ÍndiceIntroducción y Motivación ....................................................................................página 2

1.Marco teórico .....................................................................................................página 3

Base teórica del trabajo ..................................................................................página 4

El ADN ..............................................................................................................página 7

Friederich Miescher........................................................................................página 9

Mendel ..........................................................................................................página 10

Watson y Crick ..............................................................................................página 11

Proyecto genoma humano........................................................................... página 12

Kary Mullis....................................................................................................página 13

Primers o cebadores ......................................................................................página 16

Método PCR de secuenciación ......................................................................página 18

Método Electroforesis ...................................................................................página 19

2.Técnicas............................................................................................................página 20

Extracción de ADN........................................................................................ página 21

Nanodrop......................................................................................................página 23

Electroforesis .................................................................................................página 26

PCR de secuenciación ....................................................................................página 28

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Purificación ....................................................................................................página 30

Secuenciación ...............................................................................................página 31

3.Diario ................................................................................................................página 33

4.Resultados .......................................................................................................página 39

5.Conclusiones ....................................................................................................página 42

6.Agradecimientos ..............................................................................................página 43

7.Bibliografía ......................................................................................................página 44

8. Anexos............................................................................................................página 46

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Introducción y MotivaciónEste trabajo me lo planteó la profesora Neus Peris a la que por cierto estoy muy agradecido, ya que este proyecto se me planteó como un reto y una oportunidad al mismo tiempo. Un reto ya que era introducirme en un mundo desconocido para mí como es el mundo de la biología profesional, y por otro lado una oportunidad de poneren práctica los conocimientos adquiridos hasta la fecha, así como de aprender nuevas técnicas que están a la vanguardia de la comunidad científica. Aunque el mundo de la biología y la ciencia en general ya me llamaba la atención después de este trabajo se reafirma mi idea de querer estudiar algo relacionado. Pese a que este proyecto(desgraciadamente) ya ha acabado, se me antoja como una puerta abierta porla que he descubierto pasión por la bilogía.

Además no solo he aprendido a trabajar en el laboratorio sino que gracias al CRG tuvimos el enorme honor de recibir conferencias sobre los temas candentes de la actualidad biológica, por no hablar de conocí a gente excepcional.

Hablando en más profundidad sobre el trabajo, al principio la idea era hacer el Barcoding partiendo de palitos de surimi, pero después de que desde el CRG me dijeron que no sabían si tenían los primers para ese alimento en particular y después de ponerme en contacto con otras compañeras que lo hacían con palitos de merluza, decidí cambiar yo también a la merluza ya que sí que tenían los primers necesarios para esta muestra y además surgía la posibilidad de poder compartir muestras con las compañeras, cosa que hacía más fácil y probable que los resultados que no saliesen fuesen positivos. De esta manera nos dividimos, y cada uno compró un número de muestras teniendo más variedad y por tanto pudiese hacer más rica la experiencia.

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Base teórica del trabajoMi trabajo consiste en usar el método del Barcoding.

Este método fue inventado por un grupo de investigadores de la universidad de Guelph(Ontario, Canada) en el año 2003.

Barcode en inglés significa código de barras, ya que la base del trabajo es conseguir una secuencia de ADN que pueda ser legible por una maquina llamada secuenciador, i te dé como resultado unos números que corresponden a las bases del material genético y con esos números puedas compararlo con una base de datos y puedas saberde qué especie proviene ese ADN.

El objetivo del proyecto es crear una basede datos on-line con todas las especies,tanto animales como vegetales, conocidaspara tener una referencia y poder recurrir aella en caso de no saber de qué especie setrata o para saber si esa especie ya ha sidodescubierta, también se utiliza para crearárboles filogenéticos.

Un árbol filogenético es un gráfico en forma de árbol en el que se muestran las conexiones evolutivas entre especies que tienen origen común.

Partiendo de una muestra del alimento o ser vivo del que queramos secuenciar su ADNhay que seguir una serie de procesos para llegar a una muestra en forma de gel que introducir en el secuenciador. Lo bueno del método que he utilizado es que con una mínima cantidad de muestra el programa ya puede secuenciar su material genético.

La clave para distinguir una especie animalde otra la hallamos en el ADN mitocondrial,concretamente en el gen COI que es un genque presenta una alta tasa de sustitución,esto implica que exista una gran diferenciade este gen entre especies del mismogénero, concretamente del gen COI se sueleamplificar la subunidad I. Aunque enalgunas especies, como las esponjas o loscnidarios, solo con el gen COI es difícil su identificación dado a la gran tasa de variabilidad de este gen, en la mayoría se puede diferenciar perfectamente una especiede otra.

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El gen COI codifica la síntesis de la proteína "Citocromo c oxidasa" también llamado "Complejo IV", esta es una proteína transmembranosa que se encuentra en la membrana bacteriana y mitocondrial es imprescindible en procesos como la respiración aeróbica, ya que es la encargada de transmitir los electrones obtenidos de la lisis de las glucosas a la molécula de oxígeno y además interviene en la síntesis de ATP. Es absolutamente necesaria para la vida de echo de todas las mutaciones que puede haber en el ADN mitocondrial, las más importantes y perjudiciales son las de el gen COI.

En vegetales es más complicado dado que este gen en no es tan variable en este reino, como consecuencia con el gen COI no podríamos diferenciar una especie de otra, por el contario se utilizan fragmentos de ADN cloroplástico, concretamente se utilizan los genes rbcL y matK ya que existe gran variabilidad interespecífica.

Gracias a estos genes y al barcoding en general, se ha podido descubrir muchas especies y diferenciar dos que se consideraban la misma. Y se está empezando a crear la base de datos de ADN de diferentes especies tanto animales como vegetales, aparte de que ha permitido la creación de infinidad de árboles filogenéticos.

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El ADNADN son las siglas de ácido desoxirribonucleico, es una macromolécula que tienen todos los seres vivos en la cual está escrito el desarrollo y funcionamiento de los mismos. A demás del funcionamiento interno, en él también se encuentran todos los caracteres físicos de un individuo. Ser encuentra en el núcleo de cada célula.

El ADN está formado por cuatro bases: Adenina, Timina, Citosina, Guanina. El orden en que están colocadas estas bases es el que controla el funcionamiento del metabolismo,y este orden se llama secuencia. Aunque gran parte del material genético es idéntico entre especies, hay diferencias que nos permiten distinguir una especie de otra a travésdel ADN. De hecho, en los casos de seres con reproducción sexual hasta se pueden distinguir individuos concretos ya que existen diferencias en su secuencia de bases. Esto explica porque los humanos, por ejemplo, son únicos los unos de los otros.

