hla tipificación_marcelo pando
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©2013 MFMER | slide-1
Tipificación de Antígenos de Histocompatibilidad (HLA):
Evaluación de la Compatibilidad entre Donante y Receptor
Marcelo Pando
Julio, 2014
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Parte 1:HLA Fundamentos BásicosHLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
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HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación antigénica
En la Naturaleza:
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HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación antigénica
En la Naturaleza:
Embarazo
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HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación antigénica
En la Naturaleza:
Embarazo
Interaccióncon KIR
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HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación antigénica
En la Naturaleza:En Medicina:
Embarazo
Interacción con KIR
Trasplantes de organos
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HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación antigénica
En la Naturaleza:En Medicina:
Embarazo
Interacción con KIR
Trasplantes de organos
Asociación a enfermedad
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HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación antigénica
En la Naturaleza:En Medicina:
Embarazo
Interacción con KIR
Trasplantes de organos
Asociación a enfermedad
Hipersensibilidad a fármacos
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HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación antigénica
En la Naturaleza:En Medicina:
Embarazo
Interacción con KIR
Trasplantes de organos
Asociación a enfermedad
Hipersensibilidad a fármacos
Selección de pareja!
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HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación antigénica
En la Naturaleza:En Medicina:
Embarazo
Interacción con KIR
Trasplantes de organos
Asociación a enfermedad
Hipersensibilidad a fármacos
Selección de pareja!
DIVERSIDAD!
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HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación antigénica
En la Naturaleza:
Embarazo
Interacción con KIR
Selección de pareja!
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HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación antigénica
En la Naturaleza:En Medicina:
Embarazo
Interacción con KIR
Trasplantes de organos
Asociación a enfermedad
Hipersensibilidad a fármacos
Selección de pareja!
DIVERSIDAD!
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Complejo HLA
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Chromosome_6.svg#filelinks (Wikimedia Commons)
Cromosoma 6• Alrededor de 1900 genes• 170 millones de pares de bases• 4 Mbp en el complejo HLA
HLA 220 genes
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Complejo HLA
MHCHLA4 Mb
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Complejo HLA
MHCHLA4 Mb
Class I
Class II
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HLA Región de clase I
HLA-A HLA-B
HLA-C1.3 Mb
81 Kb
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Región de clase II
HLA-DRHLA-DP
398 Kb
47 Kb
HLA-DQ
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Desequilibrio de Ligamiento
HLA-B - > C
HLA-DR - > DQ
93% de pacientes con B35 tendrán C*4
60% de pacientes con DR4 tendrán DQ839% de pacientes con DR4 tendrán DQ71% de pacientes con DR4 tendrán DQ4
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Serotipos: Antígenos Clásicos de HLAHLA-A HLA-BA1 Bw4 A2 Bw6A3 B5 A9 B7 A10 B703 A11 B8 A19 B12 A23 B13 A24 B14 A2403 B15 A25 B16 A26 B17 A28 B18 A29 B21 A30 B22 A31 B27 A32 B2708 A33 B35 A34 B37 A36 B38A43 B39A66 B3901 A68 B3902 A69 B40 A74 B4005 continue… continue…
HLA-CwCw1 Cw2 Cw3 Cw4 Cw5 Cw6 Cw7 Cw8 Cw9Cw10
HLA-DR HLA-DQDR1 DQ1 DR103 DQ2 DR2 DQ3 DR3 DQ4 DR4 DQ5DR5 DQ6DR6 DQ7DR7 DQ8DR8 DQ9DR9 DR10 DR11DR12DR13DR14DR1403 DR1404 DR15DR16DR17DR18
DR51 DR52 DR53
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Serotipos: Antígenos Clásicos de HLAHLA-A HLA-BA1 Bw4 A2 Bw6A3 B5 A9 B7 A10 B703 A11 B8 A19 B12 A23 B13 A24 B14 A2403 B15 A25 B16 A26 B17 A28 B18 A29 B21 A30 B22 A31 B27 A32 B2708 A33 B35 A34 B37 A36 B38A43 B39A66 B3901 A68 B3902 A69 B40 A74 B4005 continue… continue…
HLA-CwCw1 Cw2 Cw3 Cw4 Cw5 Cw6 Cw7 Cw8 Cw9Cw10
HLA-DR HLA-DQDR1 DQ1 DR103 DQ2 DR2 DQ3 DR3 DQ4 DR4 DQ5DR5 DQ6DR6 DQ7DR7 DQ8DR8 DQ9DR9 DR10 DR11DR12DR13DR14DR1403 DR1404 DR15DR16DR17DR18
DR51 DR52 DR53
630 Alleles
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Diversidad de HLA: IMGT/HLA
http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/
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Nomenclatura Molecular de HLA
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Niveles de Tipificación Molecular
• Baja resolución• A*02, B*35
• Resolución intermedia• A*02:01/02:03/02:07
• Alta resolución• A*02:01
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HLA en Trasplantes
• Trasplantes de órganos solidos• Tipificación de serotipos: A1, A2, etc.
