ah in vivo - expofybi · nuevas entidades hiperglicosiladas derivadas de hepo como posibles...
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NUEVAS ENTIDADES HIPERGLICOSILADAS DERIVADAS DE hEPO COMO POSIBLES CANDIDATOS TERAPÉUTICOS DE ENFERMEDADES NEUROLÓGICAS
Milagros Bürgi1, Gabriela Aparicio2, Camila Scorticati2, Marina Etcheverrigaray1, Ricardo Kratje1, Marcos Oggero1*
1. UNL, CONICET, FBCB, Centro Biotecnológico del Litoral, Ciudad Universitaria -C.C. 242- (S3000ZAA) Santa Fe, Pcia. Santa Fe, Argentina. 2. UNSAM, CONICET, IIB-INTECH, Laboratorio de Neurobiología, Campus Miguelete, San Martín, Buenos Aires, Argentina. * Corresponding author: [email protected]
INTRODUCCIÓN
La eritropoyetina (EPO) es el principal regulador de la eritropoyesis que asume, además, otro rol relevante en la homeostasis cerebral, desarrollo neuronal y neuroprotección. Desde el punto de vista terapéutico, la hEPO recombinante es considerada una droga segura y bien tolerada en el tratamiento de la anemia. Sin embargo, cuando pretende ser utilizada como agente neuroprotector/neuroplástico, es decir, en pacientes que no padecen anemia, sus efectos hematológicos deben ser considerados como efectos secundarios, ya que puede causar policitemia, hipertensión y fenómenos protrombóticos.
La EPO se une a un homodímero conformado por dos subunidades del receptor para cumplir su función eritropoyética. El hallazgo de otro receptor, además del clásico homodímero, involucrado en el accionar citoprotector en algunos tejidos como por ej., en el cerebro, sugiere que ambos efectos serían totalmente independientes.
Dado que resulta de interés el desarrollo de análogos de hEPO que modulen selectivamente el rol eritropoyético del neuroprotector/neuroplástico, distintos autores han diseñado diversas estrategias para disminuir la actividad eritropoyética de la citoquina, conservando su potencial neuroprotector. Sin embargo, los procedimientos desarrollados hasta el momento no lograron cumplir dicho propósito. En nuestro laboratorio nos propusimos generar nuevos derivados de hEPO modificados por glicoingeniería de modo de agregar sitios susceptibles de N-glicosilación con el fin de bloquear la interacción del receptor homodimérico con aquellas regiones identificadas como esenciales para desplegar su acción hematopoyética sin modificar residuos que sean necesarios para ejercer su actividad neuroprotectora y neuroplástica. De este modo, nos centramos en la búsqueda de moléculas análogas a hEPO útiles para el tratamiento de enfermedades de origen neurológico que protejan al paciente del avance de la enfermedad y establezcan las bases para mejorar la calidad de vida del mismo.
Generación de análogos de EPO mediante mutagénesis sitio-dirigida para introducir un sitio potencial de N-glicosilación
Producción en sobrenadantes de cultivos de células CHO.K1-MutEPO
Purificación de las variantes mediante cromatografía de inmunoafinidad
Análisis de la actividad hematopoyética
Evaluación de la actividad neuroprotectora y neuroplástica
Caracterización fisicoquímica
Determinación del número de isoformas
Determinación de la masa molecular
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
• La utilización de N-glicoingeniería bloqueó las propiedades hematopoyéticas de la hEPO no afectando o, incluso, mejorando sus propiedades neuroprotectoras y neuroplásticas. Estos resultados destacan el potencial terapéutico de tales análogos de la citoquina y, asimismo, ponen en evidencia una nueva particularidad del empleo de glicanos como reactivos para bloquear funciones indeseadas de una proteína al tiempo de aportarles propiedades inherentes a los mismos como la mejora farmacocinética.
CONCLUSIONES EPO
-
Derivados de EPO
NEUROPLASTICIDAD/NEUROPROTECCIÓN
AUSENCIA DE ACTIVIDAD HEMATOPOYÉTICA
INFERIOR DEPURACIÓN PLASMÁTICA
200
116,25 97,4 66,2
45
31
21,5
14,4
6,5
rhEPO MutA MutB MutC MM
Evaluación de la masa moleculas de las variantes de EPO mediante SDS-PAGE seguido de Western blot . MM: masa molecular
Masa molecular
*Mut A 66-34 kD
*Mut B 66-29 kD
*Mut C 45-35 kD
*rhEPO 41-34 kD
pI rhEPO Mut A Mut B Mut C
IEF seguido de tinción con colorante Azul de Coomasie para determinar el número de isoformas de cada variante de EPO. pI: punto isoeléctrico
2.5
5.5
Desarrollo de las variantes de EPO Producción y Purificación Caracterización fisicoquímica
Las 3 variantes mostraron superior masa molecular y mayor número de isoformas que EPO, confirmando la incorporación del nuevo sitio de N-glicosilación.