El material genético se divide en cromosomas, que son la forma en que se ordena y almacena el ADN. Los cromosomas están formado por ADN más unas proteínas llamadas histonas. Las histonas se encargan de que las cromosomas mantengan su estructura. El número de cromosomas varía de una especie a otra, los humanos tenemos 46 (23 pares), gato 38 (19 pares), los gatos 78 (39 pares).

Los cromosomas están divididos en fragmentos que se encargan de un carácter determinado, cada uno de estos fragmentos se llama gen. El gen que determina un carácter determinado se encuentra en la misma parte del cromosoma en todos los seres de la misma especie, pero de un individuo a otro puede cambiar. Por ejemplo, el gen que controla el color del cabello se encuentra en el mismo punto del cromosoma en todos los casos pero el orden en que están colocadas las bases en ese gen determina si esa persona será morena, rubia, pelirroja...

En cada célula tenemos dos cromosomas por cada carácter, uno del padre y uno de la madre. Esto se debe a que aunque normalmente cuando la célula se reproduce hace una copia de sí misma es decir si copia los 23 pares (en el caso humano)mitosis . Pero en el caso de la creación de células sexuales, solo se copia un cromosoma de cada par (meiosis), es decir, la nueva célula tendrá la mitad de cromosomas que una célula de la piel (por ejemplo). De esta manera aunque los espermatozoides y lo óvulos tienen la mitad de cromosomas de su unión saldrán células con una dotación igual de cromosomas que las células de la piel.

Entonces si tenemos dos cromosomas que dan información de los mismos caracteres como se expresan? La respuesta es sencilla, en el caso de que los dos cromosomas den la misma información será esta la que se exprese.

Ejemplo:

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Cromosoma padre, gen color del pelo ------> Negro

Cromosoma madre, gen color de pelo ------> Negro

En el caso de que un gen contradiga al otro, uno de ellos se quedará inactivo, y no expresará su información pero sí que puede ser transmitida a generaciones futuras. Para saber cuál de los dos genes es el se expresará hay que conocer cuál es el dominante.

Ejemplo:

En el caso del color de pelo, el gen dominante es el negro sobre el rubio

Cromosoma padre, gen color del pelo ------> Negro

Cromosoma madre, gen color de pelo ------> Rubio

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Dado que pelo negro es dominante sobre rubio, el gen que indica pelo rubio es el que quedará

inactivo y el que indica pelo negro es el que se expresará.Friederich MiescherLa primera persona en aislar el materialgenético de una célula, en este caso de losleucocitos fue Friederich Mischer, que fue unmédico y biólogo suizo que vivió durante elsiglo XIX. Friederich, empezó asilandoglóbulos blancos a partir del pus, pronto sedio cuenta que al tratar con determinadassubstancias salinas esos leucocitos, obteníauna solución gelatinosa. Posteriormente sepropuso estudiar más a fondo esa solucióndescubrió que esas sustancia conteníanitrógeno y fósforo.

Friederich intuyó que la solución gelatinosaprovenía del núcleo celular, acto seguido sepuso a estudiar esa sustancia pero esta vez enotras células, y la separó en una ácida que llamó nucleína, que actualmente se llama ácido nucleído y otra muy básica a la que llamó protamina que se puede relacionar conlas histonas.

La técnica más generalizada utilizada actualmente para extraer el ADN no difiere mucho de la técnica desarrollada por Friederich.

Antes de nada a la muestra se le añade alguna solución rica en iones sodio o amonio, con esto conseguimos que el ADN se pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble en agua. Se trata de usar primero una solución orgánica (Fenol, cloroformo...) para separarproteínas y lípidos, por el contrario, los grupos fosfatos que forman la membrana se tratan simplemente con agua y centrifugación dado su gran componente hidrófilo, pese a que tenemos la muestra contaminada con algún disolvente orgánico, este se evapora a los pocos minutos, dejando la muestra limpia. A continuación se necesita añadir un poco mas de agua para que el ADN vuelva a su estructura habitual. Como resultado obtenemos la misma substancia gelatinosa que obtuvo Friederich Miescher hace más de 200 años.

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MendelGregor Johan Mendel, fue un naturalista y monje católico de laorden agustina nacido en la actual República Checa en el año1822. Fue un pionero ya que describió a través de variosexperimentos las leyes que rigen la herencia genética.

Mendel era un gran amante de la naturaleza entre otros motivosgracias a que su padre era agricultor y le enseño a hacer injertosy a cultivar en general. Cuando entro en la orden se dedicó atrabajar el huerto y así empezó a experimentar.

Los experimentos consistían en lo siguiente:

Cogió dos variedades de guisantes, una que daba semillas amarillas y otra que daba semillas verdes, a esta generación la llamó generación P (paternal) y cruzó estas variedades. Como resultado toda la siguiente generación llamada F1 (generación filial 1) tenía las semillas amarillas. Después de esto decidió cruzar la primera generación entre si y obtuvo la F2 donde las plantas producían plantas semillas amarillas y verdes en proporción 3-1 (tres amarillas por cada una verde). Repitió este experimento pero esta vez cruzó una variedad de guisantes con la piel rugosa y otra con la piel lisa, como consecuencia, la primera generación salió con la piel lisa. Y la segunda con proporción 3-1 también.

A partir de estos resultados, descubrió que había algunos caracteres dominantes (semillas verdes, piel lisa) que se imponían sobre otros a los que llamó recesivos (semillas verdes, piel rugosa).

Después de repetir sus experimentos formuló 3 leyes:

«Cuando se cruzan dos individuos de raza pura, los híbridos resultantes son todos iguales»

«Ciertos individuos son capaces de transmitir un carácter aunque en ellos no se manifieste»

«Los caracteres se transmiten de forma independiente los unos de los otros»

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Watson y CrickJames Watson es un biólogo que junto a muchaspersonas pero principalmente junto Francis Crickdescubrió la estructura del ADN, juntos y gracias a estedescubrimiento recibieron el premio nobel deMedicina el año 1962.

Watson y Crick buscaban la estructura del ADN que lepermitía a esta molécula almacenar tal cantidad deinformación y sobre todo le permitía reproducirse ytransmitir dicha información, para ello se sirvieron detrabajos previos de otros científicos como MauriceWilkins quien se dedicaba a investigar dicha estructuravaliéndose de técnicas físicas utilizando laspropiedades de los rayos X. Pero lo que les dio la clavepara descubrir la famosa estructura de doble hélice, fue los estudios de Rosalind Franklin quién también utilizaba los rayos X para investigarla, ella se encargaba de hacer fotografías mediante difracción de rayos X, Maurice Wilkins le robó la llamada "fotografía 51" y fue a través de ella que Watson y Crick descubrieron la verdadera estructura de la molécula de ADN.

