Automatización en Microbiología Clínica

PhD (c ). Juan Agapito Panta

Atutomatización y métodos rápidos

• Estudia la mejora de los métodos– Aislamiento– Detección precoz– La caracterización (identificación) y– La enumeración de los microorganismos y sus

productos

• En muestras– Clínicas– De alimentos– Industriales y ambientales

Métodos

• Detección de crecimiento– Turbidez– Metabolitos radiactivos– Impedeancia eléctrica– Bioluminiscencia

• Identificación– Colorimetria– Cromatografía para Ag y

metabolitos– Métodos inmunológicos

• Antibiograma

• Para identificación y diagnóstico

• Sistemas manuales• Sistemas mecanizados• Sistemas

inmunológicos• Sistemas moleculares• Otras técnicas

Automatizados Rápidos

TurbidezTurbidez• Por densidad óptica• Por nefelometría o dispersión de la luz• Como indicador de crecimiento y desarrollo

– Determinar si existe microorganismos en muestras• Medicamentos estériles• Orinas (detección de infección clínicamente significativa)

– Indicador de crecimiento• En presencia de inhibidores específicos• Sensibilidad a Antibióticos

• Formato cubetas microdilución• Agitador incubador

Métodos radiactivosMétodos radiactivos

• Producción de metabolitos radiactivos• Un ejemplo Biotec

– Producción de CO2 radiactivo gaseoso– Por microorganismos que metabolizan

sustancias marcadas con 14 C : glucosa, aminoácidos y alcoholes

• Hemocultivos– Se analiza producción de 14C

Impedancia eléctricaImpedancia eléctrica• Se mide los cambios de impedancia

• Las variaciones en el flujo de corriente eléctrica que atraviesa el medio en el cual se esta incubando la muestras

• Rápido y automático• Control contínuo

• Primer signo de variación

• No requiere manipulación – manual ni técnica (industria alimentaria)

BioluminiscenciaBioluminiscencia

• Basado en luciernagas (reacción química)– Conversión del sutrato luciferina en oxiluciferina y luz

– Catalizada por la enzima luciferasa con energía proveniente de la desfosforilacóon de ATP

• Luminómetro (similar al fotómetro)– Mide la luz generada por esta reacción

• Cantidad de luz producida– Es directamente proporcional al ATP presente

Bioluminiscencia Bioluminiscencia

• Gen Reporter– Detección de viabilidad del crecimiento

bacteriano por bioluminescencia (Luciferasa)

– También se ha observado variación de la intensidad de luz producida por cepas sensibles y resistentes

TM4 luciferina

ATP

FÓTON

ColorimetríaColorimetría

• Pruebas bioquímicas convencionales

– Cambios de color de los indicadores de pH

– Presencia de productos finales del metabolismo

• Célula fotoeléctrica

– Mide cambios de color

• Combinación colorimetría + nefelometría

• Combinación identificación + antibiograma

Un ejemplo VITEK

• Automatización total / rapidez 2-6 hrs• Cartuchos o placas

– 30-45 micropocillos con sustratos

• Varios cartuchos– Gram negativos 90 especies– Gram positivos 49 especies– Anaerobios 80 especies– Neisseria y Haemophylus 30 especies

• Antibiogramas• MIC varias configuraciones• Varios modelos

CromatografíaCromatografía

• Diagnóstico de enfermedad infecciosa– Mediante identificación de constituyente antigénico

– Mediante identificación de productos del metabolismo bacteriano

• Cromatografía en fase gaseosa– Anaerobios

• Comatografia líquida de alta performancia (HPLC)

Identificación inmunológicaIdentificación inmunológica

• Anticuerpos monoclonales• Métodos automatizados

– Contrainmunoelectroforésis

– Nefelometría

– RIA (Radioinmunoanalisis)