Análisis de la actividad hematopoyética (AH) Evaluación de la neuroprotección
0,17 0 0
100
Mut A Mut B Mut C rhEPO
AH in vitro (%) AH in vivo
rhEP
O
Mut A
Mut B
Mut C PBS
0
2
4
6
8
***
ns
% R
etic
ulo
cito
s
Nuevas variantes de EPO
EPO
AH
Evaluación de la AH in vivo en ratones normocitémicos (n=4) Se determinó el porcentaje de reticulocitos luego del tratamiento con cada variante de EPO. *** p ≤ 0,001 y ns (no significativo) representan el grado de significancia estadística luego del análisis mediante test ANOVA y post-ANOVA Tukey (n=4).
Evaluación de la AH in vitro en líneas celulares eritroides UT-7 y TF-1. Se analizó la capacidad de la citoquina para promover la proliferación eritroide.
PBSST
P
rhEPO + ST
P
Mut A
+STP
Mut B
+ STP
Mut C
+STP
0
10
20
30
40
50
** ** *** ******
Actividad neuroprotectora in vitro
Apo
ptos
is (%
)
La actividad neuroprotectora de las variantes de EPO fue evaluada en cultivos primarios de neuronas de 11 DIV. Las células fueron tratadas con EPO o con sus variantes y la apoptosis inducida por STP (estaurosporina). Se determinó el porcentaje de núcleos apoptóticos mediante tinción con Hoescht y Phaloidin-FITC. *** p ≤ 0,001, **p ≤ 0,01 representan el grado de significancia estadística luego del test ANOVA seguido del test de Bonferroni.
Todos los análogos de EPO protegieron los cultivos neuronales primarios del daño inducido por STP, demostrando su actividad neuroprotectora.
Se cuantificó la longitud de la neurita más larga por célula, la longitud media de las neuritas y el número de neuritas por célula utilizando el plugin NeuronJ de ImageJ (NIH). Se determinaron las diferencias significativas utilizando el test ANOVA.
ANOVA (dos colas) ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05 vs grupo control p>0.05 = ns
*
*
*
*
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
rhEPO Mut A Mut B Mut C
300
300
Syn
/ N
MD
A-R
1
Syn NMDA-R1 Syn /
NMDA-R1
Co
ntr
ol
Syn
/ N
MD
A-R
1
La formación de la sinapsis en neuronas de hipocampo fue medida por colocalización de marcadores pre- y post-sináptio en aproximadamente 20 or 30 neuronas por condición, usando tres regiones dendríticas por neurona. Las neuronas seleccionadas estaban a una distancia de al menos dos diámetros celulares de la célula más cercana. La colocalización de puncta fue determinada usando el plugin Puncta Analyzer. Las diferencias significativas fueron determinadas utilizando el test ANOVA.
EPO 50 EPO 300 PBS
CONTROLES MUT A MUT B MUT C
EPO
La densidad de filopodios (número de filopodios en 20 µm de extensión de neurita medido a 50 µm del soma) fue cuantificado en 40–50 neuritas de distintas neuronas por grupo.
MUT A MUT B MUT C
EPO 300 PBS
CONTRO
L
EPO
Las 3 variantes de EPO fueron capaces de promover la
neuritogénesis, la densidad de filopodios y estimular la formación de
la sinapsis en cultivos neuronales primarios.
Evaluación de la neuroplasticidad
PBS
EPO
MUT
A
MUT
B
MUT
C 0
2
4
6
*****
*****
Fil
op
od
ios
po
r 2
0 u
m
de
ne
uri
ta
PBS
EPO
MUT
A
MUT
B
MUT
C
0
1
2
3
4
***
* *
***
Se
ña
les
de
sin
ap
sis
Neuritogénesis Densidad de filopodios Sinapsis
IA 2B2 3 6 ml mut 104 161107 pH25001:10_UV1_280nm IA 2B2 3 6 ml mut 104 161107 pH25001:10_UV2_254nm IA 2B2 3 6 ml mut 104 161107 pH25001:10_Cond IA 2B2 3 6 ml mut 104 161107 pH25001:10_Fractions IA 2B2 3 6 ml mut 104 161107 pH25001:10_Logbook
-1500
-1000
-500
0
500
1000
1500
mAU
0 50 100 150 200 250 ml
Eq
uili
bra
do
au
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ero
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mb
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La
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do
1
Pu
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de
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mb
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La
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n
E3
E5
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pu
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de
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as
Ne
utr
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n
Co
nse
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cio
n
F3 F4 F5 F4 F2 Waste
Cromatograma correspondiente a la cromatografía de inmunoafinidad de Mut B utilizando el mAb 2B2 anti-EPO(IA2B2)
MM rhEPO MutA MutB MutC
SDS-PAGE para evaluar la pureza de las variantes de EPO luego de su purificación mediante IA2B2. MM: masa molecular
Las 3 variantes mostraron > 89 % de pureza luego de un único paso de cromatográfico.
CHO.K1-MutB CHO.K1-MutC
CHO.K1- MutA
IA 2B2 5 ml mut 104 160701:10_UV1_280nm IA 2B2 5 ml mut 104 160701:10_Cond IA 2B2 5 ml mut 104 160701:10_pH IA 2B2 5 ml mut 104 160701:10_Fractions IA 2B2 5 ml mut 104 160701:10_Logbook
-1760.0
-1758.0
-1756.0
-1754.0
-1752.0
-1750.0
-1748.0
-1746.0
mAU
275.0 280.0 285.0 290.0 295.0 300.0 305.0 310.0 ml
Elu
cio
n
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
CIP
1
Cip
2
F2 Waste