alcohol de papa
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“OBTENCIÓN DE ALCOHOL APARTIR DEL ALMIDÓN DE LA PAPA”
I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
Hoy en día existe un grave problema ambiental “el smoke y la
contaminación”, han producido daños a la capa de ozono Debido
principalmente al uso intensivo (80%) de combustibles fósiles (carbón,
petróleo, gas natural) en actividades industriales y el transporte se ha
producido un excesivo aumento en las cantidades de óxidos de nitrógeno y
dióxido de carbono emitidas a la atmósfera Además del incremento de las
emisiones existen otros problemas como la deforestación (20%), que han
limitado la capacidad regenerativa de la atmósfera para eliminar el dióxido
de carbono, principal responsable del “Efecto Invernadero”.Por lo tanto se
busca la utilización de otras fuentes de energía renovables como los
Biocombustibles hacen parte de la solución para disminuir las emisiones de
gases contaminantes, actualmente se esta produciendo alcohol de la caña
de azúcar pero recientes estudios han determinado que el bagazo de la
caña de azúcar tiene alto contenido de contaminantes entre ellos tenemos al
“bagazosis” que es una enfermedad que se presenta en trabajadores
expuestos a la inhalación de polvos de bagazo de caña enmohecido que
forma parte de un conjunto de enfermedades de características clínicas,
inmunológicas e histopatológicas semejantes, denominado alveolitis alérgica
extrínseca, pero el término correcto es el de neumonitis por hipersensibilidad
ya que la respuesta inmunopatológica se localiza en la porción distal del
árbol respiratorio y abarca desde el bronquiolo terminal respiratorio, hasta
los alvéolos y los capilares pulmonares, también afecta a los ojos ya que las
partículas de hollín de tamaño igual o menor a 10 micrones, se incrustan en
las corneas .Recientemente la OMS, anuncio que el 40% de pobladores
mueren por causa del bagazosis y que el otro 60 % sufren de afecciones
respiratorias los mas afectados son los niños debido que están el mayor
tiempo en contacto con la naturaleza, no solo esto en cada inicio de zafra
para los pobladores se hace insoportable convivir con la gran cantidad de
hollín y humo que emanan las chimeneas de caña de azúcar dañando el
patrimonio natural y cultural. Ante es problemática existe como alternativa la
obtención de alcohol a partir de otra materia prima que no sea tan perjudicial
1
como es el almidón de la papa para producir alcohol anhidro para aditivo de
combustible y para carburantes; también se puede producir en gran escala
alcohol para el consumo humano (vodka).
I.1. Interrogantes De La Investigación:
I.1.1 ¿Cuál es el proceso de obtención de alcohol apartir del almidón
de la papa?
I.1.2. ¿Qué parámetros fisicoquímicos se controlara en la obtención
de alcohol del almidón de la papa?
I.1.3. ¿Cuál será el rendimiento de alcohol que se obtendrá del
almidón de la papa?
I.1.4 ¿Cuál es el grado alcohólico del alcohol obtenido del almidón de
la papa?
II. ANTECEDENTES:
GULATI et al., (1996), Investigarón sobre “Maíz como materia prima en una
planta productora de alcohol etílico”, Par la hidrólisis del almidón se usa la -
amilasa obtenida de bacterias termo resistentes Bacillus licheniformis tiene
que ser llevada a altas temperaturas (90-100ºC) para el rompimiento de los
gránulos del almidón, el almidón licuado se somete a sacarificación a
menores temperaturas (60-70ºC) con glucoamilasa con Aspergillus Níger la
cual hidroliza las dextrinas hasta glucosa.
NETWORK, W. (2002), Investigo sobre “La producción de etanol usando
mezclas de jugo de sorgo dulce”, granos de alto contenido de almidón, tallos
con alto contenido de sacarosa y hojas y bagazo con alto contenido de
lignocelulosa bajo condiciones normales y de muy alta concentración de
sólidos (VHG), usando cepas de Saccharomyces cerevisiae a 30°C
obteniendo concentraciones de etanol de hasta 16,8%v/v El objetivo de este
trabajo fue determinar las condiciones para obtener el mejor grado de
hidrólisis del almidón del grano, usando las propias enzimas que se generan
durante la germinación.
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AFANADOR, A. (2005) Investigo sobre “El Banano verde en la producción
de etanol” el banano verde con cáscara tiene alto contenido de almidón y
celulosa, se le considera como una materia prima potencial para la industria
del bioetanol., la producción de alcohol a partir de almidones y celulosa con
procesos químicos o biológicos (hidrólisis) para su conversión a jarabes
azucarados, que una vez acondicionados se someten a la acción de
levaduras que efectúan la fermentación alcohólica. El etanol resultante se
lleva a procesos de destilación y deshidratación hasta obtener alcohol
anhidro (99,5% v/v).
LOZANO U. Á. (2003) Investigo sobre “Producción de etanol a partir de yuca
mediante bioreactor de tanque agitado con control de variables” Se obtiene
del almidón aislado de la yuca raíz sin cáscara, dicho almidón (polisacárido
de glucosa) se somete a hidrólisis química, de tal forma que se produzcan
azúcares fermentables, que son sometidos a una fermentación anaeróbica
por la levadura Saccharomyces cerevisiae obteniendo una solución
etanólica. Ambas etapas, hidrólisis y fermentación anaeróbica son realizadas
en el Bioreactor de Tanque Agitado controlando variables de pH,
Temperatura, Agitación, Tiempos de hidrólisis y de fermentación y
Concentración de sustratos.
SUNG Y CHENG J, (2002) Investigarón sobre, “Producción de alcohol a
partir del trigo”. La que usualmente se utiliza en la producción de alcohol,
llamada Zymomonas mobilis, obtiene excelentes resultados pero sólo a partir
de la celulosa de los palos de trigo se podría hacer alcohol donde se logra
rendimientos que alcanzan0.357 Etanol/kg de trigo mediante el proceso
Biostill.
CHAVES, S. M. (2004), Investigo sobre “Alcohol apartir de la caña de
azúcar”, para la producción de etanol la principal materia prima es el jugo de
caña o las melazas (subproducto de la industria azucarera) .Se puede
obtener cerca de 70L EtOH/ton de caña y 9L EtOH/ton de melazas .El
microorganismo mas utilizado es el Saccharomyces cerevisiae por su
capacidad de hidrolizar la sacarosa de la caña de azúcar para su conversión
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hasta glucosa y fructuosa se puede dar en condiciones anaeróbicas en
pequeñas cantidades de O2.
LYND, LR (2002), Investigo sobre “Alcohol apartir de Biomasa
Lignocelulósica”, los materiales que mas se han investigado son residuos
forestales, de la industria papelera y residuos de sólidos urbanos. El
complejo Lignocelulósico esta compuesto de una matriz de carbohidratos de
celulosa y lignina enlazada por cadenas de hemicelulosa el pretratamiento
tiene que desintegrar esta matriz par que la celulosa redusca su grado de
cristalinidad y aumente la célula amorfa que es la que se requiere para el
posterior ataque enzimático con células hexogenas la cual hace que se de
una solución de glucosa que después hará que se convierta en EtOH
mediante microorganismos.
III. JUSTIFICACIÓN:
III.1. JUSTIFICACIÓN TEORICA: El Etanol en mezcla con la Gasolina
reduce las Emisiones de Monóxido de carbono (CO), sin incrementar la
de Óxidos Nitrosos (N0x) ya que de acuerdo con la Asociación de
Recursos Renovables de Canadá, el agregado de un 10% de etanol al
combustible trae los siguientes beneficios: reducción de un 30% de las
emisiones de monóxido de carbono y disminución entre un 6% y un 10%
de reducción de las emisiones de dióxido de carbono a la atmósfera.
III.2. JUSTIFICACIÓN TECNICA: En nuestro país la producción de papa
se realiza en 6 meses con un promedio de 176.200 Ha, si consideramos
el porcentaje de desperdicios del 3% por falta de transporte,
almacenamiento y conservación tendríamos alrededor de 79.800
Toneladas de papa residual al año que podría ser utilizada en la
producción de almidón, que sería de aproximadamente 15.960
Toneladas, que por hidrólisis enzimática se obtendría 15.162 Toneladas
de azúcares fermentables y que por fermentación es posible producir
alrededor de 50 millones de litros de alcohol. Una temprana experiencia
de producción de vodka, con la cooperación de la República de Polonia,
en el sur chico peruano, no prosperó por que la variedad de papa
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utilizada tenía un alto contenido de agua, solo 18 % de materia seca.
Esta papa "aguachenta" es típica de la producción costera. Pero en
nuestros andes tenemos variedades de papas con más del 30% de
materia seca, y la variedad requerida para la producción de papa exige
sólo un 25% de materia seca.
