parte de bioprocesos grupo c3
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LAB DE BIOPROCESOSTRANSCRIPT
RESULTADOS: (GRUPO C3 )
6.1 TABLAS DE MEDIOS DE CULTIVO
A la hora de diseñar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los microorganismos, asimismo nos interesa cuánto de biomasa se desea producir.
Estado: Medio líquido
Volumen del medio: 10 – 30 % del volumen del matraz
Temperatura: 35°C
pH: 4.2 (ajustar pH con tampón citrato)
Velocidad de agitación: 150rpm en el agitador orbital (shaker)
- Se utilizará como fuente de carbono y energía:
“glucosa”
Medio de Mantención:
Tabla 01: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (50 mL) NUTRIENTE
CONCENTRACIÓN (G/L) PESO (G)
PARA 50 ML
Extracto de Levadura 3 0.15
Peptona 5 0.25
Extracto de Malta 3 0.15
Agar 20 1.00
Glucosa 10 0.5
Medio de Activación:
Tabla 02: Concentración de Nutrientes para un medio de activación (20 mL) NUTRIENTE
CONCENTRACIÓN (G/L) PESO (G)
Glucosa 10 0.2Extracto de levadura 3 0.06Extracto de malta 5 0.1Soluciones de sales (de la tabla 04)
5ml/L 0.1
Se debe tener un Toptima= 35°C y N 240rpm
Medio Fermentación: Tabla 03: Concentración de Nutrientes para un medio de fermentación.
NUTRIENTE FUENTE CONCENTRACIÓN (g/L)
PESO (G)PARA 100 mL
xilosa C 10 1.8648Extracto de Levadura
- 3 0.6
(NH4)2SO4 N 3 0.6MgSO4.7H2O Mg 1.1 0.4KH2PO4 P y K 5 0.22Soluciones de Sales Concentradas
5 0.22
Curva de Calibrado de glucosa por Espectrofotometría por DNS (Patrón glucosa)
N° TUBO ml. de Solución Saturada
ml. de H2O destilada
Concentración (g/L)
ABS (540nm)
1 2.00 0.00 4.0 0.7922 1.75 0.25 3.5 0.6993 1.50 0.50 3 0.6114 1.25 0.75 2.5 0.5165 1.00 1.00 2.0 0.4156 0.75 1.25 1.5 0.3257 0.50 1.50 1.0 0.2028 0.00 2.00 0.0 0.000
Las concentraciones e hallaron de la siguiente manera:
TUBO N° 1 (C1)(V1) = (c2)(v2)
(2ml)(4g/L) = (2ml)(C2) C2 = 4g/L
TUBO N°2 (C1)(V1) = (c2)(v2)
(1.75ml)(4g/L) = (2ml)(C2)
C2 = 3.5g/L
Así se hizo para cada mezcla de cada tubo.
Tomando los puntos:
Concentración (g/L)
ABS (540nm)
4.0 0.7923.5 0.6993 0.6112.5 0.5162.0 0.4151.5 0.3251.0 0.2020.0 0.000
Graficamos [ abs] Vs. [X ]
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.50
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
f(x) = 0.198055137844612 x + 0.0117543859649123R² = 0.998369374126893
Curva de Calibrado de glucosa por Espectro-fotometría por DNS)
ABS (540nm) Linear (ABS (540nm) )
ABS
CON
CEN
TRAC
ION
(g/l
)
Determinación de Peso Seco Celular
CURVA PATRON DE BIOMASA
Determinación de Peso Seco Celular
MUESTRA PESO DEL CAPACHOGr.
PESO TOTAL = CÉLULA SECA + CAPACHO
PESO SECO CELULAR
1 0.1290 0.1325 0.00352 0.1242 0.1257 0.00153 0.1379 0.1422 0.00434 0.1096 0.1099 0.00035 0.1309 0.1320 0.00116 0.1338 0.1343 0.00057 0.1660 0.1661 0.0001PROMEDIO 0.0016
De las mismas muestras obtenidas (3 tubos de 5ml c/u), se determinó su absorbancia, tomando estas como 1:1, es decir, sin dilución: I.1. Determinación de biomasa por densidad óptica durante la cinética
de fermentación
TABLA Nº 02: Crecimiento Microbiano de Pichia stipitis NRRL Y-7124.