O de Baja resolución: A*01, A*02, etc.
• Trasplante de Medula Ósea o Células Madre• Tipificación de alta resolución: hasta el nivel de
secuencia aminoacídica: • A*01:02, A*02:243, etc.
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Moléculas de HLA
• HLA de Clase I: HLA-A, HLA-B y HLA-C
• HLA de Clase II: HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP
α1 α2
α3β2m
β1α1
α2 β2
DRA1 DRB1 -> DR1-18
DRB3, 4, 5 -> DR51, DR52, DR53
DQA1 DQB1 -> DQ1-9
DPA1 DPB1 -> DPs
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HLA de Clase I HLA de Clase II
Cadena Alfa
HLA-AHLA-BHLA-C
Cadena Alfa
DRA1DQA1DPA1
Cadena Beta
DRB1DRB3DRB4DRB5
DQB1DPB1
Cadena Beta 2 microglobulina
Moléculas de HLA: estructura y función
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HLA de Clase I
HLA de Clase II
Linfocitos T CD8 Linfocitos T CD4
NK
Moléculas de HLA: estructura y función
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Estructura de HLA de Clase I
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Estructura de HLA de Clase II
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Epitopes de HLA AA Pos 10 20 30 40 50 A*01 GSHSMRYFFT SVSRPGRGEP RFIAVGYVDD TQFVRFDSDA ASQKMEPRAP A*02 ---------- ---------- ---------- ---------- ---R------ AA Pos. 110 120 130 140 150 A*01 CDVGPDGRFL RGYRQDAYDG KDYIALNEDL RSWTAADMAA QITKRKWEAV A*02 ----S-W--- ---H-Y---- ------K--- ---------- -T--H----A AA Pos. 210 220 230 240 250 A*01 LRCWALGFYP AEITLTWQRD GEDQTQDTEL VETRPAGDGT FQKWAAVVVP A*02 ------S--- ---------- ---------- ---------- ---------- AA Pos. 310 320 330 340 A*01 AVVAAVMWRR KSSDRKGGSY TQAASSDSAQ GSDVSLTACK V A*02 ---------- ---------- S--------- ---------- -
α1 α2
α3β2m
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Epitopes HLA AA Pos. 110 120 130 140 150 A*01 CDVGPDGRFL RGYRQDAYDG KDYIALNEDL RSWTAADMAA QITKRKWEAV A*02 ----S-W--- ---H-Y---- ------K--- ---------- -T--H----A
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Epitopes HLA AA Pos. 110 120 130 140 150 A*01 CDVGPDGRFL RGYRQDAYDG KDYIALNEDL RSWTAADMAA QITKRKWEAV A*02 ----S-W--- ---H-Y---- ------K--- ---------- -T--H----A
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Epitopes HLA AA Pos. 110 120 130 140 150 A*01 CDVGPDGRFL RGYRQDAYDG KDYIALNEDL RSWTAADMAA QITKRKWEAV A*02 ----S-W--- ---H-Y---- ------K--- ---------- -T--H----A
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Epitopes HLA AA Pos. 110 120 130 140 150 A*01 CDVGPDGRFL RGYRQDAYDG KDYIALNEDL RSWTAADMAA QITKRKWEAV A*02 ----S-W--- ---H-Y---- ------K--- ---------- -T--H----A
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Genética del HLA: Genes HLA Clase I
Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 Exon 7 and 8
α1 α2
α3β2m
ADN
ARNm
Proteína
Exon 2 Exon 3 Exon 4
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Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exones 4, 5 & 6
Genética del HLA: Genes HLA Clase II
Cadenas alfa
DRA1DQA1DPA1
Cadenas beta
DRB1DRB3DRB4DRB5
DQB1DPB1
ADN
ARNm
Proteína
Exon 2 Exon 3
α2
α1 β1
β2
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Resumen Parte 1: HLA Fundamentos Básicos
• Gran diversidad: génica, alélica y haplotípica.