III.3. JUSTIFICACIÓN SOCIAL: Dentro de éste contexto se sitúa la
presente investigación que se inclina al aprovechamiento del recurso
agrícola, almidón de papa, como fuente energética en la producción de
etanol y el aprovechamiento de los productos intermedios del bioproceso
como son la proteína unicelular, la glucosa y los preparados crudos de
amilasas como resultado los mayores beneficiarios serian los pequeños
productores de papa, también se indicó que de los sobrantes de papa
generados en el proceso de extracción de etanol carburante se podrían
obtener subproductos de ágil comercialización como alimentos para
ganadería y abonos orgánicos, dando cuenta que este proceso no sólo
ampliaría la producción industrial del energético sino que propone la
exploración de otros mercados y la dinamización de la economía
nacional.
IV. MARCO TEORICO:
IV.1. PAPA.
IV.1.1. Aspectos Generales.
Requejo y Ortega (1996). En el Perú se encuentran alrededor de 2000.
variedades de mayor calidad se producen sobre los 3,000 m.s.n.m.
Actualmente contamos con variedades nativas y modernas por su origen.
Por su color son blancas y de color y por el uso son amargas, amarillas e
industriales. Los tubérculos de papa tienen diversos usos, así en la
alimentación humana el producto se consume fresco o procesado. Dentro de
los componentes nutritivos el que se encuentra en mayoría es el agua que
constituye en torno al 80% del total. Le siguen los carbohidratos que
constituyen el 16-20% entre los que hay que destacar el grupo de los
almidones que son polisacáridos complejos que se absorben como glucosa
previa hidrólisis enzimática. La fibra alimentaría representa 1-2% del total de
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la papa y se encuentra preferentemente en la piel, siendo los más
importantes la glucosa, fructosa y sacarosa.
IV.1.2. Ubicación Taxonómica.
Género: Solanum
Especie: Solanum tuberosum
Familia: Solanáceas.
Origen: Nativa de los Andes y cultivada desde la época prehispánica.
Distribución: Costa y sierra peruanas. Extendida a todo el mundo
(Requejo y Ortega, 1996)
IV.1.3. Composición química de la papa.
Cuadro 1: Principales componentes de la papa, rango y media.
Componentes Rango % Media
Agua 63.2 - 86.9 75.05
Sólidos totales 13.1 - 36.8 23.7
Proteína (Nitrógeno total + 6.25) 0.7 - 4.6 2
Glicoalcaloides (Solanina) 0.2 – 41 3-10(mg/100gr)
Grasa 0.02 - 0.20 0.12
Azúcares reductores 0.0 - 5.0 0.3
Total Carbohidratos 13.3 - 30.53 21.9
Fibra Cruda 0.17 - 3.48 0.71
Ácidos Orgánicos 0.4 - 1.0 0.6
Ceniza 0.44 - 1.9 1.1
Vitamina C 1 - 54 mg/100gr 10-25(mg/100gr)
Fuente: Mataix, (1997)
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IV.2. ALMIDÓN, (materia prima).
Espinosa (2004), Probablemente no existe otro compuesto orgánico tan
ampliamente distribuido en los vegetales como el almidón. Es el producto de
asimilación más importante de la fotosíntesis y constituye la principal
sustancia de reserva de los vegetales.
El almidón se encuentra en abundancia en:
Graminneas (cereales): trigo (Triticum sativum); arroz (Oryza sativa);
maíz (Sea mays); avena (Avena sativa); centeno (Secale cereale);
cebada (Hordeum vulgare)
Leguminosas (legumbres): porotos (Phaseolusvulgaris); arvejas
(Pisum sativum); lentejas (Lens sculenta), etc.
Solanáceas: papas (Solanum tuberosum).
Industrialmente se le obtiene por vía húmeda a partir de ellos.
IV.2.1. CARACTERÍSTICA Y PROPIEDADES.
Espinosa (2004), la diferencia entre harina y almidón de papa es la papa
entera que se le ha quitado el agua y se ha molido para obtener la harina. El
almidón se obtiene después de romper el tejido, por ejemplo al pasar la papa
por un extractor de jugos sale un jugo con un residuo lechoso ese residido
lechoso es el almidón el cual debe sufrir varios lavados para eliminar los
contaminantes y obtener un almidón blanco. Se presenta como polvo blanco
fino, insípido, constituido por granos característicos microscópicamente para
cada especie. Para su caracterización se toma en cuenta: tamaño (aprox. 2-
150 u), forma, hilio o núcleo, estratificaciones; granos simples o compuestos
y aspectos a la luz polarizada.
El almidón es insoluble en agua fría; en agua caliente se hincha formando
engrudo; se torna de azul a azul violeta con sol; da glucosa como producto
final de la hidrolisis total.
IV.2.2. ESTRUCTURA DEL ALMIDÓN.
Martínez, (2006), Químicamente el almidón o fécula es un polisacárido
homogéneo que esta formado por una mezcla de dos polisacáridos
estructuralmente diferentes: amilosa y amilo pectina.
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Como primera aproximación, se puede decir que el almidón está constituido
por unidades de D(+)-glucosa enlazadas α-1.4. Nuestras enzimas hidrolizan
los almidones hasta sus unidades constituyentes de glucosa, la cual, como
ya hemos expresado, sirve a nuestro organismo de nutriente y es utilizada
para diferentes transformaciones metabólicas.
Al tratar el almidón con agua caliente, este se separa en dos fracciones: una
dispersable, que se conoce como amilosa y otra no dispersable, que es la
mayoritaria, que se conoce como amilopectina.
Almidón
Los dos constituyentes del almidón difieren en diversos aspectos y por tanto
los consideramos por separado.
o Amilosa.
Amilosa es una molécula lineal compuesta por 250 a 300 unidades de Â
a -D-glucopiranosa enlazadas por uniones 1-4 (Martínez, 2006)
Figura 1: Estructura de la amilosa
o Amilopectina.
Está también constituido por unidades de D (+)-glucosa, con enlaces
8
H2O
Δ
Amilosa 20 %
Amilopectina 80 %
α-1.4, pero las cadenas son de 1000 unidades o más y presentan
ramificaciones cada 25 unidades α-1.6 en los puntos de ramificación. La
hidrólisis de la amilopectina van produciendo mezclas de Oligosacáridos,
de masa moleculares gradualmente menores, que se conocen como
“Dextrinas” que se utilizan en el acabado de tejidos y en la fabricación de
pegamentos, etc. (Martínez, 2006)
Figura.2 Estructura de la amilopectina.
IV.2.3. Composición del almidón de papa.
Cuadro 2.
Componentes Análisis típico
Almidón el 80%
Agua el 20%
Ceniza 0,30%
Arena 0,02%
Proteína 0,09%
Fósforo, P 0,07%
FUENTE: Martínez, (2006)
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IV.3. Etanol (Producto).
Se le denomina también Alcohol etílico cuya molécula tiene dos átomos de
carbono. Es un líquido incoloro, de sabor urente y olor fuerte, que arde
fácilmente dando llama azulada y poco luminosa. Se obtiene por destilación
de productos de fermentación de sustancias azucaradas o feculentas, como
uva, melaza, remolacha, papa. Forma parte de muchas bebidas, como vino,
aguardiente, cerveza, etc., y tiene muchas aplicaciones industriales. Su
fórmula química es CH3-CH20H. Para bebidas alcohólicas, prácticamente
todo el alcohol etílico que se consume es una mezcla de 95% de alcohol y
5% de agua. Cualquiera que sea su método de preparación, primero se
obtiene alcohol etílico mezclado con agua, y luego se concentra esta mezcla
por destilación fraccionada. (Ward, 1991).
IV.3.1. CARACTERISTICAS DEL ALCOHOL ETILICO.
El alcohol etílico rectificado deberá tener las siguientes características:
CUADRO 3.
Grado alcolhólico volumétrico 96° GL a 20°C
Densidad relativa máxima 0,8120 a 20ºC
Residuo no volátil máximo 1 mg/100 alcohol a 1000 ºGL
Acidez para 100 ml de alcohol a 100 ºGL Máximo 1 ,8 mg de ácido acético
Esteres por 100 ml de alcohol a 100 ºGL Máximo 6,5 mg de acetato de etilo
Aldehídos por 100 ml de alcohol a 100 ºGL Máximo 1 mg
Fuente: Normas y Tecnología (Ward, 1991).
IV.3.2. APLICACIONES Y USOS.
El alcohol etílico es uno de los compuestos orgánicos usados en la industria,
en laboratorios y en el hogar. Actualmente tiene una extraordinaria
importancia comercial e industrial, ya que se utiliza como combustible,
disolvente, agente extractivo, anticongelante y como producto químico. Se
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utiliza en las industrias de perfume, barnices, lacas, pinturas, jabones,
productos medicinales, películas fotograficas, licores, cosméticos, azúcares
fermentables. (Ward, 1991).
Uso Industrial: Es ampliamente utilizado para la elaboración de
licores, como productos de uso doméstico, como combustible, etc.
Uso Comercial: El alcohol es actualmente un producto en potencia
como energía convencional y de aceptación en el uso de combustible
para automóviles.
Uso Domestico: Es ampliamente utilizado por los pobladores como
desinfectante, en curaciones y como fuente de energía calorífica.
IV.4. PROCESOS DE OBTENCIÓN DE ALCOHOL.
IV.4.1. PROCESOS FERMENTATIVOS.