N° HORA tiempo (horas)
Absorbancia (640nm)
1 09:30:00 a.m. 0.00 0.0282 11:11:00 a.m. 1.81 0.0383 12:50:00 p.m. 3.20 0.0484 02:58:00 p.m. 5.28 0.0335 04:05:00 p.m. 6.75 0.0346 05:20:00 p.m. 7.90 0.0327 06:15:00 p.m. 8.85 0.038
FIGURA 1: Curva de Crecimiento Microbiano de Picchia stipitis NRRL Y-7124, utilizando como fuente de carbono a la glucosa.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
0.045
0.05
Tiempo (horas)
Abso
rban
cia (6
40 nm
)
TABLA N° 03: DATOS DEL ANÁLISIS PESO SECO
N° Muestra
Peso inicial
(g)
Peso final (g)
X(g/5mL)
1 0.2385 0.239 0.00052 0.2446 0.2452 0.00063 0.2401 0.2406 0.00054 0.2476 0.248 0.0004
PROMEDIO 0.0005
X 1=0.0005g
5mLx
1000mL1 L
=0.1 g/L
X 2=0.0006g
5mLx
1000mL1 L
=0.12g/L
X 3=0.0005g
5mLx
1000mL1 L
=0.1g/L
X 4=0.0004g
5mLx
1000mL1L
=0.08g /L
TABLA N° 04: Datos De La Curva De Calibrado De Biomasa
[ ] ABS (640 nm)
X (g/L)
1:1
0.317 0.10.313 0.120.308 0.10.312 0.08
1:1 0.3125 0.1
1:2 0.167 0.053441:4 0.079 0.025281:8 0.042 0.01344
1:10 0.036 0.01152
0.3125 0.10.167 X
X=0.167∗0.10.3125
=0.05344
0.3125 0.10.042 X
X=0.042∗0.10.3125
=0.01344
0.3125 0.10.036 X
X=0.036∗0.10.3125
=0.01152
0.3125 0.10.079 X
X=0.079∗0.10.3125
=0.02528
Dilución 1:5 Dilución 1:10
Dilución 1:20 Dilución 1:50
FIGURA 02: Curva De Calibrado De Biomasa
0.0 0.1 0.20
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
f(x) = 3.125 xR² = 1
X (g/l)
Abso
rban
cia (6
40 n
m)
Dónde:
y = 0.3125 X
y: Absorbancia 640 nm
x : Biomasa g.L-1
R2 = 1
TABLA Nº 05: Crecimiento Microbiano de Pichia stipitis NRRL Y-7124.
tiempo (horas)
Absorbancia (640nm)
X (g/L)
00.028 0.00896
1.810.038 0.01216
3.20.048 0.01536
5.280.033 0.01056
6.750.034 0.01088
7.90.032 0.01024
8.850.038 0.01216
FIGURA 3: Curva de Crecimiento Microbiano de Picchia stipitis NRRL Y-7124,
utilizando como fuente de carbono a la glucosa.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0.016
0.018
Tiempo (h)
X (g
/L)
FIGURA 4: Curva Corregida de Crecimiento Microbiano de Picchia stipitis
NRRL Y-7124, utilizando como fuente de carbono a la glucosa.
0 1 2 3 4 5 60
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0.016
0.018
Tiempo (h)
X (g
/L)
El crecimiento de biomasa según se muestra en nuestra grafica se observa un crecimiento notorio hasta las 3 horas y un aproximado de 20 minutos, es en este intervalo que se
manifiesta el crecimiento y se puede determinar el µM, para la
A. Cálculo de la Productividad Celular:
Con referencia a los datos de la tabla Nº 05
Productividad Máxima:
Evaluada en la fase Exponencial:
QX /S=X−X0
t−t0
Q x/ s=0.01536−0.01216
3.2−1.81
Q x/ s=0.002302g .biomasaL .hora
Productividad Total:
tiempo (horas)
Absorbancia (640nm)
X (g/L)
00.028 0.00896
1.810.038 0.01216
3.20.048 0.01536
5.280.033 0.01056
El crecimiento de biomasa según se muestra en nuestra grafica se observa un crecimiento notorio hasta las 3 horas y un aproximado de 20 minutos, es en este intervalo que se
manifiesta el crecimiento y se puede determinar el µM, para la
6.750.034 0.01088
7.90.032 0.01024
8.850.038 0.01216
Evaluada en todo el crecimiento Microbiano:
QX /S=X−X0
t−t0
Q x/ s=0.01216−0.00896
8.85−0
Q x/ s=0.00036158g .biomasaL .hora
B. Calculo de la velocidad máxima de crecimiento exponencial (µ máx)
TABLA Nº 06: Linealización de la fase exponencial del Crecimiento
Microbiano de Pichia stipitis NRRL Y-7124 de la tabla Nº 05
Tiempo (horas)
X (g/L) Ln(X/X0)
1.810.01216 0.30538
3.20.01536 0.53899
FIGURA 04: Linealización de la Fase Exponencial del Crecimiento
Microbiano de Pichia Stipitis NRRL Y-7124.
