APOPTOSIS

Mientras los filósofos buscan el significado de la vida, los biólogos están más interesados en el significado de la muerte

Valerie Fadok

ApoptosisN

º d

e ci

taci

ones

/añ

o (m

ed li

ne)

Apoptosis

Year1970 1980 1990 2000

0100020003000400050006000700080009000

10000

100

9876

19721972

2007 2008123411 147025

AutoinmunidadAutoinmunidad SIDASIDACáncerCáncer AlzheimerAlzheimer

Apoptosis fisiológicaApoptosis fisiológica

DefectoDefecto ExcesoExceso

ÍNDICE1. Fases y características de la apoptosis

2. Apoptosis y filogenia2.1. Caenorhabditis elegans2.2. Drosophila melanogaster2.3. Apoptosis en vertebrados

3. La maquinaria de la muerte celular en humanos 3.1. Caspasas 3.2. Sustratos de caspasas 3.3. Inhibidores de caspasas 3.4. Vías de inducción de apoptosis

3.4.1. Vía extrínseca o de los receptores de muerte3.4.2. Vía intrínseca o mitocondrial

1) FASES Y 1) FASES Y

CARACTERÍSTICAS CARACTERÍSTICAS

DE LA APOPTOSISDE LA APOPTOSIS

Fases de la apoptosis

1. 1. DecisiónDecisión

2. 2. EjecuciónEjecución

4. 4. DegradaciónDegradación y y presentación presentación

antígenosantígenos

3. 3. FagocitosisFagocitosis

DesequilibrioDesequilibrioentre factoresentre factoresinductores einductores einhibidoresinhibidores

Temprana:Temprana:

Activación Activación de proteasas yde proteasas yendonucleasasendonucleasas

InIntermedia:termedia:Fragmentación DNA Fragmentación DNA

TardTardíía:a:Emisión de Emisión de

cuerpos apoptóticoscuerpos apoptóticos

Activación Activación de receptoresde receptores

Detección Detección de fosfatidil de fosfatidil serina (PS)serina (PS)

Evita liberación de componentes intracelulares inflamación TGF

Diferencias entre Diferencias entre apoptosis y necrosis.apoptosis y necrosis.

ApoptosisApoptosis NecrosisNecrosis(Oncosis)(Oncosis)

Programada genéticamenteProgramada genéticamente Accidental.Accidental.

Se mantieneSe mantiene Se rompeSe rompe

DisminuyeDisminuye aumentaaumenta

Se preservan Se preservan Se desintegran Se desintegran

Fragmentación del DNAFragmentación del DNA tardía tardía

fragmentosfragmentos grandesgrandes

.. En cuerpos apoptóticosEn cuerpos apoptóticos rodeados por membrana rodeados por membrana

Son reconocidosSon reconocidos y fagocitados y fagocitados

Los contenidosLos contenidos de los orgánulosde los orgánulos

se liberanse liberan

Inducen Inducen inflamación local.inflamación local.

Membrana.Membrana.

Tamaño celularTamaño celular

Orgánulos.Orgánulos.

TempranaTemprana fragmentos fragmentos

oligonucleosomalesoligonucleosomales

Fragmentación celularFragmentación celular

Restos celularesRestos celulares

MecanismoMecanismo

CARACTERÍSTICAS DE LA APOPTOSIS

Consecuencias de la apoptosisLa célula se fragmenta en cuerpos apoptóticos La célula se fragmenta en cuerpos apoptóticos con PS en la cara exterior de su membranacon PS en la cara exterior de su membrana

Las células fagocíticas:Las células fagocíticas:

• Reconocen PS y fagocitan los cuerpos Reconocen PS y fagocitan los cuerpos apoptóticos apoptóticos

• Al fagocitarlos producen mediadores anti-Al fagocitarlos producen mediadores anti-inflamatoriosinflamatorios

Consecuencias de la apoptosis

1.1. Se impide la liberación de los contenidos Se impide la liberación de los contenidos celulares al espacio extracelular celulares al espacio extracelular