A parte de la estructura en doble hélice descubrieron que el ADN estaba compuesto por Aenina, Guanina, Citosina y Timina y el hecho de que estas bases se emparejaban de forma adenina con timina y citosina con guanina. También formularon la idea de la replicación del ADN y de que las cadenas estaban colocadas de forma antiparalela.

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Proyecto genoma humanoEl proyecto genoma humano, fue una investigación llevada a cabo por los institutos nacionales de salud de Estados Unidos pero que contaba con la colaboración de científicos de diferentes países entre ellos España, comandada por el científico Francis Collins y que supuso una inversión de 3000 millones dedolares por parte de los EstadosUnidos, el proyecto comenzó en 1990 y tenía como plazo 15 años para descifrar el mapa completo de los cromosomas humanos, lo que incluía secuenciar el ADN, es decir reconocer cada una de las bases y saber el orden en que están colocadas y localizar los genes humanos en los 23 cromosomas .La investigación finalizó en 2003, 2 años antes de la fecha prevista. Las investigaciones se hicieron a partir de muestras de semen y sangre de donantes que por supuesto permanecieron anónimos.

Para llevar a cabo tal estudio se utilizaron tres técnicas principalmente:

Ligamiento: Se trata de estudiar la posición de los marcadores genéticos, para poder determinar el orden en que están colocados los genes en el ADN, fue una técnica que empezó a idearse a mediados del siglo XX pero que se desarrolló muchísimo gracias a este proyecto.

Cartografía Física: Una técnica que combina tanto robótica como laser para calcular exactamente la distancia entre dos puntos del ADN, tomando como punto inicial un marcador de gen.

Secuenciación Sanger: Se trata de hacer que los nucleótidos sean fluorescentes para así poder determinar el orden en que están colocados estos mismos. Frederick Sanger recibió el premio Nobel por este método en el año 1975.

El genoma humano son los 23 pares de cromosomas (22 pares de autosomas y 1 par deheterocromosomas o cromosomas sexuales). El genoma humano a su vez está compuesto por unos 25000 genes distintos repartidos en los cromosomas, cada unos de estos genes codifica una proteína concreta, el objetivo era saber ubicar cada uno de estos genes en los cromosomas. En el año 2000 se publicó un borrador y finalmente en2003 se publico el mapa completo y se dio por concluido el proyecto, gracias al proyecto genoma humano se ha conseguido diagnosticar algunas de las enfermedades hereditarias tales como: enfermedad de Gaucher, Alzheimer, enfermedad de Huntington, síndrome de Marfan.

Gracias a este proyecto no solo se ha podido tratar mejor a los pacientes de enfermedades hereditarias, sino que ha permitido numerosas investigaciones sobre la evolución, diferencias entre etnias y clonación.

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Kary Mullis PCR son las siglas de (polymerase chain reaction) quesignifica en ingles reacción en cadena de la polimerasa. Esuna técnica creada por Kary Mullis en 1968.

Kary Mullis nació en Columbia (Carolina del Sur), estudióquímica y en 1977 se trasladó a Kansas donde en 1985desarrolló la técnica del PCR que es una técnica que consisteen amplifica un fragmento de ADN. La idea se le ocurrió dosaños antes pero sus colegas de trabajo no la vieron viable,así que el solo se puso a trabajar en ello desde 1983 a 1985.La idea inicial era poco efectiva dado que la polimerasa alser una proteína se desnaturalizaba a ciertas temperaturas.

Por eso en 1985 Mullis cambió la polimerasa que se usabaen ese momento (extraída del E. coli) por una termoestableextraída de la bacteria Thermus Aquaticus (simplificadacomo Taq) esta nueva polimerasa dada su estructurafuncionaba a la perfección a unos 72 ºC pudiendo actuar a casi 100 ºC.

Cuando publicó este avance, la opinión pública hizo eco de este descubrimiento y posteriormente en el año 1993 le galardonaron con el premio nobel de química y con el premio Japón. Posteriormente vendió la patente a una empresa por valor de 300.000.000$.

Como dato anecdótico se podría decir que la novela Jurassic Park de Michael Crichtonsen 1990 y posteriormente la película del mismo nombre dirigida por Steven Spielberg en 1993, no tendrían ningún sentido ni validez científica ya que a partir de pequeños fragmentos de ADN se consigue una cadena de ADN entera.

La técnica que utilizamos para el Barcoding no difiere en nada de la creada por Kary Mullis en 1985, consiste en lo siguiente:

Introducir en un recipiente para PCR: tu muestra (actuará como molde para crear las copias y amplificarlo),2 cebadores o primers (uno para la cadena 5 -->3 y otro para la 5-->3 ) que actúen como enganche a la hora de crear las copias, iones magnesio y cloro para que actúen como cofactores de la polimerasa, nucleótidos para formar las cadenas, polimerasa Taq o similares con temperatura optima alrededor de 70 ºC y por último una solución tampón para mantener el Ph estable.

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Una vez se haya introducido estos elementos en un recipiente, se colocan en la máquina de PCR, que es una máquina que mantiene la sustancia en movimiento constante y hace variar la temperatura.

El ciclo de cambios de temperatura es el siguiente:

1) 94-96 ºC durante 9 minutos.

2) 96-98 ºC durante 20-30 segundos.

3) 50-65ºC durante 40-50 segundos.

4) 72 ºC durante 4-5 minutos.

5) 75 ºC durante 5-10 minutos

6) Para mantener la muestra en óptimas condiciones hasta un año conservar a 4 ºC

La explicación para cada paso es la siguiente:

1) El primer paso sirve para activar la polimerasa, de esta manera puede empezar a funcionar, solo hace falta hacer este paso si se trata de polimerasa termoestable extrema.

2) El segundo paso consiste en aumentar la temperatura para desnaturalizar la molécula de ADN, de esta manera las dos cadenas se separan rompiendo los puentes de hidrógeno entre ellas.

3) En esta temperatura los primers o cebadores se unen a cada una de las cadenas paraempezar a crear cada una de las hebras de ADN. A partir de estos fragmentos de ADN preexistentes se pueden empezar a unir las bases complementarias a cada cadena.

4) 72 ºC es la temperatura ideal a la que trabaja la polimerasa Taq, que es la más utilizada, si por el contrario se usa otro tipo de polimerasa, es probable que varíe un poco pero no suelen diferir demasiado.