1.5 1.7 1.9 2.1 2.3 2.5 2.7 2.9 3.1 3.3 3.50.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0.55
0.6
f(x) = 0.16850317769179 xR² = 0.999999478880591
Tiempo (h)
Ln (X
/Xo)
lnXX0
=μmax . t
La ecuación lineal es: y = 0.1685X
Reemplazando las variables según las gráficas:
lnXX0
=0 .1685 t
Entonces:
µ máx. = 0.1685 h-1
C. Calculo del tiempo de duplicación:
td=ln2μmax
Reemplazando:
td=ln20 . 1685
td=4 .1136horas
Esto es: td =4.1136 horas
D. Determinación de azucares reductores (Fuente de Carbono): Método
DNS
Tiempo (hr) ABS glucosa (g/l) Glucosa (g/l)*Dilución
(1:12)0 0.6854 1.1462 13.75449102
0.05 0.68 1.1372 13.646706590.1 0.665 1.1123 13.34730539
0.15 0.657 1.0990 13.187624750.2 0.64 1.0707 12.84830339
0.25 0.634 1.0607 12.728542910.3 0.623 1.0424 12.50898204
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.350.800
0.850
0.900
0.950
1.000
1.050
1.100
1.150
1.200
1.250
1.300
DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES
Tiempo (hr)
Conc
(g/l
)
Esta grafica de consumo de azúcares reductores nos da que la levadura
degrada la Glucosa para convertirla en azúcares, es por eso la
concentración de Glucosa disminuye en a través del tiempo por parte
de la levadura Pichia stipitis NRRL Y-7124, hasta el punto en que la
Glucosa es degradada casi por completo, entonces la concentración de
azúcares reductores empieza a disminuir ya que su consumo por parte
de la levadura se ve incrementada en mayor proporción que la
degradación de la Glucosa.
E. Curva de crecimiento de biomasa y consumo de sustrato
Tiempo
(Hr)
X Biomasa
(g/l)
Sacarosa (g/l) Sacarosa
(g/l)*Dilución
0 0.00896 1.262 10.0958083
8
1.5 0.01216 1.225 9.80306054
6
3 0.01536 1.174 9.39055222
9
4.5 0.01056 1.127 9.01796407
2
5.5 0.01088 1.064 8.51230871
6
6.5 0.01024 0.949 7.59414504
3
8 0.01216 0.881 7.04856952
8
0 1 2 3 4 5 6 7 86
7
8
9
10
11
12
0.008
0.009
0.01
0.011
0.012
0.013
0.014
0.015
0.016
Sacarosa (g/l)*Dilución X Biomasa (g/l)
Tiempo
Conc
(g/l
)
F. Cálculo de rendimiento (Yx/s)
a. Sustrato en célula:
Y xs
= 0.01216−0.0089610.09580838−7.048569528
Y xs
=0.00105(gr debiomasa¿¿gr de sacarosa)¿
Y xs
=0.105 %
Esta grafica resumen, se observa
de como el sustrato (Glucosa) va
disminuyendo conforme aumenta
la biomasa, esto se debe por que
la biomasa va consumiendo el
sustrato.
G. método enzimático en la experiencia con Pichia stipitis NRRL
Y-7124 utilizando glucosa como fuente de carbono.
|¿|0.3264 X (glucosa gL )
TIEMPO ABS ABS*Factor [ ] GLUCOSA
0 0.158 1.264 3.87254902
0.05 0.166 1.328 4.068627451
0.1 0.14 1.12 3.431372549
0.15 0.151 1.208 3.700980392
0.2 0.156 1.248 3.823529412
0.25 -0.085 -0.68 -2.083333333
0.3 0.151 1.208 3.700980392
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.253
3.2
3.4
3.6
3.8
4
4.2
TIEMPO (HORAS)
CON
CEN
TRAC
ION
G/L
Tabla Nº04: Parámetros cinéticos y rendimientos determinados en la
experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando
glucosa como fuente de carbono.
Parámetro cinético
y rendimientos
Valor obtenido
experimentalmente
m (h-1) 0.1685
td (h) 4.1136
Qmáx x/s (g/L*h) 0.002302
Xmax (g/l) 0.01536
H. Variación del pH durante el crecimiento celular:
Tabla Nº 05: Variación del pH Respecto al Tiempo
Tiempo pH
1 4.5
7.5 4.552
I. CROMATOGRAFÍA DE GASES.
Existe Una gran variedad factores que impidieron producir etanol, una de ellas posiblemente
fue la mala manipulación de la muestra en el análisis de la curva de DNS, donde la muestra fue
expuesto al aire por mucho tiempo causando esto la evaporación del etanol.