Es un proceso bioquímico mediante el cual ciertos microorganismos
metabolizan las moléculas de azúcar produciendo etanol y CO2.
También se producen glicerol y ácido succínico, lo que muestra que la
fermentación incluye otras reacciones secundarías. La fermentación es
llevada a cabo generalmente por levaduras del género Saccharomyces
realizándose por acción de un complejo enzimático llamado enzimático que
permite transformar las hexosas en alcohol y C02. Otros complejos
enzimáticos intervienen cuando se degradan otros tipos de azucares:
Pentosas como la xilosa y arabinosa, que producen alcohol por acción de
algunas levaduras del género Torula.
Disacáridos como la sacarosa y maltosa que son fermentadas por
Saccharomyces.
Polisacáridos como el almidón, dextrina, celulosa y otros, podrán ser
fermentados siempre que se hidrolice previamente en mono, di o tri
Sacáridos.
La industria de las fermentaciones utiliza como fuente de origen para el
proceso a casi todas las materias primas que poseen carbohidratos en su
constitución (Silva, 2000)
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Una de las formas de obtener alcohol etílico es mediante la fermentación de
mostos azucarados de acuerdo a 1a ecuación establecida primero por
Lavoisier1787, luego Gay-Lussac en 1820 y corregida por Dumas en 1840,
que establecieron el desdoblamiento de los azucares por la ecuación
química siguiente:
C12H22011 + H2O 2 (C6H12O6) x
C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O
Metabolismo oxidativo (formación de Biomasa)
C6H12O6 6 C2 H5OH + 2 CO2
Metabolismo fermentativo (formación del alcohol)
C2 H5OH + 3 O2 2 CO2 + 3 H2O
Metabolismo oxidativo del etanol (formación de biomasa)
En la práctica se comprueba que el metabolismo de la glucosa es mucho
más compleja, ya que según las cantidades ambientales, el metabolismo
puede ser parcialmente fermentativo o parcialmente oxidativo
(BRUSHMAN, 1980).
IV.4.2. Clasificación de acuerdo al medio donde se desarrollan.
a) . La fermentación Aeróbica.
Es el proceso donde se suministra oxígeno al sistema y se desprende CO2.
En general las fermentaciones aeróbicas pueden representar de la siguiente
manera:
m. o + Elementos Nutrientes + O2 C02 + Productos + m.o
- Los microorganismos son: Bacterias, levaduras, hongos, tejido celular.
- Los nutrientes son: Carbono, hidrógeno azufre, fósforo, magnesia, sodio.
- Las condiciones adecuadas para su desarrollo son: pH, temperatura,
viscosidad, oxigeno disuelto y la segunda es un proceso en el cual no
necesita oxígeno. (Jorgensen, 1995).
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b) La fermentación Anaeróbica.
Es un proceso en el cual no se necesita oxígeno, Cuando no hay oxígeno,
en muchas formas de vida se detiene el mecanismo celular de respiración
aeróbica, provocando su muerte; pero en otras, como en ciertas bacterias, el
proceso se realiza por medio de un mecanismo al que los científicos
bautizaron como respiración anaeróbica. A diferencia de la respiración
aeróbica, en la anaeróbica no existe un solo grupo de reacciones químicas
que la describan, ni siempre se obtienen los mismos productos finales. En
ella, el lugar que ocupa el oxigeno atmosférico es reemplazado por
sustancias inorgánicas oxigenadas, como los sulfatos y nitratos, en tanto que
los productos formados, además del dióxido de carbono, suelen ser
sustancias inorgánicas, en vez de agua. (Jorgensen, 1995)
IV.4.3. Alcohol A Partir Del Almidón De La Papa.
Para obtener etanol a partir de almidón es necesario romper las cadenas de
este polisacárido para obtener jarabe de glucosa, el cual se puede convertir
en EtOH mediante las levaduras. Por ello, se debe incluir una etapa
adicional de hidrólisis (rompimiento, degradación) de este biopolímero. De
cada 100g de almidón se pueden obtener teóricamente 111g de glucosa, lo
que implica una relación estequiométrica de 9:10. El almidón fue
tradicionalmente hidrolizado mediante ácidos, pero la especificidad de las
enzimas, sus condiciones suaves de reacción y la ausencia de reacciones
secundarias han hecho que las amilasas sean los catalizadores usados para
esta tarea. Para la primera etapa de la hidrólisis de las suspensiones de
almidón que tienen que ser llevadas a altas temperaturas (90-110 ºC) para el
rompimiento de los gránulos de almidón, condición necesaria para el
tratamiento enzimático. El producto de esta etapa o licuefacción es una
solución de almidón que contiene dextrinas (oligosacáridos compuestos por
varias unidades de glucosa) y pequeñas cantidades de glucosa. El almidón
licuado se somete a sacarificación a menores temperaturas (60-70 ºC) con
glucoamilasa obtenida de Aspergillus niger o de especies de Rhizopus la
cual hidroliza las dextrinas hasta glucosa. (Nigam y Singh, 1995),
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Se ha reportado la producción de EtOH a partir del almidón como papa,
papa dulce. Se ha propuesto la hidrólisis del almidón de la papa para
obtener soluciones de glucosa mediante un reactor enzimático de membrana
de fibra hueca con conversiones de 97,3%. (Nigam y Singh, 1995).
IV.4.4. Fermentación Alcohólica A Partir De La Papa.
Se corta en lonjas un kilo de papas, los cuales se cuecen con 1.5 litros de
agua y se pasan por un tamiz. Se forma una pasta el cual se vuelve a cocer
añadiendo agua durante 1/2 a 1 hora agitando para que todo el almidón o
fécula, cuyo proceso se sigue mediante Ia reacción que da con el yodo (la
coloración al principio azul cambia después a roja y al final del proceso ya no
se observa coloración alguna), a medida que progresa la sacarificación, el
producto se hace cada vez claro. Una vez terminada la transformación de la
fécula, se enfría a 30 ºC y se procede a introducir en un frasco o recipiente
de 3 litros, añadiendo unos 10 gr. de levadura (preparar una pasta) se deja
fermentar por espacio de 3 días. El producto resultante de la fermentación se
procede a destilar (TELLO, 2004).
IV.5. REGULACIÓN DE FACTORES DURANTE LA FERMENTACIÓN.
IV.5.1. Nutrientes.
Las Levaduras necesitan una fuente de carbono, otra de nitrógeno,
minerales y vitaminas. Entre los minerales se tiene al: fósforo, potasio,
azufre, magnesio, hierro, zinc, manganeso, cobre, etc. Se requieren también
de oligo elementos o activadores de enzima. Como constituyentes de las
otras fuentes tenemos los azucares, aldehídos, ácidos grasos, peptonas,
aminoácidos, amoniaco, sulfato de amonio, cloruro de amonio e inositol.
Se debe hacer notar que para el caso de las levaduras el fósforo es esencial
para su metabolismo. Existen tres tipos de levaduras: (KRYACHKOV, 1980).
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A. Levaduras altas.
Son aquellas que se desarrollan ascendiendo durante la fermentación hasta
la superficie del líquido en fermentación, en donde permanecen bien como
cepa uniformemente distribuida o bien corno anillo en la pared del recipiente
o cuba de fermentación. (KRYACHKOV, 1980).
B. Levaduras bajas.
Son aquellas que se desarrollan exclusivamente en el fondo del recipiente o
cuba de fermentación. Pero durante la fermentación es lanzada hacia las
partes superiores del líquido como consecuencia de la formación de
anhidrido carbónico. (KRYACHKOV, 1980).
C. Levaduras de Destilería.
Es una variedad de la Saccharomyces cerevisiae que tiene la caracteristica
de ser bastante estable y tolerar altas concentraciones de alcohol etílico
(12%), sin perjudicar su calidad fermentativa. Hay levaduras que soportan
hasta el 11 % del alcohol etílico pero tiene el inconveniente que no fermenta
todo el azúcar presente en el mosto a fermentar. La saccharomyces
cerevisiae tiene dos enzimas:
C.1. La Invertasa, que da lugar a que la sacarosa se hidrolize, formando
una molécula de glucosa y una molécula de fructuosa.
C.2. La Zimasa que transforme la glucosa y fructuosa formados, en alcohol
etílico y anhidrido carbónico. En realidad ésta zimasa está constituida por
varias enzimas y co-enzimas, las cuales originan la fermentación alcohólica.
(KRYACHKOV, 1980).
D. COMPOSICIÓN QUIMICA DE LAS LEVADURAS.
Las levaduras contienen aproximadamente de 68-83% de humedad las
mismas que están constituidas de sustancias nitrogenadas, carbohidratos,
lípido, vitaminas, minerales y otras sustancias, normalmente el contenido de
nitrógeno varia entre 7 y 9 %, aun puede descender hasta 2.5 y ascender
hasta un 14%. Un elevado porcentaje que esta entre 64-76%, lo constituyen
las proteínas puras alrededor del 10% se presentan en las bases puricas. El
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4% en las pirimidinas y cerca del 15% de nitrógeno total se presenta en
forma de aminoácidos, nucleótidos y otros productos. (Salinas, 1998).