5) En esta fase se consigue completar las posibles cadenas que hayan quedado incompletas, esta fase se utiliza para asegurarnos que todas las cadenas se completan al 100%

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6) Esta fase es la de conservación, sirve para que las fibras se mantengan en perfectas condiciones para ser analizadas en el caso de que no se vayan a analizar en un periodo menor a 24 horas.

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Primers o cebadores

Un primer es una secuencia de nucleótidos más o menos corta que se introduce en la mezcla, junto a tu muestra con tal de conseguir que, en la PCR, se una a cada una de lashebras y así la polimerasa se adhiera a la cadena de forma más sencilla con tal de hacermás efectivo este proceso. Se necesitan ciertos primers dependiendo de si la muestra es animal, vegetal, y en el caso de que sea animal si corresponde a carne, pescado...

Dado que el ADN está formado por 2 cadenas, necesitas primers diferentes dependiendo de la cadena a la que hagas referencia, por este motivo cuando hablemosde la mezcla de primers, hablaremos de: Mezcla de Primers F (Forward), y, Mezcla de primers R (Reverse).

Como ya hemos mencionado anteriormente se necesitan diferentes tipos de primers dependiendo de la naturaleza (pez, bacteria, insecto...) de tu muestra, estos primers son el inicio de la parte del gen que queremos amplificar, y son conocidas. De todas maneras, pese a ser conocidas puede haber pequeñas variaciones, por ello a la hora dehacer el PCR, se suelen introducir por lo menos 2 primers F y 2 primers R, como consecuencia la efectividad aumenta.

En mi caso ya que las muestras eran de origen animal, más específicamente de pez, introducimos dos primers de cada, cada uno contenía una secuencia de más o menos 40 nucleótidos.

Los primers introducidos fueron:

Forward:

VF2_t1 TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC

FishF2_t1 TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC

Reverse:

FishR2_t1 CAGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA

FR1d_t1 CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA

Para consultar los diferentes primers que se pueden usar en los casos de que la muestra no sea un pez, añado en los anexos una página donde se puede observar los primers adecuados para cada caso en particular.

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Método PCR de secuenciaciónCon este método conseguimos que se queden marcados los nucleótidos de forma fluorescente.

Consiste en que además de nucleótidos para hacer una amplificación introducimos dinucleótidos (ddAdenina, ddCitosina, ddGuanina, ddTimina). Los dinucleótidos se colocan en el lugar que debería ocupar su nucleótido homólogo pero no permiten que se una otro nucleótido a su lado por tanto funcionan como un terminal, además tienenla peculiaridad de reaccionar con fluorescencia a determinados colores. Por tanto con este protocolo obtenemos muchas cadenas con terminales en diferentes puntos, ordenándolos por tamaño y provocando esa reacción de fluorescencia podemos determinar todas las bases de la cadena de ADN.

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Método ElectroforesisLa electroforesis es una técnica que consigue separar las moléculas de una muestra según su movilidad en un campo eléctrico la separación se puede hacer en un medio sólido aunque normalmente se utiliza un gel. En el caso de utilizar un gel se suele utilizar uno hecho a base de agarosa.

Aunque normalmente se utiliza para material genético (ADN,ARN) también se puede utilizar con proteínas y ácidos nucleídos. Dado que el ADN tiene una carga negativa provocada por los grupos fosfatos, tenderá a ir hacia el polo positivo atravesando la redde fibras tridimensional (gel), esto implica que las moléculas más grandes tienden a ir más lentas dado que el gel les ofrece una resistencia mayor a su avance, en cambio las más ligeras y pequeñas suelen avanzar más rápido y llegar más lejos ya que no encuentran tanta resistencia por parte del gel.

En el caso del ADN hay que teñir la muestra para poder comprobar el resultado, para ello se utiliza Bromuro de etidio (C21H20Br N3 ) o en su defecto Syber Safe. Con estos dos reactivos hay que extremar las precauciones ya que son altamente cancerígenos por ello hemos de utilizar guantes de seguridad, que son más gruesos para que no se pueda colar nada del liquido en las manos.

También hay que tener cuidado de dejar las ranuras abiertas para poder depositar en su interior las muestras y desde allí empiecen a fluir del cátodo al ánodo ya que el gel tiende a cubrirlos. También es importante dejar que el gel solidifique al aire libre o en el caso de que lo pongamos en la nevera vigilarlo cada poco tiempo ya que es muy fácilque se congele y si eso sucede es inservible.

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Extracción de ADN

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Lisis celular

Consiste en romper la membrana celular con tal de conseguir la liberación del material genético, para poder llevar a cabo este proceso es necesario romper la membrana de fosfolípidos que tienen todas las células.

Hay diferentes tipos de lisis:

-Por congelación

-Homogenitzación líquida

-Sonificación (con ultrasonidos)

-Utilizando detergentes

Nosotros utilizaremos un kit con algunos buffers (soluciones) con tal de romper la membrana, por lo tanto llevaremos a cabo una extracción química.

Con tal de mantener en secreto la formula de algunas soluciones las propias empresas no escriben su receta por lo tanto vamos a llamar a las soluciones con siglas.

Protocolo

Antes de empezar:

Todos los pasos se llevaran a cabo a temperatura ambiente (15-25 ºC)a no ser que se indique lo contrario.

Asegurarse que los Buffers AW1 i AW2 han sido mezclados con etanol.

Si tu muestra está congelada equilibrar su temperatura con la de la habitación.

Procedimiento:

Con la ayuda de unas tijeras o un bisturí y una balanza, cortar de 25 a 10 mg de tu muestra i meterlo en un tubo de micro centrifugación de 1,5 ml de capacidad, y acto seguido triturarlos con varillas de PVC (escogemos el PVC ya que la muestra de alimento no se quedará adherida).

Añade 20 microlitros de proteinasa K (uno de los buffers utilizado para romper las proteínas). Mezclar con un vortex y dejarlo incubar a 56ºC hasta que las proteínas estén completamente disueltas.

Mezclar en el vortex durante 15 s. Añadir 200 microlitros de buffer AL a la muestra. mezclar en el vortex y añadir 200 microlitros de etanol 96 -100% y volver a mezclar.

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Pipetear la solución obtenida en un tubo con filtro, centrifugar a 8000 rpm durante 1 minuto. Conservar el filtro y desechar el tubo.

Introducir el filtro en un nuevo tubo y añadir 500 microlitros de Buffer AW1, acto seguido mezclar a 8000 rpm durante un minuto, descartar el tubo y añadir el filtro a otro tubo.

