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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
Determinación de Acanthamoeba spp. y Naegleria fowleri mediante un análisis fenotípico
en aguas termales de la provincia de Pichincha-Ecuador
Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la obtención del
título de Bioquímica Clínica
AUTORAS: Lalaguaña Zamora Carolina Mercedes
Pico Puebla Adriana Margoth
TUTORA: Dra. Isabel Margarita Fierro Aguas
Quito, 2019
II
Lalaguaña Zamora Carolina Mercedes, Pico Puebla Adriana Margoth
(2019).
Determinación de Acanthamoeba spp. y Naegleria fowleri mediante
un análisis fenotípico en aguas termales de la provincia de Pichincha-
Ecuador.
Tutora: Dra. Isabel Margarita Fierro Aguas
Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la
obtención del título de: Bioquímica Clínica.
iii
DERECHOS DE AUTOR
Nosotras, Carolina Mercedes Lalaguaña Zamora y Adriana Margoth Pico Puebla, en calidad
de autoras y titulares de los derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación
“Determinación de Acanthamoeba spp. y Naegleria fowleri mediante un análisis fenotípico
en aguas termales de la provincia de Pichincha-Ecuador”, de conformidad con el Art. 114 del
CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS
CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedemos a favor de la Universidad Central del Ecuador
a una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con
fines estrictamente académicos. Conservamos a nuestro favor todos los derechos de autor sobre
la obra, establecidos en la norma citada.
Así mismo, autorizamos a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual de conformidad
a lo dispuesto en el Art.144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
Las autoras declaran que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de
expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por
cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de
toda responsabilidad.
Lalaguaña Zamora Carolina Mercedes
C.I. 1724929185
__________________________
Adriana Margoth Pico Puebla
C.I. 1726204223
iv
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, Isabel Margarita Fierro Aguas en calidad de tutora del proyecto de investigación titulado:
“Determinación de Acanthamoeba spp. y Naegleria fowleri mediante un análisis fenotípico
en aguas termales de la provincia de Pichincha-Ecuador”, elaborado por las estudiantes
Carolina Mercedes Lalaguaña Zamora y Adriana Margoth Pico Puebla, para optar por el título
Profesional en Bioquímica Clínica dejo constancia que he leído el trabajo de titulación y
considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en
el campo epistemológico, por lo que APRUEBO, a fin de que sea sometido a la evaluación por
parte del tribunal calificador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 08 días del mes de agosto del 2019
Dra. Isabel Margarita Fierro Aguas
C.I. 0600921746
v
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR EL TRIBUNAL
El Tribunal constituido por: Gabriela Maldonado Duque MSc., Dr. Eduardo Mayorga Llerena
y Dra. Isabel Margarita Fierro Aguas luego de revisar el trabajo de investigación titulado:
“Determinación de Acanthamoeba spp. y Naegleria fowleri mediante un análisis fenotípico
en aguas termales de la provincia de Pichincha-Ecuador”, previo a la obtención del título (o
grado académico) Bioquímica Clínica presentado por las señoritas Carolina Mercedes Lalaguaña
Zamora y Adriana Margoth Pico Puebla, APRUEBA el trabajo presentado.
Para constancia de lo actuado firman:
.…………………………… …………………………….
Gabriela Maldonado Duque MSc Dr. Eduardo Mayorga Llerena
C.I. 1721069043 C.I. 1801508019
Dra. Isabel Fierro Aguas
C.I. 0600921746
vi
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
El presente trabajo titulado: “Determinación de Acanthamoeba spp. y Naegleria fowleri
mediante un análisis fenotípico en aguas termales de la provincia de Pichincha-Ecuador, se
realizó en las instalaciones del Centro de Biología de la Universidad Central del Ecuador.
vii
DEDICATORIAS
Dedicado a: Mi pequeña hija Isabelita
“Desde que llegaste aprendí a orar con más Fe y agradecer con más frecuencia”
Adriana M. Pico Puebla
viii
A mis padres Jorge y Dolores, quienes me han dado su apoyo en esta etapa y a pesar de las
dificultades que se presentaron no dejaron que retrocediera sino que cada día avanzará más, a
mis hermanos Liz, Romel, Isaías y Andrea quienes son una parte fundamental en mi vida, para
seguir confiando en Dios y ver que todo lo que ha prometido en nuestras vidas se va a cumplir, y
en un tiempo no muy lejano voy a estar celebrando todos sus triunfos.
Carolina M. Lalaguaña Z.
Dios es bueno y todo el tiempo bueno es Dios.
ix
AGRADECIMIENTOS
A Dios y a la virgencita, por derramar sobre mí tantas bendiciones, darme salud y fortaleza en
cada adversidad que se presentó a lo largo de mi carrera y poner en mi camino personas
maravillosas que sin duda han sido claves para poder alcanzar esta meta.
