producciÓn de proteÍnas recombinantes en cÉlulas de...

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS

RECOMBINANTES EN CÉLULAS DE

MAMÍFEROS

• En 1986 el activador de

plasminógeno tisular humano

(tPA, Activase; Genentech USA)

fue la 1er proteína terapeútica

proveniente de células de

mamífero en ser aprobada para

la venta.

• Más del 70 % de las proteínas

recombinantes terapeúticas de

las farmaceúticas son producidas

en células de mamíferos

EXPRESIÓN DE GENES EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS

Producción de proteínas biofarmaceúticas

Baeshen et al. Microbial Cell Factories 2014, 13:141

US sales of top nine classes of biologic drugs in 2011. Adapted from Aggarwal et. al

Recent advances in mammalian protein production. Ashok D. Bandaranayake1 and

Steven C. Almo. FEBS Lett. 2014 January 21; 588(2): 253–260.

Nature Biotech. Vol 22, 11, 2004

21 días

Mejoramiento en 20 años

¿Cómo se mejoró la producción en estos años?

Mejoramiento de:

Vectores

Ingeniería de la célula huésped

Desarrollo de medios de cultivo

Métodos de screening

Desarrollo e ingeniería de procesos

EXPRESIÓN

ESTABLE

TRANSITORIA

EXPRESIÓN DE GENES ESTABLE

Integración del gen de interés en genoma por

recombinación no homóloga

Ubicación aleatoria

Líneas celulares: CHO (Chinese hamster ovary)

NSO (mouse myeloma)

BHK (baby hamster kydney)

HEK-293 (human embryo kidney)

Lineas celulares usadas para producir glicoproteínas por industrias farmaceúticas

Adaptado de Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells

Marie-Eve Lalonde, Yves Duroche. Journal of Biotecnology, 2017

Células CHO

Se adaptan y crecen en suspensión

Pocos virus humanos se propagan en ellas

Pueden crecer en medio libre de suero y medios

químicamente definidos

Modificaciones postraduccionales

Funcionan varios sistemas de amplificación génica

MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN

Fosfato de calcio, DEAE dextran (transit), polietileneimina

Electroporación

Liposomas

Bombardeo con partículas

Microinyección

La linearización de los plásmidos mejora la eficiencia de la transfección estable

Fosfato de calcio: precipita con el ADN

Polietileneimina: polímero catiónico

DEAE dextran: polímero catiónico

ENDOCITOSIS

ELECTROPORACIÓN

LIPOSOMAS

Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun

John A O'Brien and Sarah C R Lummis Nature Protocols 1, 977 - 981

(2006)

BIOLÍSTICA

MICROINYECCIÓN

VECTORES

Origen de replicación bacteriano

Marcador de selección bacteriano

Promotor para mamíferos y elementos regulatorios

Señal de terminación de la transcripción y poliadenilación

Marcador de selección para células de mamíferos

AGENTES DE SELECCIÓN

DHFR: dihidro folato reductasa

GS: glutamina sintetasa

ANTIBIÓTICOS: G418, puromicina,

higromicina

El gen de selección y el gen recombinante pueden estar en el mismo vector o en vectores separados

Para aumentar la chance de obtener líneas celulares altamente productoras el gen de selección puede estar bajo un promotor débil

DHFR: convierte DHF en THF, requerido en

síntesis de glicina, purinas y timidina

Células: CHO DHFR-

Medio de selección: sin hipoxantina, timidina, ni

glicina

Amplificación génica: METOTREXATE (MTX)

AMPLIFICACIÓN

GÉNICA CON MTX

El gen de la DHFR se amplifica

cuando las células son sometidas al

metotrexate (mecanismo de

resistencia)

Metotrexate

αMEM, FCS dializado

Clonado: dilución límite

CLONADO DE CÉLULAS RESISTENTES

2. Clonado por dilución límite

1. Aislamiento con cilindros

GLUTAMINA SINTETASA

Células: varias, NSO (murina), CHO K1, ambas con

baja actividad de GS

Medio de selección: sin glutamina

Amplificación génica: METIONINA SULFOXIMINA

(MSX)

Método más rápido que DHFR

Glufosinato: herbicida. Inhibe a GS,

causa aumento de NH4 que

envenena a las plantas

PROMOTORES y enhancers

Virales: CMV. MPSV (myeloproliferative sarcoma

virus), SV40, AdMLP (adenovirus major late promoter)

Celulares: EF Iα (factor de elongación α), βactina

Regulables: tetraciclina

El transporte citoplasmático y la traducción eficiente del RNAm en eucariotas depende del splicing, por lo tanto agregar al menos 1 secuencia intrónica entre el promotor y el ADNc

VECTORES BI CISTRÓNICOS

INTERNAL

RIBOSOME

ENTRY SITE

expresión balanceada de genes

IRES

marcador de selección

Para aislar células

productoras x FACS

Expresión estable

Sistema de expresión regulada en células de mamíferos

ON: cumermicina OFF: novobiocina

Sistema para expresión transitoria y estable

Secuencia consenso KOZAK

Elemento regulatorio pos transcripcional

WOODCHUCK: WPRESecuencia presente en región 3´ no traducida (3´UTR) del virus de

hepatitis B

Su presencia mejora la expresión genética a nivel post transcripcional

modificando: poliadenilación, exportación y/o traducción.

