Anlisis dinmico y control de bioprocesos

Pablo A. Lpez Prez,

Rigel V. Gmez Acata,

Vicente Pea Caballero,

Ricardo Aguilar Lpez,

email: raguilar@cinvestav.mx

Departamento de Biotecnologa y Bioingeniera. Cinvestav.

Actualmente la industria biotecnolgica necesita cumplir con estndares nacionales e

internacionales de seguridad industrial, legislacin ambiental y produccin continua de alta

calidad, lo cual lleva a implementar sistemas de optimizacin eficientes, principalmente con

informacin en tiempo real de las variables crticas del proceso. Los procesos biotecnolgicos

implican la incorporacin de microorganismos creciendo mediante la catlisis de reacciones

bioqumicas. Los sistemas biolgicos presentan comportamientos singulares tales como

oscilaciones en las concentraciones de uno o ms metabolitos, multiplicidad de estados

estacionarios, histresis y caos1.Lo anterior es de especial inters para los sistemas biolgicos

con aplicacin industrial, por ejemplo: la produccin de enzimas, antibiticos, vacunas,

colorantes, combustibles o la remocin de diversos contaminantes recalcitrantes, entre ellos la

gran familia de pesticidas, herbicidas, metales pesados y derivados del petrleo, por

mencionar algunos.

Los modelos matemticos desarrollados para representar el comportamiento de los

microorganismos son necesarios para realizar predicciones y tomar decisiones racionales, esto

debido a la compleja relacin entre los subsistemas, la no linealidad y la heterogeneidad del

comportamiento cintico, que son caractersticas comunes de los procesos biolgicos, con la

finalidad de favorecer o evitar caer -durante la operacin de los diferentes bioprocesos- en

estas singularidades, que pueden afectar directamente la productividad aumentndola o

disminuyndola2.

En este sentido, existen diversos factores importantes a considerar en la optimizacin del

bioproceso: a) Variables que no pueden medirse en tiempo real por falta de sensores

adecuados; b) condiciones extremas de operacin, lo cual repercute en sensores diseados a

resistir temperaturas altas, presin y diferentes pH, lo que implica costos elevados; c) algunas

variables no pueden ser medidas en lnea y necesitan pruebas de laboratorio, en este rubro

mucha de la tecnologa aplicada a este tipo de bioprocesos es muy cara, por ejemplo: los

equipos pticos y sensores va enzimtica que no pueden medir con fiabilidad variables como

biomasa o metabolitos intracelulares en lnea.

Estos factores se convierten en limitantes para el buen funcionamiento de biorreactores, por

lo que es necesario llevar a cabo diversos anlisis dinmicos de sistemas biolgicos modelados

de forma propia, adems de disear, analizar, validar e implementar estructuras de estimacin

y control que permitan el monitoreo en lnea del bioproceso mediante la utilizacin de

variables de fcil adquisicin (pH, O2, CO2, T, entre otras). Estos esquemas son conocidos como

observadores de estado o estimadores (Virtual Software), los cuales son desarrollados en

paralelo a los esquemas de control incorporando una interface con el usuario en donde se

verifica el estado del sistema en tiempo real; estas estrategias de operacin, monitoreo y

control son tecnologas clave en este campo3,4.

Por esta razn, muchos investigadores han centrado su atencin en el desarrollo de algoritmos

adecuados para llevar a cabo la estimacin y control de bioprocesos. En este sentido, varias

tcnicas se han introducido para estimar las variables de estado con mediciones disponibles. A

pesar que las teoras y aplicaciones para sistemas lineales estn bien desarrolladas, la no

linealidad de los procesos biolgicos ha dado lugar al desarrollo de los observadores no

lineales. Sin embargo, la construccin de los observadores no lineales todava ofrece un campo

de investigacin abierto.

La estructura de estos esquemas se basa en la integracin de un modelo matemtico basado

en balances de materia y energa que representen a nivel macroscpico y microscpico el

comportamiento de las variables implicadas en el bioproceso, simulando y validando con la

parte experimental el modelo propuesto utilizando diversas herramientas computacionales.

Una vez representada la dinmica del bioproceso, se disean estructuras de estimacin y lazos

de control mediante pruebas analticas asegurando su convergencia con el sistema

experimental para una aplicacin viable; estas estructuras se implementan en algoritmos

computacionales en una unidad virtual (virtual instrument-software sensor) en una PC, en

donde se alimentan las mediciones de los sensores en lnea salidas de control hacia el

biorreactor y mediante un mecanismo de tipo interface-operador se pueden modificar los

objetivos de control, as como el diagnstico del sistema buscando una mejora continua para

cada etapa del bioproceso (figura 1).

