100 años de cultivos celulares

100 años de Cultivos Celulares www.cultek.com

Introducción a los Cultivos Celulares

Un poco de historia

• 1880-1910: Primeros ensayos de sobrevida de células fuera de organismos enteros (Roux, Haberlandt, etc.)

• 1912: Burrows y Carrel establecen las primeras líneas celulares. Desarrollan técnicas asépticas de trabajo y material específico

Un poco de historia

• 1920-1940: Se establecen líneas celulares de diversos órganos animales• 1940-1955:

– Se replican virus sobre células cultivadas– Se producen las primeras vacunas virales en cultivos celulares– Se definen las condiciones para congelar células en nitrógeno líquido (Alan

Parks, 1949)– Se establece la línea HeLa (1ª de origen humano, 1952)– Se desarrollan los primeros medios de cultivo químicamente definidos– Se cultivan las primeras células de insectos

Un poco de historia

• 1960’s: Se desarrollan las técnicas de hibridización en cultivos• 1970’s:

– Los cultivos celulares se incorporan a la ingeniería genética– Desarrollo de grandes reactores de cultivos en suspensión

• Reciente:– Modificación genética controlada de células– Desarrollo de medios de cultivo libres de suero– Desarrollo de medios de cultivo libres de componentes animales

Cultivos celulares

• Propagación de células fuera del organismo de origen

• Pueden ser de origen vegetal o animal, y dentro de éstas, pueden provenir de distintos tejidos de vertebrados o invertebrados

• Los cultivos celulares producen clones, por lo que todas las células de un cultivo poseen el mismo genotipo, excepto que se produzcan mutaciones durante el proceso

¿Para qué cultivar células in vitro ?

• Investigación– Comprender la fisiología celular– Toxicología, virología, etc.

• Ingeniería de tejidos– Piel, hígado– Hueso y cartílago

• Producción de biológicos– Anticuerpos monoclonales– Hormonas (FSH)– Enzimas– Vacunas virales (polio, aftosa, parvo, moquillo, etc.)

Ventajas• Un solo tipo bien definido de células en cada cultivo• Fácil de manipular, condiciones controladas• Establecimiento de líneas internacionales de fácil

acceso• Alternativa al uso de animales

– Sistema para estudiar principios fisiológicos– Chequeo posterior en un número reducido de animales

• Pueden obtenerse grandes cantidades de células• Permite trabajar en pequeña, media y gran escala• Las células pueden mantenerse congeladas por

largos períodos de tiempo con mínima pérdida de viabilidad

Sin embargo...

• Cuidado que no son animales enteros– Las células no están organizados en verdaderos

tejidos– No hay interrelación con otros tejidos– El comportamiento es distinto a la organización

tridimensional• El entorno es distinto• Las condiciones de crecimiento son distintas• Las conclusiones de los ensayos deben ser

debidamente acotadas

Componentes de un cultivo

CÉLULAS

Tipos de cultivo• Cultivo primario: células, tejidos u órganos tomados

directamente de un animal.• Cultivo de órganos, explantes: mantenimiento de

órganos o parte de órganos in vitro.• Cultivo de tejidos: mantenimiento de tejidos in vitro.• Cultivo de células: mantenimiento de células dispersas.• Líneas celulares: células mantenidas por subcultivos

sucesivos comenzando por un cultivo primario.• Cultivos continuos: células que han logrado sobrevivir a

muchos subcultivos. Expectativa de vida “infinita”.

Líneas celulares continuas: algunos ejemplos

• BHK: Fibroblastos de riñón de hamster sirio dorado• CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico• MDCK: Epitelio de riñón canino (Cocker Spaniel)• CHO: Epitelio de ovario de hamster chino• VERO: Fibroblastos de riñón de mono verde africano• HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano• MDBK: Epitelio de riñón de bovino adulto• HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana• FHBE: Endotelio de corazón fetal bovino• Etc., etc., etc.

Colecciones internacionales más importantes

Sigla Nombre u organismo Ciudad, país Nº de cultivos

ATCC American Type Culture Collection

Human and Animal CellCultures

European Collection of CellCultures

Istituto Giannina Gaslini

Minassas, USA

DSMZ Braunschweig, Alemania

≈500

ECACC Salisbury, Wiltshire, UK

≈1000

≈800

Genova, Italia ≈2300

Fuente: www.biotech.ist.unige.it/cldb/indexes.html

Banco de células español

• El Banco Nacional de Líneas Celulares se configuracomo una estructura en red con varios nodoscoordinados por un central, que tendrá como objetivogarantizar en todo el territorio nacional la disponibilidadde líneas de células troncales humanas embrionarias y adultas para la investigación biomédica.

• El Banco de Líneas Celulares está adscrito a la Subdirección General de Investigación en TerapiaCelular y Medicina Regenerativa del Instituto de SaludCarlos III,

• Link a la Web del Banco Nacional de Células:– http://www.cultek.com/link/link.asp?link=http://www.isciii.es/htdoc

s/terapia/terapia_bancocelular.jsp

SOPORTE

CELULAS

Soporte

• Líquido: Células en suspensión

Bioreactores

Soporte

• Sólido: Células adheridas a superficies plásticas, membranas, polímeros, vidrio etc.