GRUPO A2 ETANOL M3
ABS=0.048
Para realizar la curva de calibración se usó una solución de etanol, metanol y propanol como patrón interno, se les midió el área a diferentes concentraciones y se hizo la relación de área entre los dos picos. Los datos para esta se muestran en la gráfica relación de área vs porcentaje de etanol (v/v).
Y=aX+b
a=6.872274 e−006
b=−0.3801215
R2=0.9981825
R=0.9990908
0 50000 100000 150000 200000 Area0.000
0.003
0.005
0.007
0.010
0.013
Conc.(x100)
CON. ÁREA0.2 83.5960.6 141.8331 205.383
1.4 256.076
De esta curva se obtiene la ecuación lineal y = mx.
Y=6.872274−6 X−0.3801215
Entonces se adiciona una masa conocida del estándar interno a una masa conocida de
muestra y esta mezcla se inyecta al cromatógrafo. Del cromatógrama se obtienen las áreas
de analito y del estándar y luego con la ecuación de calibración y conociendo la masa del
estándar se puede obtener la masa del analito en la muestra.
% (v /v )=Relaciónde área−0.3801215
6.872274−6 %¿¿¿
CONSUMO DE SUSTRATO
Se diluyó la muestra inicial en 1/3 es decir se colocaron en casa tubo de ensayo 1ml de muestra
(sobrenadante) + 2ml de H2O destilada. Luego se siguió con el proceso indicado para determinar
Azúcares Reductores por el Método DNS.
La siguiente ecuación, se obtuvo de la Curva de Calibrado para el consumo de sustrato.
Donde: y = Absorbancia; x = Conc. Sustrato
TiempoAbs.(540 nm)
Concentración Sustrato
(g/L)
Concentración Sustrato
(g/L) * factor de DILUCIÓN (2)
0 0.648 3.3345 10.00351 0.640 3.2935 9.88052 0.638 3.2832 9.84963 0.635 3.2678 9.80344.5 0.634 3.2626 9.78786 0.633 3.2525 9.75757.5 0.630 3.2422 9.72669 0.613 3.1549 9.4647
Ahora, vamos a graficar el Crecimiento Celular con el Concumo de Sustrato a través del tiempo
y = 0.1949X-0.0019
0 1 2 3 4 5 6 7 8 93.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
Tiempo Vs. So (Conc. Sustrato)
Tiempo (h)
Conc
entr
ació
n Su
stra
to (g
/L)
TiempoConcentración Celular (g/L)
Concentración Sustrato (g/L)
8:30am (Punto 0) 0.110599078 7.595064498
9:30am (Punto 1) 0.110599078 7.583847448
11:30am (Punto 3) 0.122119816 7.2809871
2:00pm (Punto
5.5) 0.168202765 6.697700505
5:00pm (Punto 8) 0.099078341 6.686483455
Xo
Observamos en la gráfica que el crecimiento celular no fue el esperado, ya que hubo muerte celular a las 5.5 horas de iniciada la fermentación. El consumo de sustrato, por ende, no será demasiado, ya que al haber una mínima cantidad de masa celular, el consumo de sustrato será demasiado para ellas. La variación de sustrato, aproximadamente, fue de 0.9g/L. No se determinó el máx ya que no seμ preesenció un crecimiento logarítmico adecuado.
So
0 1 2 3 4 5 6 7 8 90
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
6.2
6.4
6.6
6.8
7
7.2
7.4
7.6
7.8
Tiempo Vs. [X] y [S]
Series2Series4
Tiempo (hr.)
Conc
entr
ació
n (g
/L)
Entonces, graficamos el Tiempo versus el Ln(x), de la siguiente manera:
Si se quisiera determinar el valor de Umáx, se tendría que hacer lo siguiente:
(dx/dt) = u.x
(dx/x) = u.dt
INTEGRAL DE Xo – X de (Lnx) = INTEGRAL DE 0 – t (u.dt)
Ln(x) – ln(xo) = u.t
Ln(x) = u . t + ln(xo)
Y = 0.3614x - 07466
0 0.5 1 1.5 2 2.5
-0.8
-0.7
-0.6
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0f(x) = 0.361427948908082 x − 0.746639684805616
ln(x) vs tiempo(horas)
tiempo(horas )
ln(x
)
μmáx = 0.3614
Tiempo (horas) ln(x)
Concentració
n Celular
(g/L)
0 -0.73563723 0.4792
1 -0.40721664 0.6655
2 -0.01278133 0.9873