Añadir 500 microlitros de Buffer AW2. Centrifugar durante 3 minutos a 14000rpm desechar tubo y transferir el filtro a un nuevo tubo, añadir 200 microlitros de Buffer AEincubar durante 1 minuto a temperatura ambiente y centrifugar durante un minuto a 6000 rpm (repetir este paso para mayor posibilidades de éxito)

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NanodropEl nanodrop es una máquina que sirve para calcular la concentración de ADN que tienes en tu muestra. Sirve como un método de control para saber si la extracción de ADN ha ido bien.

Funciona de la siguiente manera:

Abres la maquina y metes un microlitro de el último buffer que utilizaste en la muestra (que actuará como control), después de limpiar el buffer de la máquina, introduces tu muestra y en la pantalla te sale un gráfico. Como el que muestro a continuación, en el que claramente se ve como se separan los componentes de la muestra por peso, el ADN se encuentra alrededor de 260 ng.

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PCR

El PCR (Polymerase Chain Reaction, o Reacción en Cadena de la Polimerasa) es un proceso por el cual consigues crear más copias de la cadena de ADN.

Este proceso funciona de la siguiente manera

En un tubo especial llamado tubo de PCR introducimos:

(Todo el proceso que vamos a llevar a cabo debe ser mezclado "on ice" (en hielo) para mantener la temperatura y así poder llevar a cabo el experimento)

4 microlitros de agua

2'5 microlitros de un buffer Ph

1 microlitro de sal (MgCl)

0'5 microlitros de la mezcla de primers forward

0'5 microlitros de la mezcla de primers reverse

1 microlitro de polimerasa

2 microlitros de tu muestra de ADN

1 microlitro de Nucleótidos (A,G,C,T)

Una vez has metido todo esto en un tubo de PCR toca introducir el programa en una maquina especial para hacer el PCR que básicamente es una máquina que varía su temperatura según el programa seleccionado, de esta manera consigues diferentes efectos en la cadena de ADN como desnaturalizar el ADN, permitir el funcionamiento

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de la polimerasa, renaturalizar la cadena de ADN o mantenerlo para que no se estropee.

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ElectroforesisLa electroforesis es un proceso por el cual se puede comprobar si la cadena de ADN ha creado el suficiente número de copias en el PCR, para comprobarlo vamos a poner 1 microlitro de cada muestra en un gel que habremos de hacer, junto a las muestras pondremos también un Buffer que servirá como regla para medir de que tamaño tenemos los fragmentos de ADN .

Una vez tienes las muestras en el gel hay que añadir un tinte(bromuro de etidio) que sirve para responder a la luz ultravioleta, y acto seguido aplicamos una corriente eléctrica, como la secuencia de ADN tiene una carga negativa al aplicarle corriente consigues que los trozos que se han creado en la PCR se vayan deslizando por el gel, losmás ligeros por lo tanto pequeños se desplazan más lejos, en cambio los más grandes se quedaran cerca. Nos interesa que los fragmentos sean de por lo menos 600 nucleótidos y con la regla lo podemos comprobar.

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Es importante tener extremada precaución a la hora de utilizar el bromuro de etidio ya que es altamente cancerígeno.

Para hacer el gel:

1.- Necesitamos 10 ml de TAE ( el TAE es una solución tampón que contiene una mezclade Tris base , ácido acético y EDTA . Una solución tampón es la mezcla de un ácido y una base. Sirve para mantener constante el Ph del gel).

2.- Añadir 100 ml de agua destilada a los 10 ml de TAE.

3.- Introducir 1g de Agar (el Agar es un espesante natural para transformar el líquido engel).

4.-Mezclar y meter en el microondas 1'30 minutos.

5.-Introducir en la cubeta de Electroforesis.

6.- Dejar enfriar a temperatura ambiente.

7.- Teñir la mezcla con SYBR Safe.

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PCR de secuenciación

En esta imagen podemos ver que la ddC reacciona con color azul, la ddT con rojo, la ddG con negro y la ddA con verde.

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Elementos necesarios:

Big dye ----------------------------------2.0 microlitros

Buffer secuenciador de ADN------1 microlitro

Primers---------------------------------3.2 pmol

Muestra------------------------------- Mirar tabla de referencia

DMSO (opcional)--------------------5%-7% total

ddH2O--------------------------------- Enrasar hasta 10 microlitros

Después de introducir todos los elementos en el eppendorf de PCR hay que introducirlo en la máquina de PCR con una programación específica

Programación de la PCR:

94ºC 3 min96ºC 10 seg

25 ciclos50ºC 5 seg60ºC 4 min

4ºC --- ---

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Como podemos ver esta PCR difiere mucho en la que hemos hecho al inicio de la extracción ya que en este caso el objetivo no es obtener el máximo número posible sino que es el de hacer pocas copias pero de mejor calidad, y a la vez optimizar recursos dado que la mayoría de elementos que estamos utilizando son muy costosos, por lo tanto gastamos menos cantidad de cada uno de los distintos ingredientes, afortunadamente el método de secuenciación que vamos a utilizar (método Sanger) consigue analizar ADN a partir de muy poca cantidad de la muestra, por eso para reducir costes las empresas suelen poner estas cantidades mínimas.

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Purificación del PCR de secuenciaciónNo podemos introducir la muestra que sale del PCR directamente al Secuenciador, antes de hacerlo hay que purificarla.

1. Añadir 5 volúmenes de Buffer PB por cada 1 de muestra que tengas.

2. Introducir la muestra en un tubo con filtro, i centrifugar durante 30-60 segundos.

3. Desechar el tubo i introducir el filtro en otro tubo.

4. Añadir 0,75 microlitros de Buffer PE y 0,4 microlitros de alcohol 96-100% y centrifugar durante 30-60 segundos.

5. Desechar el tubo y introducir el filtro en otro tubo, acto seguido centrifugar 1 minutoadicional.

6. Colocar el filtro en otro tubo y añadir 50 microlitros de Buffer EB y después de dejarlo 1 minuto en reposo, centrifugar durante 1 minuto. El Buffer EB lo que hace es que las cadenas de ADN con los ddNucleótidos terminales se desenganchen del filtro, provocando que precipiten al fondo del tubo.

