de canales. La composicióndel exopolisacárido es diferente en cada bacteria yvaria desde alginato en P. aeruginosa, celulosa enS. typhimurium, un exopolisacarido rico en gluco-sa y galactosa en V. cholerae, poli-N-acetilglucosa-mina en S. aureus, etc. Además, estudios recien-tes han puesto de manifiesto que incluso unamisma bacteria, dependiendo de las condicionesambientales en las que se encuentre, puede pro-ducir distintos exopolisacáridos como componen-tes de la matriz del biofilm. Así, algunas cepas deP. aeruginosa son capaces de producir, además dealginato, un polisacárido rico en glucosa queforma un película en la interfase medio aire, al quese ha denominado “pellican”.

Finalmente, algunas bacterias de la matriz delbiofilm se liberan del mismo para poder colonizarnuevas superficies, cerrando el proceso de des-arrollo de formación del biofilm. La liberación delas bacterias desde el biofilm es el proceso quemenos se conoce. En el caso de S. aureus se hadescrito un proceso de variación de fase produci-do por la inserción reversible de un elemento deinserción (IS256) en el interior del operón(icaADBC) responsable de la síntesis del exopoli-sacárido del biofilm. El proceso de inserción delelemento parece ocurrir aleatoriamente en lapoblación con una frecuencia de 10−6 y producebacterias deficientes en la síntesis del exopolisa-cárido y por tanto deficientes en la formación delbiofilm. Esto permite a la bacteria mantener unpequeño porcentaje de la población incapaz desintetizar el exopolisacárido y poder escapar delbiofilm. Como la inserción es un proceso reversi-ble, el salto de la secuencia de inserción desde el

operón ica provocará una nueva variación de fase.Otra alternativa descrita en S. aureus, consiste enla obtención de variantes deficientes en la forma-ción del biofilm debido a la eliminación de una islade patogenicidad que contiene elementos esencia-les para este proceso de biosíntesis (Ubeda et al.,2003). Algunos autores sostienen que en algunasbacterias el proceso de liberación desde el biofilmse produce gracias a la producción de enzimasque degradan de forma específica el exopolisacári-do del biofilm. La presencia en distintos genomasde genes codificantes de hipotéticas proteínas(endoglucanasas) que podrían ser responsables deesta función avala esta hipótesis, pero es necesa-rio confirmarla experimentalmente en el laborato-rio.

Regulación del proceso de formación del biofilm

Numerosas evidencias experimentales sugierenque el proceso de formación del biofilm esta

regulado por una compleja cascada de regulado-res. Entre ellos, un trabajo pionero con P. aerugi-nosa demostró que el proceso de formación delbiofilm esta regulado por un proceso de “quorumsensing” o autoinducción. El sistema de quorumsensing es un mecanismo de regulación depen-diente de la acumulación en el medio ambiente deuna molécula señal, autoinductor, que permite ala bacteria sentir la densidad de población exis-tente. En bacterias gram-negativas el autoinduc-tor es principalmente acilhomoserina lactona,mientras que en bacterias gram-positivas elautoinductor son péptidos. Cuando se acumulaen el medio una suficiente cantidad del autoin-ductor este activa un receptor específico que alte-ra la expresión de genes afectando a distintosfenotipos. En relación con el quorum sensing, seha identificado una molécula denominada “fura-nona”, producida por el alga Delisea pulcra, conuna estructura similar a las acilhomoserina lacto-nas. Estas moléculas en lugar de inducir la res-puesta, bloquean el sistema de quorum sensing yla consiguiente formación de biofilm. En la actua-lidad se esta intentando desarrollar inhibidores dela formación del biofilm basados en derivados dela furanona, ya que esta molécula es extremada-mente tóxica. De forma similar en S. aureus se hadescrito un péptido denominado RIP, que inhibeun sistema de quorum sensing y el proceso de for-mación del biofim.

Aparte del quorum sensing, se ha demostradoque otros reguladores globales, como CsrA en E.coli y CytR en V. cholerae, son también determi-nantes importantes para el desarrollo de biofilm

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de estas bacterias. En S. aureus, nuestro grupo hademostrado que un regulador global de virulenciadenominado SarA es esencial para el desarrollodel biofilm de esta bacteria. Este trabajo encuen-tra por primera vez un nexo de unión entre la viru-lencia de la bacteria y el proceso de formación delbiofilm (Valle et al., 2003).

Además de la regulación a nivel transcripcio-nal, existen numerosos indicios de la existencia deuna regulación postranscripcional del proceso deformación del biofilm. Así, la activación de la sín-tesis de celulosa en S. typhimurium se produce porel activador alostérico c-diGMP. La concentraciónde este activador depende de dos actividades enzi-máticas, diguanilato ciclasa y fosfodiesterasa, aso-ciadas a enzimas que contienen los dominiosGGDEF y EAL. En S. typhimurium existen almenos 18 proteínas que contiene estos dominios,y se desconoce si todas estas proteínas afectan ala regulación del proceso de síntesis de celulosa endistintas condiciones ambientales o si son respon-sables de otras funciones.

Finalmente, parece lógico que la formación debiofilm se produzca en respuesta a las condicionesambientales y por tanto que existan sistemas defosfotransferencia de dos componentes que trans-mitan la señal ambiental al interior de la bacteriapara adecuar la expresión de genes a la nuevasituación ambiental.

Cuestiones abiertas para el futuro

Apesar de lo mucho que hemos aprendido sobrelos biofilms bacterianos en los últimos años,

todavía es necesario definir con precisión cuál esel fenotipo “Biofilm”. Sólo en ese momento sepodrá determinar cuales son los cambios fisiológi-cos que tienen lugar en el mismo y cúales son losrequerimientos genéticos y los mecanismos deregulación de dicho proceso. Además, esto permi-tirá unificar los resultados experimentales obteni-dos, porque en la actualidad parte de la confusión

existente puede deberse a que estamos incluyen-do dentro del paraguas “Biofilm” distintos fenoti-pos que probablemente no en todos los casos, seajustan exactamente a la misma definición debiofilm.

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