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Mª LUISA CAMARÓ SALA

1. INTRODUCCIÓN

2. NORMATIVA APLICABLE

3. OBJETIVOS

4. DEFINICIONES

5. TECNICA

6. RESULTADOS

7. CONCLUSIONES

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1. INTRODUCCIÓN:

� ADMINISTRACIÓN DE ANTIBIÓTICOS EN LA PRÁCTICA CLÍNICA (DÉCADA 1940).

� APARICIÓN DE BACTERIA MULTIRRESISTENTE.

� ESCASEZ DE TRATAMIENTOS ALTERNATIVOS.

� USO INAPROPIADO E INDISCRIMONADO DE LOS ANTIBIÓTICOS.

� CONTROL DEFICIENTE DE LA INFECCIÓN BACTERIANA.

1. INTRODUCCIÓN:

� PROBLEMA GRAVE DE SALUD QUE AFECTA A DIFERENTES SECTORES ANIVEL MUNDIAL.

� ELABORACIÓN DE ESTRATEGIAS DE ACTUACIÓN A NIVEL EUROPEO YNACIONAL.

� CODEX ALIMENTARIUS: ADOPTÓ LAS DIRECTRICES PARA EL ANÁLISIS DERIESGO DE RESISTENCIAS TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS.

� PROGRAMA NACIONAL DE MONITORIZACIÓN DE RESISTENCIASANTIMICROBIANAS 2014-2020

� CEPAS:� SALMONELLA EN ALIMENTOS (2017)� CAMPYLOBACTER EN AVES (2016-2017)� E. COLI EN CIEGOS DE AVES (2018)

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2. NORMATIVA APLICABLE:� Directiva 99/2003, sobre vigilancia de zoonosis y agentes zoonóticos y AMR

� Reglamento 2160/2003: control de salmonella y otros agentes zoonóticos detransmisión alimentaria

� Decisión 2007/407/CE, sobre la vigilancia armonizada de la resistencia aantimicrobianos en Salmonella en aves de corral y cerdos (derogada)

� Misión comunitaria 2016/8678, sobre la evaluación de la vigilancia y la notificación dela resistencia de las bacterias zoonóticas y comensales a los antibióticos.

� Informe nacional de fuentes y tendencias de zoonosis.� Decisión de Ejecución de la Comisión de 12 de noviembre de 2013 sobre el

seguimiento y la notificación de la resistencia de las bacterias zoonóticas ycomensales a los antibióticos. (2013/652/UE)

� Reglamento (CE) 2073/2005, relativo a los criterios microbiológicos aplicables a losproductos alimenticios.

� Norma UNE-EN ISO 20776-1:2006: Sistemas de ensayo de laboratorios clínicos y dediagnóstico in vitro. Ensayo de susceptibilidad de agentes infecciosos y evaluación delfuncionamiento de los dispositivos de susceptibilidad antimicrobiana. Parte 1: Métodode referencia para ensayo de la actividad in vitro de agentes antimicrobianos frente abacterias aeróbicas de crecimiento rápido implicadas en enfermedades infecciosas.

� Especificaciones técnicas EFSA sobre programa de resistencias a antimicrobianas.

3. OBJETIVOS:

�Evaluar la respuesta “in vitro” de un microorganismo a

la acción de los antibióticos: determinación de la CMI.

�Cumplimiento del programa nacional, 2014-2020

mediante el envío al CNA de las cepas de Salmonella

aisladas.

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4. DEFINICIONES

� Agente antimicrobiano: Sustancia de origen biológico, semisintética osintética, que inhibe el crecimiento de bacterias o mata bacterias.

� CMI: Concentración mínima inhibitoria. Concentración más baja de unagente antimicrobiano, que en condiciones in vitro definidas, impideel crecimiento visible de bacterias antes de un periodo de tiempodefinido. Dicha concentración se expresa en mg/l.

� Punto de corte: Valores específicos de parámetros (CMI), según loscuales las bacteria se pueden asignar a las categorías de “sensible““intermedio” y “resistente”.