7. Añadir un volumen de Loading Dye por cada 5 volúmenes de la muestra, mezclar la solución.

Como sustancia final tendremos un gel blanquecino precipitado en el fondo del tubo. Esta muestra ya puede ser llevada al secuenciador para ser analizada, es importante rotular cada muestra para evitar que se pierdan o se confundan.

ddNucleótidos

Muestra purificada

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SecuenciaciónEl secuenciador es una máquina capaz de leer la muestra y traducirla a un lenguaje capaz de ser leído y comparado, en el este caso nosotros usamos el secuenciador Sanger, ya que es el que se utiliza para leer la fluorescencia.

Antes de nada el secuenciador necesita ordenar las cadenas de ADN por tamaño, básicamente utiliza una sistema muy parecido al del gel de electroforesis, es decir, crear una corriente eléctrica (de polo negativo a positivo) provocando que las cadenas de ADN se dispersen por el gel, los más ligeros o sea los más pequeños se deslizan más lejos, en cambio los más pesados por lo tanto los grandes se quedan más cerca, de estamanera colocamos de forma descendiente la cadena de ADN (X nucleótidos, X-1 nucleótidos, X-2 nucleótidos...), la diferencia con el gel de electroforesis es que, el recorrido que ha de hacer la cadena de ADN es más largo por lo tanto la distancia entrelas diferentes copias del ADN (de diferente tamaño) quedan más esparcidas y es posible diferenciar una de otra.

Una vez tenemos cada cadena distanciada una de la otra y en orden, la maquina va mirando con que color responde el ddNucleótido terminal de cada cadena, y va creando una gráfica marcando el color con el que reacciona y por tanto cual es ese nucleótido. Dado que hemos creado gran cantidad de copias y dado que cada una es de diferente tamaño pero todas son la misma cadena podemos ir reconstruyendo la secuencia entera mirando cual es el último nucleótido de cada cadena.

Este es el ejemplo de cómo queda una gráfica de Sanger, esta en concreto es una gráfica perfecta, sin ruido de fondo ni confusión de bases.

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Habitualmente las gráficas quedan más parecido a esto, no queda tan claro como la de antes y hay ruido de fondo.

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Este es un secuenciador Sanger, para funcionar necesita un ordenador con el programa indicado para poder elaborar los gráficos

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Día 1El primer día nada más llegar y conocer a los compañeros de laboratorio, que hacían unTrabajo de investigación igual que el mío pero con diferentes alimentos, tuvimos el gusto de conocer a Annick, la persona que nos supervisaría en el laboratorio, acto seguido subimos al laboratorio y empezamos a familiarizarnos con las herramientas que íbamos a usar.

Posteriormente nos dijeron las normas que debíamos cumplir dentro, no solo del laboratorio, sino que de todo el recinto del CRG, una vez en el laboratorio hicimos un simulacro y practicamos el plan de evacuación.

Después de todo esto nos asignaron unas batas y dedicamos el primer día a practicar con las micropipetas ya que es, de lejos, el material que más utilizamos, esto sirvió parafamiliarizarnos con la rutina que íbamos a tener durante esos días y aprendimos que hay diferentes micropipetas para diferentes cantidades y que es necesario cambiar la punta cada vez que se use ya que por el contario la muestra se puede ver contaminada.Nos enseñaron básicamente que pulsando hasta la mitad se hace el vacio, luego la introduces en el líquido deseado, dejas de pulsar y el liquido sube, después lo colocas en el sitio donde lo quieras depositar y pulsas completamente para dejarlo.

Los días previos a empezar yo me había puesto en contacto con otras dos compañeras de laboratorio (que trabajaban juntas) y hacían el experimento con barritas de merluza como yo así que decidimos repartirnos la compra de muestras para así tener más muestras con las que trabajar.

Decidimos usar:

DIA

Eroski

Pescanova

Pescanova Kids

Bon Area

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Día 2El día 2 empezamos la extracción propiamente dicha, es importante cortar el palito endos y sacar la muestra de la parte de dentro intentando retirar el máximo número de posibles agentes contaminantes (pan rallado, papel...). Después de esto, hicimos la mezcla siguiendo el protocolo, cortando la muestra, triturándola, añadiendo proteinasaK y lo dejamos incubar a 56 ºC durante 2 horas en las cuales apuntamos todo lo que habíamos hecho.

Una vez pasado este período de tiempo, añadimos el Buffer AL, centrifugamos, introducimos el Buffer AW1, centrifugamos, y añadimos el Buffer AW2 antes de volver a centrifugar. Por último introdujimos el Buffer AE y lo dejamos reposar para posteriormente volver a centrifugarlo.

Antes de acabar el día nos dirigimos al nanodrop para comprobar que todo había salidobien, desgraciadamente nos salieron resultados pésimos, inservibles. Por lo tanto aunque estaba fuera de hora, después de comer y en vez de ir a la conferencia propuesta por el CRG, volví al laboratorio a repetir el proceso pero esta vez dejándolo incubar toda la noche y esta vez aumentando la cantidad de proteinasa K a 250 microlitros puesto que el nanodrop salía sucio, lleno de proteínas.

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Día 3 El tercer día nada más llegar acabamos el procedimiento de la extracción de ADN, y fuimos a comprobar los resultados, antes de ir ya nos anunciaron que l proceso que estábamos llevando a cabo era mucho más difícil si se intentaba con alimentos congelados como era el caso.

Los resultados se consideraban correctos y se podía seguir el proceso si la muestra superaba un mínimo de nanogramos por microlitro. Los resultados fueron los siguientes.

DIA= 6'2

Eroski=10'7

Pescanova=5'8

Pescanova kids=5'7

Bona area=11'6

Todos los nanodrops salieron muy limpios lo que permitía que los resultados pudiesen ser utilizables a partir de 10'0 ng/microlitro.

Después de esto teníamos que hacer la PCR, pero había un problema ya que se habían perdido los manuales de instrucciones para usar cualquiera de las dos máquinas de PCR (modelos diferentes, con diferente funcionamiento) de las que disponíamos en el laboratorio, yo me ofrecí voluntario para intentar entender el funcionamiento y programarlas mientras mis compañeras preparaban las muestras. Después de media hora conseguí entender la primera de ellas y la programé, acto seguido todos los compañeros del laboratorio que necesitaban hacer un PCR introdujeron sus muestras por desgracia no cabían todas así que me apresure y conseguir programar la otra, con lo que todos pudimos hacer el PCR.

La PCR tarda unas dos horas en hacerse, por lo que intentamos hacer la extracción de ADN otra vez con las mismas muestras, repitiendo el proceso. Cuando acabó el PCR, dejamos la muestras a 4ºC para preservarlas en óptimas condiciones hasta el día siguiente y dejamos la otra tanda incubando toda la noche.

