ANTEPROYECTO DE TESIS

“CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN LA ALMEJA MANO DE LEÓN Nodipecten subnodosus DURANTE LA EXPOSICIÓN A TOXINAS PARALÍTICAS (PSPs) DEL

DINOFLAGELADO Gymnodinium catenatum.

María Guadalupe Carrisoza Valenzuela

Co -Directores de tesis: Dr. Felipe Ascencio Valle

Dr. Francisco Vargas Albores

Nodipecten subnodosus, almeja mano de león.Distribución, Laguna Ojo de liebre, B.C.S, México hasta las costas del Perú.

Debido a sus hábitos filtradores (fitoplantófagos) pueden acumular y transmitir pasivamente sustancias tóxicas.

Introducción

Inhaled waterExhaled water

El estudio del fitoplancton tóxico ha cobrado gran interés debido a su impacto en la salud pública y ecosistemas costeros, así como en actividades económicas como la pesca, acuicultura y turismo.

Las zonas ostrícolas del Noroeste de México han sufrido graves pérdidas (hasta del 100% del cultivo), sin contar con una explicación satisfactoria de las causas del fenómeno.

En los cultivos acuícolas, es muy común el estrés producido tanto por factores bióticos como abióticos. Los eventos tóxicos son un claro ejemplo de agentes bióticos que afectan las condiciones de salud en moluscos.

La literatura referente al efecto de las toxinas paralíticas (PSP) en pectínidos es reciente y escasa.

Es necesario realizar trabajos que describan los procesos fisiológicos, de las distintas especies que se ven afectadas tanto a nivel toxicológico, como inmunológico y genético.

Hipótesis Hipótesis

La caracterizacion de la expresión genica diferencial en los tejidos La caracterizacion de la expresión genica diferencial en los tejidos (hemolinfa, glándula digestiva y músculo aductor) de (hemolinfa, glándula digestiva y músculo aductor) de N. subnodosus,N. subnodosus, durante la exposición a toxinas paraliticas de durante la exposición a toxinas paraliticas de G. catenatum,G. catenatum, mediante el uso mediante el uso de microarreglos, permitira identificar los genes involucrados en la de microarreglos, permitira identificar los genes involucrados en la respuesta inmune. respuesta inmune.

La caracterización de la expresión génica en los tejidos (hemolinfa, glándula La caracterización de la expresión génica en los tejidos (hemolinfa, glándula digestiva y músculo aductor) de digestiva y músculo aductor) de N. subnodosusN. subnodosus y su modificación durante la y su modificación durante la exposición a toxinas paralíticas de exposición a toxinas paralíticas de G. catenatum,G. catenatum, permitirá identificar los permitirá identificar los genes involucrados en el proceso genes involucrados en el proceso

Con el empleo de nuevas herramientas de biología molecular y genómica como es el caso de microarreglos (diseñados para observar cambios en la expresión de los genes, ante una determinada condición) (Ramírez et al, 2003) podría llegarse, en un periodo corto, a conocer los genes involucrados en el sistema inmune, sintetizados como respuesta a un estímulo (Estrada-Muñoz, 2005).

Con el empleo de nuevas herramientas genómicas, como es el caso de microarreglos (diseñados para observar cambios en la expresión de los genes, ante una determinada condición) podría llegarse, en un periodo corto, a conocer los genes afectados por la presencia de la toxina y aquellos expresados como respuesta a un estímulo.

(Ramírez et al, 2003)(Estrada-Muñoz, 2005)

El presente estudio pretende la caracterización de la expresión génica de la almeja mano de león N. subnodosus bajo condiciones controladas de exposición a toxinas paralíticas (PSP) del dinoflagelado Gymnodinium catenatum, mediante la realización de microarreglos. Contribuyendo de esta forma al conocimiento de los genes involucrados en la defensa de estos organismos.

Objetivo

Caracterizar la expresión génica de la almeja mano de león N. subnodosus durante la exposición a toxinas paralíticas (PSP) del dinoflagelado Gymnodinium catenatum, mediante la realización de microarreglos.

Objetivos particulares.

• Construir una librería génica (genoteca)

• Construir los microarreglos

• Exponer organismos juveniles de N. subnodosus a dosis subletales de las toxinas paralíticas de G. catenatum

• Detectar modificaciones en la expresión génica diferencial en los tejidos hemolinfa, glándula digestiva y músculo aductor de N. subnodosus expuestos o inyectados con PSPs de G. catenatum

• Caracterizar los genes más representativos, que fueron modificados

Metodología.

Experimentos de alimentación2 experimentos 48 h y 24 días

Experimentos de inyección de la toxina PSP de G. catenatum.

2 experimentos 8 h y 5 días

Estero Rancho Bueno, Bahía Magdalena, B. C. S. de 4-6 cm. de altura de concha.