4. DEFINICIONES� Punto de corte:

� Clínico: Establecido con criterios microbiológicos, clínicos(ensayos de respuesta), y farmacológicos (farmacocinética yfarmacodinámica de los antimicrobianos).

� Epidemiológico: Establecido mediante estudios estadísticos delos valores de CMI obtenido para una población de cepas enrelación con un antimicrobiano. Son conceptualmenteinvariables, no dependen de la dosis y no necesariamente tienenque coincidir con los puntos de corte clínicos.

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4. DEFINICIONES: PUNTO DE CORTE

CLSI EUCAST

PUNTOS DE CORTE CLÍNICOSPUNTOS DE CORTE CLÍNICOS Y

EPIDEMIOLÓGICOS

4. DEFINICIONES: PUNTO DE CORTE CLÍNICO

� Sensible S: Cepa bacteriana inhibida in vitro por una concentración deagente antibacteriano menor o igual al punto de corte establecido paradicho antimicrobiano, que se asocia con una alta probabilidad de éxitoterapeútico.

� Resistente R: Cepa bacteriana inhibida in vitro por una concentración deun agente antimicrobiano, superior al punto de corte establecido paradicho antimicrobiano, que se asocia con una alta probabilidad defracaso terapéutico .

� Intermedio I: Cepa bacteriana inhibida in vitro por una concentración deagente antibacteriano que se asocia con un efecto terapéutico incierto.

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4. DEFINICIONES: PUNTO DE CORTE EPIDEMIOLÓGICO

� Sensible S: Cepa bacteriana inhibida in vitro por una concentración deagente antibacteriano menor o igual al punto de corte establecido paradicho antimicrobiano.

� Resistente R: Cepa bacteriana inhibida in vitro por una concentración deun agente antimicrobiano, superior al punto de corte establecido paradicho antimicrobiano.

� NOTA: En nuestro estudio se utilizarán los puntos de corte epidemiológicos dereferencia establecidos por EUCAST que aparecen en la Decisión de Ejecución dela Comisión de 12 de noviembre de 2013 (2013/652/UE).

4. DEFINICIONES

� RESISTENCIA:

� NATURAL O INTRÍNSECA: Bacteria que carece de la dianapara un determinado antimicrobiano.

� ADQUIRIDA: Es debida a la modificación de la carga genéticade la bacteria que puede aparecer por mutacióncromosómica o por mecanismos de transferencia genética.

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Nueva bacteria resistente

Bacteria sensible

Bacteria resistente

Transferencia degenes de resistencia

4. DEFINICIONES : MECANISMOS DE RESISTENCIA:

� Modificaciones bacterianas que impiden la llegadadel antimicrobiano al punto diana.� Mutaciones en las porinas de la pared (betalactámicos)� Alteración de los sistemas de transporte (aminoglusidos en

anaerobios)� Salida del antimicrobiano por expulsión activa.

� Alteración por parte de la bacteria del punto diana.� Alteración a nivel del ADN-girasa (quinolonas).� Alteración del ARN ribosómico 23s (macrolidos).� Alteración de enzimas PBPs (proteinas fijadoras de

penicilinas) (betalactámicos).

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4. DEFINICIONES : MECANISMOS DE RESISTENCIA:� Inactivación por enzimas.

� Beta-lactamasa de espectro extendido (ESBL): enzimascodificados por plásmidos, encontrados en las enterobaceriasy que confieren resistencia a penicilinas, cefalosporinas de 3ªy 4ª generación y monobactamos (aztreonam). No confierenresistencia a carbapenemes y son inhibidas por el ácidoclavulánico.

� Beta-lactamasa AmpC: Son de naturaleza cromosómica oplasmídica, inducibles o no inducibles (constitutiva) confiereresistencia a penicilinas, cefalosporinas de 1ª,2ª y 3ªgeneración. No confieren resistencia a carbapenemes y alas cefalosporinas de 4ª generación. No se inhiben por elácido clavulánico.

� Beta-lactamasa carbapenemasas: Inactivan las penicilinas,la mayoría de las cefalosporinas y en grados diferentes alos carbapenemes, así como antimicrobianos de otrasfamilias. Entre ella se encuentra la OXA-48, que es la másfrecuente en nuestro país.

