practica 9 analisis microbiologico de mariscos
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PRACTICA N 9
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE MARISCOS
I.INTRODUCCIN
Alteraciones en la manipulacin almacenamiento de mariscos
1.1 Cambios bioqumicas
Las modificaciones sufridas por el marisco desde su captura hasta que
llega al consumidor tienen aspectos similares a las del pescado, pero
difieren notablemente en otras. El envejecimiento y el deterioro de los
tejidos ocurren de modo parecido al del pescado, y se ve influido por
idnticos factores. La escasa cantidad de glcidos en los crustceos y la
riqueza en enzimas proteoliicos determinan una leve cada del pH y una
rpida alterabilidad, con liberacin de compuestos nitrogena dos
voltiles. Algunos enzimas oxidan pigmentos, que dan lugar a un
ennegrecimiento de la cabeza conocido como melanosis. En los
moluscos, la cifra de glcidos permite un mantenimiento mas prolongado
de su buen estado.
1.2 Derivados de los mariscos
Los productos derivados de los mariscos que recoge el Cdigo
Alimentario Espaol son: semiconservas, conservas, sopas de mariscos
y bullabesas y platos cocinados.
Tienen caractersticas parecidas a las de los derivados del pescado,
pero lgicamente la base la constituyen los crustceos y los moluscos.
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Semiconservas.-Son productos a base de crustceos y de moluscos sometidos a un tratamiento apropiado y mantenidos en
recipientes impermeables al agua a presin normal. Las
semiconservas deben almacenarse en frigorfico y su conservacin
es limitada en el tiempo. Pueden darse como mariscos enteros o
troceados y suelen llevar un lquido de cobertura, que puede ser
aceite vegetal, vinagre o la mezcla de ambos en diferentes
proporciones y con distintos condimentos.
Conservas.- Son aquellos productos hechos (OR moluscos o crustceos, con o sin adicin de sustancias autorizadas, contenidos
en envases hermticamente cerrados y tratados exclusivamente por
el vapor, para asegurar su conservacin.
1.3 Alteraciones en e almacenamiento
El marisco congelado almacenado sufre, al igual que el pescado,
procesos que cambian su composicin lipidia. Las grasas modificadas
con las protenas, dando lugar a complejos lipoproteicos y a compuestos
de molcula pequea. Aparecen pigmentos castao-rojizos, equivalentes
a la lipofucsina, que se utilizan para determinar la edad de los
crustceos marinos. La interaccin lipdico-proteica retarda la oxidacin
de las grasas durante e almacenamiento.
En los mariscos enlatados y sometidos a la accin del calor se precisa
realizar una serie de tareas. Las gambas y otros crustceos, despus
de descongeladas, se lavan, separado los ejemplares rotos, decolorados
o alterados y los residuos extraos. Ms tarde, se les quita la cabeza y
se pelan; posteriormente, se escaldan en salmuera hirviente. Estas
gambas precocidas se lavan de nuevo, se revisan, se categorizan y se
envasan a mano o a mquina.GUIA DE LABORATORIO Biol. Ms. C. Alicia Decheco EgusquizaMICROBIOLOGIA II
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Por ltimo, se aade salmuera, aceite o salsa y se cierran los envases.
En cuanto a las almejas y otros moluscos, en primer lugar se lavan para
que desaparezca la arena y el barro; luego, se precuecen al vapor. Mas
tarde, se extraen de las conchas a mano o a maquina y se cortan por un
lado para eliminar completamente la arena o el barro que pudiera
quedar. Tras un nuevo lavado se extirpan el sifn, las paredes laterales
del cuerpo y el estmago, procediendo, por ltimo, al envasado y a la
adicin de agua, salmuera, aceite, jugo o salsa.
Como ocurre en el pescado, tras someter a gambas, langostas y
cangrejos a la accin del calor, pueden aparecer manchas negras en la
superficie por el depsito de sulfuro de hierro.
2. Microbiologa de los mariscos
2.1 Caractersticas microbiolgicas
La presente de bacterias en la superficie de los crustceos es similar a la
del pescado. En el caso (de los moluscos, la contaminacin se reduce
ostensiblemente cuando se someten a depuracin en tanques con agua
marina limpia circulante. La posible existencia de grmenes patgenos
se corresponde con el lugar donde viven y con la forma de alimentarse,
caracterizada, en los moluscos bivalvos, por la filtracin de muchos litros
de agua cada da. Los microorganismos ms ubicuos son Salmonella,
Shigella, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Clostridium perfringens y
virus.
