objetivo: presentar los principales conceptos vinculados a

Objetivo: Presentar los principales conceptos vinculados a la espectroscopía infrarroja, con particular énfasis en las biomoléculas

Carga horaria: 46 hs Teórico/Práctico: 12 hs T / 34 hs P (5 créditos)

Aprobación del curso: Con la asistencia obligatoria a todos los prácticos, y la entrega del informe correspondiente al trabajo especial. Posteriormente, deberán rendir un examen escrito sobre los temas teóricos y prácticos dictados en el curso. La nota final de aprobación tendrá en cuenta la nota obtenida en el informe del trabajo especial (50 %) y del examen escrito (50 %).

Trabajo Especial: Consta de parte experimental a la cual se asigna una carga horaria de 18hs y un informe escrito con una breve introducción de la temática elegida, discusión de los resultados y conclusiones.

Bibliografía Recomendada

Barbara Stuard, Infrared Spectroscopy Fundamental and Applications (2004)

Da-Wen Sun, Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis and Control (2009)

Jerry Workman; Jr. Lois Weyer Practical, Guide to Interpretative Near-infrared Spectroscopy (2007)

J. Kauppinen;J. Partanen, Fourier transforms in Spectroscopy (2001)

Clays and Clay Minerals, 1973, Vol. 21, pp. 363-368

Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 30(2):95-120 (1995)

Talk Letter Shimadzu

IR cercano

IR lejano

• 12800-4000 cm-1

• 4000-400 cm-1

• 400-10 cm-1

La absorción de luz se produce por alteraciones en la vibración de las moléculas

REPASO DE UNIDADES

IR medio

ν = 1/λ Siendo v el número de onda y λ la longitud de onda

Cuanto más fuertes o rígidos son los enlaces químicos mayores son las frecuencias observadas.

Las masas atómicas menores tienden a originar frecuencias mayores.

Predicciones del modelo clásico

H2O vs. D2O

Ejemplo:

m1 y m2 representan la masa de los átomos y la constante k se relaciona a la rigidez del enlace

Regla de selección

Regla de selección: Para que la molécula sea visible en el infrarrojo el momento dipolar de la misma debe cambiar durante la vibración.

N

N

N2 H2O

NO VISIBLE VISIBLE

Las vibraciones simétricas son más débiles que las asimétricas. Ejemplo C-C o N-N cuyas bandas son débiles. Como regla general cuanto mayor sea el cambio del momento dipolar, mayor es la intensidad de la banda infrarroja asociada a la vibración.

Los modos normales de vibración, son los tipos de vibraciones fundamentales que se pueden presentar en las moléculas.

El número de modos independientes de vibración en una molécula de N átomos se calcula asumiendo que el movimiento de cada átomo se puede describir en términos de desplazamientos a lo largo de tres direcciones espaciales, de modo que tendremos 3N desplazamientos a considerar.

Dependiendo de si el modo vibra en fase o no se dice que son simétricos o asimétricos.

El principio de la técnica se basa en la absorción de radicación IR.

FUENTE RADIACIÓN INCIDENTE

MUESTRA RADIACIÓN TRANSMITIDA

DETECTOR

Una parte de la radiación es absorbida por la muestra y la luz transmitida es medida por el detector

T= It Io

A= -log (T)

Interferómetro de Michelson

Interferencia destructiva

Interferogramas obtenidos para una radiación monocromática (a) y policromática (b)

Solución Finita

Transformada de Fourier

Apodización

Box-Car

Triangular

Happ-Genzel

Transmisión

Pastilla de KBr y mull Sólidos

Líquidos

Gases

Ventanas, celdas de volumen fijo y método “sandwich”

Celdas de gases

Sólidos

9-10 Ton y 2 Ave María (2 min)

Método de la pastilla de KBr

Sólidos Pastilla de KBr

Es el método más utilizado para la caracterización de sólidos. Tradicional. Actualmente el aceptado en el análisis farmacéutico Es sencillo. Produce buenos espectros en general, aunque depende de la calidad de la pastilla. La reproducibilidad de los anchos de las bandas y la línea de base puede variar dependiendo del nivel de rugosidad de la pastilla y el ancho de la misma.

El efecto de Christiansen es el incremento en la transmitancia de un polvo cristalino en las longitudes de onda donde los índices de refracción de la matriz iguala a la de la muestra.