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5. Detección de E.Coli comensal y E.Coli ß-lactamasas de Espectro Entendido en cepas deE.Coli procedentes de muestras de ciego de aves:

� 1.-Preparación de la muestra.

� 2.-Enriquecimiento en agua de peptona tamponada.

� 3.-Siembra por aislamiento en los diferentes medios decultivo e identificación de E.coli comensal.

� 4.-Siembra por aislamiento en los diferentes medios decultivo e identificación de E.coli BLEE .

� 5.-Estudio de resistencia por microdilución.

1. Preparación de la muestra:

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2.Enriquecimiento en agua de peptona tamponada,

FIG 1.Apariencia típica de E. coli en el medio MCA

Siembra confluente en el agar ChromoID Smart

10 µl APT 10 µl APT

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3. Aislamiento e Identificación E.coli comensal� Tomar 10 �l del APT incubada y sembrar por

aislamiento en Agar MacKonkey. Incubar a 44±1ºCdurante 24 horas.

� Observar el crecimiento bacteriano y la apariencia de lascolonias. Seleccionar tres colonias lactosa positiva(colonias color rojo-púrpura) y subcultivarlas en:� MCA a 37 ± 1ºC durante 18-22 horas� TBX a 44 ± 1ºC durante 18-22 horas� AN a 37 ± 1ºC durante 18-22 horas

� De todas ellas elegir una colonia con las siguientescaracterísticas:� MCA: Sin crecimiento.� TBX: Crecimiento típico de E. coli, colonias azul verdosas.� AN: Crecimiento a partir del cual se realizará el estudio de

resistencias o se procederá a su congelación en caldoapropiado (MCG) para su posterior realización.

3. Aislamiento e Identificación E.coli BLEE /AMPC� Sembrar 10 �l por aislamiento a partir del APT incubada en

Agar MacKonkey con cefotaxima (MCA).� Incubar a 44 ±1ºC durante 18-22 horas.� Observar el crecimiento bacteriano y la apariencia de las

colonias. Seleccionar tres colonias lactosa positivo (coloniascolor rojo-púrpura) y subcultivarlas:� MCA a 37 ± 1ºC durante 18-22 horas� TBX a a 44 ± 1ºC durante 18-22 horas� AN a 37 ± 1ºC durante 18-22 horas

� De todas ellas elegir una colonia con las siguientescaracterísticas:� MCA: Con crecimiento típico (colonias con coloración rojo-

púrpura).� TBX: Crecimiento típico de E. coli, (colonias azul verdosas).� AN: Crecimiento a partir del cual se realizará el estudio de

resistencias o se procederá a su congelación en caldoapropiado (MCG) para su posterior realización.

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3.Aislamiento e Identificación E.coli Carbapenemasas/Oxa48.� Tomar 10 �l del APT incubada y sembrar por aislamiento en Agar

ChromoId CarbaSmart. en las dos partes en las que se divide la placacomo se puntualiza en la figura 1.

� Incubar a 37 ± 1ºC durante 18-24 horas.

� Observar el crecimiento bacteriano y la apariencia de las colonias decada sección de la placa y seleccionar hasta tres colonias con lascaracterísticas típicas y subcultivar en:� MCK a 37 ± 1ºC durante 18-22 horas

� TBX a a 44 ± 1ºC durante 18-22 horas

� AN a 37 ± 1ºC durante 18-22 horas� De todas ellas elegir una colonia con las siguientes características:

� MCK: Con crecimiento típico (colonias con coloración rojo-púrpura).

� TBX: Crecimiento típico de E. coli, (colonias azul verdosas).� AN: Crecimiento a partir del cual se realizará el estudio de

resistencias o se procederá a su congelación en caldo apropiado(MCG) para su posterior realización.