2.2. Permite muerte celular sin inflamación Permite muerte celular sin inflamación

3.3. La apoptosis permite la muerte celular La apoptosis permite la muerte celular sin provocar daño a las células sin provocar daño a las células adyacentesadyacentes

2) APOPTOSIS Y 2) APOPTOSIS Y

FILOGENIAFILOGENIA

2. Apoptosis y filogenia

2.1. Caenorhabditis elegans

2.2. Drosophila melanogaster

2.3. Vertebrados

2.1. C. elegans- Primera evidencia de una base genética de la apoptosis.

- Desarrollo invariante y lineal.

- Durante la ontogenia de un gusano adulto hermafrodita, 131 céls

de la 1090 céls somáticas mueren por apoptosis (959 céls).

- Análisis genético que determinó genes específicos para la

regulación de la apoptosis:

- egl-1

- ced-3

- ced-4

- ced-9

2.1. C. elegans

A) Mutaciones con pérdida de función en egl-1, ced-3 o ced-4

provocan la supervivencia de las 131 céls: genes

inductores de apoptosis.

B) Gen supresor de apoptosis, ced-9

- Mutantes carentes de ced-9: muerte durante el

desarrollo por muerte masiva de céls

- Ganancia de función: supervivencia de la 131 céls.

2.1. C. elegansLa maquinaria básica de muerte celular está altamente conservada

en la evolución de los metazoos

- ced-3 es una cistein proteasa con dominios de interacción

q forman una estruc. parecida al apoptosoma: caspasa iniciadora

- ced-4 es una proteína adaptadora q desencadenaría la

activación de ced-3 si no estuviera unida a ced-9.

- ced-9 es supresora de muerte celular y homóloga a Bcl-2.

- egl-1 desplaza a ced-9 de ced-4.

2.1. C. elegans

2.2. D. melanogasterSimilitudes con C. elegans:

- Caspasas

- Adaptadores

- Supresores

Aparecen:

- p53

- IAPs

- Mitocondria

2.2. D. melanogaster

2.3. VERTEBRADOS

1. Tanto en C. elegans como en D. melanogaster el desarrollo está

restricto a la vida temprana o a la metamorfosis.

2. En vertebrados la morfogénesis, el remodelado y la regeneración

se produce abundantemente en muchos tejidos a lo largo de toda la

vida.

3. La maquinaria apoptótica es homóloga a invertebrados aunque

más elaborada y degenerada.

2.3. VERTEBRADOS

En mamíferos aparece:

1. Familia de receptores de muerte cuyo reconocimiento

desencadena activación de caspasas y muerte.

2. Daños pro-apoptóticos impactan directamente en la

mitocondria y liberan péptidos pro-apoptóticos:

- Holocitocromo c

- Smac/DIABLO que antagoniza la actividad anti-

apoptótica de XIAP.

2.3. VERTEBRADOS

3) MAQUINARIA DE LA MUERTE 3) MAQUINARIA DE LA MUERTE

CELULAR EN HUMANOSCELULAR EN HUMANOS

3. Maquinaria de la muerte celular en humanos

3.1. Caspasas

3.2. Sustratos de caspasas

3.3. Inhibidores de caspasas

3.4. Vías de inducción de apoptosis

3.4.1. Vía extrínseca

3.4.2. Vía intrínseca

3.1. CASPASAS3.1. CASPASAS

CASPASAS- Son cistein proteasas específicas de aspartato (caspase)

- Se expresan como proenzimas (zimógenos)

- Presentan 3 dominios:

1. Prodominio terminal

2. Subunidad larga (p20) que contiene el centro activo

3. C-terminal que es la subunidad pequeña (p10)

Prodominio terminal

Subunidad larga (p20)

Subunidad pequeña (p10)

Asp

Asp

ACTIVACIÓN DE CASPASAS

Asp

Asp Caspasainiciadora

Caspasaactiva

MECANISMOS DE ACTIVACIÓN DE CASPASAS

1. Activación por otra caspasa

2. Activación inducida por proximidad

3. Asociación con una subunidad reguladora

1. ACTIVACIÓN POR OTRAS CASPASAS

- Activación de una caspasa por otra previamente activada:

cascada de caspasas

- Caspasas con prodominio corto: Caspasas efectoras

- Caspasas –3, -6, -7.

