bqca. qm alicia i. cuesta, consultora internacional de la fao · adquisición de cepas de...

Aseguramiento de calidad

CULTIVOS DE REFERENCIANorma ISO 17025

Bqca. QM Alicia I. Cuesta, Consultora Internacional de la FAO

Objetivos de la clase

1. Cultivos de referencia: definición y requisitos.2. Preservación y mantenimiento de cultivos de referencia.3. Proveedores de cepas de referencia.4. Manejo y uso de cultivos de referencia

Cultivos de referencia:Cultivos de referencia:

REQUISITOREQUISITOPara acreditar o mantener la acreditación de un ensayo,

el laboratorio de microbiología debe contar con cultivos de referencia.

El número y la elección del género y especie de las mismas dependerá

de los ensayos que se efectúan y las necesidades particulares de estos últimos.

Cultivos de referencia:Cultivos de referencia:REQUISITOREQUISITO

SON NECESARIOS PARA DEMOSTRAR TRAZABILIDAD.

El laboratorio debe elaborar e implementar un procedimiento documentado para

el uso y manejo de cultivos de referencia.

¿ Para qué son necesarios los cultivos de referencia ?

Evaluación de la calidad de los medios de cultivo.

Realizar controles de calidad interno durante la ejecución delos ensayos.

Realizar controles de calidad de reactivos.

Pruebas confirmatorias. Ejemplo prueba de CAMP

Validar métodos.

Cultivos de referencia:Cultivos de referencia:

Definición: Término colectivo que se refiere

a cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo.

 Se debe tratar de un cultivo puro .(PUREZA).

Genéticamente estables.( ESTABILIDAD)( mantenimiento de características genotípicas y fenotípicas)

Células microbianas capaces de crecer (VIABILIDAD).Cepas de referencia: Las colecciones suministran las cepascon instrucciones para su recuperación.

Requisitos:

Cultivos de referencia:Cultivos de referencia:

En todos los casos la manipulación y modo de conservación de las cepas debe ser tal de prevenir :

El deterioro de las cepas.

La contaminación cruzada.

Mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de las cepas.

Su crecimiento característico debe ser documentado sobre cada medio sobre el que se utiliza como cepa control.

Definición: Material de referencia

Material o sustancia que posee valores de una o más propiedades suficientemente homogéneas y bien conocidas para permitir su uso en la calibración de aparatos, la evaluación de un método de medición o la atribución de valores a estos materiales.( COGUANOR NGR/ISO/IEC 43-1)

CEPAS DE REFERENCIA:CEPAS DE REFERENCIA:

PARA DEMOSTRAR LA TRAZABLIDAD DEBEN OBTENERSE DIRECTAMENTE DE:UNA COLECCIÓN NACIONAL O INTERNACIONAL DE CULTIVO DE REFERENCIA RECONOCIDO.Son microorganismos definidos:

Por lo menos a nivel de género y especie.catalogados.muy caracterizados. de origen conocido.

[ISO 11133-1:2000]

Se comercializan liofilizadas.

CEPAS DE REFERENCIA:CEPAS DE REFERENCIA:

Los organismos de acreditación deben considerar válida

la fuente de dónde provino la cepa.

IMPORTANTE: En la práctica para cumplir con el requisito prevenir mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de las cepas de el número de repiques a partir de la cepa de referencia debe ser limitado( en general es aceptado hasta 5 repiques a partir de la cepa de referencia )

Si una cepa se adquiere por cualquier vía que no sea la propia colección,

NO se puede mencionar utilizando el número que tienen en esa colección,

sino solamente como derivada de la cepa de colección.

Adquisición de Cepas de referencia:

 1 era opción: Obtención directa a partir de una colección nacional e internacional reconocida.

 2 da opción: Proveedores comerciales certificados por ISO que 9001.Comercializan repiques de cepas de referencia adquiridas en una colección reconocida. Generalmente el 3er o 4 repique.Deben mantener sus recipientes originales.Requerimiento en la recepción (compra de insumo) : certificado de origen donde conste el número de repique y el origen entre otros.