3.Aislamiento e Identificación:

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3.Aislamiento e Identificación :

SUSPENSIÓN BACTERIANA

5. TÉCNICA: PRINCIPIO

ANTIMICROBIANO A DISTINTAS

CONCENTRACIONES

CRECIMIENTO BACTERIANO

O

INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

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5. TÉCNICA: PRINCIPIO DEL MÉTODO

� Técnica de microdilución en placa

� Etepas del método:

� 1) Preparación del inóculo: consiste en preparar una suspensióndel microorganismo en estudio a una concentración de célulasdefinida (1 – 2 x 108 ufc/ml) para lo cual utilizaremos unnefelómetro. Esta suspensión la diluiremos en el medio de cultivoadecuado, según el microorganismo que se esté analizando.

� 2) Inoculación de las placas de antimicrobianos: con la suspensióndel microorganismo preparada en la etapa anterior, inocularemoslas placas de 96 pocillos con los compuestos antimicrobianos adiferentes concentraciones. Se inoculará una cantidad definida desuspensión bacteriana (50-100 µl) en cada pocillo mediante uninoculador automático de placas.

� 3) Lectura e interpretación de los resultados.

5. TÉCNICA:

Anexo 2: Diseño y composición de las placas Sensiti tre

Microorganismos: Salmonella spp y E.coli

Placa: EUVSEC

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5. TÉCNICA: Placa:EUVSEC2

5. TÉCNICA:

Placa: EUCAMP2 Microorganismos: Campylobacter jejuni y campylobacter coli

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5. TÉCNICA: PREPARACIÓN DEL INÓCULO

5. TÉCNICA: PREPARACIÓN DE LA PLACA

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5. TÉCNICA: LECTURA DE LA PLACA

5. TÉCNICA: PUNTOS DE CORTE PARA LOS DISTINTOS AGENTES ANTIMICROBIANOS (EUCAST)

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5. TÉCNICA: PUNTOS DE CORTE PARA LOS DISTINTOS AGENTES ANTIMICROBIANOS (EUCAST)

5. TÉCNICA: CONTROLES

� INÓCULO: �VALORACIÓN

�PUREZA

� CONTROL TÉCNICA: CEPAS DE REFERENCIA�E. COLI ATCC 25922�CAMPYLOBACTER JEJUNI ATCC 33560

� REACTIVOS: CERTIFICADOS DE CALIDAD

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6. RESULTADOS: VALORES ESPERADOS CEPAS DE REFERNCIA

� E. COLI ATCC 25922(1): Rango establecido según Noma ISO 20776-1:2006

ANTIMICROBIANORANGO

ESTABLECIDO (1)RESULTADO ESPERADO

CMI ( mg / l )AMPICILINA 2-8 2-8

CEFOTAXIMA 0.03-0.12 <0.25CEFTACIDINA 0.06-0.5 < 0.5

CLORAMFENICOL 2-8 < 8CIPROFLOXACINA 0.004-0.015 < 0.015

COLISTINA 0.25-2 < 1-2GENTAMICINA 0.25-1 < 0.5-1MEROPENEM 0.008-0.06 < 0.03

ACIDO NALIDÍXICO 1-4 < 4TETRACICLINA 0.5-2 < 2TIGECICLINA 0.03-0.25 < 0.25

TRIMETROPRIM 0.5-2 0.5-2

6. RESULTADOS: VALORES ESPERADOS CEPAS DE REFERNCIA

� C. JEJUNI ATCC 33560(2): Rango establecido según NCCLS Veterinari Subcommittee, Clinical and Laboratory Standards Institute

ANTIMICROBIANO

RANGO ESTABLECIDO (2)

RESULTADO ESPERADO

CMI ( mg / l )

ERITROMICINA 0.25-2 < 1-2

CIPROFLOXACINA 0.03-0.12 < 0.12

TETRACICLINA 0.25-1 < 0.5-1

GENTAMICINA 0.25-2 0.25-2

ACIDO NALIDÍXICO 4-16 4-16

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CEPAS DE SALMONELLA ESTUDIADAS: 87