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2.2 Cambios microbiolgicos
Las alteraciones microbiolgicas que sufren los mariscos constituyen,
en muchos casos, graves problemas de salud pblica. Los crustceos se
suelen capturar en regiones alejadas de la costa, por lo que no suelen
portar grmenes patgenos. No obstante, se ha extendido su cultivo en
viveros de regiones costeras, en las que el peligro de contaminacin se
multiplica; de hecho, se han descrito importantes brotes de intoxicacin
por Vibrio parahaemolyticus, procedente de residuos terrestres, en
mariscos cocidos y recontaminados con posterioridad.
En los moluscos con alteraciones de detecta un crecimiento de bacterias
Gram negativas proteolticas: Pseudomonas y Vibrio, y sacarolticas:
Lactobacillus. Las primeras generan aminas y amoniaco; las segundas
reducen el pH. Tomar ciertos moluscos bivalvos crudos puede ocasionar
toxiinfecciones graves por Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae,
Escherichia coli, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens,
Staphylococcus aureus enterotoxignico, Vibrio parahaemolyticus y
virus. El consumo de otras alteradas puede acarrear cuadros de fiebres
tficas, paratficas, hepatitis vricas. Los mejillones crudos, mal cocinados
o recontaminados, pueden ser origen de fiebres tficas y de
salmonelosis.
Mencin aparte merece la contaminacin por biotoxinas marinas
fabricadas por los dinoflagelados presentes en el plancton. Algunos
biotoxinas afectan al sistema nervioso las neurotoxinas y otras, al tubo
digestivo enterotoxinas -. En determinadas circunstancias favorables,
los dinoflagelados ascienden hacia la superficie marina y se reproducen
rpidamente, dando lugar a coloraciones extraas, entre las que
predomina el rojo; este fenmeno se conoce como marca roja o purga
de mar. Los moluscos, en especial, los mejillones y las almejas, filtran
cada da grandes cantidades de agua y se alimentan de estos
organismos, y las toxinas se fijan al hepatopncreas o al sifn. Al ser GUIA DE LABORATORIO Biol. Ms. C. Alicia Decheco EgusquizaMICROBIOLOGIA II
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consumidos por el ser humano, sobreviene la intoxicacin que, en el
caso de la neurotoxina, puede ocasionar la muerte y en el de la
enterotoxina, provocar trastornos gastrointestinales.
2.3 Control microbiolgico de los mariscos
Las muestras de crustceos con caparazn se consiguen
desinfectando, su superficie con alcohol de 70C y, luego, se retiran
aspticamente con material estril. Si carecen de caparazn, la carne se
debe manipular tambin (le modo asptico con material estril).
Si se trata de moluscos se debe tomar un nmero suficiente (los
individuos para que el volumen de carne y de lquido intervalvar no sea
inferior a 0 ml.
Se deben limpiar concienzudamente a chorro y mediante un cepillo para
retirar todo tipo de sustancias extraas adheridas a las conchas como
algas, tierra, etc.
Tras un ligero flameado, las valvas se abren y recogen los cuerpos y el
lquido intervalvar sobre pro beta estril. Se aade diluyente hasta
obtener un dilucin 1:10 0; se puede utilizar como diluyente solucin
Ringer a 1/4 agua de triptona. Finalmente, la mezcla se tritura y
homogeneiza y se usa como solucin madre.
El protocolo de estudio microbiolgico en los mariscos es el siguiente:
Recuento de colonias aerobias revivificables.
Investigacin y recuento de Escherichia coli.
Investigacin y recuento de Enterobacteriaceae totales.
Investigacin de Salmonella y Shigella.
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Investigacin y recuento de Streptococcus aureus
enterotoxignico.
Investigacin y cuento de Streptococcus D. de Lancefield.
Investigacin de Vibrio paraharahaemolyticus
Investigacin de biotoxinas marinas hidrosolubles (PSP).
Investigacin de biotoxinas marinas liposolubles (DSP).
Investigacin de toxinas botulnicas.
Para la investigacin de toxinas marinas se puede recurrir a mtodos
biolgicos, inmunolgicos y qumicos. El bioensayo en ratn es el
Procedimiento oficial para determinar biotoxinas PSP, y es el mejor
mtodo de que se dispone. Se valora la posibilidad de sustituirlo por
algn otro mtodo, especialmente, fluoromtrico o HPLC. Para las
biotoxinas DSP se puede utilizar el bioensayo en ratn o HPLC.
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Preparacin de la muestra
Mariscos con valvas:
1. Recipiente con boca ancha con capacidad de 20 unidades de mariscos
con valvas aprox. 10 gr.
2. Recipiente con escurridero de agua.
3. Vaso de precipitacin con 500 ml. de capacidad.
4. Vaso de licuadora estril.
5. Escobilla dura.
6. Cuchillo estril
7. Cuchara estril
8. Servilleta estril.
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9. Balanza de capacidad no inferior a 2500 gr. y una sensibilidad de 0.1 gr.
