tecnología de cultivos celulares en investigación, producción de

CULTIVO DE CÉLULAS EN LA PRODUCCION

DE BIOLOGICOS

M.V. ROQUE FERNANDEZ VERA

Introducción histórica.

• Hooke, Robert (1635-1703), 1º descubrimientos de las células vegetales.

• El cultivo de tejidos se desarrolló a finales del siglo XIX aplicado a técnicas de embriología.

• Roux : 1885 mantuvo células de embrión de pollo en solución salina durante unos días.

• Burrows y Carrel Utilizaron células de mamífero, perros, gatos , cobayos, y tumores sólidos.

• Rous y Jones (1916) emplearon extractos con tripsina disociar células y embriones , estableciendo el 1º

cultivo celular

• Grey y col.(1952) establecen la 1ª línea celular continua, bien conocidas las células HeLa .

• Eagle (1955) 1ª investigación sistemática requerimientos nutritivos de las células en cultivo

• Hayflick y Moorhead (1961)1ª vez antibióticos para prevenir la contaminación de los cultivos de

fibroblastos

• Sato y col.(76-82) publicaron trabajos donde líneas celulares requieren mezclas distintas de hormonas y

factores de crecimiento en medios libres de suero.

• Los últimos años la aplicación de tecnologías en cultivo celular hay grandes avances para comprender

los mecanismos intracelulares e intercelulares estableciendo co-cultivos,...

• Actualmente ha revolucionado el manejo de cultivos celulares a través de la clonación, y los trabajos con

células madre:

Introducción histórica PERU.

• En Perú se realiza trabajos con tejidos de animales desde la década de los 50 donde se inocula

animales con virus como para la producción de vacuna antivariólica .

• Igualmente se trabaja vacuna antirrabica tipo FERMI inoculando corderos y tipo SEMPLE donde se

inocula conejos posteriormente se inocula ratones lactante vacuna antirrábica tipo FUENZALIDA Y

PALACIOS

• Entre los años 70 y 80 se trabaja con cultivos primarios la vacuna ANTIAFTOSA donde se usa epitelios

linguales de bovinos y adyuvada con Hidróxido de Aluminio.

• A finales de los 70 se construye el laboratorio de vacunas virales y un equipo de profesionales medicos

veterinarios se especializan en el centro de referencia de PANAFTOSA – BRASIL en la producción de

vacuna aftosa en cultivos celulares células BHK21

• En 1983 se inagura el LVV y se comienza con la producción de vacuna anti aftosa trivalente ( virus

O,A,C ) oleosa

• En1984 se propone la producción de vacuna antirrábica en CC (cel BHK) uso veterinario a partir 1986

se produce el primer lote de vacuna, y hasta la fecha se viene produciendo tratando de cubrir la

demanda nacional.

• En 1998 se trabaja lotes piloto de vacuna antirrábica en células VERO para humanos

CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS

Aplicaciones del cultivo celular. Los estudios Abarcan muchas disciplinas .

Actividad intracelular. trascripción de DNA, síntesis de proteínas, metabolismo energético.

Flujo intracelular. ej. ensamblaje y desensamblaje de los diferentes componentes intracelulares, movimientos del RNA : núcleo-citoplasma, movimiento de proteínas,...

Ecología celular. estudia necesidades nutricionales, infecciones, transformación celular (inducidas por virus o agentes químicos), cinética de población celular,...

Interacciones celulares. Procesos de inducción embrionaria, cooperación metabólica, inhibición por contacto o por adhesión, interacciones célula-célula.

CULTIVOS CELULARES

Áreas de Investigación

Virología :condiciones de cultivo, virus animales y plantas, producción vacunas antivirales.

Investigación del Cáncer

Inmunología. introducción de técnicas de fusión celular en producción de anticuerpos monoclonales, y el análisis genético de la célula somática.

Ingeniería de proteínas. producción de proteínas en líneas celulares : interferón, insulina, hormona de crecimiento,...

Estudios de interacción y señalización celular,. Comprende el estudio de los receptores y de las vias de translocación de la señal.

Aplicaciones diagnósticas. En medicina y farmacología destacan el análisis cromosómico de células crecidas a partir de muestras de amniocentesis, detección de infecciones virales, ensayos de toxicidad,...

Aplicaciones médicas : mantenimiento y producción de tejidos para transplante.

Aplicaciones industriales y agronómicas : producción por reproducción "in vitro" de clones de plantas de interés comercial,...

y otras muchas.