S. Agona

1%

S. Bredeney

8%

S. Cerro

1%

S. Chester

14%

S. Enteritidis

9%

S. Infantis

19%S. Kentucky

10%

S. Mikawasima

1%

S. Montevideo

1%

S. Rissen

6%

S. Typhimurium

30%

SEROTIPOS DE SALMONELLA

GRÁFICO DE LA SENSIBILIDAD DE LAS CEPAS DE SALMONELLA TYPHIMURIUM: 26 CEPAS

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

NAL AMP AZ CTX CFT CIP CHL COL GEN MERO SMX TET TGC TMP

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GRÁFICO DE LA SENSIBILIDAD DE LAS CEPAS DE SALMONELLA ENTERITIDIS : 8 CEPAS

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

NAL AMP AZ CTX CFT CIP CHL COL GEN MERO SMX TET TGC TMP

GRÁFICO DE LA SENSIBILIDAD DEL RESTO DE LAS CEPAS DE SALMONELLA: 53 CEPAS

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

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GRÁFICO DE LA SENSIBILIDAD DE TODAS LAS CEPAS DE SALMONELLA: 87 CEPAS

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

NAL AMP AZ CTX CFT CIP CHL COL GEN MERO SMX TET TGC TMP

GRAFICO COMPARATIVO DE LA SENSIBILIDAD DE LAS DISTINTAS CEPAS DE SALMONELLA SPP

� S. TYPHIMURIUM

� S. ENTERITIDIS

� OTRAS

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

NAL AMP AZ CTX CFT CIP CHL COL GEN MERO SMX TET TGC TMP

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CEPAS DE CAMPYLOBACTER ESTUDIADAS: 123.

17%

83%

CEPAS CAMPYLOBACTER

C.COLI C.JEJUNI

GRÁFICO DE LA SENSIBILIDAD DE LAS CEPAS DE CAMPYLOBACTER COLI: 21 CEPAS

CIP; 4,8

ERY; 90,5

GEN; 95,2

NAL; 0,0

STR; 66,7

TET; 14,3

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GRÁFICO DE LA SENSIBILIDAD DE LAS CEPAS DE CAMPYLOBACTER JEJUNI: 102 CEPAS

CIP; 5,9

ERY; 100,0

GEN; 99,0

NAL; 3,9

STR; 95,1

TET; 20,6

GRAFICO COMPARATIVO DE LA SENSIBILIDAD DE LAS CEPAS DE C. COLI Y JEJUNI

� C. COLI

� C. JEJUNII

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

CIP ERY GEN NAL STR TET

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7. CONCLUSIONES:

�Es importante el estudio de las resistencias para Salud Pública�El procedimiento empleado debe ser normalizado.�El porcentaje de cepas de Salmonella spp estudiadas que

presentan resistencia al menos a un antimicrobiano es el 82,73%.�Entre las cepas de Salmonella spp resistentes estudiadas, el 88.9%

presentaban resistencia a más de un antibiótico, el 27,18% a tresantibióticos y sólo el 4,17% a 6 o más antibióticos.

�No se ha encontrado ninguna cepa de Salmonella spp resistente acefotaxima, ceftazidima o meropenem.

�El serotipo más comúnmente aislado ha sido Typhimurium: 30%

7. CONCLUSIONES:

� Las cepas de S. Typhimurium presentan:�Mayor sensibilidad a:

� Acido nalidíxico

� Ciprofloxacina

�Mayor resistencia a:� Ampicilina

� Sulfametoxazol

� Tetraciclina

�Las cepas de S. Enteritidis presentan:�Mayor sensibilidad a:

� Sulfametoxazol

� Tetraciclina

� Las cepas de Campylobacter coli y jejuni no presentan diferencias encuanto a su sensibilidad a los antibióticos testados.

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7. CONCLUSIONES:

�Las cepas de Campylobacter coli y jejunipresentan resistencia:

�Ácido Nalidíxico�Ciprofloxacina�Tetraciclina

�Los resultados obtenidos coinciden con los publicados.

7.CONCLUSIONES:

�Se han analizado desde 21/03/18 hastael 22/10/18, un total de 91 muestras deciegos de ave y no se ha detectadoninguna cepa de E.coli con ß-lactamasastipo carbapenemasas ni OXA-48.

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