IV.5.2. pH.
Los microorganismos tienden a crecer en un intervalo limitado de pH y, aún
dentro de éste intervalo frecuéntemente cambian su metabolismo como
resultado de un cambio de incluso 1-1.5 unidades de pH. En general, las
levaduras crecen en un intervalo de 3 a 6. Esto solamente es una
generalización, puesto que ciertas bacterias y levaduras crecerán aunque
con menor rapidez a valores de pH tan bajos como 2. Estos diferentes
intervalos de pH para el crecimiento, se pueden usar durante las
fermentaciones para reducir la posibilidad de contaminación. Así las
fermentaciones de levaduras con frecuencia operan a un pH tan bajo como
económicamente sea posible para evitar la contaminación bacteriana, con
una consecuente reducción de los costos de esterilización.
Durante las fermentaciones por lo general es necesario controlar el pH,
cuando se forman productos ácidos como el ácido láctico, acético y cítrico o
cuando los mismos sustratos de crecimiento son ácidos o bases, de modo
que al consumirse el pH del medio cambiará de manera importante.
(Scragg, 1997).
IV.5.3. Temperatura.
La temperatura afecta el crecimiento de manera notable, principalmente
porque los microorganismos de una especie dada solo pueden crecer en un
rango restringido de temperatura. Los psicrófilos presentan un rango de
temperatura de 5 a 15°C, los mesófilos de 25 a 40 ºC y los termófitos de 45
a 60ºC. Además, debemos mencionar que la temperatura también afecta el
rendimiento durante la fermentación. Las levaduras se desarrollan entre 25 a
45°C, su temperatura óptima es de 30 a 40ºC, pueden vivir en forma latente
fuera de estos rangos, mientras no se inactiven sus enzimas.
(Quintero, 1981)
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Cuadro 4.Temperatura máxima, mínima y optima para la esporulación de
algunas levaduras.
LEVADURA T max. ºC Tmin. ºC Topt. ºC
Saccharomyces cerviciae 35-37 9-11 30
S. pastorianus 29-32 0.5-4 27.5
S. intermedius 27-29 0.5-4 25
S. validus 31-33 4.7-5 25
S. turbidaus 33-35 4-8 29
FUENTE: Prescot (2000) “Microbiología Industrial” Ed. Aguilar.
IV.5.4. Oxigeno.
Las levaduras pueden desarrollarse tanto en condiciones anaeróbicas como
aeróbicas, lógicamente las rutas metabólicas serán diferentes.
El oxígeno merece mención especial, pues su ausencia o abundancia
permite una selección tanto de microorganismos como de productos del
metabolismo. El crecimiento microbiano es función de muchas variables y
todavía no se establecen relaciones matemáticas que cubran esos rangos
de operación o interrelaciones con ellas. Sin embargo, con el conocimiento
actual es posible iniciar una fermentación y poco a poco a través de la
experimentación ira mejorando y dirigiendo el crecimiento y el metabolismo
microbiano en el sentido que se desee: aumentando el rendimiento,
disminuyendo el consumo de nutrientes o excluyendo selectivamente ciertos
productos. (Quintero, 1981).
IV.5.5. CONTENIDO DE AZUCAR:
Se puede hacer muchas variaciones en los procedimientos de
fermentación, pero la mas recomendable deacuerdo a las experiencias en
las destilerías sugieren el empleo de la concentración de azúcar en el
empleo del mosto para la fermentación sea del 12 5 en peso. Si el mosto
es demasiado concentrado el alcohol que se produce puede inhibir la
acción de la levadura, lo que traería como consecuencia la prolongación
del tiempo de fermentación y que no se convierte la parte del azúcar. La
dilución execiva del mosto a fermentar es antieconómica, pues la extraña
17
perdida de un valioso espacio de fermentación, como consecuencia de ello
aumenta el volumen del mosto a destilar trayendo consigo un mayor costo
de producción en la destilería. (Charley, 2001)
IV.5.6. TIEMPO DE LA FERMENTACIÓN.
La duración de los periodos de fermentación es muy variada según el
método que se emplee. Cuando se prepara la levadura madre se observo
que la fermentación es alta o tumultuosa con un gran desprendimiento de
anhídrido carbónico iniciado al cabo de las ocho horas en vista de que la
reproducción de las levaduras ha sido lo suficientemente para la conversión
de azucares fermentecibles en alcohol: mientras que si se añade la levadura
directamente a la cuba de fermentación tarda en reproducirse, por lo tanto la
fermentación tumultuosa se inicia a partir de las dieciocho horas. Concluye la
fermentación a las 72 horas, mientras que en el caso anterior la finalización
de la femetación es antes de las dieciocho horas. (Charley, 2001)
IV.6. OPERACIONES DE DESTILACIÓN Y RECTIFICACIÓN.
IV.6.1. Destilación.
Es una operación de separación basada en las diferencias de volatilidad
relativa en una mezcla, esto es, diferencia entre los puntos de ebullición de
los componentes de la mezcla.
La alimentación del mosto previamente filtrada se efectúa mediante una
bomba de tornillo rodante. accionada por un mecanismo de Transmisión que
permite la regulación continua de la velocidad en litros por hora. La
destilación se puede efectuar en dos columnas de funcionamiento continuo;
el mosto se precalienta en los tubos de un deflegmador (es una operación en
la cual alguna mezcla de vapor generalmente saturado se someto a
condensación parcial por medio de' enfriamiento por lo cual el vapor saliente
se enriquece en el componente más volátil; es un intercambiador de tubos
vertical y cilíndrico) para posteriormente alimentarse en la parto superior de
lo primera columna do destilación. Los vapores do esta columna pasan a la
segunda columna de destilación del cual se obtienen vapores con contenido
de 60% vlv en promedio de alcohol el cual es condensado totalmente
18
utilizando un condensador total vertical y un condensador de fases.
(Márquez, 1998)
IV.6.2. Rectificación.
Es también una operación de separación basada en diferencias de
volatilidad relativa y tiene por objeto eliminar el contenido de impurezas de la
mezcla a niveles permisibles y al mismo tiempo elevar el contenido de
alcohol de Ia mezcla hasta el punto Azeotropico (En la mezcla alcohol agua
se forma un azeótropo y no es posible superar este punto por destilación
ordinaria a presión atmosférica) teóricamente.
La operación en la columna de rectificación se inicia con reflujo total a efecto
do conseguir 01 perfil de temperaturas adecuado para obtener el producto. A
propósito, existen dos; formas de operar una columna intermitente:
1.- Rectificación a producto constante. Para cuyo efecto se debe cambiar la
relación de reflujo en forma continua hasta alcanzar un valor máximo límite
al funcionamiento de la columna de reflujo total.
2.- Rectificación a reflujo constante: Es en que la composición del destilado
varía a mediada que se modifica la composición de la mezcla contenida en
el calderin. (Márquez, 1998)
IV.7. FERMENTADOR.
El fermentador o bioreactor es un recipiente en donde se desarrolla procesos
bioquimicos, al cual se deberá proporcionar de un medio ambiente aséptico
en el que únicamente se encuentran los microorganismos deseados.
Para el funcionamiento de cualquier bio-reactor, se deben tener las
condiciones necesarias para su esterilización y mantener la asépsia, debe
contar con dispositivos que permitan el suministro de substratos o de
nitratos, un control adecuado de temperatura y pH adecuado, niveles
apropiados de oxigeno disuelto, evacuando los productos y sub productos, y
una buena agitación que permita mantener las condiciones uniformes en
todo el reactor. El diseño de un bio-reactor es específico para cada proceso
biológico y su complejidad depende de los experimentos de proceso, por
tanto un sistema no debe ser más complicado de lo que resulta ser
necesario. (Vargas y Condori 2000).
19
IV.7.1. TIPOS DE FERMENTADORES.
Por su funcionamiento, se tienen de dos tipos y son:
a) Fermentadores Por Lotes Discontinuos.
Se operan cargando inicialmente el sustrato y la cantidad total de reactivos,
luego se procesa y después de, se descargan los productos, quedando
nuevamente el reactor disponible para iniciar otro ciclo, dentro de ellos
tenemos:
Tanque agitado
Estacionarios
b) Fermentadores Por Lotes Continuos.
El equipo se mantiene operando en estado estable con una alimentación de
reactivos y una descarga de productos constantes. (Vargas y condori 2000). De
este tipo tenemos los siguientes:
Tanque Agitado.
Columnas empacadas con enzima inmovilizada.
Torres de lecho fluidizado donde el flujo del medio mantiene
suspendidos los microorganismos.
Además tomando encuenta el estado físico de la mezcla reaccionante, los
fermentadores se pueden dividir en:
Homogéneos.-En los cuales las reacciones ocurren en una solo fase.
Heterogéneos.- Donde se presentan en dos o mas fases.
IV.7.2. Descripción del Bioreactor Tipo Tanque con Agitación.
Los fermentadores de tanque agitados mantienen un sistema homogéneo
Mediante agitación mecánica que provoca una adecuada dispersión y
mezclado de los materiales inyectados consiguiéndose una mejor
transferencia de calor para mantener la uniformidad de la temperatura, y una
rápida disolución de los gases burbujeados como el oxigeno en el aire.