Proveedores de cepas de referencia:

Primera opción:Algunos ejemplos

ATCC (American Type Culture Collection).SVM (Foundation for the Advancement of Public and

Environmental Protection)CECT (Colección española de cultivos tipos).CNCM. (Collection Nationale de Cultures de

Microorganismes) lNSTITUT PASTEUR

Segundo opción:Algunos ejemplosProveedores acreditados por ISO 9001 que realizan repiques a partir cepas adquiridas en la colección reconocida.Oxoid Companie

Cepas de colección de referenciahttp://wwwatc.org

Definición: Material de referencia certificado.

Material o sustancia acompañado de un certificado, que posee valores de una o más propiedades, certificados por un procedimiento que establece su trazabibilidad a una realización exacta de la unidad en la cual se expresan los valores de dichas propiedades, para el cual cada valor certificado está acompañado por su incertidumbre, con un nivel de confianza establecido.( COGUANOR NGR/ISO/IEC 43-1)

Cepas de referencia certificadas:

Definición: Cepas de referencia certificadas es un Material de referencia certificado biológico.La colección certifica que ha suministrado una determinada cepa, que es un cultivo puro, y que se ha caracterizado por pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares adecuadas.

Por ser un material biológico surgen dificultades de certificación

Reconstitución

de las cepas de referencia:Las Cepas de referencia ingresan al laboratorio de microbiología se registran en planilla según procedimiento.Las Cepas de referencia se almacenan entre 0-5 º C hasta su uso. Las Cepas de referencia se reconstituyen y se siembran utilizando el medio de cultivo, las condiciones de incubación y el procedimiento indicado en las instrucciones para cada tipo de microorganismo del organismo proveedor de las cepas. En paralelo, a las Cepas de referencia, se les realiza un control de calidad de pureza y viabilidad y se registra.

Identificación de la cepa.

Género y especie del microorganismo

TIPO y Nº de colección.Nº de lote.Fecha de recepción.Control de calidad de la

cepa de referencia Conforme (SI/NO).

Fecha de caducidad de la cepa.

Personal responsable.

REGISTRO DE CEPAS DE REFERENCIA:

Control de calidad de pureza y viabilidad:

 Se realiza a diferentes niveles del proceso. CADA VEZ QUE HAGO UN REPIQUE.

 Su finalidad es asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus caracteres bioquímicos.

Frecuencia de realización de este control: para las cepas de reserva almacenadas el laboratorio la establecerá en cada caso.

 En caso de no presentar las características establecidas se ejecuta la Acciones correctivas establecida en el procedimiento.

Registro de Control de calidad de pureza y viabilidad de las cepas:

Fecha del control.

Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo. TIPO y Nº de colección.

Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo).

Pruebas a realizar (depende del microorganismo): o Coloración de Gramo Características de las colonias en medios selectivoso Pruebas bioquímicas y serológicas.

CEPAS DE CEPAS DE RESERVARESERVA

Cepas de reserva:Cepas de reserva:Definición: Cepas idénticas obtenidas mediante un Definición: Cepas idénticas obtenidas mediante un único único subcultivosubcultivo de una cepa de referencia.de una cepa de referencia.[ISO 11133-1:2000].Las cepas de reserva son una serie de alícuotas de cultivos idénticos obtenidas en el laboratorio por subcultivo de la cepa de referencia.

CREF

Cres Cres CresCresCresCres

REPIQUE UNICO

Las cepas de reserva las prepara y conserva el laboratorio.

Cepas de reserva:Cepas de reserva:

Dentro del laboratorio (ver plano del laboratorio) Debe haber un lugar destinado a almacenar las cepas de reserva.

Debe estar claramente señalado que se trata de cepas potencialmente peligrosas

y su manipulación restringida a personal autorizado.

A)LIOFILIZACIÓN.

B) CONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS.

MÉTODOS PARA

LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO

DE CEPAS DE RESERVA

obtenidas a partir de cepas de referencia :

Uso de agentes

Crioprotectores

A) LIOFILIZACIÓN.

Definición: es un proceso de desecación desde el estado congelado.