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Día 4El penúltimo día comenzó trabajando con dos tandas de muestras, por un lado teníamos que hacer la electroforesis con las muestras de la PCR y por el otro la segunda tanda de secuenciación de ADN.

Las muestras de la extracción las preparamos igual que las anteriores y las introducimos en el PCR para que se ampliase y multiplicase.

Para hacer la electroforesis nos dividimos en dos grupos, unos prepararían la muestra con el tinte y otros se encargarían de hacer el gel de agarosa. En este procedimiento es necesario extremar las precauciones puesto que el tinte es altamente cancerígeno. Por ello en vez de usar los guantes de látex habituales usamos unos mucho más gruesos, y intentamos manejar esa sustancia el menor rato posible.

Para hacer el gel no era necesario extremar tanto las precauciones, aún así dado que necesitábamos elevar el gel de agarosa a temperaturas elevadas también utilizamos unos guantes aislantes especiales.

Después de poner el gel (aún en estado líquido) en la cubeta hemos de dejarlo enfriar, nosotros para agilizar el proceso lo metimos en el congelador, pero desgraciadamente se nos olvidó y se congelo por lo que quedó inservible, así que hicimos una segunda vez el gel y esta vez lo sacamos del congelador a tiempo pero se nos rompió a la hora de meter las muestras, así que preparamos un tercer gel, esta vez sí que lo preparamosbien, pero a la hora de hacer las pruebas para ver si el ADN se había duplicado nos dieron negativas, pero no solo a nosotros sino que a todas los compañeros del laboratorio, en vista de estos resultados nos reunimos y comparamos los procedimientos para encontrar el posible error, después de mucho mirar descubrimos que habíamos confundido una etiqueta y en vez de introducir un coctel de nucleótidos en la PCR tan solo habíamos metido Timina con lo que era imposible que las cadenas de ADN se pudiesen copiar.

Visto que habíamos echado a perder 3 días y medio de trabajo y que en las muestras que habíamos metido recientemente en el PCR también tenían este mismo problema. Nos pusimos manos a la obra para repetir todo lo hecho hasta ese momento para que al día siguiente a última hora pudiésemos enviar las muestras a secuenciar. Antes de irnos a comer hicimos la extracción de ADN (por tercera vez) y después de comer, y porsegunda vez en esa semana nos perdimos la conferencia y subimos al laboratorio a seguir con los protocolos, una vez hecha la extracción, preparamos la muestra (esta vezbien) para introducirla en el PCR y la dejamos congelada hasta el día siguiente.

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Día 5El último día llegamos al laboratorio conscientes de lo delicado de la situación puesto que en pocas horas teníamos que hacer mucho trabajo. Sacamos la muestra de la PCR, hicimos el gel y comprobamos que(esta vez sí) obteníamos resultado positivo, así que nos preparamos para hacer la preparación de la última parte del proceso y la más difícil: La segunda PCR, la PCR de secuenciación.

Ya que la programación de la primera PCR había salido bien me encargué de programarla segunda, después de programarla, esta vez bastante más rápido que la primera, estuve preparando las muestras para introducirlas en la PCR, para tener más posibilidades dividimos las muestras por la mitad y hicimos el proceso dos veces y por separado, una por cada mitad, una vez hecho esto tuvimos que esperar unas horas másy mientras la primera PCR se hacía, cuando acabó purificamos estas muestras recién salidas de la PCR y pusimos la segunda tanda dentro de la máquina. Cuando acabamos de purificar la primera tanda (la primera mitad) esperamos a que acabara la segunda tanda de PCR y también la purificamos. una vez hecho esto, etiquetamos cada una de las muestras y las enviamos al secuenciador, donde un técnico especializado se encargaría de llevar a cabo la secuenciación.

Nos dijeron que nos enviarían los resultados por email unas 48 horas después y que a las personas que no les había dado resultado positivo podrían volver al laboratorio dos días más para intentar repetirlo y que esta vez les saliera bien.

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ResultadosDe las 8 muestras enviadas, nos dio resultado positivo en 5 casos, y de esos 5 casos encontramos coincidencia en 3. Para encontrar coincidencias comparamos la secuenciaque se nos envió por email después de secuenciar, ya traducida a las bases nitrogenadas (A,T,G,C), con una base de datos online llamada "BOLD system". A continuación escribire las 3 muestras que han tenido concordancia, el porcentaje de concordancia con esa especie y el fragmento de ADN (del gen COI) conseguido y comparado, acompañado de una foto de la especie de merluza en cuestión.

MUESTRA EROSKI

Nombre científico: Merluccius Australis

Nombre común: Merluza Austral

Reproducción: Entre Agosto y Septiembre

Alimentación: Calamares, bacaladilla, bacalaos.

Profundidad: Viven entre los 30 y los 1000m.

Medida: entre 80-150cm.

Localización: Uruguay, Argentina, Chile, Australia y Nueva Zelanda.

Concordancia de la muestra con el modelo de ADN: 99'2%

Muestra obtenida:

"TGTCTGATCGGCACTGTAGGTTTTTTCTGCCCCCCCAAAGGGGCAAAATTTTTTTGGGGGGGGGGTATGCAAAAAAGGCTAGCGATGGAGTCGCACCTAAAAATAACGAAATCGTCACGGCCACGCCTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCGTTAATAATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTCGTCCCCCTAATGATCGGAGCCCCCGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAACATAAGCTTCTGGCTTCTCCCTCCATCTTTCCTGCTCCTCCTAGCATCTTCCGGGGTAGAAGCCGGGGCCGGCACAGGTTGAACAGTTTACCCCCCTCTTGCAAGCAATCTTGCCCACGCTGGCCCCAGCGTGGACCTCACTATTTTCTCACTTCACTTAGCTTGCATTTTCTCAATTCTGGGAGCAATTAATTTCATTACTACTATTATTAATATAAAGCCCCCTGCAATCTCACAATACCAGACACCCCTCTTTGTTTGATCCGTCCTTATTACAGCCGTCCTTCTCCTACTCTCCCTGCCCGTCTTGGCCGCCGGCATCACAATACTGCTAACTGACCGAAACCTCAACACCTCCTTCTTTGACCCCGCCGGAGGGGGAGACCCCATCCTATACCAACACTTATTCTGATTCTTCGGTCACCCTGAACTGTAATACCTGTTTACCTGACA"

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MUESTRA PESCANOVA KIDS

Nombre científico: Merluccius Paradoxus

Nombre común: Merluza de altura del Cabo

Reproducción: Entre septiembre y noviembre.

Alimentación: Calamares, y pequeñoscrustáceos.

