aproximación práctica al estudio del kras y otros
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Aproximación práctica al estudio
del KRAS y otros biomarcadores
Javier Hernández Losa.
23-Mayo-2013
Evaluación, gestión y rentabiliad de la muestra
S09-23447
%celularidad
tumoral
70%
Fase Pre-analítica: Selección del material
A
C D
B
Macrodisección
Bloque NO
tumoral
Bloque TUMORAL
Fase Pre-analítica: Selección del material
A B
C
A) Realizar 2-5 cortes a 5-10 µm en un microtomo, utilizándose cuchillas desechables
para cada caso con el fin de evitar contaminaciones cruzadas
B) Cada corte es recogido con ayuda de una aguja estéril e introducido en un tubo
eppendorf estéril previamente rotulado
Imagen cedida por el Dr. F. Lopez-Rios
Fase Pre-analítica: Selección del material
Kits disponibles de extracción de DNA
¿Que tipo de extracción de DNA uso?
Técnica de columnas caotropicas
Mayor cantidad ADN
¿Menor calidad?
Necesidad desparafinacion
Técnica de Bolas Magneticas
Menor cantidad ADN
¿Mayor calidad?
No desparafinacion
¿Que significa Calidad del ADN?
¿Que significa Calidad del ADN?
Caso 1
Bola Magnética Ct=30,19
Columna Ct =33.46
Determinaciones genericas de un ensayo de 180pb
HPAC 50-0.39 ng
50ng
0.39ng
Caso 2 Caso 3
Caso 4 Caso 5
Bola Magnética Ct=30,19
Columna Ct =30.60
Determinaciones genericas de un ensayo de 180pb
Bola Magnética Ct=29,2
Columna Ct =33,6
Bola Magnética Ct=30,2
Columna Ct =36.2
Bola Magnética Ct=30
Columna Ct =36.2
NºCopias (180 pb)
Comparativa de diferentes métodos de extracción de ADN
DNA_2241
Bola
Magnètica
Columna
G12V Ct=28
G12V Ct=29 G12S Ct=33
G12S Ct=30.6
DNA_2338 DNA_2443
G12S Ct=33.04
G12S Ct=27.26
Determinaciones específicas de KRAS por Therascreen
Columna
DNA_2236
Bola
Magnètica
G12D Ct=30.4
G12D Ct=34.7
DNA_2571
G12V Ct=29
G12V Ct=27
Determinaciones específicas de KRAS por Therascreen
Curso On-line Biomarcadores. Modulo 4
www.cancer.sanger.uk
¿Que metodología uso?
¿Que necesito ver?
Resumen de Técnicas mas empleadas
Curso On-line Biomarcadores. Modulo 4
RGQ PCR Kit
Pyro KitStrip
AssayAmoy
Dx Entrogen Genomica Cobas
TecnologíaScorpions
ARMSPirosecuen.
Hibridación
TirasDxARMS TaqMan
Hibridación
ArrayTaqHRM
Sensibilidad
%3 5 1 ? 1 5 5
Detección
Codon/Mut
.
12
13
12
13
61
12
13
BRAF
12
13
12
13
61
BRAF
12
13
BRAF
12
13
61
No
distingue
Resumen de Técnicas mas empleadasen formato KIT Comercial
http://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf11/P110030A.pdf ; http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm310899.htm
http://www.genengnews.com/gen-news-highlights/fda-approves-qiagen-s-kras-companion-diagnostic-and-new-use-for-erbitux/81247009/
therascreen PCR: tecnología ARMS-Scorpions
Primers ARMS
Los primers ARMS hibridan en la
posición mutada, y permiten a la
Taq DNA polimerasa iniciar la
reacción de PCR
Los primers ARMS no hibridan
con el DNA nativo
El primer ARMS se extiende en el DNA mutado
Primer ARMS
El primer ARMS no se extiende en el DNA nativo
Primer ARMS
therascreen PCR: tecnología ARMS-Scorpions
Primers ARMS
Primer ARMSA G G C
T C A G T C G
El primer ARMS se extiende en el DNA mutado
Primer ARMS
therascreen PCR: tecnología ARMS-Scorpions
Primers ARMS
El primer ARMS no se extiende en el DNA nativo
A G G C
T C A C T C G
X
Visualización de KRAS en Rotor Gene Q
Visualización de KRAS en Rotor Gene Q
Mayo 2012-2013 626 determinaciones de KRAS
6 Resultados No valorable
Controles de Calidad Externos
Mediana = 99
Nº Laboratorios= 56 (43)
Informes Ronda 5 SEAP (2012)
Resultados globales de las determinaciones
Ronda 5 Control Calidad SEAP (2012)
Controles de Calidad Externos
105 Laboratorios participantes de 26 paises
Año 2012
Nº Laboratorios= 117
30 paises
Normativa de calidad en el laboratorio
Normativa de calidad en el laboratorio
Normativa de calidad en el laboratorio
Total ISO9001 ISO15189
56 10 2
Ronda 5 Control Calidad SEAP (2012)
21% Laboratorios.
Conclusiones
1. Tener en cuenta las limitaciones y posteriores aplicaciones de
las metodologías de extracción de ácidos nucleicos
2. Elegir un método de determinación que cumpla criterios
de calidad (CE_IVD)
3. Participar en las rondas de control de calidad externas
4. Implementar normativas de calidad a los procedimientos
que se realizan en los laboratorios de Patología Molecular
Muchas gracias por la atención