Agentes Crioprotectores: Leche descremada de calidad microbiológica( esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol.

PRODUCTO: se puede conservar en refrigeración o a temperatura ambiente por años.

MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

B) CONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS:

Agentes Crioprotectores: Leche descremada de calidad microbiológica( esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol.Glicerol al 10%Caldo BHI con glicerol 20%.

Proceso de congelación: Equipamiento o insumos para lograr la congelación:Congelador o cámara o uso de Nitrógeno líquido.

MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

B) CONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS:

Proceso de congelación: Temperaturas de congelación:Deseable a -70 o -80 º C o menores temperaturas.A temperaturas más altas como -20 º C no es lo ideal pero tal vez sea la única forma posible. Es preferible a -40º C.

Envases: Uso criovial o tubo estéril.

PRODUCTO: se puede conservar en a temperatura congelación por años.

Inconveniente: problemas y pérdida de las cepas la falta de suministro de energía, falta de insumos o avería del equipamiento.

MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE

CEPAS DE RESERVA

!! Es muy importante un buen método de conservación de modo de mantener los microorganismos vivos, puros y la cepa microbiana auténtica!!

Para lo cual se debe tener en cuenta los conocimientos básicos de Microbiología.

Proveer condiciones adecuadas para cada tipo de microorganismo.

Con cada subcultivo, hay Riesgo de cambio de la cepa.

Evito el crecimiento.

FACTORES QUE AFECTAN LA VIABILIDAD DE LA CEPA

La viabilidad de las cepas, sometidas a un proceso de congelación (para su almacenamiento), está determinada por los siguientes factores:

a) Tipo de cepa. Ejemplo las bacterias Grampositivas resisten mejor que las Gram negativas.

b) El cultivo debe estar en las mejores condiciones posibles antes de ser expuesto a bajas temperaturas.

FACTORES QUE AFECTAN LA VIABILIDAD DE LA CEPA

b) Condiciones necesarias antes de ser expuesto a bajas temperaturas:1. La EDAD DEL CULTIVO puede afectar la capacidad del microorganismo de sobrevivir.Cultivos demasiados jóvenes o demasiado viejos son menos resistentes al shock térmico.Ideal es fin etapa logarítmica principio fase estacionaria tienemayor probabilidad de recuperación.( en bacterias en general es 24 horas de incubación a 37º C)

2. Las CONDICIONES DE DESARROLLO también juegan un papel importante . Ejemplo; Las levaduras que crecen aireadas y agitadas tienen mayor resistencia a la temperatura que aquellas que desarrollan en un medio sólido.

MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

Las instrucciones del fabricante de los sistemas de preservación de cepas

disponibles comercialmente deben ser rigurosamente respetados y observados.

Ejemplo:Supervivencia de los microorganismos

almacenados a –20º C en Mast CryobankReferencia: Mast Cryobank TM, ETICOR

Microorganismo Supervivencia en meses

Enterobacter aerogenes 48 Pseudomona aeruginosa 18 Salmonella typhimurium 48 Staphylococcus aureus 48 Listeria monocytogenes 48 Listeria ivanovii 48 Rhodococcus equi 48 Bacillus cereus 24 Clostridium perfringes 48

Procedimiento:Cepas de reserva:Cepas de reserva:

Paso 1: Los tubos o criovialesdonde se almacenan las cepas reserva , se rotulan (previamente a la inoculación)

Paso 2: El desarrollo microbiano obtenido, se inocula asépticamente en el medio líquido sobrenadanteque contienen los crioviales.

Paso 1: Información en cada criovial: •Identificación de la cepa• Tipo y Nº de colección• Nº de repique.•Fecha de realización del C res.•Fecha de vencimiento del criovial.• Nº de tubo o criovial.

REGISTRO DE CEPAS DE RESERVA

Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo.TIPO y Nº de colección.Nº de Lote Cepa referencia.Nº de criovial o vial.

Fecha de reconstitución de la Cepa referencia.