Profundidad: Viven entre los 200 y los 800 m .

Medida: Entre50 y 80 cm.

Localización: Costas del sur de África.

Concordancia de la muestra con el modelo de ADN: 99'6%

Muestra obtenida:

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"CCCCTGGATTCGGCACTGTAGGTTTTTTTTGCCCCCCCAGGGGGGAAAATGGTTTCTGGGGGGGGGGACTGACTTAAAAATTAACACGGCCGTCGGCACCCTAAAATACAACGTGATCGTCACGGCACACGCCTTCGTAATAATCTTCTTTATAGTAATACCACTAATAATTGGAGGCTTTGGAAACTGGCTCGTCCCCCTAATGATTGGGGCCCCCGACATAGCCTTCCCCCGAATAAATAACATAAGCTTCTGGCTTCTCCCTCCGTCTTTCCTGCTCCTCCTAGCATCTTCTGGGGTAGAAGCCGGGGCCGGGACAGGCTGAACAGTCTATCCCCCTCTTGCAAGCAATCTTGCCCACGCTGGCGCCTCCGTTGACCTCACCATCTTCTCACTCCACCTAGCAGGTGTTTCATCAATTCTAGGGGCAATTAATTTTATTACTACTATTATCAACATAAAACCCCCTGCAATCTCACAGTACCAAACACCCCTCTTTGTTTGGTCCGTCCTTATTACAGCCGTCCTGCTACTGCTATCTCTGCCCGTCTTGGCCGCCGGCATCACAATGCTATTAACTGACCGAAACCTCAACACCTCTTTCTTTGACCCCGCCGGAGGGGGAGACCCAATCCTATACCAACACTTGTTC

TGATTCTTCGGTCACCCTGAAGTGTCATAGCTGTTTCCTAA"MUESTRA DIA

Nombre científico: Merluccius Paradoxus

Nombre común: Merluza de altura del Cabo

Reproducción: Entre septiembre y noviembre.

Alimentación: Calamares, y pequeños crustáceos.

Profundidad: Viven entre los 200 y los 800 m .

Medida: Entre50 y 80 cm.

Localización: Costas del sur de África.

Concordancia de la muestra con el modelo de ADN: 99'28%

Muestra obtenida:

"CCCCTGGATTCGGCACTGTAGGTTTTTTTTGCCCCCCCAGGGGGGAAAATGGTTTCTGGGGGGGGGGACTGACTTAAAAATTAACACGGCCGTCGGCACCCTAAAATACAACGTGATCGTCACGGCACACGCCTTCGTAATAATCTTCTTTATAGTAATACCACTAATAATTGGAGGCTTTGGAAACTGGCTCGTCCCCCTAATGATTGGGGCCCCCGACATAGCCTTCCCCCGAATAAATAACATAAGCTTCTGGCTTCTCCCTCCGTCTTTCCTGCTCCTCCTAGCATCTTCTGGGGTAGAAGCCGGGGCCGGGACAGGCTGAACAGTCTATCCCCCTCTTGCAAGCAATCCTGCCCACGCTGGCGCCTCCGTTGACCTCACCATCTTCTCACTCCACCTAGCAGGTGTTTCATCAATTCTAGGGGCAATTAATTTTATTACTACTATTATCAACATAAAACCCCCTGCAATCTCACAGTACCAAACACCCCTCTTTGTTTGGTCCGTCCTTATTACAGCCGTCCTGCTACTGCTATCTCTGCCCGTCTTGGCCGCCGGCATCACAATGCTATTAACTGACCGAAACCTCAACACCTCTTTCGTTGACCCCGCCGGAGGGGGAGACCCAATCCTATACCAACACTTGTTCTGATTCTTCGGTCACCCTGAAGTGTCATAGCTGTTTCCTAA"

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ConclusionesComo conclusiones de este trabajo podemos sacar que aparte de haber conseguido reconocer con éxito 3 especies de merluza en 3 marcas diferentes de palitos, podemos decir a demás que he aprendido a trabajar en un laboratorio con el ambiente habitual de una investigación científica, a demás gracias a los errores que hemos cometido en diferentes etapas del Barcoding, y que se han visto plasmados en mi diario he podido entender que en la ciencia, muchas veces no consigues resultados positivos pero hay que seguir intentándolo hasta conseguir el resultado deseado o en su defecto, sacar conclusiones del porqué de esos resultados negativos.

Como se ha podido observar en mi trabajo, de las 8 muestras que enviamos solo hemos podido obtener resultado positivo en 3 de ellas, y de las 5 que no hemos podidoobtener, se pueden separar en dos grupos :

1. ADN no extraido. Es el caso de 3 de las muestras enviadas, en este caso las muestras enviadas a secuenciar NO CONTENIAN ADN. Muy probablemente el error en este caso este en la PCR ya que significa que no se han podido hacer las copias del ADN modelo.

2. ADN sin concordancia en la base de datos. Es el caso de 2 de las muestras. Aquí sí que la muestra contenía ADN pero no concordaba con ningún animal registrado en la base de datos BOLD system. Esto puede deberse a que esa especie en concreto no haya sido secuenciada o a errores a la hora de purificar el PCR. Personalmente considero que es más probable el segundo caso.

Pese a todo y teniendo en cuenta que extraer ADN de productos congelados es sumamente difícil, y contando con la multitud de problemas que han ido apareciendo, considero que conseguir reconocer especies de merluza en 3 muestras es un resultado altamente satisfactorio sobre todo si recordamos que no hizo falta volver una semana más.

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AgradecimientosMe gustaría empezar a dar las gracias a la profesora Neus Peris por ofrecerme la posibilidad de hacer este trabajo, así como por la confianza demostrada al hacerlo.

También quiero agradecer al CRG que me permitiera llevara a cabo mi proyecto en sus instalaciones, en especial a Annick Labeeuw por la ayuda recibida así como a todos los compañeros con los que compartí esta experiencia y con los que establecimos una amistad que trascendió más allá del laboratorio. El CRG es el Centre de Regulació Genómica que se encuentra dentro del PRBB Parc de la Recerca Biomédica de Barcelona, fue un proyecto de la Generalitat para poner en el mapa científico nuestro país y sobre todo Barcelona, y de hecho podríamos decir que el objetivo se ha cumplido ya que actualmente es un referente ya no solo a nivel de España o Europa sino que a escala global, con descubrimientos y técnicas pioneras en el mundo.

Por último desearía agradecer a todos los conferenciantes que nos dieron los coloquiospor la tarde compartiendo sus conocimientos con nosotros.

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