Contenedores de 40 L a 22oC, aireación constante y agua de mar filtrada, recambios totales diariamente. Alimentación, mezcla de 3 especies de microalgas (Chaetoceros gracilis, C. calcitrans e I. galbana )

Obtención y aclimatación de almejas

24 días

2x107 cel de G. catenatum al

día/recipiente

Experimentos de alimentación

48 h

20 organismos/recipiente con 3 replicas

Extracción de ARN

Hemolinfa, glandula digestiva y musculo aductor

Tasas de aclaramiento.

12 días 1x106 cel/individuo/día de G. catenatum en combinación con

25x106 cel/individuo/día de I. galabana

Los siguientes 12 días se alimentará con 200x106 cel/ind/día

de I. galabana

Los controles se alimentarán durante los 24 días

con 400x106 cel/ind/día de I. galbana

Recambios totales cada 2 días

8 almejas cada 4 días (controles y tratamientos)

Hemolinfa, glandula digestiva y musculo aductor

Extracción de ARN

20 organismos/recipiente con 3 réplicas

2 L de cultivo de G. catenatum (fase exponencial tardía),

Densidad cel

Se centrifugará a 5000 g, por 10 min. a 4ºC

Resuspensión en 50 mL de HCl 0.1 N,

Lisis con perlas de vidrio, y calentamiento a ebullición por 5 min

La toxina extraída se almacenará a 4ºC

Extracción de la toxina paralítica de G. catenatum

Cultivo de microalgas

Gymodinium catenatum (cepa GCCV-6), se cultivará en medio GS-e, bajo ciclos 16:8 h luz/oscuridad, a 22oC en condiciones anaerobias. Fase exponencial tardía (106 cel/L). Isochrysis

galbana (ISG-1) dieta control.

5 días

Experimentos de alimentación

8 h

Extracción de ARN

2 mL de hemolinfa

Hemolinfa, glandula digestiva y musculo aductor

Extracción de ARN

15 almejas

500 µL de toxina (80 ng eq sax/cel/mL).

Transcurridas 8 h

48 almejas

500 µL de toxina (80 ng eq sax/cel/mL).

Se tomarán muestras al azar de 8 organismos a las 12, 24, 48, 72, 96 y 120 h de iniciado el experimento

Después de la inyección se alimentará como durante la aclimatación pero a

dosis de 1x106 cel/recipiente/día.

Controles: almejas inyectadas con 500 µL

de HCl 0.1 N

Diseño de oligonucleotidos: se seleccionarán los segmentos más conservados del resultado del alineamiento con los mRNA de interés registrados en los bancos de secuencias.

Extracción de ARN, con el sistema Tri Pure (Boehringer Mannheim´s) fenol - tiocianato de guanidina. Transcripción a ADNc con transcriptasa reversa y la amplificación se realizará en un termociclador.

Microarreglos. Se utilizará la librería genómica que se realizará a partir de N. subnodosus. Se usará biotina como marcador de cARN y aproximadamente 15 µg de ARN fragmentado se hibridizarán para cada arreglo. Los arreglos serán escaneados utilizando un GeneArray escáner. El análisis de los datos obtenidos se realizará de acuerdo a Gregorio et al. (2001).

• Microarreglos. Se utilizarán los microarreglos generados por el Labororatorio de Microarreglos de Noroeste (CIAD/CIBNOR/CICESE) que contiene los clones de la genoteca (nDNA) de N. subnodosus (NODSU3C).

• SONDAS, El RNA total será extraído y purificado utilizando TRIZOL. El RNA será marcado con CyScribe Direct mRNA Labeling (Amersham Biosciences) y será hibridizado utilizando Lucidea SlidePro Hybridizer.

• Análisis de datos, siguiendo las recomendaciones de Gregorio et al. (2001), los microarreglos, serán registrados utilizando un ArrayWoRx Scanner y los datos evaluados utilizando el software ARRAY VISION

• Huella génica de los clones positivos, será obtenida por digestión con BamHI. Todos los clones serán enviados a secuenciar de los extremos (end sequencing) lo que permitirá identificar redundantes.

• Al menos dos clones positivos serán totalmente secuenciados, utilizando subclonaciones o walking primer

• La caracterización del clon incluye: secuencia completa, localización del gen expresado, definición de regiones no transcritas y asociación (si existe) con otros genes.

• Confirmación. Las modificaciones en la expresión serán confirmada por PCR tiempo real, utilizando primer específicos diseñados a partir de la secuencia. A partir del RNA de los biensayos, se hará el cDNA que servirá de templado.

Actividad 1er Sem 2do Sem 3er Sem 4to Sem 5to Sem 6to Sem

Cultivo de microalgas y obtención de organismos X          

Experimentos de alimentación X          

Experimentos de inyección de toxinas   X        

Diseño de Oligonucleótidos X          

Extracción de ARN X X        

Transcripción y amplificación X X        

Secuenciación X X        

Librería genética X X        

Diseño de microarreglos     X X    

Análisis de datos X X X X X  

Avances trabajo de investigación X X X X X X

Cursos X X X      

Redacción de artículos     X X X X

Defensa de tesis           X

Calendario de actividades.

Gracias