Cultivo de Células en Producción de Biológicos

Equipos en el laborataorio de CC

Cabinas de flujo laminar (áreas de trabajo y de contención estéril).

Incubadores : baños termostatizados, incubadores de CO2, Incubadores 'roller', ...

Instrumentos ópticos de observación del cultivo : microscopio invertido de contraste de fases, de fluorescencia,...

Instalación de criogenia (tanques de N2 líquido) y congeladores

Equipo de esterilización : autoclave, equipos de filtración,...

Otros instrumentos : centrífugas, contadores electrónicos (Cell Counters), equipo de purificación de agua, balanzas, pH-metro, pipeteadores...

NORMAS DE SEGURIDAD

TECNICAS DE LABORATORIO ESTANDAR Y NORMAS DE HIGIENE PERSONAL:

BPM, BPL, BPA, desarrollo procedimientos, minimizar riesgos biológicos, químicos y físicos.

El lavado de manos inicio y fin jornada y el uso de indumentaria de protección es obligatorio para el manejo de cultivos y agentes biológicos.

Usar sustancias antimicrobianas, secar con toallas de papel o aire.

No comer, beber, fumar, aplicarse cosméticos ni guardar o almacenar alimentos y bebidas en el área de trabajo del laboratorio.

No pipetear con la boca.

El ingreso a las zonas restringidas deben efectuarse únicamente a través de las instalaciones de cambio de ropa y ducha.

Vacunarse..

CULTIVOS CELULARES

CLASES DE CULTIVOS CELULARES

CULTIVOS PRIMARIOS

CULTIVOS EN MONOCAPA

CULTIVOS EN SUSPENSION

CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS

Cultivo primario: células, tejidos u órganos tomados

directamente de un animal.

Cultivo de órganos, explantes: mantenimiento de

órganos o parte de órganos in vitro.

Cultivo de tejidos: mantenimiento de tejidos in vitro.

Cultivo de células: mantenimiento de células dispersas.

Líneas celulares: células mantenidas por subcultivos

sucesivos comenzando por un cultivo primario.

Cultivos continuos: células que han logrado sobrevivir a

muchos subcultivos. Expectativa de

CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS

BHK: Fibroblastos de riñón de hamster sirio dorado CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico MDCK: Epitelio de riñón canino (Cocker Spaniel) CHO: Epitelio de ovario de hamster chino VERO: Fibroblastos de riñón de mono verde africano HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano MDBK: Epitelio de riñón de bovino adulto HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana FHBE: Endotelio de corazón fetal bovino Etc., etc., etc.

CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS

Sigla Nombre u organismo

Ciudad, país Nº de cultivos

ATCC American Type Culture Collection

Minassas, USA 800

DSMZ Human and Animal Cell Cultures

Braunschweig, Alemania

500

ECACC European Collection of Cell Cultures

Salisbury, Wiltshire, UK

1000

GEIMM Istituto Giannina Gaslini

Genova, Italia 2300

CULTIVOS CELULARES INSTALACIONES

CULTIVOS CELULARES EQUIPOS

CRIOPRESERVACION

MEDIOS DE CULTIVO CELULAR

Agua

Sales

Glucosa

Ácidos grasos

Vitaminas

Suero

Péptidos

Micro y oligoelementos Aminoácidos esenciales Factores de crecimiento Otro regulador de pH Indicador de pH Antiespumante ¿Antibióticos?

COMPONENTES:

MEDIOS DE CULTIVO CELULAR

CONDICIONES DE UN MEDIO

CUALIDADES:

Específico para la célula a cultivar

Nutritivo

pH adecuado

Capacidad buffer

Isotónico

Estéril

MEDIOS DE CULTIVO CELULAR

Medio Basal de Eagle (BME). Medio con aminoácidos esenciales. Se suplementa con suero bovino fetal al 10 %.

Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM). aminoácidos en mayor concentración que el BME. adición de suero (10 %).

R.P.M.I. 1640. crecimiento de linfoblasto y líneas celulares leucémicas en suspensión.

Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). 4 V AA y vit. selección de hibridomas .

Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que incluye en su formulación albúmina bovina, transferrina, selenito, et... linfocitos libre de suero.

McCoy 5A. L.C diploides tanto de rata como humanas.

Medio L-15 de Leibovitz. cultivo de virus.

Medio F-10 de Ham. L.C. humanas, se suplementan con proteínas, hormonas metales como Fe, Cu, Zn. Cé. amnióticas.

Medio F-12 de Ham. medio libre de suero.

