cèl·lules mare pluripotents i medicina regenerativa

CÈL·LULES MARE PLURIPOTENTS I MEDICINA

REGENERATIVA

Begoña Aran

Banc de Línies Cel·lulars

Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona

CÉLULAS MADRE

Se trata de células indiferenciadas que se han localizado en la masa celular interna del blastocisto, en algunos tejidos fetales, en el cordón umbilical y la placenta y en varios tejidos adultos.Son células pluripotentes (o en algunos casos totipotentes) que dan lugar a células y tejidos especializados.Su utilidad estriba en la utilización para tratamientos de patologías con pérdida de función celular

Células madre embrionarias: autorenovación y pluripotencialidad

Autorenovación DiferenciaciónDivisionasimétrica

CELULAS PLURIPOTENTES

• Células madre • CM embrionarias• CM fetales• CM adultas

• Células pluripotencia inducida (iPS)

Pluripotency

células madre adultas

• son células indiferenciadas que se hallan en tejidos adultos diferenciados y que son capaces de renovarse a sí mismas y diferenciarse en todos los tipos celulares diferenciarse en todos los tipos celulares del tejido del que provienen.

• algunas pueden ser pluripotentes.• se encuentran en hígado, médula osea,

pancreas, piel, cerebro, sangre…

células madre adultas

su frecuencia es baja, son difíciles deidentificar y purificar, su proliferación eslimitada y son difíciles de mantener en un estado indiferenciado.

células madre fetales

• se trata de tipos celulares primitivos que se hallan en el feto y que pueden desarrollarse en células madre neuronales, células madre hematopoyéticas (cordón umbilical y placenta), progenitoresplacenta), progenitoresde islotes pancreáticos.

células madre embrionariasson las que derivan de la masa celular interna(MCI) de un blastocisto (día +5/6 de desarrollo, ± 150 células). Las ± 150 células). Las células de la MCI dan lugar a las 3 líneas del embrión: ectodermo, mesodermo y endodermo.

MCI

In vivo

In vitro

Modelo de enfermedadesy desarrollo de fármacos

Estudio del desarrollo y organogénesis

Terapia celular

ENFERMEDADES CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN CELULAR POTENCIALMENTE TRATABLES MEDIANTE TERAPIA BASADA EN CM

� Alteraciones neurodegenerativas� Accidentes vasculares� Lesiones medulares� Fallo cardíaco� Diabetes mellitus

Derivación células madre embrionarias

• Descongelación de los embriones (centros RA)• Cultivo embrionario*

los embriones en distinto estadío embrionario deben cultivarse hasta blastocisto

* Deben seguirse los protocolos utilizados en el laboratorio de FIV.

Eliminación de la zona pellucida

Eliminación del trofectodermo

Descongelación embriones

Cultivo hasta blastocisto

D+5/6

Derivación células madre embrionarias

zona pellucida

- 5mg/ml pronasa- Ac. Tyrode’s

Eliminación del trofectodermo

Monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados (CCD1112SkATCC), en placas cubiertas de gelatina (0.1%)Feeders cells

Siembra y cultivo del blastocisto o MCI sobre monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados, en placas cubiertas de gelatina (0.1%)

Derivación células madre embrionarias

CULTIVO

KO-DME Medium supplementado con:2 mmol/l Glutamax 0,05 mmol/l 2-mercaptoethanol 8 ng/ml basic fibroblast growth factor (FGF)1% non-essential amino acids20% KO-Serum Replacement 0,5% penicillin-streptomycin

Derivación ES[2]

p0 d4 (10x) p0 d7 (20x) p0 d9 (20x)p0 d4 (10x) p0 d7 (20x) p0 d9 (20x)

p1 d2 (4x) p1 d6 (4x )p0 d12 (10x)

Células somáticas de pluripotencia inducida (IPS)

• Paciente-compatible• No problemas éticos• Disponible en humanos• Pluripotentes

Fibroblastos

• Pluripotentes • Integración medianter vector

(virus)• Segura? Activación oncogenes,

transmisión línea germinal?CélulasES-like

Takahashi et al., 2007Nakagawa et al., 2007Park et al., 2007

Integración genes (virus)

Método reprogramación

Lentivirus/retrovirus mediated reprogramming methods are stillmajor approaches for generation of iPS

Modeling human disease with iPS cells

Modeling human disease with iPS cells

Modeling human disease with iPS cells

Modeling human disease with iPS cells

Modeling human disease with iPS cells

Fosfatasa alcalina

Actividad Telomerasa

Immunocitoquimica para marcadores de

Caracterización

Inmunocitoquimica para marcadores de pluripotencialidad

cariotipo

Microsatélites & HLA

para marcadores de diferenciación In vitro

Formación de cuerpos embrioideos

Inmunohistoquímica para marcadores de diferenciación In vivo(formación teratomas)

pluripotencialidad

DIFERENCIACIÓN

Proceso mediante el cual una célula madre indiferenciada se indiferenciada se transforma en células especializadas (diferenciadas) de un determinado tipo celular.