(Vargas y Condori 2000).
IV.8. Diseño Y Puesta En Marcha De Un “Sistema Semicontinuo En Dos Etapas: Hidrólisis –Fermentación” Para La Producción De Etanol A Partir De Almidón De Papa Usando Simultáneamente Aspergillus Niger Y Saccharomyces Cerevisiae.
ALONZO, (2006) Describe el diseño y evaluación de las variables que
gobiernan el sistema semicontinuo en dos etapas: hidrólisis - fermentación
20
para la producción de etanol a partir de almidón de papa usando
simultáneamente Aspergillus niger y Saccharomyces cerevisiae, con
resultados comparables a los del método clásico de monocultivo pero con
tiempos de bioproducción inferiores. La hidrólisis del almidón y posterior
fermentación produjo cantidades significativas de biomasa, azúcares
simples, y enzimas como productos colaterales al etanol. Los
microorganismos tipo nativo del Aspergillus niger y Saccharomyce cerevisiae
utilizadas en este estudio fue suministrada por el Laboratorio de
Investigaciones Microbiológicas de la Universidad Industrial de Santander.
ALONZO, (2006), describe el Bioreactor semicontinuo que consta de un
reactor por cada etapa del proceso. Cada reactor tiene una capacidad de 2
litros construido en vidrio con tapas esmeriladas con cuatro accesos; dos
para la entrada y salida de gases, una para suministro de inoculo y de medio
nuevo y otra para monitoreo de muestras y control de temperatura. Entre los
reactores se encuentra el Biofiltro, de 1 litro de capacidad en vidrio con tapa
esmerilada y unido con los reactores por medio de conectores en vidrio
provistos de válvulas de paso tipo bureta. indica que dentro del biofiltro se
encuentra primero el prefiltro que es una malla circular en alambre que
soporta una capa de lana de vidrio de 3mm de espesor con el fin de retener
las partículas más grandes como las dextrinas y el micelio de Aspergillus
niger a 4 cm del prefiltro se encuentra el filtro de membrana de 0.2 micras el
cual retiene las unidades reproductoras de Aspergillus niger, garantizando la
esterilidad del los hidrolizados de almidón que van al reactor de fermentación
con la Saccharomyces cerevisiae. Para disminuir el tiempo de filtración y
aumentar su eficiencia el biofiltro posee un desprendimiento lateral para la
conexión a la bomba de vacío con su respectiva trampa.
ALONZO, (2006).Señala las variables objeto de estudio fueron: Velocidad de
crecimiento, tiempo de generación, sustrato limitante, concentración del
producto, concentración celular, flujo volumétrico, tasa de dilución como
base para la determinación de la µmax , Ks , Productividad, Concentraciones
de biomasa y sustrato en el equilibrio. Determinando lo anterior se puede
decir que se tiene la descripción experimental del cultivo continuo de
21
acuerdo a la Teoría del Quimiostato para cada etapa del proceso. Se
realizaron 3 experimentos completos para concentraciones de almidón
iniciales de 2, 4, y 8 g/100mL respectivamente. En cada experimento se
realizaron los siguientes pasos: Primero hidrólisis del almidón de papa por
Aspergillus niger a la concentración inicial de almidón indicada, para un
volumen de 1 litro de cultivo y un tiempo de hidrólisis de 60 horas en la
primera etapa y 48 horas después de cada suministro de medio nuevo. El
segundo paso, una vez trascurrido el tiempo de la hidrólisis es la Filtración
de 500mL de hidrolizados eliminando Aspergillus niger y la dextrina limite
con el fin de "esterilizar" el futuro medio para la fermentación de los azúcares
en el tercer paso. En este ultimo paso el filtrado es recibido en el bioreactor
de fermentación que contiene el inoculo de Saccharomyces cerevisiae en un
medio de hidrolizado de almidón con el fin de eliminar la etapa de adaptación
y arrancar en etapa de crecimiento exponencial para la producción de etanol.
El tiempo de fermentación alcohólica fue de 48 horas a condiciones
anaeróbicas. El suministro de medio e inoculo nuevo, 500mL, para el
bioreactor de hidrólisis se realiza una vez se hayan evacuado los 500mL de
hidrolizado hacia el biofiltro transcurridas las 60 horas iniciales de hidrólisis,
después el periodo de suministro se realiza cada 48 horas para un flujo
volumétrico de 500mL/48 horas en las dos etapas. Se consideraron tres
suministros para cada experimento a intervalos de 48 horas.
ALONZO, (2006), indica las condiciones de cultivo para la etapa de
hidrólisis. Para todos los experimentos la inoculación fue de
aproximadamente 105 conidiosporas, conteo realizado mediante cámara de
Neubahuer, las concentraciones de las sales del medio de cultivo
corresponden al medio mineral Czapek (composición, g/litro de NaNO3, 3;
K2HPO4, 1; MgSO4. 7H2O, 0.5; KCl, 0.5; FeSO4 . 7H2O, 0.01) y almidón de
papa como fuente de carbono. El volumen total del medio fue de 1000 mL,
se suministró oxígeno al medio durante todo el proceso mediante bomba de
acuario (Power 500, Aquarium Air Pump) con una tasa de volumen de aire
aproximadamente de 90 litros por hora.
ALONZO, (2006), indica las Condiciones para la etapa de fermentación.
Para todos los experimentos la inoculación fue de aproximadamente 106
22
levaduras, conteo realizado mediante cámara de Neubahuer, las
concentraciones de las sales del medio de cultivo corresponden al medio
mineral proveniente del cultivo de la hidrólisis una vez retirado el Aspergillus
niger, la fuente de carbono corresponde a los azúcares producto de la
hidrólisis del almidón. El volumen total del medio fue de 1000 mL. Las
concentraciones de azúcares están indicadas para cada experimento al igual
que los intervalos de muestreo. Cada muestra tomada fue filtrada con el fin
de separar la levadura a través de dos capas de papel filtro cualitativo
Whatman. La masa celular fue secada a 110°C con pesos constantes para
evaluar la proteína unicelular. Los filtrados fueron utilizados para la
cuantificación del alcohol los azúcares reductores y la glucosa.
IV.8.1.Determinación de nitrógeno y proteína en la biomasa.- La
determinación de nitrógeno total se realizó por el método de Kjeldalh.
(William, 1984)
IV.8.2. Determinación de Carbohidratos Totales.- Los Azúcares Totales
son determinadas en muestras duplicadas de filtrados fungales con el
Método de Fenol - Acido Sulfúrico. (Wistler, 1964.).
IV.8.3. Determinación de los Azúcares Reductores. Los Azúcares
Reductores son determinadas en muestras duplicadas de filtrados fungales
con el Método de Bernfeld, utilizando el Acido 3,5-dinitrosalicílico.
IV.8.4. Determinación del Almidón en el medio. La determinación de
almidón se realiza mediante lecturas de absorbancias del complejo
coloreado de yoduro-yodato más almidón a 640 nm contra una curva de
calibración. (Nielson, 1963).
IV.8.5. Determinación de Glucosa. La Glucosa es determinada por el
Método de Glucosa Oxidasa y peroxidasa utilizando el Kit de Sera - Pak.
IV.8.6. Determinación de las concentraciones de Etanol. La
concentración del etanol fue determinada mediante el método de gravedad
23
específica por picnómetro, de acuerdo a la metodología de la A.O.A.C
9.012/80. (Abouzied, 2002).
IV.9. Estudio De Los Factores Que Afectan La Hidrólisis Enzimática Y El Proceso Fermentativo Para La Producción De Alcohol A Partir De Papa (Solanum tuberosum).
González y Córdoba (2006), estudiaron a nivel de laboratorio, la hidrólisis
enzimática y la fermentación de la papa (Solanum tuberosum), a fin de
determinar las mejores condiciones para producir alcohol. En la primera
etapa experimental se analizó el efecto sobre la conversión a azúcares
reductores, de la concentración de las enzimas α-amilasa y
amiloglucosidasa, la concentración de sustrato y el tiempo de sacarificación.
Se determinó que el efecto combinado entre las concentraciones de la
enzima α-amilasa y el sustrato presentó significancia estadística; la
conversión a azúcares reductores se ve favorecida al utilizar los valores de
0,8 mL/kgsustrato y 20 % respectivamente. La concentración de la enzima
amiloglucosidasa y el tiempo de sacarificación no presentaron significancia
estadística, por lo que se recomienda utilizar 0,8 mL/kgsustrato y un tiempo
de 14 h. En la segunda etapa experimental realizaron el seguimiento cinético
de la hidrólisis y se sugiere disminuir el tiempo de acción de la enzima α-
amilasa a 0,5 h y para la sacarificación utilizar un período de 15 h. Además,
se encontró que el valor máximo de torque requerido para la agitación en el
proceso de gelatinización fue de 11 N·cm y de 1 N·cm para la dextrinización
y la sacarificación, respectivamente. (González y Córdoba, 2006).
