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Análisis Inmunofenotípico de los SLPc.
Aula Formativa Hematólogos Jóvenes, 24 de marzo 2011
Eugenia Fernández Mellid Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela
Introducción
La citometría de flujo (CMF) estudia la presencia/ausencia deantígenos específicos (inmunofenotipo) en una población aestudio.
Para seleccionar los marcadores inmunofenotípicos (panel)que empleamos para estudiar una muestra nos basaremosen: Historia clínica. Hallazgos clínicos, analíticos y pruebas de imagen. Estudio morfológico. (Estudio CMF previo)
Poblaciones celulares/linajes a identificar: Linfocitos T Linfocitos B Células plasmáticas Serie mielomonocítica
2006 Bethesda International Consensus Recommendations on the Inmunophenotypic Analysis of
Hematolymphoid Neoplasia by Flow Cytometry: Optimal Reagents and Reporting for the Flow Cytometric
Diagnosis of Hematopoietic Neoplasia. Cytometry B Clin Cytom. 2007;72 Suppl 1:S14-22.
Interpretación y análisis del estudio mediante CMF
1. Linaje celular
2. Estadio madurativo.
3. Presencia de poblaciones clonales
4. Análisis del fenotipo de la población a estudio.
Análisis inmunofenotípico busca identificar:
Citometría de flujo en los SLPc
Síndromes linfoproliferativos crónicos (SLPc): Proliferaciones de linfocitos maduros. Inmunofenotipo similar al de las células linfoides
maduras normales (ausencia de marcadores antigénicos de inmadurez).
Pueden ser: De células B De células T De células NK.
Muestras a analizar: Sangre periférica Aspirado de médula ósea. Muestras de células obtenidas por PAAF/biopsia de
ganglio, suspendidas en soluciones conservantes. Líquido ascítico, pleural, cefalorraquídeo….
Citometría de flujo en los SLPc
IDENTIFICACIÓN DE POBLACIONES DE LINFOCITOS:
Basado en 3 marcadores:
CD19: Linfocitos B
CD3: Linfocitos T
CD56: Linfocitos NK.
Empleando CD45: proporción de lasdistintas poblaciones sobre la
celularidad total.
Citometría de flujo en los SLPc-B
Diferenciación linfoide B:
Dos fases:
1. Antígeno-independiente: tiene lugar en la
médula ósea (adulto)Linfocitos B
inmunocompetentes y autotolerantes.
2. Antígeno-dependiente: migración de linfocitos
B maduros desde la médula ósea a órganos
linfoides secundarios.
Citometría de flujo en los SLPc-B
Población B anormal puede distinguirse: Cadenas ligeras de superficie:
Kappa o lambda. Ratio kappa/lambda <0,3 o > 4
Expresión aberrante de antígenos: Presencia de antígenos que no se expresan
normalmente en células de línea B (antígenos de línea linfoide T…)
Presencia de antígenos en una subpoblación de linfocitos B que se expresan normalmente en otras subpoblaciones pertenecientes a compartimentos biológicos/ganglionares distintos. (p.e Bcl2 en CD10+)
NEOPLASIAS DE LINFOCITOS MADUROS B
Citometría de flujo en los SLPc-B
EXPRESIÓN ABERRANTE DE ANTÍGENOS: Expresión de CD5 y CD10:
CD5: molécula accesoria implicada en la modulación de los procesos de activación y diferenciación, expresada en la superficie de los linfocitos T y en una subpoblación de linfocitos B.
CD10: marcador de superficie de los precursores más inmaduros de linfocitos B
En función de la expresión de CD5 y CD10 distinguimos:
CD5+/CD10-
CD5+/CD10+
CD5-/CD10-
CD5-/CD10+
Citometría de flujo en los SLPc-B
CD5+/CD10-
LLC-B Manto Otros
CD23+ CD23- Algunos LNH-B de zona marginal
Linfoma linfoplasmocítico
Linfoma B difuso de células grandes
…
Si CD 23 -/+d: ver CD200:
CD200++: LLC-B
CD200-/+d: Manto
Típicamente CD20 +d
CD22+d
FMC7-
Expresión débil de Igs de superficie
CD38
ZAP 70
CD20 +d/+
FMC7-/+d
LLC-B: ZAP-70 y CD38: valor pronóstico. ZAP-70: dificultades técnicas para una
determinación fiable: Marcador citoplásmico EDTA, tiempo… Positividades débiles
CD-38: determinación más fiable, aunque: No clara positividad/negatividad Células positivas y negativas en la misma muestra. Diferencias según fluorocromo, SP o BM… Variaciones en el curso de la enfermedad y tras
tratamientos.
Citometría de flujo en los SLPc-B
Citometría de flujo en los SLPc-B
CD5-/CD10+
Folicular Difuso de células grandes
Otros
Bcl-2 +
CD43-
Bcl-2-/+d
CD43+
Burkitt en la infancia
Algunas Tricoleucemias.
Citometría de flujo en los SLPc-B
LNH-B difuso de células grandes: No-centro germinal Centro germinal:
20-40% Habitualmente CD10+
Importancia diagnóstica de morfología y molecular.
Burkitt en la infancia: CD5-/CD10+ con elevada frecuencia Bcl-2 –,CD10++, CD43- Para diferenciar de LNHBCG tener en cuenta inmunofenotipo,
morfología, índice de proliferación y molecular.