Matrix attachment regions: MARsSecuencias del ADN en donde la cromatina se une a la matriz nuclear.

Zonas transcripcionalmente activas, asociadas con hiperacetilación de

histonas.

Ubiquitous Chromatin Opening element: UCOE

Isla CpG libre de metilación que anula los efectos dependientes del sitio

de integración (insulator) y mantiene la cromatina ‘’abierta’’…mayor

transcripción

MEJORAMIENTO DE LA PRODUCTIVIDAD

ESPECÍFICA DE LAS LÍNEAS CELULARES

Método de transfección/cantidad de plásmido

transfectado ??

Aumentando la rigurosidad de la presión de

selección: altas dosis de MTX en células DHFR-

transformadas con DHFR reducción de nº de

líneas celulares a examinar

Pero, altas dosis de drogas crecimiento lento de

las células

Atenuación del marcador de selección

Mutación del gen para reducir su actividad

uso de codones

promotor débil

Modulación de la expresión desestabilización del ARNm: sec. ARE (rica en AU)

desestabilización de la proteína: sec. PEST

atenuación de IRES

PEST sequences and regulation by proteolysis Martin Rechsteiner and Scott W. Rogers TIBS 21 - JULY 1996

Regiones ricas en P, E/D, S y T flanqueadas por aa básicos

presentes en proteínas de vida media corta. Están en enzimas

claves de control metabólico, ciclinas, proteínas quinasas y

fosfatasas, factores de transcripción

Ingeniería celular

Generación de líneas celulares con mayor

productividad y supervivencia: transformación

con proto oncogenes, genes reguladores del ciclo

celular, genes de factores de crecimiento (ej.

IGFI), genes antiapoptóticos.

Expresión de fosfatasa alcalina, junto con p27 y bcl-xl. Vector tricistrónico inducible

Optimización del

medio de cultivo

Medios de cultivo de

composición definida

Cultivos sin suero

Medios libres de suero

Suplementos: transferrina

factores de crecimiento: insulina/ IGF1

hidrolizados (animales, levaduras, plantas)

albúmina

Problemas: adaptación celular

velocidad de crecimiento reducida

menores rendimientos

MEJORAMIENTO DE SCREENING

PARA DETECTAR LAS MEJORES

PRODUCTORAS

La células en suspensión pasan en “fila india” y son

iluminadas por un rayo láser. La luz dispersada o la

fluorescencia emitida (si fueron marcadas con un

fluorocromo) es colectada, filtrada y convertida a valores

digitales que son guardados en una computadora

Citometría de Flujo

Técnica analítica que mide propiedades de células

suspendidas en un fluido

MEJORAMIENTO DE SCREENING PARA

DETECTAR LAS MEJORES PRODUCTORAS

Métodos basados en FACS: fluorescense activated

cell sorting = citofluorometría de flujo

Extensión de la citometría de Flujo

Permite la separación física de poblaciones celulares

seleccionadas, para luego utilizarlas en diferentes

ensayos.

Luego del análisis, el fluído es separado en una serie

de gotas.

Aquellas gotas que contengan las células de interés,

son electrostáticamente cargadas y desviadas hacia

un receptáculo.

FACS

FACS

Coexpresión del gen de interés (GI) con GFP, células

seleccionadas por fluorescencia de GFP

Coexpresión del GI con una proteína de superficie

que puede ser marcada por un anticuerpo específico

fluorescente

Incubación de células transformadas con DHFR con

MTX fluorescente

Para aislar células

productoras x FACS

ClonePix

Selector de colonias automático

Se cultivan las células en medio semi sólido para formar colonias

individuales

Los clones mejores productores son aspirados

y transferidos a una nueva placa

Cell Xpress

Identifica y purifica las células mejores productoras.

Lisis foto mecánica de las células que producen poco

ESTABILIDAD DE LA PRODUCCIÓN DE LA PROTEÍNA

RECOMBINANTE

Silenciamiento génico: reducción o eliminación de la

transcripción del gen

Mayor determinante: estructura de la cromatina en el sitio

de integración (hipoacetilación de histonas, metilación de H3, aumento de

la metilación CpG del promotor) heterocromatinización

Las líneas celulares candidatas deben ser cultivadas

durante varios meses sin presión de selección

Experiencia con CHO-DG44: sin presión de selección

½: silenciamiento en días

1/3: silenciamiento gradual en 6 meses

15-25%: estables sin selección

Hacker et al, Biotech. Advances, xxx, 2009

ESTRATEGIAS PARA EVITAR EL SILENCIAMIENTO

LCR (locus control region): segmento de ADN que controla la

estructura de la cromatina aumentando la expresión de genes

ligados, de manera tejido específica, dependiente del nº de copias e

independientemente de la posición

Insulators: elementos regulatorios de la transcripción que modulan

la interacción entre enhancers y promotores y protegen a los genes

del silenciamiento por cromatina adyacente de manera tejido

independiente

Bloqueo de desacetilación de histonas: butirato, ac. Valproico

Inhibidores de ADN metil transferasas: azacitidina.