En la fermentación alcohólica del sustrato hidrolizado, estudiaron el efecto
de la concentración de células y la presencia de biotina como promotor de la
fermentación. Se encontró que la concentración de células no es significativa
y se recomienda utilizar una concentración de 50 millones células/mL. La
presencia del promotor presentó significancia estadística entre los niveles
utilizados. Al evaluar el efecto de cuatro concentraciones del promotor, se
observó que la concentración de 0,2 mg/kg favorece la producción de
alcohol. En la etapa del seguimiento cinético de la fermentación, se obtuvo
un consumo de azúcares reductores de 91 %, una concentración máxima de
24
alcohol de 10,33 % v/v, un rendimiento de etanol con respecto al ideal de
0,98 y una eficiencia de la fermentación de 0,91. El rendimiento de etanol
para el proceso global fue de 0,0746 kgetanol/kgpapa.
IV.9.1. Evaluación de las condiciones para la hidrólisis enzimática de la
papa.
El objetivo de esta evaluación fue encontrar aquella combinación de
concentraciones de las enzimas a-amilasa (0,6 mL/kg papa seca y 0,8mL/kg
papa seca) y amiloglucosidasa (0,8 mL/kgpapa seca y 1,0 mL/kg papa seca),
concentración de sustrato (razón de sustrato seco y agua, 15% y 20 %) y
tiempo de reacción con la enzima amiloglucosidasa (14 h y 18 h). Se utilizó
un diseño factorial completo de 24 a dos niveles, la variable de respuesta fue
el rendimiento de azúcares reductores, expresado como masa de azúcares
reductores producidos por unidad de masa de sustrato. Se compararon los
valores de la variable de respuesta con el fin de encontrar las condiciones
que maximizan la conversión del almidón en azúcares reductores, mediante
un análisis de efectos. (González y Córdoba, 2006).
Para lograr esto, se colocó una masa conocida del sustrato en el recipiente
destinado para la hidrólisis, según la corrida aleatorizada del diseño
experimental, se le adicionó cloruro de calcio (40 ppm) y se llevó a un pH de
6,5. Con un baño térmico se elevó la temperatura de la mezcla hasta 95 ºC y
se llevó a cabo el proceso de dextrinización por un período de 2,5 h con una
agitación constante de 225 r/min. Al final de esta etapa se debió enfriar la
mezcla hasta 60 ºC y agregar HCl hasta alcanzar un pH de 4,5 para
desactivar la enzima. Se agregó la cantidad de amiloglucosidasa (AMG) que
correspondiera según el diseño para continuar con la etapa de la
sacarificación por el tiempo determinado, con una agitación de 150 r/min.
Terminada esta etapa, se inactivó la enzima y se analizaron las muestras
para determinar la cantidad de azúcares reductores. (González y Córdoba,
2006).
25
IV.9.2. Cinética de las enzimas α-amilasa y amiloglucosidasa (AMG) en
la hidrólisis enzimática de la papa.
El objetivo de esta etapa fue realizar un seguimiento de la cinética de las dos
enzimas utilizadas durante la hidrólisis de la materia prima. Se tomaron
muestras cada 30 min para la primera enzima y cada hora durante la
sacarificación para determinar el comportamiento de la cantidad producida
de azúcares. Para este estudio se realizó la hidrólisis enzimática de la papa,
en un volumen de 3 L. Se utilizaron las mejores condiciones obtenidas de la
fase experimental de la hidrólisis enzimática. Para el seguimiento de la
cinética de las enzimas a-amilasa y AMG, se utilizó una concentración de
sustrato de 20 %, una concentración de la enzima de α-amilasa de 0,8
mL/kgsustrato seco, una concentración de la enzima de AMG de 0,8
mL/kgsustrato seco, un tiempo de sacarificación de 20 h y las mismas
condiciones de pH, concentración de cloruro de calcio, temperatura,
agitación y tiempo utilizadas previamente en la dextrinización y
sacarificación. Además se utilizaron los mismos métodos para la
desactivación de cada una de las enzimas. (González y Córdoba, 2006).
IV.9.3. Estudio del requerimiento de torque en la hidrólisis enzimática
de la papa.
El estudio consistió en hacer un seguimiento del requerimiento de torque
durante la hidrólisis de la papa, para determinar el valor máximo y poder
posteriormente utilizar esta información para el cálculo de potencia para
efectos de cambio de escala. Para poder realizar esto, se fija la velocidad de
agitación a 225 r/min., utilizando un agitador de hélice y se fija una relación
de diámetro de agitador a diámetro de recipiente de 0,39, una relación de
altura de agitador a diámetro de agitador de 0,16 y una relación de altura de
líquido a diámetro de recipiente de 1. El análisis consiste en varias etapas,
una primer etapa que inicia en el momento en que el recipiente se coloca en
el baño de agua a una temperatura de 95 ºC hasta 10 min después de la
adición de la enzima α-amilasa; la segunda es inmediata y transcurre hasta
finalizar la dextrinización y la última etapa, en la que ocurre el proceso de
26
sacarificación. El requerimiento de torque en la etapa de dextrinización se
tomó cada 10 s, en la etapa de sacarificación cada minuto; además se
realizaron mediciones de temperatura y pH. (González y Córdoba, 2006).
IV.9.4. Evaluación de las condiciones para la fermentación del sustrato
hidrolizado.
El objetivo fue encontrar aquella combinación de concentración del
microorganismo S. cerevisiae (50 millones de células/mL sustrato hidrolizado
y 100 millones de células/mLsustrato hidrolizado) y la ausencia o presencia
de un promotor (0,2 mg/kgsustrato hidrolizado) de la fermentación, según un
diseño factorial completo 22, duplicado, que permita obtener el máximo
rendimiento de etanol, expresado como la concentración de etanol (% v/v).
El conteo de células se realizó con un microscopio y una cámara de
Neubauer. El sustrato se preparó hidrolizando la harina de papa de la misma
manera como se preparó en el estudio de la cinética de las enzimas, pero
utilizando recipientes de 3,5 L para hidrolizar una masa de disolución de
3000 g. Al final de la sacarificación, se filtró el hidrolizado obtenido, se reguló
el pH a un valor de 4,5 y se agregaron nutrientes a las concentraciones,
utilizando cantidades semejantes a las reportadas. Este jarabe se distribuyó
en erlenmeyers de 250 mL, con una cantidad de jarabe de 200 g, cerrados,
que funciona como una válvula reguladora de presión. (Araya, 1998).
Cuadro 5.Concentraciones de los nutrientes a utilizar en la fermentación.
NUTRIENTE CONCENTRACIÓN(g/L)
Nitrato de amonio 2,00
Sulfato de Magnesio 1,00
Fosfato monoacido de potasio 1,00
Extracto de levadura 2,00
Fuente: (González y Córdoba, 2006)
27
La fermentación se realizó a una temperatura de 31ºC en un baño con
agitación a 150 r/min. Al finalizar la fermentación se inactiva el
microorganismo, se centrifugó y se realizó la determinación del índice de
refracción del destilado, previa realización de una curva de calibración, con
la que se interpoló de ella la concentración de etanol en porcentaje en
volumen.
IV.9.5. Evaluación de la concentración del promotor en la fermentación
de la papa hidrolizada.
González y Córdoba, (2006). Para evaluar el efecto únicamente de la
concentración del promotor sobre la conversión de etanol, se realizaron
experimentos adicionales, a cuatro concentraciones de promotor (0, 0.1,0.2 y
0.3) mg/kgsustrato hidrolizado. Se utilizaron las mismas variables fijas
mencionadas en la sección anterior y se utilizaron 50 millones
células/mLsustrato hidrolizado. (González y Córdoba, 2006)
IV.9.6. Seguimiento cinético de la fermentación en un reactor de 5
litros.
El objetivo del seguimiento a mayor escala, es determinar los diferentes
parámetros cinéticos del período de fermentación. Para esta etapa, se
preparó una suspensión de harina de 6 L de sustrato, la cual se hidrolizó,
obteniéndose un volumen de filtrado aproximado de 4,5 L y se dividió en dos
porciones para realizar por duplicado la fermentación. Se utilizaron las
mismas condiciones en la primera evaluación de la fermentación. Al
hidrolizado se le agregaron los nutrientes, que se inoculó con una cantidad
de microorganismos de 50 millones células/mLsustrato hidrolizado y una
concentración de promotor de 0,2 mg/kgsustrato hidrolizado. La
fermentación se llevó a cabo en un reactor de 5 L, el cual tiene un sistema
de agitación, calentamiento y/o enfriamiento y un puerto para toma de
muestras. Para el seguimiento cinético se midió la concentración de etanol
de azúcares reductores y la concentración de microorganismos; el tiempo de
fermentación es de 30 h y se tomaron periódicamente muestras para los
análisis. Al finalizar la fermentación se tomó una muestra y se analizó en el
Laboratorio de Control de Calidad de la Fábrica Nacional de Licores para
28
determinar los congenéricos mediante HPLC, según el método IT-008.
(González y Córdoba, 2006).
Figura 3: Variación de la concentración de alcohol con el tiempo.