- Amplificación e integración de señales

1. ACTIVACIÓN POR OTRAS CASPASAS

2. ACTIVACIÓN INDUCIDA POR PROXIMIDAD

- Activación de una caspasa por proximidad: Trimerización de

receptores que reclutan caspasas y se procesan mutuamente.

- Caspasas con prodominio largo: Caspasas iniciadoras.

- Caspasa -8.

- Implicada en vía extrínseca (CD95).

2. ACTIVACIÓN INDUCIDA POR PROXIMIDAD

3. ASOCIACIÓN CON UNA SUBUNIDAD REGULADORA- Activación de una caspasa a través de un cofactor.

- No se activa por proteolisis sino por cambio conformacional.

- Caspasas con prodominio largo: Caspasas iniciadoras.

- Caspasa -9. Cofactor: Apaf-1. Citocromo c.

- Implicada en vía intrínseca o mitocondrial.

3. ASOCIACIÓN CON UNA SUBUNIDAD REGULADORA

Apoptosoma

CASPASAS

- Las caspasas efectoras se activan proteolíticamente por otras

caspasas

- Las caspasas iniciadoras son activadas mediante interacciones

reguladas proteína-proteína.

3.2. SUSTRATOS DE 3.2. SUSTRATOS DE

CASPASASCASPASAS

SUSTRATOS DE CASPASAS

- La caspasa-3 es la última responsable de los efectos apoptóticos

junto con las caspasas -6 y –7.

- Estas 3 caspasas ejecutoras causan el fenotipo apoptótico:

1) Fragmentación de DNA

2) Alteraciones de la membrana plasmática

3) Translocación PS

1) FRAGMENTACIÓN DEL DNA

- La caspasa-3 actúa sobre el complejo DNasa activado por caspasa

(CAD) y sobre su inhibidor, iCAD.

iCAD CAD Caspasa-3

2) ALTERACIONES DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA

- La caspasa-3 actúa sobre:

- La gelsolina - La fodrina

- Se disocia de membrana plasmática del citoesqueleto

- Formación de vesículas- Plegamiento de la membrana plasmática

3.3. INHIBIDORES 3.3. INHIBIDORES

DE CASPASASDE CASPASAS

INHIBIDORES DE CASPASAS

- Proteínas inhibidoras de apoptosis (IAP).

- Se identificaron en baculovirus. Hay al menos 5 en mamíferos:

- X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP)- c-IAP1- c-IAP2- IAP neuronal- Survivina

- Todos inhiben caspasa –3 y –7 activa y procaspasa-9.

INHIBIDORES DE CASPASAS

Frenan la apoptosis por inhibición, unión y degradación:

1. Dominio repetido IAP de baculovirus (BIR) por el q el IAP se

une e inhibe a las caspasas. Entre 1-4 dominios BIR.

2. Dominio RING q actúa como una ligasa de ubiquitina:

degradación del IAP y de cualquier caspasa unida a él.

3. Dominio CARD: regulación directa o indirecta del

procesamiento de las caspasas. c-IAP1 y c-IAP2

INHIBIDORES DE CASPASAS

RING BIR3 BIR2 BIR1 XIAP

RING BIR3 BIR2 BIR1CARDc-IAP1c-IAP2

3.4) VÍAS DE INDUCCIÓN 3.4) VÍAS DE INDUCCIÓN

DE APOPTOSISDE APOPTOSIS

3.4) VÍAS DE INDUCCIÓN DE APOPTOSIS3.4) VÍAS DE INDUCCIÓN DE APOPTOSIS

Existen dos vías de inducción de apoptosis:

3.4.1. Vía extrínseca o vía de los receptores de muerte

3.4.2. Vía intrínseca o vía de la mitocondria

3.4.1. VÍA EXTRÍNSECA

- A través de receptores superficiales: receptores de muerte.