Otros soportes de Cultivo

SoporteTitulación de virus en microplacas con tinción final

Soporte

• Superficies cubiertas con sustancias que favorecen el crecimiento celular

Microcarriers

Extraído de “From Space to the Clinical Bedside”

En Internet: slsd.jsc.nasa.gov/bso/resources/ lectures/npLectureMechCulture.pdf

FASE GASEOSASOPORTE

CELULAS

Fase gaseosa

• La concentración de oxígeno necesaria depende de los requisitos de las células

• La concentración de dióxido de carbono depende de la capacidad buffer del medio de cultivo

• Usualmente el equilibrio dióxido de carbono (en la fase gaseosa) - bicarbonato (en la fase líquida) actúa como buffer del cultivo

Materiales

FASE GASEOSASOPORTE

CELULAS

Medios de cultivo celularesCUALIDADES:

• Específico para la célula a cultivar• Nutritivo• pH adecuado• Capacidad buffer• Isotónico• Estéril

Componentes de los medios de cultivo

• Agua• Sales• Glucosa• Ácidos grasos• Vitaminas• Suero• Péptidos

• Micro y oligoelementos• Aminoácidos esenciales• Factores de crecimiento• Otro regulador de pH• Indicador de pH• Antiespumante• ¿Antibióticos?

Organización de un subcultivo

• El objetivo de un subcultivo (pasaje) es mantener las células en condiciones de replicación normal.

• En el subcultivo se renueva el medio de cultivo y se lleva la relación células/medio/superficie de soporte, a la inicial.

• Las células adheridas a soportes sólidos deben ser primero despegadas de este soporte y separadas enzimáticamente (tripsina). Luego se resuspenden, se tiñen con colorante vital (Azul Tripan) y se cuentan en cámara de Neubauer.

• Si se parte de un cultivo de células en suspensión directamente se procede a contar las células.

Organización de un sub-cultivo• Una vez conocida la concentración de células

en el material de origen, se definen las condiciones del subcultivo deseado y se realiza el pasaje.– Ejemplo

• Material de origen: 2x106 cél/ml• Destino: tres botellas de 175 cm2 con una concentración

inicial de 35000 cél/cm2

• Necesidad: 3 x 175 x 35000 = 1.8x107 células• 1.8x107 células / 2x106 cél/ml = 9 ml ( 3 ml / botella )

Factores críticos

• Suero:– Ventajas: Gran aporte de nutrientes básicos,

proteínas, factores de crecimiento, hormonas, promotores de adhesión, inhibidores enzimáticos, etc.

– Desventajas: Composición indefinida, variabilidad entre lotes, interferente en procesos de purificación de proteínas, interferente en procesos de multiplicación viral, vehículo de entrada de contaminaciones, etc.

Factores críticos

• Temperatura de cultivo: depende del origen de las células. Mamíferos: 37ºC, peces e insectos: 18-22ºC, aves: 38.5ºC, etc.

• Contaminaciones: gran complicación en los laboratorios de cultivos celulares, principalmente a escala industrial. Pueden ser por levaduras, hongos miceliares, virus, bacterias, micoplasmas, otras células, etc.

Factores críticos no biológicos

• Orden• Limpieza• Higiene personal• Vigilancia microscópica• Estudio adecuado de los problemas• Análisis de problemas potenciales• Trazabilidad de los cultivos• Protocolización exhaustiva

Equipamiento

• Además del equipamiento usual de cualquier laboratorio, se requiere:– Microscopio invertido– Cámara de conteo de células– Flujo laminar de características adecuadas al trabajo a

desarrollar– Sistema de filtración esterilizante de soluciones, líquidos y

medios de cultivo– Material de soporte estéril– Espacio frío de 4, -20, -75 y –196ºC– Estufas de cultivo con o sin atmósfera de CO2

Materiales

FASE GASEOSASOPORTE

CELULAS

Catálogo

Medios de cultivo

• Medios para Cultivo Celular– Hyclone, pinche aquí– Biochrom, pinche aquí.

Agitación(pinche sobre imagen)

Cabinas de flujo laminar (pinche sobre imagen)

Incubadores de CO2 (pinche sobre imagen)

Manejo de líquidos(pinche sobre imagen)

Materiales

FASE GASEOSASOPORTE

CELULAS

Catálogo Aplicacionesactuales

Hibridomas: producción Anticuerpos Monoclonales(pinche sobre imagen)

Celulas Madre (Stem Cells)(pinche sobre imagen)

Fertilización In Vitro(pinche sobre imagen)

Soporte técnico(pinche sobre imagen)

• Manuales• Protocolos• Referencias• Guías de ususario• Artículos técnicos

Nuestras marcas

Seminarios conmemorativos del Centenario de las técnicas de Cultivo Celular

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