Tricoleucemia: morfología y respuesta al tratamiento similar a las CD10-
Citometría de flujo en los SLPc-B
CD5-/CD10-
Tricoleucemia Marginal Otros
CD20++
CD22++
CD11c++
CD25+
CD103+
Kappa/lambda superficie+/++
CD11c+/-
CD103+/-
Ocasionalmente
Kappa/lambda superficie –
Kappa/lambda citoplásmica+
LNH-B difuso cels grandes
Folicular CD10-
Manto CD5-
Citometría de flujo en los SLPc-B
•CD5+/CD10+:
•Neoplasias linfoides maduras B que expresen CD5 y CD10 son infrecuentes.
•Múltiples subtipos de LNH pueden presentar este fenotipo. Valorar:
•Morfología
•Tamaño celular (Folicular, Manto, LLC vs Burkitt, LDCG, LLA)
•Citogenética, FISH…
Tipo Marginal Tricoleucemia LLC-B Manto Folicular LNHBCG Burkitt
CD19 + + + + + +/- +
CD5 -/(+) - + + - - -
CD10 - +/-Variante-
- - + + +
CD22 + + +d/- + + + +
CD23 - - + - - - -
Igs Superf
IgM IgM,IgG +d/- + + +/(-) +
CD43 - + + - -/(+) -
FMC7 + + - +/(-) +/- +/- -/(+)
CD103 -/(+) + Variante +/-
- - - - -
CD11c -/+ +
Variante+/-
-/+ - - - -
CD25 -/+ +
Variante-
-/+ - - -/(+) -
CD20 +/(-) + + + + +(-) +
CD79b + + - + - + +
Inmunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. M C Béné, T Nebe, P Bettelheim, B Buldini, H Bumbea, W Kern, F Lacombe, P Lemez, I Marinov, E Matutes, M Maynadié, U Oelschlagel, A Orfao, R Schabath, M Solenthaler, G Tschurtschenthaler, A M Vladareanu, G Zini, G C Faure and A Porwit Leukemia , (21 January 2011) | doi:10.1038/leu.2010.312
Citometría de flujo en los SLPc-T/NK
•Mayor dificultad para identificar poblaciones inmunofenotípicas anormales de células T o NK->clasificación peor establecida.
•Diagnóstico clínico+morfológico+inmunofenotípico+molecular.
•Desde el punto de vista de CMF, población T/NK puede diferenciarse por:
•Expresión débil/fuerte/pérdida de antígenos T/NK(CD3, CD5, CD7)
•Expresión aberrante de antígenos B.
•Alteración ratio CD4+/CD8+
•Expresión TCR V-beta (preferible reordenamiento TCR por técnicas moleculares)
Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasm Fiona E. Craig and Kenneth A. Foon
From www.bloodjournal.org by on April 14, 2009
Citometría de flujo en los SLPc
PANEL DE SCREENING:
Identificación de poblaciones linfocitarias: CD19, CD3, CD56
Panel B (población CD19+): CD5, CD20, CD22, CD23, CD103, CD10, Kappa-
Lambda de superficie, CD25, CD79b, CD38.
Panel T: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD7
Panel NK: CD56, CD57, CD45, CD158, CD94
Inmunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. M C Béné, T Nebe, P Bettelheim, B Buldini, H Bumbea, W Kern, F Lacombe, P Lemez, I Marinov, E Matutes, M Maynadié, U Oelschlagel, A Orfao, R Schabath, M Solenthaler, G Tschurtschenthaler, A M Vladareanu, G Zini, G C Faure and A Porwit Leukemia , (21 January 2011) | doi:10.1038/leu.2010.312
Figure 2
MANTLE ZONE CD19, CD20, CD22, CD79,
FMC7, sIg, bcl-1, CD5, CD43,
(CD10, CD23 neg)
FOLLICULAR CD19, CD20, CD22, sIg+, CD79,
CD10, bcl-2
(CD5, CD23, CD43 neg)
DIFFUSE LARGE B CELL LYMPHOMAS, sIg+,
cIg+, CD19, CD20, CD79, CD22++, CD79, CD10+
(CD5 rare cases, bcl-2, bcl-6, MUM-1 can be useful
for further classification)
BURKITT CD19, CD20, CD22,
CD79, sIg, CD10, DR, bcl-6
(CD5, CD23, Tdt neg)
T LYMPHOMAS AND ANGIOIMMUNOBLASTIC
CD5+/CD10+/CD3+/CD4+
SEZARY CD3, CD2, CD5, CD4, CD7+/-(CD8 neg)
LARGE CELLS ANAPLASTIC CD2, CD4, CD3+, CD30
PERIPHERAL CD2, CD3, CD5, CD4
ANGIOCENTRIC CD2, CD5, CD4 ou CD8, CD56
INTESTINAL CD3, CD7, CD103
ATLL CD3, CD4, CD25, CD45RO, CD7neg
MARGINAL ZONE CD19, CD20, CD22, CD79, sIg, FMC7, bcl-2,
CD23+ (CD5, CD10, CD43, bcl-6 neg)
NODAL MALT
CLL CD19, CD20, CD43,CD23, sIg+/-, CD5 (CD79 CD10, CD22,
FMC7 neg)
HCL CD19, CD20, CD22, sIg++, CD11c, CD25, CD103, CD123
(CD5, CD10, CD23 neg)
INTESTINAL OR LUNG MALT
Follicular, mantle zone,
marginal zone
SLVL
circulating marginal zone cells
WALDENSTROM CD19, CD20+, CD22,
CD79 sIg+, cIg, FMC7 (CD5, CD10,
CD23 neg)
MYELOMA cIg, CD56, CD45+,
CD38, CD138
(CD19, CD20, CD22 neg)