ESTUDIO DE

BIOFILMS

BUCALESDEPARTAMENTO MÉDICO DENTAID

Las bacterias de la cavidad oral pueden estar en la saliva o adheridas

a las superficies bucales (mucosas, lengua, dientes)

Biofilms bucales: agrupaciones bacterianas embebidas en matrices

que se adhieren a superficie.

Composición: 15-20% población microbiana

80-85% matriz de polisacáridos extracelulares,

proteínas, sales minerales y material celular

Localización en diente: supragingival

subgingival

interproximal

DEFINICIÓN

PATOGENICIDAD

BIOFILMS

Supragingival e

Inteproximal

Bacterias cariogénicas

Destrucción del

esmalte dental

Subgingival

Inflamación y

destrucción del

periodonto

Bacterias

periodontopatógenas

CARIES GINGIVITIS PERIODONTITIS

Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Porphyromonas gingivalis

Prevotella intermedia

Fusobacterium nucleatum

Tannerella forsythia

Campylobacter rectus

Eikenella corrodens

Parvimonas micra

Selenomonas spp

Eubacterium spp

Treponema spp

700 especies bacterianas están presentes

en el biofilm bucal

DIVERSIDAD BACTERIANA

DE LA CAVIDAD BUCAL

FORMACIÓN DE BIOFILMS

Formación de película

adquirida con proteínas

salivares sobre el esmalte

1

Adhesión de colonizadores

primarios: bacilos y cocos gram

positivos (S. sanguis, S.

oralis,…) y crecimiento

2

Unión de Fusobacterium

nucleatum: facilita la adhesión

de otras bacterias (gram

negativas, anaerobios…)

3

4 Colonizadores terciarios.

Incremento de la complejidad:

gram negativos, anaerobios

estrictos

4 μm4 μm

Las bacterias, al crecer en forma de biofilms, actúan como una

comunidad bacteriana, lo que les otorga las siguientes propiedades:

Heterogeneidad fisiológica

Mayor resistencia fenotípica

Quorum sensing (comunicación interbacteriana)

Capacidad adaptativa

Resistencia a los agentes antimicrobianos

PROPIEDADES DE LOS BIOFILMS

IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DE BIOFILMS

Las bacterias aisladas (planctónicas) tienen diferente

comportamiento y propiedades que cuando están

organizadas en biofilms.

Estas propiedades diferentes les confieren un incremento en

la resistencia frente a antisépticos y un aumento en su

patogenicidad.

Por tanto, es necesario estudiar el comportamiento de las

bacterias en biofilms y poder prevenir así las patologías

bucales que puedan causar.

Desarrollo Biofilm in vitro

Crecimiento estático Crecimiento en flujo

Biofilm maduro

Cultivo en placa Técnicas moleculares Técnicas microscópicas

PCR

PCR-RT

PCR-RT-PMA

Microscopía electrónica de

barrido (SEM)

Microscopía de láser confocal

(CLSM)

Ensayos

DESARROLLO BIOFILM IN VITRO

Crecimiento estático

Se realiza en placas microtiter. Se usan inóculos orales (de

saliva o placa subingival) o una selección de bacterias supra y/o

subgingivales.

Se intentan reflejar condiciones fisiológicas de la boca (pH, Tª,

anaerobiosis).

No se puede recrear el dinamismo característico de la boca:

flujo salival y flujo crevicular al que están sometidas las

bacterias.

Este dinamismo condiciona las propiedades estructurales

del biofilm.

Estudios demuestran que la estructura y propiedades del biofilm

varían dependiendo de si el crecimiento es estático o en flujo

Placa microtiter

DESARROLLO BIOFILM IN VITRO

Crecimiento en flujo

- Modelo de estudio que permite la formación de biofilm oral multiespecie in vitro en

condiciones similares a la realidad, gracias al sistema en flujo

- Crecimiento similar al que obtendríamos en la cavidad bucal

ENSAYOS

Sobre los discos de hidroxiapatita donde está el biofilm

maduro, se realizan distintos ensayos, con el fin de

evaluar su comportamiento.

Estos ensayos fundamentalmente incluyen el uso de

antisépticos, y están orientados a evaluar su eficacia

y/o la resistencia del biofilm

También se realizan ensayos sobre la matriz

extracelular (80% del biofilm), que tiene gran influencia

en propiedades del biofilm como la resistencia a los

antisépticos.

CULTIVOS

Cultivo en placa

- El biofilm maduro y tratado se siembra en medios de cultivo apropiados para su

crecimiento.

- En función de las características metabólicas de las especies, se utilizan diferentes medios

de cultivo.

- Posteriormente, se evalúa la población microbiana que ha crecido (de forma cualitativa y

cuantitativa).

Cámara de anaerobiosis

PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

Son técnicas de extracción de DNA. Con estas técnicas, es

posible amplificar el DNA bacteriano de una muestra:

- PCR: Cualitativa. Detecta DNA mediante señal en gel de

electroforesis

- PCR-RT (PCR en tiempo real): permite cuantificar el

producto de esta amplificación a medida que se va

sintetizando mediante fluorocromos

- PCR-RT-PMA (PCR-RT con propidio de monoazida).

Gracias a la adición del PMA, es posible diferenciar

entre DNA de bacterias vivas y muertas, valorándose así

la eficacia de antisépticos

TÉCNICAS MOLECULARES

Microscopio óptico de láser confocal (CLSM)

• Aumento de la resolución

• Capacidad de penetración en el biofilm

• Obtención de imágenes de secciones ópticas extremadamente finas.

• Se consigue enfoque sobre un único plano.

• Nos permite identificar y cuantificar la población bacteriana viva y muerta:

VALORACIÓN DE EFICACIA DE ANTISÉPTICOS

TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA

Imágenes en un microscopio Óptico de Láser Confocal de un biofilm oral desarrollado in Vitro. En verde se observan los

microorganismos marcados con Syto9 (vivos) y en rojo se observan los microorganismos marcados con Ioduro de Propidio

(muertos).

La imagen de la izquierda corresponde a un control negativo y la de la derecha es la misma población bacteriana tras el

tratamiento con Clorhexidina 0,12% + CPC 0,05% (Perio·Aid Tratamiento)

Imágenes de microscopía de láser confocal

CHX 0,12% + CPC 0,05%

PERIO·AIDControl negativo

Microscopio electrónico de barrido (SEM)

EVALUACIÓN DE RESULTADOS –

TÉCNICAS MICROSCOPÍA

• Aumento de la resolución hasta más de 100.000 veces.

• Haz de electrones (en lugar de haz de luz) que “barre la muestra”, punto por punto de la

muestra.

• Imágenes tridimensionales realistas sobre la superficie de un objeto

• Gran profundidad de campo

• Obtención de imágenes de la estructura del biofilm (morfología bacteriana,

interconexiones, matriz, etc.)

Imágenes de microscopía electrónica de barrido

Diferentes micrografias tomadas con SEM pertenecientes a biofilms orales mono y multiespecie

desarrollados en el laboratorio de microbiologia de Dentaid Research Center.

@Dentaid