“Gene targeting”: dirigir inserción a zonas de eucromatina

Barras: células que expresan IL2R, promedio de 10 líneas celulares estables

(blancas: 1 copia del gen , negras: multicopia)

La presencia del insulator cHS4 βglobina protege la expresión

del transgen en el tiempo

Methods in Molecular Biology, vol 267: Recombinant Gene Expression

Recombinación sitio-específica

Recombinasas fago P1: cre lox

Saccharomyces cerevisiae: flp FRT (Flp recombination target)

fago λ: λ integrasa attP y attB (irreversible)

“Genomic hot spot”

Mammalian Chromosome Engineering: Methods and Protocols,

Methods in Molecular Biology, vol. 738, 2011

Integración dirigida

ZFN: Zn finger n.

Endonucleasas TALENS: transcription activator-like effector n.

Meganucleasas

Cortan secuencias específicas de ADN se favorece la integración de genes

por recombinación homóloga

CRISPR

Cromosomas artificiales: tecnología ACE

Fundamentalmente secuencias repetitivas, ADN satélite, ricas en AT

Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 21

Cromosomas artificiales: tecnología ACE

Transferencia de cromosomas a otras líneas celulares

Aislamiento de los ACEs por citometría de flujo. Tinción diferencial

con Hoescht 33258 (AT) y cromomicina-A3 (GC).

Cultivos celulares para producción

Células adheridas

microcarriers

Roller bottles

Células en suspensión

Adaptación de las células a crecer en suspensión

Transformación de células en suspensión

Desarrollo de bioprocesos en escala pequeña, “scale down”

Spinner flask

Volúmen min. 50 ml. Densidad celular 2-3 10 6 cel/ml

TubeSpin reactors

Tubos ventilados de 50 ml . Se alcanzaan

densidades celulares > 107 cel/ml en 5-20 ml

SimCell technology

EXPRESIÓN DE GENES TRANSITORIA

¿Para qué?

• Verificar la identidad del gen clonado por la

expresión de una actividad

• Probar efecto de mutaciones sobre la actividad de

una proteína

• Aislar genes de una biblioteca por la expresión de

una actividad

• Ahorrar tiempo y dinero

CÉLULAS COS: African green monkey cells

transformadas con virus SV40 defectuoso en el origen

de replicación. Producen el antígeno T grande pero no

partículas virales.

Vector: ori de SV40, 10.0000 a 100.000 copias/célula.

CÉLULAS WOP: células de ratón 3T3 transformadas

con virus polioma defectuoso en el origen de replicación.

Producen ag. T grande pero no partículas virales.

Vector: ori de polioma.

Supresor ambar: Se propaga en E. coli que contiene el plásmido helper P3

que tiene mutaciones ambar en gen de R a tetraciclina y ampicilina

EXPRESIÓN TRANSITORIA

Células COS

Expresión transitoria: 2 sitios de clonado

CÉLULAS COS

No introducen fucosas.

En algunos casos la

glicosilación es pobre

EXPRESIÓN TRANSITORIA A GRAN ESCALA

• Período: 1-14 días post transfección en cultivos en

suspensión.

• Células: CHO y HEK-293 (human embryonic kidney)

Sistemas episomales: HEK-293 T (Ag T SV40), HEK-293

EBNA (Ag virus Epstein Barr), CHO-T (Ag T Py).

• Desarrollo de vectores para expresión episomal

(producen el Ag T)

• Volúmen hasta 2008: 100 l.

• Ahorro de tiempo y $: no hay selección

• En HEK293: se llegó hasta 1 g/l en 14 días (2008)

• No hay proteína de uso terapeútico aprobada hasta

el momento….???

• Transfección: fosfato de calcio, polietileneimina,

DEAE dextrano o electroporación. Eficiencia: > 70 %

• Infección viral: alfavirus, adenovirus, vaccinia.

Estrategias para aumentar la expresión

Sobre expresar proteínas anti apoptóticas: bcl2,bcl-x

Detener el ciclo celular: agentes anti mitóticos

conchicina, vinblastina, etc o genéticamente con

inhibidores del ciclo celular p21,p18, 27

Agregar factores de crecimiento: FGFa, IGF

Inhibidores de ADN metil transferasas y de histonas

deacetilasas (ácido valproico, butirato)