• Inmunidad contra las diferencias entre lo propio y lo ajeno.
• La posición de la diferencias en la molécula de HLA es importante en la generación de alo-anticuerpos.
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Resumen Parte 1: HLA Fundamentos Básicos
• Tipos de resolución en la tipificación de HLA es importante para cada tipo de trasplante.
• Exones 2, 3 y 4 son los tipificados en las moléculas de HLA Clase I.
• Exones 2 y 3 son los tipificados en las moléculas HLA Clase II.
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Parte 2: Tipificación de Antígenos de HLA
Metodologías:
Serología: usa células y detecta los antígenos HLA en la superficie celular.
Molecular: Usa ADN y detecta los dos alelos de un gen.
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Tipificación de Antígenos de HLA:
ADN:
Proteína:
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Tipificación de Antígenos de HLA: Serología
NEGATIVO POSITIVO
Suero contra HLA-B57
HLA-B57
HLA-A1
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Tipificación de Antígenos de HLA: Molecular
Exon 2 Exon 3 Exon 4
Exon 2 Exon 3HLA de Clase II
PCR
HLA de Clase I
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Tipificación por Primers Específicos de Secuencia (SSP)
HLA-DR1
Paciente LMPositivo para HLA-DR1
Control interno
Positivo
Paciente JMNegativo para HLA-DR1
Control interno
Negativo
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Tipificación por Primers Específicos de Secuencia (SSP)
HLA-ABDR TRAY
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Tipificación por Primers Específicos de Secuencia (SSP)
HLA-ABDR TRAY
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Tipificación por Primers Específicos de Secuencia (SSP)
HLA-ABDR TRAY
HLA-A1, A3HLA-B35, B57HLA-DR7, DR4
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Tipificación con Sondas de ADN: SSOP
ADN:
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Tipificación con Sondas de ADN: SSOP
ADN:
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Tipificación con Sondas de ADN: SSOP
Sonda 1 Sonda 2
Isótopo Radioactivo
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Tipificación con Sondas de ADN: SSOP
Sonda 2Sonda 1
LUMINEX
Sonda 1 Sonda 2
Isótopo Radioactivo
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Cada perla tiene una fluorescencia verde y naranja
Tipificación con LUMINEX SSOP
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Cada grupo de perlas tiene una sonda diferente
Tipificación con LUMINEX SSOP
Red intensity
Gre
en in
tens
ity
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Cada perla tiene una fluorescencia verde y naranja
Tipificación con LUMINEX SSOP
Red intensity
Gre
en in
tens
ity
A3 B57
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Cada perla tiene una sonda diferente
Red intensity
Gre
en in
tens
ity
Tipificación con LUMINEX SSOP
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Cada perla tiene una sonda diferente
Red intensity
Gre
en in
tens
ity
Tipificación con LUMINEX SSOP
HLA-A1, A3HLA-B35, B57HLA-C*4, C7
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Secuenciación de HLA
Exon 2 Exon 3 Exon 4
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Secuenciación de HLA
Exon 2 Exon 3 Exon 4
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Secuenciación de HLA
Exon 2 Exon 3 Exon 4
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Secuenciación de HLA: Ambiguedades
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Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14
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Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14
1 2 3 4 5 6 7 8
16
24
31
PC
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Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14
1 2 3 4 5 6 7 8
16
24
31
10
PC
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Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14
1 2 3 4 5 6 7 8
16
24
31
10
PC
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Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14
1 2 3 4 5 6 7 8
16
24
31
PC
9
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Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14
1 2 3 4 5 6 7 8
16
24
31
PC
9
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Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14
PC
1 2 3 4 5 6 7 8
16
24
31
PC
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Ventajas y Desventajas
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Resumen Parte 2
• Las distintas técnicas de tipificación obtienen informacion diferente que se puede complementar.
• Serología detecta la molécula de HLA en la superficie celular.
• Las técnicas moleculares usan ADN y asumimos la expresión correcta.
• La tipificación de alta resolución nos da el nivel de tipificación mas alto pero limitado a la región que se secuencia.