– ELISA• Ampliamente utilizado

• Para detectar Ag- Ab

• Para virus, bacterias, hongos y parásitos

Para identificación y diagnósticoPara identificación y diagnóstico

• Multiples pasos– Identificación convencional– Código numérico

• Sistema unitario– Más rápido

• API 20E (Enterobacteriaceae)– 20 pruebas bioquimicas

• Sustancias deshidratadas• En 5 – 8 h pérfil de cifras

Rápidos

API 20E Enterobacteriaceae +18-24 hGenerate profile #

Biochemical reactions:

Biochemical reactions:ENTEROTUBE II

12 testsO/N

MICRO-ID & MICRO-ID Listeria*15 tests4 h

Identificación automatizadaIdentificación automatizada

• VITEK (2 – 6 h)– 300 especies clínicas

• Biolog– Microplacas– Cataboliza 95 fuentes de C– Tetrazolium: indicador de actividad

microbiana• BBL® cristalTM Gram positivo ID Kit

– 121 G +– Entericos y no fermentadores, identificacion

de bact Gram – aerobias y bacilos gram negativos no fermentadores de glucosa

BIOLOG

Kits inmunológicos rápidosKits inmunológicos rápidos

• Más útiles cuando– No es posible cultivar (Treponema)– Es peligroso (Rickttsias)– Es demasiado complejo (Mycobacterium)

• Fácil de usar• Rápidos• Sensibles • Especificos

Ejemplos de detección de Ag

• Estreptococo grupo A en frotis faríngeo– Culturette Group A Strep ID kit, Directige

• Virus sincitial respiratorio en frotis nasofaríngeo• VHS (Virus Herpes Simple) en 1-2 minutos• En LCR Neisseria meningitidis, Streptococcus

pneumoniae, Haemophilus influenzae– Bactigen, Directigen

• Detectar y confirmar Staphylococcus aureus– Staphaurex en 30 segundos

Ejemplos de detcción de Ac.

• Ac. contra VIH– SUDS HIV-1 en 10 minutos

• Ac. contra Helicobacter pylori en suero– Quick Vue H pylori Test en 7 minutos– LINKª H. PYLORI en 5 minuto– LINK2ª H. PYLORI en 1 minuto

InmunocromatografiaInmunocromatografia

• Microesferas latex– coloreadas (azul)

• Ligadas a sustancia (250)– Ag o Ac (Ac Listeria)

• Reaccionan con muestra– complejo Ag-Ac

– migración lateral

• Ac inmovilizado– retiene complejo Ag-Ac

– evidencia línea de color

TUBO INDICADOR DE CRECIMIENTO MYCOBACTERIANO (MGIT)

TUBO INDICADOR DE CRECIMIENTO MYCOBACTERIANO (MGIT)

• Lectura 7 – 10 días • No radiométrico• No requiere de equipos

automatizados• Requiere espacio limitado

para la incubación• Puede usarse para pruebas de

ADN y bioquimicas.

METODOS RADIOMETRICOS (SISTEMA-BACTEC SEMIAUTOMATIZADO)

METODOS RADIOMETRICOS (SISTEMA-BACTEC SEMIAUTOMATIZADO)

• Detecta automáticamente el crecimiento micobacteriano midiendo la cantidad de 14CO2 producido por la metabolización de sustratos (ácidos grasos) marcados con 14C

MEDIOS DE CULTIVO BIFASICO NO RADIOMETRICOS (MB-SEPTI-CHECK)

MEDIOS DE CULTIVO BIFASICO NO RADIOMETRICOS (MB-SEPTI-CHECK)

• Medio bifásico suplementado : - Chocolate - Lowestein – Jeensen - Middlebrook• La identificación es visual sobre el

medio sólido.• Puede observarse pigmento y

morfología Caldo 7H12

BACTEC 9000BACTEC 9000

• MGIT (Mycobacteria growth indicator tube, B&D)

– Automatizado

– Fluorimétrico (No-radiométrico)

– Resultados en 5 días a 10 días