Christiansen effect

Algunos problemas

Christiansen effect

Afecta la intensidad relativa de las bandas de absorción.

Puede minimizarse utilizando espesores pequeños de pastillas.

Sólidos

Mull

Nujol o parafina líquida

Fluorolube

Mull

Líquidos

El agua es uno de los principales inconvenientes para trabajar en líquidos

H2O

D2O

Líquidos

Método “Sandwich”

Útil para el análisis rápido de líquidos Consiste en depositar una gota de la muestra entre dos ventanas Cualitativo

Ventana de espacio controlado

Puede presentar problemas durante el armado del dispositivo de medida Es necesario medir el paso óptico Cuantitativo

Ventana de espacio controlado

Ventana de espacio controlado

Gases

A menor densidad de los gases se necesita un mayor camino óptico. Típicamente puede estar entre 5 y 10 cm.

ATR: Reflexión total atenuada

Muestra

dp

n1

n2

n2 > n1

n1 y n2 corresponden a los índices de la muestra y el cristal

Profundidad de penetración del rayo

ATR

Índice de refracción

de la muestra

Profundidad del haz

Ángulo de incidencia

Cambia el ángulo límite

ATR

La absorbancia medida depende de la penetración de la muestra y del número de reflexiones de la muestra, que a su vez se relacionan con número de onda, el ángulo de incidencia del haz de luz y la relación de los índices de refracción

Número de onda

Profundidad del haz

Absorbancia

El efecto puede ser compensado por software

ATR

Ángulo de incidencia

Número de reflexiones

Absorbancia

Profundidad del haz

Absorbancia

ATR

Contacto de la muestra con el cristal

Ventajas

Rápida: no se necesita preparar la muestra Útil para todo tipo de muestras: opacas, cristales, polvos hormigón Mejora la reproducibilidad, minimiza variaciones de espectros por parte del usuario. Espectros de alta calidad.

Desventajas

La muestra puede formar una película sobre el cristal Necesidad de medir toda la muestra y no solo las primeras dos micras Demostrar que el cristal está limpio el cristal se puede romper la alineación puede cambiar La sensibilidad es menor a los métodos de transmisión

Reflexión especular y difusa

Reflexión especular

Ideal para la caracterización de superficies pulidas. Comúnmente usadas en films y muestras liquidas bañando una superficie de teflón como soporte. Útil para medidas de capas finas o mono capas.

Ventajas

Desventajas

Los espectros dependen del índice de refracción Las superficies deben ser como espejos

Reflexión difusa

La muestra debe generalmente diluirse con KBr. Los espectros son buenos si la muestras son homogéneas. La preparación de la muestra puede ser trabajosa y los espectros pueden verse distorsionados.

Reflexión difusa

R:= Reflectancia absoluta c:=Concentración de la muestra k:=Coeficiente de absorción molar

La luz recibida por el detector es una combinación de la luz reflejada y la luz trasmitida por la partícula

Utilizada para el análisis de fibras, polvos, granos, polímeros, jabones, etc.

Desventaja: Los espectros pueden aparecer muy distorsionados

Intensidades de la señal

• En una primera aproximación son función de

la vibración y el grupo funcional.

• La intensidad exacta es función de la

molécula y la matriz.

• No hay reglas directas de cuantificación, ya

sea para moléculas o grupos funcionales.

¿Qué esperamos de un espectro infrarrojo?

El espectro debe ser preciso, reproducible

Fuentes de imprecisión

Ruido

Distorsiones

Deriva (cambios del instrumento con el tiempo de uso).

Usuario

Infrarrojo en el análisis

Análisis cuantitativo

Determinación de concentraciones u otras

propiedades

Análisis cualitativo

Determinación de la estructura

Seguimiento de reacciones

Identificación de muestras desconocidas

Confirmación de identidad

Análisis cualitativo

No es el objetivo del análisis asignar cada banda.

Es útil saber que grupo funcional corresponde a

cada banda de forma general.

Existen tablas que permiten correlacionar las

bandas de absorción de varios grupos funcionales

Límite de detección

Depende de la muestra

Para sólidos basta con 10mg de muestra en general.