10.Licuadora de 2 velocidades.
11. Alcohol etlico de 70%.
12.Solucin buffer de fosfato o agua de peptona el 01%.
13. Mechero.
14. Asa de siembra.
15. Tubo con cultivo puro.
16. Tubo con TSI.
17. Tubo con SIM.
18. Tubo con LIA.
19. Tubo con citrato.
PROCEDIMIENTO
1. Colocar 20 unidades de mariscos valvados en un recipiente de boca
ancha. Cepillar cada uno de ellos bajo el chorro de agua potable, con
especial atencin a las grietas y uniones de las valvas.
2. Colocar las muestras limpias en un recipiente con calador y dejar
escurrir el agua.
3. Lavar y desinfectar las manos con alcohol de 70%.
4. Colocar la muestra en la mano sobre una servilleta de papel limpia, de
tal forma que una de las partes convexos, descanse sobre la palma de la
mano.
5. Insertar el cuchillo en el punto de unin de las valvas. Cortar el msculo
de la valva superior, palanquear las valvas y dejar que el lquido caiga
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sobre el vaso de precipitados previamente tapados. Retirar la baada
superior y transferir la carne al vaso contenido el lquido valvar.
6. Pesar el vaso con la muestra extrada.
7. Transferir la muestra al vaso de la licuadora.
8. Adicionar una cantidad igual al peso de la muestra de solucin buffer de
fosfato o agua peptonada al 0.1%.
9. Homogenizar tomando las precauciones indicadas en preparacin y
dilucin de las muestras de alientos ( 2 ml de este, homogenizado
contienen 1 gr. de mariscos).
En caso de que el homogenizado resulte de consistencia pesada y difcil de
pipetear, adicionar 3 partes de diluyentes en peso de la muestra (4 ml., de
esta muestra contiene 1 gr de las muestras en examen). Corregir las
proporciones a ser tomadas para la siembra.
MEDIOS UTILIZADOS
CALDO AZIDA GLUCOSA
Art. Num 1590
Para ensayo previo orientativo de enterecocos y para enriquecimiento selectivo
de los mismos.
Este medio de cultivo corresponde a las recomendaciones de los
Estndar Methods for the Examination of Water and Wastewater (1975).
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Forma de preparacin
La sodio-asida presenta en una concentracin que respeta al mximo a
los enterococos e inhibe notablemente a la flora gram-negativa que les puede
acompaar.
La utilizacin de sodio-azida como sustancia inhibidora selectiva de
bacterias gramnegativas se remonta a los trabajos de EDWARS (1933 1938)
y HARTMANN (1936) sobre el aislamiento del Str. Agalactiae, Ulteriormente,
MALLMANN (1940) y SNYDER aislamiento de enterococos a partir de aguas.
La demostracin de enterococos (Streptococcus faecalis, S. bovis y S.
Equinus) sirve como un indicador de contaminantes fecales, especialmente de
corrientes de agua, aguas residuales que contengan cloro y baos Yodo, en
todos los cuales pueden estar ya extinguidas en el momento de la
investigacin las bacterias coliformes menos resistentes, inclusive E. Coli.
Composicin (g/litro)
Peptona de casena 15.0; extracto de carne 4.8; D (+)-Glucosa 7.5;
Sodio cloruro 7.5; Sodio azida 0.2.
Preparacin
Disolver 35 g o 70 g por litro, distribuir y esterilizar autoclave. No recalentar.
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Empleo e interpretacin
Si la cantidad de producto a ensayar es pequea (hasta 1 ml, se incorpora en
el caldo de concentracin sencilla (35 g/litro) que queda as diluido a la
concentracin habitual.
Incubacin : desde 254 hasta 48 horas, a 37C.
La produccin de enturbamiento durante la incubacin (crecimiento)
permite sospechar la presencia de enterecocos. En este caso, y para su
confirmacin, se resiembra en Calco-purpura de bromocresol axida (MERCK,
Art. Num 30332). Si no se presenta turbidez alguna, puede desecharse con
seguridad la presencia de enterococos.
Agar ENDO-C
(Agar-fucsina-lactosa seg. ENDO, tipo)
ENDO-C Agar
Art. Num 4044
Medio de cultivo selectivo, para demostracin y aislamiento de E. Coli fecal y
coliformes en los ms diversos materiales.
Este medio de cultivo corresponde a lo prescrito en los Estndar
Methods for the Examination of Dairy Products (1967) y en los Estndar
Methods for the Examination odf Water and Wastewater (1975).