FUENTE: González y Córdoba, (2006)
IV.10. DISEÑO DE EXPERIMENTOS PARA LA HIDRÓLISIS DEL
ALMIDÓN DE PAPA POR VÍA QUÍMICA Y PARA LA FERMENTACIÓN
ALCOHÓLICA.
IV.10.1. Diseño Factorial Completo.- Se utiliza en la planeación de
experimentos que produzcan una información confiable en el menor número
de ensayos. El número de experimentos que se deben efectuar es 2n donde
n es el número de variables independientes de dicho proceso. (Grosz, 1999).
IV.10.2. Determinación de las variables y sus niveles.- El primer paso a
seguir es la escogencia de las variables que puedan ser controladas durante
el proceso y sus niveles mas adecuados. Después de una búsqueda
bibliográfica y ensayos preliminares se consideran las variables más
influyentes como independientes. Los demás valores de las variables del
proceso se mantienen constantes. (Grosz, 1999).
Los valores mas apropiados de las variables del proceso, se dan como un
rango dentro del cual se determinan los niveles apropiados para el diseño. El
29
nivel máximo se simboliza como (+) y el nivel mínimo como (-). La variable
dependiente o respuesta se simboliza como Y. En el caso de que cada
experimento se realice como replica, la respuesta Y es el promedio de las
dos respuestas, como se expone a continuación:
Y11, Y12 = Respuesta del experimento y su replica.
Y1 = Promedio de la respuesta.
Para poder determinar la precisión de la experimentación se hace un análisis
estadístico utilizando experimentos de control. Con los datos del análisis
estadístico se plantea el modelo matemático que describe la significación de
las variables en el proceso. Obtenidos los anteriores resultados se calcula
los efectos simples, dobles y triples de las variables. De acuerdo a los
ensayos preliminares las variables seleccionadas (n) y sus niveles máximos
(+) y mínimos (-) para la hidrólisis del almidón (Grosz, 1999).
V. OBJETIVOS DEL ESTUDIO.
V.1. Objetivo General.
“Obtener alcohol a partir del almidón de la papa”
V.2. Objetivo especifico.
Determinar el % de rendimiento para la hidrólisis del almidón
de la papa mediante una ecuación
Determinar el % de rendimiento para la fermentación alcohólica
mediante un modelo matemático.
Determinar las características físico-químicas del alcohol
proveniente de la fermentación del almidón de la papa.
VI. HIPÓTESIS.
VI.1. Hipótesis General.,
30
La obtención de alcohol por el proceso semicontinuo hidrólisis-
fermentación depende del almidón de la papa para la hidrólisis y del
tipo de microorganismo para la fermentación (Saccharomyces
cerevisiae) y de las condiciones de operación del bioreactor.
VI.2. Hipótesis especifico.
El % del rendimiento de la hidrólisis del almidón de la papa esta
en función de la Concentración de [HCl], la Concentración de
Almidón y Tiempo de hidrólisis con estas variables y con los
resultados en el laboratorio se pueden hallar dicha ecuación.
El % de rendimiento para la fermentación alcohólica depende
de la temperatura, concentración de azucares totales y pH con
estas variables y con los resultados en el laboratorio se puede
hallar un modelo matemático.
La determinación de las características físico-químicas
depende del etanol convertido en producto de la fermentación
alcohólica del almidón de la papa.
VII. Identificación de variables:
VII.1. Variable Independiente.
Almidón de la papa (materia prima)
VII.2. Variable dependiente.
Alcohol del almidón de la papa (producto)
VII.3. Variables Intervinientes.
-Tiempo de hidrólisis,
-Temperatura
31
-Concentración de azucares totales
-El pH.
Cuadro 6: Operacionalización De Variables.
VARIABLES INDICADORES ÍNDICES VALORACIÓN
Variable Independiente
(Vi) Almidón de la papa
1. Recurso Agrícola
2.CaracterizaciónQuímica del
almidón de la papa
1.1. Papas andinas
2.1.ContenidoHumedad, proteína,
grasa, cenizas, fibra y carbohidratos
2.2 Rendimiento de la
hidrólisis del almidón
Kg
%
%
Variables dependientes
(vd) Alcohol Etílico 1.CaracterizaciónFísico y química
del alcohol obtenido
1.1. Grado Alcohólico.1.2. pH.
1.3. Densidad1.4. Rendimiento de la fermentación alcohólica
-ºGL.-pH.g/ml.
%
Variables Intervinientes(Vit) Tiempo
(Vit) Temperatura
(Vit) Concentración de azucares totales
(Vit) pH
1.Cantidad de tiempo para la
hidrólisis
2.Cantidad de calor en la
fermentaciónalcohólica
3.Cantidad de azucares totales
Acidez del fermento
1.1. Tiempo
1.2.Temperatura
1.3. Concentración
1.4. pH
- Horas
- ºC
- ºBrix
- % acidez
VIII. UTILIDAD DE LOS RESULTADOS DE ESTUDIO.
32
-Los resultados del trabajo de investigación sirven para que tenga como
referencia para la potencial industrialización del almidón de la papa y
sobre la obtención de nuevas fuentes de energía.
-Además el alcohol obtenido apartir de la fermentación del almidón de la
papa se podrá utilizar como disolventes y/o como insumo Alcohol Etílico
para la industria ya que el alcohol etílico es menos dañino para la salud,
en su consumo, menos contaminante para el medio ambiente y traerá
beneficios en el comercio.
IX. METODOLOGIA.
IX.1.Tipo de estudio.
Investigación aplicada basada en principios científicos tecnógicos. Durante el
proceso de obtención del alcohol.
IX.2. Material Experimental Y Equipos.
a. Materia prima
En esta investigación se utilizara el almidón de la papa (solanum
tuberosum) como materia prima la cual será adquirida en el
mercado de puno.
b. iniciador.
La levadura para iniciar la fermentación alcohólica es el
Saccharomyces cerevisiae.
c. Material de laboratorio.
Vaso de precipitados de 500ml.
Pipetas
Termómetro
Papel filtro.
Matraz de erlenmeyer,
Tamiz de 0.1mm.
Recipientes.
d. Instrumentos y equipos de laboratorio
33
Autoclave, temperatura 120°C y a una presión de 15 psi.
Fermentador de 10 litros de capacidad semi-industrial (construido
de acero inoxidable) de la FIQ-UNA Puno.
Destilador.
Estufa (0-60ºC).
Refractómetro (0-32ºBrix).
Balanza Analítica.
Potenciometro (pH)
Alcoholímetro de laboratorio de 0-35 ºGL.
e. REACTIVOS QUIMICOS:
Acido clorhídrico.
Agua destilada.
IX.3. PROCEDIMIENTO.
IX.3.1. AISLAMIENTO DEL ALMIDÓN DE LA PAPA. La extracción del
almidón de la papa se realizó de acuerdo a los siguientes pasos:
A.1. Primero: Lavado; con el fin de retirar tierra y otras impurezas que
trae la papa.
A.2. Segundo: pelado; se realiza a mano, teniendo el cuidado de no
retirar también parte del tubérculo con la cáscara.
A.3. Tercero: licuado. Se hace pasar la papa sin cáscara por un extractor
de jugos, con el fin de extraerle todo el jugo que tiene la biomasa de
la papa
A.4. Cuarto: sedimentado; consistió en decantar la lechada que sale del
tamiz para separar los gránulos del agua
A.5. Quinto: el Secado; Tanto el almidón como la fibra se secan en una
estufa a 60ºC de temperatura y durante 24 horas. (LEON, 2005).
IX.3.2. HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN DE PAPA.
34
Se realizó Hidrólisis Acida, controlando la temperatura de reacción, presión
de reacción, concentración del ácido y del almidón. Con el almidón
hidrolizado se obtienen azúcares fermentables mediante rompimiento de las
cadenas de glucosa.
Los pasos que se siguen en la Hidrólisis de almidón por vía química son los
siguientes: Se pesa una cantidad de almidón para un volumen de 800mL y
para una concentración dada de ácido en un erlenmeyer de 1L que fue
llevado al autoclave x , condiciones de 15 psi, durante 30 minutos a una
temperatura de 120°C, terminada la hidrólisis se filtra al vacío y luego se
determina la cantidad de azúcar obtenida. (LEON, 2005).
IX.3.3. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA.
Ambas etapas, hidrólisis y fermentación anaeróbica son realizadas en el
Bioreactor de Tanque Agitado controlando las variables de pH, Temperatura,
Agitación, Tiempos de hidrólisis y de fermentación y Concentración de
sustratos. Los experimentos de producción de etanol en el Bioreactor están
planteados de acuerdo a un diseño factorial de experimentos que permite el
análisis estadístico de los resultados (LEON, 2005).
Figura 4: Reactor De Tanque Agitado.
FUENTE: Vargas Y Condori, (2000)
35
Figura 5: Diagrama de flujo en la obtención de alcohol del almidón de la
papa.
IX.4. METODO DE ANALISIS.
IX.4.1. Control y análisis de la materia prima.
El almidón de la papa tiene las siguientes propiedades.