Figura 1. Optimizacin de bioprocesos.

En la actualidad el grupo de trabajo desarrolla dos casos de investigacin aplicados a sistemas

biotecnolgicos:

Caso I. Estudio del anlisis dinmico de la hidrlisis de celulosa por Cellulomonas cellulans5.

El anlisis de sistemas se lleva a cabo de tres maneras: de forma experimental, analtica y

numrica. El anlisis experimental es relativamente comn; debido a que es costoso, ste slo

estudia una pequea parte de todos los comportamientos posibles en el sistema; por otro

lado, el anlisis terico arroja mucha informacin con la limitante de que mientras ms

complejo sea el sistema modelado estudiado, se encontrarn ms dificultades para resolverlo

debido al creciente nmero de ecuaciones de estado, generalmente ecuaciones diferenciales

de primer orden (ODE por sus siglas en ingls) y ecuaciones diferenciales parciales (PDE por sus

siglas en ingls); finalmente el anlisis numrico ofrece una ventaja sobre el anterior: es capaz

de dar informacin no posible de manera analtica resolviendo los sistemas por mtodos

numricos. Este ltimo anlisis se ha desarrollado rpidamente debido al continuo

mejoramiento de las computadoras y al diseo de software matemticos (AUTO97, CONTENT,

MATCONT, BBSolveOptimun, Copasi, etc) que permiten analizar sistemas cada vez ms

complejos y de mayor orden.

El estudio de sistemas biolgicos o como mejor se le conoce Biologa de Sistemas es

relativamente un nuevo campo de la Biologa, acuado alrededor del 2000. Con respecto a los

estudios sobre la hidrlisis de celulosa, utilizando el modelo clsico del quimiostato, se busca

comparar la respuesta en la dinmica del sistema al emplear diferentes modelos no

estructurados de inhibicin por sustrato (Aiba, Andrew, Haldane, Han-Levenspiel, Luong y

Moser)5 incluidos dentro de las ecuaciones de estado del quimiostato. A su vez, se analiza un

trmino de gran importancia: el rendimiento celular. Generalmente se considera constante,

pero existen diversos trabajos donde se reporta que lo anterior limita la capacidad de

respuesta del sistema a, por ejemplo, predecir oscilaciones. Para lograr lo anterior se ha

empleado el anlisis numrico de bifurcacin, herramienta muy til que nos permite revelar la

existencia de multiplicidad de estados estacionarios, zonas de estabilidad e inestabilidad de

operacin, fenmenos de histresis, condiciones de oscilacin amortiguada (focos), sostenida

(ciclos lmite) y aperidica (caos) -por mencionar algunas- que, de forma aplicativa, nos lleva a

la optimizacin de procesos6.

Hablando del caso particular del modelo del quimiostato para la hidrlisis de celulosa, entre

los resultados obtenidos se observa que el modelo de Moser es el nico entre los estudiados

que es incapaz de alcanzar un punto de equilibrio (estado estacionario) exceptuando las

condiciones de lavado del quimiostato; que el sistema presenta multiplicidad de estados

estacionarios, donde el intervalo de multiplicidad est relacionado con la concentracin de

sustrato alimentada; que es imposible predecir oscilaciones al considerar rendimiento

constante.

Figura 2. Diagrama de bifurcacin del modelo del quimiostato para la hidrlisis de

Carboximetilcelulosa (CMC) por Cellulomonascellulans en cultivo continuo, empleando el

modelo de Luong para inhibicin por sustrato y considerando un rendimiento celular polinomial

de 3er. orden. Las lneas continuas muestran concentraciones de equilibrio de carcter nodo

estable; las lneas con crculos muestran el intervalo de oscilaciones de sustrato y biomasa; las

lneas punteadas muestran puntos de equilibrio inestables. Hopf 1 y Hopf 2 indican la presencia

de oscilaciones sostenidas (ciclos lmite). Punto Lmite es la mxima tasa de dilucin operable y

Punto de Bifurcacin es la condicin de cultivo por lote. Condiciones iniciales (10 gL-1 CMC y

1.44 gL-1 biomasa)

Caso II Sistema sulfato-reduccin por la cepa Desulfovibrio alaskensis 6SR y el acoplamiento

con aguas contaminadas con metales pesados, tales como Cromo Cr(VI) y Cadmio Cd(II) para

su remocin.