DIFERENCIACIÓN• Cambios en la expresión de genes mediante mecanismos epigenéticos

• Cambios fisiología: tamaño, forma, polaridad, actividad metabólica…metabólica…

• capacidad proliferativa diferenciación

c.madre c precursora c. diferenciada

CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro3 líneas germinales:

- Ectodermo: neuronas

- Mesodermo: cardiomiocitos

- Endodermo: tejido glandular

Embryoid bodies

Ectodermo Endodermo Mesodermo

DMEM/F 12

Neural basal medium

N2

B27

KO DMEM

FBS

Glutamax

Amino acidos no-esenciales

KO DMEM

FBS

Glutamax

Amino acidos no-esenciales

3 days in suspension in differentiation media

Glutamax

P/S

P/S

β-mercaptoetanol

P/S

β-mercaptoetanol

Ac. Ascórbico 0,5 mM

PA6 Gelatine

14-16 days 15-20 days

Diferenciación in vitro

Ectodermo: beta-tubulina

Diferenciación in vitro

Mesodermo: alfa-actinina y GATA4

Diferenciación in vitro

Endodermo: Alfa-feto proteina y FOXA2

CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo

Teratomas Ratones SCID de 8 semanas

1millón células

• intramuscular • intramuscular

• subcutáneo

• en algunos órganos

2 meses

CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo

Mesodermo (Cartilago) Endodermo (epitelio respiratorio)

Endodermo (epitelio respiratorio)

Mesodermo (Cartilago)

CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo

Diferenciación in vitro

Ectodermo: beta-tubulina

Diferenciación in vitro

Mesodermo: alfa-actinina y GATA4

Diferenciación in vitro

Endodermo: Alfa-feto proteina y FOXA2

Diferenciación de las CME

• ADIPOCITOS• ASTROCITOS• CARDIOMIOCITOS• CONDROCITOS

• PRECURSORES LINFOCITOS• MASTOCITOS• NEURONAS• OLIGODENDROCITOS

• CÉL. HEMATOPOYÉTICAS• CÉL. DENDRÍTICAS• CÉL. ENDOTELIALES• KERATINOCITOS• HEPATOCITOS

• OLIGODENDROCITOS• OSTEOBLASTOS• ISLOTES PANCREÁTICOS• MÚSCULO LISO• MÚSCULO ESTRIADO• TROFECTODERMO• GAMETOS

• Banqueo

• Registro en el Banco Nacional de Líneas Celulares

Criterios mínimos• Consentimiento informado• Trazabilidad• Aprobación Comité Ética

• Datos derivación (origen, métodos, etc)• Disponibilidad• Cariotipo• Modificación genética• Marcadores celulares de pluripotencia • Diferenciación a las 3 líneas germinales (in vitro y/o in vivo)

Terapia celular en medicina regenerativa

Trasplante de células diferenciadas , obtenidas a partir de CM, destinado a reparar tejidos en los que se ha perdido la funcionalidad.

Terapia celular con CMPhacia la aplicación clínica:

PROBLEMAS TÉCNICOS

• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y

purificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos

PROBLEMAS TÉCNICOS

• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y

purificaciónpurificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos

TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICO

Como evitarlo?• iPS• Uso de fármacos inmunosupresores• Uso de células HLA compatibles: bancos de CM• Inducción de inmunotolerancia: administración

previa de material embrionario o hematológico del donante

• CM procedentes de embriones clonados mediante transferencia nuclear

TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICO

Como evitarlo?• iPS• Uso de fármacos inmunosupresores• Uso de células HLA compatibles: bancos de CM• Inducción de inmunotolerancia: administración

previa de material embrionario o hematológico del donante

• CM procedentes de embriones clonados mediante transferencia nuclear

Stojkovic et al, 2005

PROBLEMAS TÉCNICOS

• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y

purificaciónpurificación• Funcionalidad y viabilidad post-trasplante• Aspectos metodológicos

PROBLEMAS TÉCNICOS

• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y

purificaciónpurificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos

PROBLEMAS TÉCNICOS

• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y

purificaciónpurificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos

Funcionalidad y viabilidad post-trasplante

• Es necesaria la integración y realización de conexiones necesarias para restablecer la funcionalidad del órgano.

• Estudio mecanismos control del crecimiento, migración, destino y diferenciación celular

• Estudios de restauración de la funcionalidad en modelos animales

• Órgano: varios tipos celulares

Estudios funcionalidad• Páncreas endocrino, ratones diabéticos. Soria, 2000;

Kroon, 2008.• Neuronas, enfermedad de Parkinson. Sonntag, 2007; Cho,

2008.• Precursores neuroectodérmicos, lesiones medulares.

Cummings, 2005; Keirstead, 2005; Nakamura, 2005; Cummings, 2005; Keirstead, 2005; Nakamura, 2005; Kumagai, 2009.

• Precursores miocárdicos, accidentes vasculares. Kehat, 2004; Menard, 2005; Laflamme, 2007; van Laake, 2009.

• Epitelio pigmentado de retina. Retinitis pigmentosa. Idelson, 2009.

• Neuronas estriadas. Enfermedad de Huntington. Aubry, 2008.

PROBLEMAS TÉCNICOS

• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y

purificaciónpurificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos

Aspectos metodológicos

• Estandarización protocolos: procedencia material, métodos de cultivo, preparación, almacenaje, banqueo, transporte.

• Eliminación xenobióticos• Condiciones GMP• Control de calidad• Control de calidad• Supervisión por comités externos de protocolos y

ensayos clínicos. Valoración riesgos.• Consentimiento informado

ISSCR: guidelines for clinical translation of stem cells.http://www.isscr.org/clinical_trans/pdfs/ISSCRGLClinicalTrans. pdf

Primeros ensayos clínicos

• Geron corp.: Oligodendrocitos derivados de CME, lesionados medularesmedulares

• Advanced Cell Technologies: Epitelio pigmentado de retina derivado de CME, distrofia macular de Stangerdt’s.

Moltes gràcies per la vostra atenció

baran@cmrb.eu