En líquidos es capaz de detectar concentraciones del orden de las ppm

En gases es capaz de detectar concentraciones del orden de las ppb

Factores que complican la interpretación de un espectro infrarrojo

Sobretonos y superposición de bandas

Resonancia de fermi

Acoplamiento de vibraciones

Bandas de Vibración-rotación (solo en gases)

Absorción de H2O y CO2

Sobretonos y superposición de bandas

Resonancia de fermi

La frecuencia fundamental y la del sobretono deben ser cercanas. La frecuencia fundamental y la del sobretono deben tener la misma simetría. Las vibraciones tienen que estar acopladas espacialmente

H2O

CO2

H2O

H2O

CO2

Bandas de Vibración-rotación (solo en gases)

Señales de CO2

•Aparece en regiones del espectro donde no aparecen señales de

compuestos.

•En general no molesta.

Señales del H2O

•Posición de todas las señales conocida.

•En general pueden coincidir con las señales de los compuestos que

vamos a medir.

•Puede aparecer como ruido en el espectro.

•Se puede eliminar su contribución de varias maneras: Restándolas

del blanco, compensación por software, utilizando una purga previa

con nitrógeno o un gas noble.

Espectro con vapor de agua Espectro con aire seco

Parámetros de medida

•Resolución •Número de barridos •Apertura •Apodización

Resolución

Suficiente para obtener la información buscada. Considerar que cuanto mayor es la resolución , mayor es el ruido asociado. No tomar más datos de los necesarios.

Gases: 1-2 cm-1 Líquidos 2-4 cm-1

Sólidos: 2-4 cm-1

En general

Resolución

280528202835285028652880289529102925294029552970298530001/cm

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

1,75

2

2,25

2,5

2,75

3

3,25

Abs

290129042907291029132916291929222925292829312934293729401/cm

1,6

1,8

2

2,2

2,4

2,6

2,8

3

3,2

3,4

Abs

280528202835285028652880289529102925294029552970298530001/cm

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

1,75

2

2,25

2,5

2,75

Abs

290129042907291029132916291929222925292829312934293729401/cm

1,65

1,8

1,95

2,1

2,25

2,4

2,55

2,7

2,85

Abs

290129042907291029132916291929222925292829312934293729401/cm

1,6

1,8

2

2,2

2,4

2,6

2,8

3

3,2

3,4

Abs

Cut 1Cut

Res 0.5cm-1 1scan

Res 0.5cm-1 10scan

652,5660667,5675682,5690697,5705712,5720727,5735742,57501/cm

0,075

0,15

0,225

0,3

0,375

0,45

0,525

0,6

0,675

Abs

652,5660667,5675682,5690697,5705712,5720727,5735742,57501/cm

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0,55

0,6

Abs

652,5660667,5675682,5690697,5705712,5720727,5735742,57501/cm

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0,55

Abs

4 cm-1

0.5 cm-1

2 cm-1

PARAFILM

1 scan

Resolución

PARAFILM

652,5660667,5675682,5690697,5705712,5720727,5735742,57501/cm

0,075

0,15

0,225

0,3

0,375

0,45

0,525

0,6

0,675

Abs

0.5 cm-1

652,5660667,5675682,5690697,5705712,5720727,5735742,57501/cm

0,075

0,15

0,225

0,3

0,375

0,45

0,525

0,6

0,675

Abs

0.5 cm-1

10 scans 1 scan

Resolución

•Debe ser la adecuada. •Preguntarme que tan relevante es para el análisis. •Compromiso señal ruido. •Tiempo de espera.

Número de barridos

•Suficiente para obtener una relación señal ruido aceptable. • El ruido decrece con la raíz cuadrada del número de barridos. •Incrementar los barridos en un factor de 4X. •El número de barridos en el blanco y la muestra debe ser el mismo

400600800100012001400160018002000240028003200360040001/cm

-0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

1,75

2

2,25

2,5

2,75

Abs

20100911as prepared60620100911as prepared61720100911as prepared61120100911as prepared60920100911as prepared608

4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm

-0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

Abs

4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm

-0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

Abs

4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm

-0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

Abs

4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm

-0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

Abs

4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm

-0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

Abs

4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm

-0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

Abs

4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm

-0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

Abs

1 scan 5 scans 10 scans

20 scans 40 scans 80 scans

160 scans

2 cm-1

Apertura

Diámetro impuesto en el haz de luz infrarroja. El valor de la apertura puede afectar la exactitud de la escala de frecuencia. El instrumento viene programado para seleccionar la apertura óptima de acuerdo al valor de resolución. Puede ser necesario modificarlo si el diámetro de la muestra elegida es menor que la apertura, para evitar la incidencia de “luz fantasma”.