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1er Caso:• Paciente con PRA de 100%• Anticuerpos detectados:• Contra Clase I:
• A:2 29 30 31 33 74 • B:27 44 46 47 50 5102 56 62 71 73 13 18 35 37 38
49 51 52 53 57 58 59 63 64 65 75 77 78 • C:15 4 A:23 24 25 32 68 69 17 18 2 5 6
• Contra Clase II: • DR:11 8 9 04:02 103 12 13 16 7 • DR:01:01(DR51) • DQA1:02:01 • DQ:4 5 6
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1er Caso:
• Paciente con PRA de 100%
• Probabilidad de encontrar un donante de 1 en 270
• Donante potencial con 0 mismatches para ABDRDQ
• Crossmatch prospectivo positivo para celulas T y B
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQPaciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
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1er Caso:
• Paciente con PRA de 100%
• Anticuerpos contra donante probables:
• DQA1*02:01 (MFI 4409-4813)
• DRB1*04:02 (MFI 14759)
• DRB1*04:04 (MFI 1605)
• Otros DR4 = Negativos
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1er Caso:
• Es DQA1*02:01 un DSA?
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQPaciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
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1er Caso:
• Es DQA1*02:01 un DSA?
• Evaluemos el desequilibrio de ligamiento:
DQ2 DQB1*02 --- DQA1*02:01 solo en DR7
El haplotipo de DR17 es:
DR17 DQA1*05:01 DQB1*02:01
DR17 DQA1*01:02 DQB1*06:02
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQPaciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
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1er Caso:
• Es DQA1*02:01 un DSA?
• Evaluemos el desequilibrio de ligamiento:
DQ2 DQB1*02 --- DQA1*02:01 solo en DR7
El haplotipo de DR17 es:
DR17 DQA1*05:01 DQB1*02:01
DR17 DQA1*01:02 DQB1*06:02
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQPaciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
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1er Caso:
• Es DRB1*04:02 o 04:04 DSA?
• El desequilibrio de ligamiento no nos ayuda a resolver este caso:
DRB1*04:01 DQB1*03:02 (DQ8)
DRB1*04:02 DQB1*03:02 (DQ8)
DRB1*04:04 DQB1*03:02 (DQ8)
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQPaciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
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1er Caso:• Es DRB1*04:02 o 04:04 DSA?
• Tipificación por SSP de alta resolución HLA-DR:
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1er Caso:• Es DRB1*04:02 o 04:04 DSA?
• Tipificación por SSP de alta resolución HLA-DR:
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1er Caso:
• Paciente con PRA de 100%
• DSA contra DRB1*04:04 (MFI 1605)
• FXM:
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQPaciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Celulas T Celulas B
103 MCS 85 MCSPositivo Positvo
Cutoff 57 MCS 78 MCS
Donante
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1er Caso:
• Paciente con PRA de 100%
• DSA contra DRB1*04:04 (MFI 1605)
• FXM:
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQPaciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Celulas T Celulas B
103 MCS 85 MCSPositivo Positvo
Cutoff 57 MCS 78 MCS
Donante
• Auto FXM:
Celulas T Celulas B
79 MCS 69 MCSPositivo Positvo
Cutoff 57 MCS 78 MCS
Paciente
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1er Caso:
• Paciente con PRA de 100%
• DSA contra DRB1*04:04 (MFI 1605)
• FXM:
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQPaciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Celulas T Celulas B
103 MCS 85 MCSPositivo Positvo
Cutoff 57 MCS 78 MCS
Donante
• Auto FXM:
Celulas T Celulas B
79 MCS 69 MCSPositivo Positvo
Cutoff 57 MCS 78 MCS
Paciente
•El Paciente tiene auto anticuerpos•Un DSA de bajo MFI que no explica el Flow XM•Es un muy buen donante para este paciente
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2do Caso: Anticuerpo Alelo Específico
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2do Caso: Anticuerpo Alelo Específico
DRB3*02
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Resultados del Luminex:
MFI Allele FrequencyDRB3*01 1,200 21.0%DRB3*02 24,000 65.3%DRB3*03 2,500 13.7%
•El alelo DR52 (DRB3*02) es muy frecuente y debería ser tipificado
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Resultados del Luminex:
MFI Allele FrequencyDRB3*01 1,200 21.0%DRB3*02 24,000 65.3%DRB3*03 2,500 13.7%
•El alelo DR52 (DRB3*02) es muy frecuente y debería ser tipificado
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Y despues de la tristeza de no haber ganado.
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Hay que felicitar al equipo por lo jugado!!!
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Y guardar la esperanza para el proximo Mundial!
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Gracias!
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