Propiedades físicas organolépticas:
Color
Olor
Sabor
IX.4.2. Análisis De La Composición Química Del Almidón Extraído Contenido de humedad, método gravimetrito.
Materia primapapa.
Licuefacción.
Almidón.
Hidrólisis.
Fermentación.
Destilación.
Etanol.
Ácido clorhidrico.co
Saccharomyces Cerviciae. Reactor
Fermentador.
36
Nitrógeno y proteína en la biomasa, por el método de Kjeldalh.
Carbohidratos Totales. Los Azúcares Totales según muestras duplicadas
de filtrados fungales con el Método de Fenol - Acido Sulfúrico.
Almidón en el medio, según las lecturas de absorbancias del complejo
coloreado de yoduro-yodato más almidón a 640 nm contra una curva de
calibración.
IX.4.3. Análisis fisicoquímico de la fermentación alcohólica.
Sólidos solubles, método refractometrico (ºBrix).
Grado alcohólico, método del alcoholímetro para determinar el grado
alcohólico.
Densidad, se mide utilizando el picnómetro.
pH medido con el potenciómetro.
IX.5. Determinación del El Porcentaje de Rendimiento de la Hidrólisis.
Se obtiene mediante la relación del Azúcar Teóricamente esperado con
respecto al valor leído experimentalmente de acuerdo a la siguiente relación:
(Grosz, 1999)
Donde:
- 360 g de glucosa corresponden al peso de dos moléculas de glucosa que
se hidrolizan de una unidad monomérica (maltosa) del almidón.
- 342 g peso de una unidad monomérica de almidón.
- 0.9 es la fracción que indica que el 90% del almidón hidrolizan a azúcar,
tomando un 10% en pérdida por almidón que no se alcanza a hidrolizar.
37
IX.6. Determinación del El Porcentaje de Rendimiento de la
Fermentación Alcohólica. Grosz, (1999).
El Porcentaje de Rendimiento de la Fermentación Alcohólica se obtiene
mediante la relación entre la cantidad real de alcohol producido y la
esperada teóricamente en base a la concentración de azúcar de la solución
a fermentar. Se expresa en porcentaje entre el volumen de alcohol
determinado y el volumen esperado teóricamente. Si se trata de X gramos
de azúcar, maltosa, el volumen de alcohol esperado teóricamente será:
En donde: Y = mL de alcohol teórico, 184 es el peso de 4 moléculas de
alcohol etílico que por fermentación se producen a partir de una molécula de
maltosa o dos de glucosa, 360 es el peso de una molécula de maltosa
equivalente a dos de glucosa, 0.79 es la densidad del etanol en g/mL, 500
es el volumen en mL medido para cada fermentación. (Grosz, 1999)
IX.7. Diseño De Experimentos para la Hidrólisis del Almidón de papa.
De acuerdo a referencias bibliograficas y ensayos preliminares las variables
seleccionadas (n) y sus niveles máximos (+) y mínimos (-).
Manteniendo constante la temperatura de 120°C, la presión de 15 psi y el
volumen de hidrólisis de 800 mL. Se realizan tres experimentos de Control
(simbolizados como “0” en la matriz del diseño) que no son más que tres
replicas con valores de variable intermedio de a los valores superior e
inferior como lo muestra la matriz del diseño con el fin de evaluar el límite de
confiabilidad de los experimentos de la matriz de diseño factorial e identificar
los efectos significativos de la acción de las variables en forma individual o
conjunta.
38
IX.7.1. OPTIMIZACIÓN DE LAS VARIABLES DE PROCESO.
CUADRO 7: Niveles de variables a investigar.
Variables Unidad Niveles
Inferior Superior
Z1: Concentración de [HCl] (N:mol/L) 0.05 0.10
Z2: Concentración del Almidón [AL]
(%) 6 18
Z3: Tiempo de hidrólisis (min.) 10 30
Fuente: Elaboración propia
Donde:
N=2n N=23=8
CUADRO 8:
Matriz de Diseño (2n) para la Hidrólisis del Almidón de la papa.
ºN deExperimentos
Codificación Variables
Z1 Z2 Z3
Concentración de [HCl]
Concentraciónde Almidón
Tiempo dehidrólisis
1 -1 -1 -1 0.05 6 10
2 +1 -1 -1 0.10 6 10
3 -1 +1 -1 0.05 18 10
4 +1 +1 -1 0.10 18 10
5 -1 -1 +1 0.05 6 30
6 +1 -1 +1 0.10 6 30
7 -1 +1 +1 0.05 18 30
8 +1 +1 +1 0.10 18 30
9 0 0 0 0.075 12 20
10 0 0 0 0.075 12 20
11 0 0 0 0.075 12 20
Fuente: Elaboración propia
IX.7.2. MODELO MATEMATICO PARA LA HIDROLIZIS DEL ALMIDÓN.
39
IX.8. Diseño De Experimentos para La Fermentación Alcohólica.
Para la fermentación de los hidrolizados de almidón a alcohol por parte del
Saccharomices cerevisiae fueron: La Temperatura (nivel superior 37°C, nivel
inferior 25°C), el pH (nivel superior 6.0, nivel inferior 4.0, mediante buffers), y
la concentración de azúcares reductores totales (nivel superior 12%, nivel
inferior 6%). Manteniendo constante la concentración del inoculo, flujo de
aire, la concentración de sales, y el tiempo de la hidrólisis (96 horas).
IX.8.1. OPTIMIZACIÓN DE LAS VARIABLES DE PROCESO.
CUADRO 9: Niveles de variables a investigar.
Variables Unidad Niveles
Inferior Superior
C1: Temperatura (ºC) 25 37
C2: Azucares totales (%) 6 12
C3: pH Mol/l H+ 4 6
Fuente: Elaboración propia
Donde:
N=2n
N=23
40
N=8
CUADRO 10: Matriz de Diseño para la fermentación Alcohólica.
ºN deExperimentos
Codificación Variables
C1 C2 C3 TemperaturaAzucares
totales pH
1 -1 -1 -1 25 6 4
2 +1 -1 -1 37 6 4
3 -1 +1 -1 25 12 4
4 +1 +1 -1 37 12 4
5 -1 -1 +1 25 6 6
6 +1 -1 +1 37 6 6
7 -1 +1 +1 25 12 6
8 +1 +1 +1 37 12 6
9 0 0 0 31 9 5
10 0 0 0 31 9 5
11 0 0 0 31 9 5
Fuente: Elaboración propia
IX.8.2. Modelo Matemático para la fermentación Alcohólica.
X. ÁMBITO DE ESTUDIO.
41
El presente trabajo de investigación se ejecutara en los laboratorios de
procesos, bioquímica y análisis instrumental de la facultad de ingeniería
química.
XI. RECURSOS.
XI.1. RECURSOS HUMANOS.
Nombre Función Dedicación
semanal
Pago
Mensual ($)
Total ($)
Higinio Zúñiga Tutor 20 300 1750
Laboratorista Asistente 30 350 1600
3350
XI.2. RECURSOS MATERIALES.
Descripción PrecioUnitario
Unidad Cantidad Total ($)
Infraestructura.
Laboratorio 200 Un Un 150
150
Materia prima.
papa 0.35 Kg. 9 3.15
3.15
Reactivos Químicos:
Acido clorhídrico 2 mL 10 2
Agua destilada 1 mL 1000 1
Acido Sulfúrico 1.5 mL 10 1.5
Ioduro de potasio 3.5 mL 10 3.5
8
42
Material De Laboratorio.
Autoclave 20 Un 1 20
Bioreactor 50 Un 1 50
Balanza Analítica 10 Un 1 10
Destilador. 50 Un 1 50
Estufa 30 Un 1 30
160
Material de Análisis.
Refractómetro 80 Un 1 80
Potenciómetro 80 Un 1 80
Alcoholímetro 50 Un 1 50
Picnómetro 30 Un 1 30
240
Tratamiento de la materia prima y obtención del almidón.
Lavado 5 Un 1 5
Pelado 10 Un 1 10
Licuado 15 Un 1 15
sedimentado 5 Un 1 5
secado 25 Un 1 25
60
Servicio de cómputo.
Papel bond 1 millón 1 1
Impresión 5 Un 4 20
Empastado 3 Un 3 9
Copias de tesis
4 Un 3 12
42
43
X.3. PRESUPUESTO DEDL PROYECTO.
RUBRO $
Infraestructura. 150
Materia prima. 3.15
Reactivos químicos. 8.5
Material del laboratorio. 160
Material de análisis. 240
Tratamiento de la M.P. y obtención del almidón. 60
Servicio de cómputo. 42
Imprevistos (10%). 66.365
TOTAL 663.65
Tipo de cambio 1$ = S/. 3.3
XI. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES.
Código Descripción Duración (semanas)
A1 Revisión bibliografica 2
A2 Formulación del marco teórico 1
A3 Adquisición de equipos y materiales 1
A4 Implementación del laboratorio 1
A5 Revisión de estrategia experimental 1
A6 Ordenamiento de resultados 1
A7 Análisis de los resultados 1
A8 Redacción del informe final 2
44
Código Semanas
Actividad1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
XII. BIBLIOGRAFÍA.
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