Nº de repique.Frasco en uso.Fecha de baja criovial.Ubicación de

almacenamiento.Observaciones

Procedimiento:Cepas de reserva:Cepas de reserva:

Paso 3: Congelar o liofilizar la Cres

Paso 4: Manipulación de la Cres para obtener cepas de trabajo CtIMPORTANTE!! Para cepas congeladas de crioviales este paso se debe realizar de manera de prevenir el descongelamiento y la contaminación del criovial(Cres), mediante el traslado en caja termostatizada del mismo y repique en campana de flujo laminar.

Procedimiento:Cepas de reserva:Cepas de reserva:

En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva no deben volver a congelarse.

El criovial vencido se elimina del cepario y se registra.

Cuando se fracciona alícuotas en leche u otros agentes crioprotectores, se usan, se descongelan y no se pueden volver a congelar ni a usar.

Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se pueden volver a usar.

Cepas de trabajo:Cepas de trabajo:

SubcultivosSubcultivos de microorganismos obtenidos a de microorganismos obtenidos a partir de las cepas de reserva para ser partir de las cepas de reserva para ser utilizados en los ensayos que lo precisen.utilizados en los ensayos que lo precisen.

Obtención de cepas de trabajo:Los cultivos de trabajo se obtienen a partir de la Cepas

de reserva sobre un medio sólido o líquido no selectivo adecuado utilizando un ansa estéril e incubando en condiciones adecuadas.

Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas.

Esquema de cultivos de referencia:

*Controles de pureza y pruebas bioquímicas de la cepa.

CEPA DE REFERENCIA

CONSERVACIÓN MEDIANTE DISTINTOS MÉTODOS

(Liofilización, nitrógeno líquido, ultracongelación rápida, etc.)

Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento

OBTENCIÓN DE LAS CEPAS DE RESERVA

CEPAS DE TRABAJO(Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)

UTILIZACIÓN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS, VALIDACIÓN DE MÉTODOS Y

CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD

*

Reconstitución(Sólo se acepta un único repique)

*

Descongelación / reconstitución

*

Se subcultiva

una sola vez.

CEPA DE REFERENCIA

CONSERVACIÓN MEDIANTE DISTINTOS MÉTODOS

(Liofilización, nitrógeno líquido, ultracongelación rápida, etc.)

Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento

OBTENCIÓN DE LAS CEPAS DE RESERVA

CEPAS DE TRABAJO(Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)

UTILIZACIÓN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS, VALIDACIÓN DE MÉTODOS Y

CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD

*

Reconstitución(Sólo se acepta un único repique)

*

Descongelación / reconstitución

*

Se subcultiva

una sola vez.

Se subcultivauna sola vez

PASOS a seguir para el manejo de los cultivos de referencia:

Adquisición de cepa de referencia (C Ref): - Requisitos de compra y Registro de la

cepa adquirida.

Subcultivo de C Ref: - Control de pureza y viabilidad

(REGISTRO).Preparación de la cepa de reserva (Cres)

- Control de pureza y viabilidad periódicos (REGISTRO).

- Registro de cada frasco de la nueva cepa de reserva Incorporada al cepario.

PROVEEDOR DE CEPA

LABORATORIO

LABORATORIO

PASOS a seguir para el manejo de los cultivos de referencia:

Subcultivo la cepa de reserva (C t): -Control de pureza y viabilidad (REGISTRO).

USO PARA CONTROLES DE CALIDAD

CONDICIONES CONTROLADAS DEALMACENAMIENTO

DE LA CEPA DE RESERVA

LABORATORIO

LABORATORIO

Síntesis finalEl laboratorio de microbiología debe contar con cultivos de referencia.Los cultivos de referencia se utilizan en el laboratorio para:Evaluar la calidad de los medios de cultivo, aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo y validación de métodos microbiológicos.Es necesario contar e implementar un procedimiento para el manejo de cultivos de referencia, asegurar la trazabilidad y el origen de la cepa, así como conocer las características de las cepas usadas en los ensayos de modo que mantengan su viabilidad y sus caracteres bioquímicos.

NECESITAMOS UN DESCANSO!!!NECESITAMOS UN DESCANSO!!!