Receptores de la familia de TNFR: CD95, TNFR1, TNFR2. Tb

DR3, TRAIL...

- Requiere trimerización para la transducción de la señal.

- Al receptor activado se le asocia un complejo de proteínas:

dominio de señalización inductor de muerte (DISC, death-

induced signalling domain)

DISC

1. El adaptador FADD se une a través de su dominio de muerte

(DD) al dominio de muerte del receptor activado

2. FADD contiene un dominio efector de muerte (DED) que por

homología atrae procaspasa-8 o FLICE que se activa.

3. Inhibición debida a proteínas con dos dominios DED: proteína

inhibidora de FLICE (FLIP, FLICE-inhibitory protein).

c-FLIP

CD95L

CD95

FADD

DISCDD

Caspasa-8

Procaspasa-8DED

Caspasa-3Bid

3.4.1. VÍA EXTRÍNSECAFasFasL

MORT/FAAD

caspasa 8

Cambios apoptóticos extranucleares

Fragmentación nuclear

Formación de cuerpos apoptóticos

caspasa-6caspasa-7 caspasa-3

Hidrólisis de NuMA

Cambios apoptóticos nucleares

Fragmentación DNA

Condensación cromatina

Externalización de PS

Deshidratación citoplásmica

Bid Vía mitocondrial

3.4.1. VÍA EXTRÍNSECA

3.4.2. VÍA INTRÍNSECA- La regulación de la apoptosis en esta vía es debida a la familia de

Bcl-2.

- Bcl-2 fue descubierto como un proto-oncogén en el linfoma

folicular de células B y es homólogo a ced-9.

- Existen 19 miembros que se dividen en tres grupos.

- Cada miembro posee al menos uno de los cuatro motivos

conservados denominados dominios de homología con Bcl-2

(BH): BH1-BH4.

FAMILIA DE Bcl-21. Grupo I:

- Actividad anti-apoptótica

- Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w...

- 4 motivos BH: BH1-BH4

- Cola hidrofóbica en el C-terminal

2. Grupo II:

- Actividad pro-apoptótica

- Bax, Bak, Bok...

- Carecen de BH4

3. Grupo III:

- Actividad pro-apoptótica

- Bid, Bik, Bad, Bim...

- Sólo poseen el dominio BH3

- Pueden o no tener región transmembrana

CONTROL DE LA APOPTOSIS POR LA FAMILIA DE Bcl-2

- Los miembros de la familia de Bcl-2 intentan bloquear el

siguiente movimiento de otro.

- Algunos homodimerizan

- Se forman heterodímeros de miembros pro y anti-apoptóticos

neutralizándose

Gradientepro-apoptóticos

GradienteAnti-apoptóticos

MITOCONDRIA: CENTRO DE LA MUERTE CELULAR

La mitocondria no es sólo la central productora de energía de la

célula, también es un arsenal pues secuestra un potente

combinado de proteínas pro-apoptóticas:

1. Citocromo c: Componente junto con Apaf-1 y caspasa

9del apoptosoma

2. Smac/DIABLO (second mitochondria-derived activator

of caspases/direct IAP-binding protein with low pI): es

una proteína que inhibe IAPs secuestrándolas.

Daño genotóxico

p53

Bax

Bcl-2

citocromo c

Smac/DIABLOProcaspasa-9

Apaf-1

Procaspasa-3

caspasa-3

IAPs

Apoptosoma

INTEGRACIÓN DE LAS DOS VÍAS

APOPTOSIS

- Características definidas

- Regulada genéticamente

- Conservada en la evolución

- Muy regulada: patologías

- Inducida por señales externas e internas