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Forma de actuacin
El sodio sulfito y la fucsina inhiben a las bacterias gram positivas E. Coli
y coliformes utilizan lactosa con formacin de aldehdo y cido. Por otra parte,
el aldehdo libera fucsina a partir de la combinacin fucsina-sulfito, lo cual da
lugar a la coloracin roja de las colonias. En el caso de E. Coli, esta reaccin
es tan intensa que la fucsina llega a cristalizar y por este motivo, confiere a
dichas colonias un brillo metlico estable, de reflejo verde (tpico de la fucsina
cristalizada).
Composicin (g/litro)
Peptona de carne 10.0; di-Potadio hidrogenofosfato 3.5; Lactosa 10.0
Sodio sulfito, anhidro 2.5; Fucsina 0.4; Agar agar 12.5.
Preparacin
Disolver 39 g/litro, esterilizar al autoclave y verter en placas. Si el medio
de cultivo muestra, tras la solidificacin, un tono rojo demasiado intenso puede
eliminarse dicho exceso de color aadiendo algunas gotas (hasta 1 ml/litro,
como mximo) de una solucin, anhdrido, MERCK, Art. Num 6657, e hirviendo
el conjunto a continuacin.
Ph 7.4 0.2
Por efecto del oxigeno atmosfrico y debido a la consiguiente oxidacin
del sulfito, el medio de cultivo vertido en placas se vuelve paulatinamente rojo y
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por lo tanto, inservible. Incluso conservado en la oscuridad y a la temperatura
de nevera, solo es utilizable durante pocos das.
Empleo e interpretacin
Sembrar las placas en estra por agotamiento
Incubacin: 24 horas, a 37C.
Colonias MicroorganismosRojas
Rojas con brillo metlico
Estable
Rojas hasta rojizas, semi-esfricas
mucosas
Lactosa positivos
E. coli
Enterobacter aerogenes,
Klesbsiella y tros.Incoloras, claras Lactosa (-)
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ANLISIS DE LA MUESTRA:
1. Preparar las diluciones decimales, siguiendo una de las tcnicas
descritas en preparacin y dilucin de las muestras de alimentos, hasta la
dilucin 10-4 o 10-5 si es necesario.
2. Efectuar las determinaciones microbiolgicas de acuerdo al esquema de
trabajo y a la metodologa descrita.
3. Reportar los resultados por gramo de muestra.
Pruebas Bioqumicas
La lectura en placa no es suficiente para poder identificar al (los)
microorganismos (s) en estudio, para ello emplearemos las pruebas
bioqumicas con las cuales podemos llegar a identificar el nombre del
espcimen cultivado.
Los medios de diferenciacin ms empleados en el laboratorio de
microbiologa para la identificacin de bacterias son: el agar citrato de
Simmons, el medio de SIM, el agar hierro tres azucares (TSI) y el medio de
LIA.
Luego se proceder de la siguiente manera:
1. Flamear el asa de siembra
2. Tomar una muestra del cultivo puro y sembrar en estra y por picadura en
los tubos con medios TSI, LIA y citrato. En el medio de SIM sembrar
nicamente por picadura.
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3. Incubar los tubos y hacer la lectura de los mismos a las 24 horas despus
de la siembra.
4. Realizar la prueba de indol aadiendo unas gotas de
dimetilaminobenzaldehido.
5. Realizar la prueba de la catalasa para lo cual aadir unas gotas de perxido
de hidrgeno sobre las colonias.
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CUESTIONARIOCUESTIONARIO
1. Explique la importancia de evitar contaminacin por Vibrio vulnigicus y
Salmonella en mariscos y pescados.
2. Parsitos que puedan ser transmitidos por alimentos marinos.
3. Explique como se realiza el recuento de mohos y levaduras en muestras de
alimentos marinos.
4. Explique la toma de muestras, preparacin de muestras y anlisis
microbiolgicos de los alimentos marinos.
5. Que microorganismos se pueden encontrar en el agua de mar, en las
lagunas y ros.
6. Busque en alguno recuento o Internet algn proyecto o trabajo de
investigacin relacionable a productos hidrobiologicos.
7. Cual es la finalidad del uso del medio TSI, que tipos de azucares participan
en este medio y a que microorganismos permite reconocer.
8. Cual es la finalidad del uso del medio de LIA, que reacciones nos permite
evaluar y que microorganismos nos permite identificar.
9. Que pruebas se pueden realizar en el medio citrato y que microorganismos
se pueden diferenciar con este medio.
10.Para que se emplea el medio de SIM, que microorganismos se pueden
reconocer con ste y como.
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11.Con que finalidad se realiza la prueba de la catalasa y la prueba del indol.
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