Diferentes estudios se han enfocado a investigar el potencial de los microorganismos,

principalmente bacterias y hongos en la remocin de los metales que estn participando en la

contaminacin ambiental, especialmente en efluentes. Tambin, se estn desarrollando

tecnologas que incluyen el uso de los microorganismos como agentes de remocin, para ser

una alternativa a los procesos fisicoqumicos o bien un complemento a stos. Debido a que en

la actualidad se tiene que cumplir con estndares de calidad ms exigentes en el tratamiento

de los residuos y descargas de efluentes, la mayora de los procesos de tratamiento de aguas

residuales deben ser compatibles y cumplir con criterios como:

Un proceso biolgico debe ser complementario a los procesos existentes.

El proceso debe ser suficientemente flexible a las perturbaciones en la cantidad y

composicin de los sustratos presentes en el efluente.

Deben ser eficientes, confiables y operar de manera continua como en la mayora de

los procesos fisicoqumicos.

Tienen que ser lo suficientemente robustos mediante un sistema de monitoreo,

prediccin, diagnstico de fallas y control para optimizar el proceso.

Entre los mtodos de tratamiento ms simples para la eliminacin de metales pesados, se

encuentra el de cambio de pH, el cual es un mtodo econmico de eliminacin de metales en

solucin. Sin embargo, este tipo de proceso no es selectivo y se pueden tener grandes

cantidades de precipitados, pero puede ser muy eficiente por la insolubilidad de su

precipitado; en este caso el costo depender de la concentracin del metal, la necesidad de

tratamientos secundarios, eliminacin de residuos, etc.

Entre los metales pesados, el cadmio es considerado como uno de los ms importantes

contaminantes ambientales, debido a su gran versatilidad de usos en la fabricacin de

contenedores de alimentos, aleaciones, pinturas, bateras, cueros, etc. Es un metal pesado

relativamente poco abundante. Es uno de los metales ms txicos, aunque podra ser un

elemento qumico esencial, necesario en muy pequeas cantidades, pero esto no est claro.

Normalmente se emplea especialmente en pilas. Es insoluble en bases, se disuelve en cido

ntrico diluido y es poco soluble en los cidos sulfrico y clorhdrico; es un elemento que en

muy bajas cantidades afecta mecanismos y funciones fundamentales de diferentes especies,

incluidos los humanos, siendo los rganos blanco ms importantes el hgado y el rin; en este

ltimo caso, es conocido su efecto adverso sobre la funcin renal caracterizado por

proteinuria. A nivel celular, la base de su accin txica radica en su interaccin con

fosfatidiletanolamina (WHO, 1992). El cadmio es txico para los frijoles, remolacha y nabos en

concentraciones tan bajas 0,1 mgL-1. La Norma Oficial Mexicana (NOM-001-ECOL-1996) indica

como un lmite mximo permisible en suelo de 0.05 mgL-1y en ros de 0.2 mgL-1. Por otra parte,

el cromo hexavalente Cr(VI) es uno de los metales pesados que se ha demostrado que tiene

efectos cancergenos y mutagnicos en los seres vivos.

Por qu escoger un proceso biolgico para el tratamiento de metales pesados, cuando en la

industria existen una variedad de tecnologas?

Los microorganismos tienen la capacidad para degradar una gran variedad de contaminantes

orgnicos e inorgnicos, y generalmente son procesos econmicos. Cabe mencionar que los

microorganismos no mineralizan a los metales, sin embargo tienen la capacidad de modificar

su estado de oxidacin ya sea por la excrecin de un metabolito o bien por la accin

enzimtica. Tambin, los microorganismos pueden remover los metales por dos mecanismos

fisicoqumicos; acumulacin y bio-absorcin.