Medio 199. usado para cultivo de células no diferenciadas y estudio de cromosomopatías.

MEDIO ESENCIAL MINIMO MEM

Composición Química:

L-arginina. HCL 126.00 mg/l Colina cloruro 1.00 mg/l

L-cistina. 2HCL 32.40 mg/l Acido fólico 1.00 mg/l

L-glutamina. 294.00 mg/l Inositol 2.00 mg/l D- glucosa 2000.00 mg/l Niacinamida 1.00 mg/l

L-histidina. 31.00 mg/l Bicarbonato de sodio al 7.5% 30.00 ml/l

L-isoleusina. 52.00 mg/l Piridoxal. HCL 1.00 mg/l

L-leucina 52.00 mg/l Riboflavina 0.10 mg/l

L-lisina 58.00 mg/l Tiamina HCL 1.00 mg/l

L-metionina 15.00 mg/l D- Calcio pantotenato 1.00 mg/l

L-fenilalanina. 32.00 mg/l Glutamina al 3% 10.00 ml/l

Sulfato de magnesio. 6H2O 200.00 mg/l

L-treonina 48.00 mg/l Cloruro de potasio 400.00 mg/l

L-triptófano 10.00 mg/l Cloruro de sodio 6500.00 mg/l

L-tirosina 2Na.2H2O 54.52 mg/l Fosfato dibasico de sodio 1327.00 mg/l

L-valina 46.00 mg/l Penicilina 1000.00 UI Rojo de fenol . 10.00 mg/l. Estreptomicina 100.00 mg/l

CULTIVOS CELULARES

SISTEMA DE CULTIVOS CELULARES

CULTIVOS ESTACIONARIOS

CULTIVOS ROTATIVOS

CULTIVOS EN SUSPENSION

ESTACIONARIO

ROTATIVO

PRODUCCION DE BIOLOGICOS

ROTATIVO

ROTATIVO

ROTATIVO Y SUSPENCION

PRODUCCION DE BIOLOGICOS MICROPORTADORES

RECUENTOCELULAR

CELULAS MDCK CELULAS BHK

CULTIVO DE TEJIDOS

RFV

CULTIVOS CELULARES

PRODUCCION DE BIOLOGICOS

VACUNA ANTIVARIOLICA

VACUNA ENCEFALITIS EQUINA

VACUNA ANTIAFTOSA (FRENKEL)

VACUNA ANTIAFTOSA (OLEOSA)

VACUNA HEPATITIS

VACUNA INFLUENZA

VACUNA ANTIRRABICA

OTRAS VACUNAS

PRODUCCION DE VACUNA ANTIRRABICA

VACUNA EN CULTIVOS CELULARES

INACTIVACION DE ANTIGENO

CLARIFICACION DE ANTIGENO

ANTIGENO RABICO PARA FORMULACION

ENVASE DE LA VACUNA

TAPONADO Y PRECINTADO

CONTROL DE VACUNAS

Hay factores importantes en la fabricación de Vacunas Antirrábicas, para el

control se emplean ratones adultos de (11- 14 gr.) y lactantes los cuales deben

provenir de criaderos garantizados, debiendo tener buenas condiciones de

manejo, alimentación y salud.

Los controles son decisivos, para poder usar un biológico, entre ellos tenemos

ESTERILIDAD

SEGURIDAD GENERAL

INOCUIDAD

POTENCIA (NIH)

ESTABILIDAD

VACUNA DE USO VETERINARIO

Vacuna Antirrábica en CC

RFV

Vacunación Antirrábica

138.945

224.182

126.064

73.901

129.060

59.239

112.443

238.380

128.496

224.920

0.000

50.000

100.000

150.000

200.000

250.000

300.000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

CA

NT

IDA

D E

N F

RA

SC

OS

ENTREGAS REGISTRADAS DE LA VACUNA

ANTIRRÁBICA 2004-2013

CANTIDAD

1,389,450

2,241,820

1,260,640

739,010

1,290,600

592,390

1,123,260

2,383,800

1,284,960

2,249,200

0

500,000

1,000,000

1,500,000

2,000,000

2,500,000

3,000,000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

CA

NT

IDA

D E

N D

OS

IS

ENTREGAS REGISTRADAS DE LA VACUNA ANTIRRÁBICA 2004-2013

CANTIDAD

«EL TRABAJO INDIVIDUAL GANA UNOS PASOS

PERO EL TRABAJO EN EQUIPO LOGRA LAS METAS

PRODUCIMOS PARA PROTEGER LA SALUD »

LVV

GRACIAS…