Un ejemplo de estos procesos biolgicos son las bacterias sulfato reductoras (BSR) que

mediante la produccin de Sulfuro precipitan el metal, las BSR son estrictamente anaerbicas,

heterotrficas y se clasifican segn su temperatura en mesoflicas y termoflicas, tiene un

crecimiento en un intervalo rango de pH de 6-8. En este grupo de bacterias las que han sido

ampliamente estudiadas para la remocin de metales pasados destaca principalmente el

gnero Desulfovibrio, ya que se ha observado que este gnero puede reducir enzimticamente

el Cr(VI). Adems, por ser microorganismos estrictamente anaerobios utilizan sustratos

inorgnicos como aceptores de electrones en el proceso de respiracin. Cuando el aceptor de

electrones es el sulfato, se produce sulfuro de hidrgeno. Numerosos estudios se ha realizado

para evidenciar la precipitacin de metales en presencia de sulfuro de hidrgeno,

principalmente para la recuperacin de metales valiosos, as como en los procesos de

biorremediacin de efluentes contaminados con metales pesados7. Sin embargo, una limitante

importante que se presenta cuando se utilizan las bacterias sulfato reductoras, es la inhibicin

de los cultivos por las altas concentraciones de sulfuro de hidrgeno. Por otro lado, el cadmio

se remueve va precipitacin y adsorcin en biopelcula, cabe mencionar que la cepa

Desulfovibrio alaskensis 6SR8 es capaz de formar una biopelcula como mecanismo de defensa,

en la cual el sulfuro de Cadmio precipitado es adsorbido y puede ser recuperado (figura 3),

bajo estas condiciones se logra remover 170 mgL-1de cadmio en un tiempo no mayor a 48

horas.

En este sistema se desarrollan esquemas de observacin con la finalidad de reconstruir la

dinmica de biomasa y remocin de cadmio en tiempo real utilizando esquemas de

observacin no lineales y mediciones en lnea factibles como el consumo de sulfato.

Figura 3. a) Validacin de observador no lineal propuesto () con datos experimentales (*) y

un observador clsico Leunberger (), b) Biopelcula con sulfuro de cadmio adsorbido.

El diseo de sistemas de reactores (sistemas hbridos) aplicados a la remocin de cromo

hexavalente Cr(VI), est enfocado al estudio experimental y anlisis numrico de sistemas

hbridos de reactores aplicados a la reduccin de Cr(VI) a Cr(III) con sulfuro de hidrgeno

(H2S). Los sistemas propuestos pueden estar integrados de diferentes reactores: biolgico-

electroqumico-qumico o biolgico-qumico; lo anterior depende de la concentracin de Cr(VI)

presente en las aguas contaminadas. El agente reductor (H2S) se produce en el rector biolgico

(Reactor A) a travs de oxidacin de sulfatos a H2S acoplada a la oxidacin de substratos

orgnicos utilizando la bacteria sulfato reductora Desulfovibrio alaskensis 6SR. El H2S generado

en el reactor biolgico presente en la fase gas (figura 4, lnea azul) o en la fase lquido (figura 4,

lnea verde) se utiliza para reducir el cromo en el reactor qumico (Reactor C). Si la

concentracin de Cr(VI) presente en el agua contaminada es alta, se puede realizar un

tratamiento previo para abatir la carga de Cr(VI) utilizando un proceso electroqumico (Reactor

C) y posteriormente continuar la reduccin de Cr(VI) en el reactor qumico utilizando H2S. Para

realizar el anlisis numrico se han desarrollado modelos matemticos (modelos cinticos

validados experimentalmente) correspondientes a cada reactor.

Figura 4. Sistemas de reactores (sistemas hbridos) aplicados a la remocin de Cromo

hexavalente Cr(VI).

El objetivo principal del anlisis numrico es explorar las capacidades predictivas y las

propiedades de los sistemas propuestos para la sntesis de algoritmos matemticos para

identificar, estabilizar, observar y controlar9 el proceso de reduccin de Cr(VI), y garantizar la

reduccin del metal hasta una concentracin (0.5 mgL-1) permitida por las normas vigentes

(The American Public Health Association (APHA)).

Por ejemplo: algunos resultados sobre un esquema de control no lineal aplicado para

manipular el flujo de alimentacin del agua contaminada con Cr(VI) (figura 4 y 5; lnea roja) al

reactor qumico. Los resultados numricos sobre la evolucin de la concentracin residual de

Cr(VI) y H2S a la salida del reactor qumico muestran que es posible alcanzar las

concentraciones establecidas por la norma, aplicadas no solamente a tratamientos de aguas

contaminadas con Cr(VI), sino tambin, para el desarrollo de nuevos sistemas para la remocin

de otros metales pesados (Cd, Pb, Zn, entre otros) y tambin, la recuperacin de metales

valiosos (Ag, Au, Cu, entre otros) a travs de la aplicacin de esquemas de control sobre los

sistemas propuestos.

Figura 5. Sistema hbrido de reactores aplicado a la reduccin de cromo hexavalente.

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