Al ser más extraordinario del mundo, mi madre Ligia Puebla, por cuidarme desde el primer
día de mi vida, ser la certeza en mi locura y apoyarme de todas las maneras posibles. Gracias por
amarme tanto.
A mi padre Walter Pico, por siempre estar presente, protegiéndome, procurando que nunca
me falte nada y dejándome saber que sin importar a donde vaya, estará a mi lado.
A mi ángel guardián e invisible compañía Kikito.
A mi esposo Gerardo Gonzáles, quien estuvo desde el inicio de esta larga trayectoria, gracias
por alentarme a seguir adelante, comprenderme en los momentos más difíciles, ser mi cómplice y
estar pendiente de mi.
A mi tutora Dra. Isabel Fierro, por motivarnos a realizar este estudio, instruirnos y guiarnos
durante todo el proceso.
Al Dr. Felix Andueza y Dr. Luis Castillo por ayudarnos en la realización de esta
investigación, de igual manera, al Centro de Biología por abrirnos las puertas de sus
instalaciones para llevar a cabo la parte experimental de la misma.
A la Universidad Central del Ecuador, en concreto a la Facultad de Ciencias Químicas, lugar
que fue mi segundo hogar, en donde conocí a muchas personas valiosas, profesores y amigos,
que aportaron positivamente a mi formación profesional y personal.
Adriana M. Pico Puebla
x
Después de un largo camino recorrido, circunstancias inesperadas se culminó con esta
investigación, es por ello, que quiero agradecer a Dios porque en su palabra siempre me dio
muchas promesas y entre ellas: “Solamente temed a Jehová y servidle de verdad, con todo
vuestro corazón pues habéis visto cuan grandes cosas ha hecho por vosotros”
Agradezco a mi madre Dolores Zamora quién siempre me apoyo y no tendré palabras para
agradecerle todo su esfuerzo, a mi padre Jorge Lalaguaña por confiar en mí y darme palabras de
aliento.
A mi hermana Liz quien siempre ha estado como confidente y amiga; a mis hermanos Romel e
Isaías quienes, a pesar de las dificultades siempre han buscado un momento para sacarme una
sonrisa, Andrea por su apoyo, quien demostró ser parte de la familia en tiempo de dificultades.
Agradezco a los profesores de la Facultad de Ciencias Químicas por haberme brindado los
conocimientos y haber forjado mi carácter.
Al Centro de Biología de la Universidad Central del Ecuador por permitirnos realizar nuestra
investigación en sus instalaciones.
A mi tutora Dra. Isabel Fierro por haberme guiado durante todo el proceso de este trabajo de
investigación. Doc. Felix Andueza y Doc. Luis Castillo, quienes formaron parte de este proyecto
aportando con sus conocimientos para un óptimo desempeño del mismo.
A todos mis amigos y familiares quienes formaron parte de este proceso. GRACIAS
Carolina M. Lalaguaña Z.
Dios es bueno y todo el tiempo bueno es Dios.
xi
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Introducción ............................................................................................................................... 1
CAPÍTULO I .............................................................................................................................. 4
El problema ................................................................................................................................ 4
1.1 Planteamiento del problema ............................................................................................. 4
1.2 Formulación del problema ............................................................................................... 5
1.3 Preguntas directrices ........................................................................................................ 5
1.4 Objetivos de la Investigación ........................................................................................... 6
1.4.1 Objetivo General ....................................................................................................... 6
1.4.2 Objetivos Específicos ................................................................................................ 6
1.5 Justificación e importancia ............................................................................................... 6
CAPÍTULO II ............................................................................................................................ 9
Marco Teórico ............................................................................................................................ 9
2.1 Antecedentes de la Investigación ..................................................................................... 9
2.2 Conceptualización de las amebas de vida libre .............................................................. 11
2.3 Reseña histórica ............................................................................................................. 13
2.4 Clasificación taxonómica ............................................................................................... 15
2.5 Género Acanthamoeba spp. ........................................................................................... 18
2.5.1 Estadíos ................................................................................................................... 19
2.5.2 Patología .................................................................................................................. 22
2.5.3 Encefalitis amebiana granulomatosa ....................................................................... 25
2.5.4 Patogenia y cuadro clínico ...................................................................................... 25
2.5.6 Tratamiento ............................................................................................................. 27
2.5.7 Factores de riesgo .................................................................................................... 27
xii
2.5.8 Queratitis y queratoconjuntivitis acanthamebiana .................................................. 28
2.5.9 Patogenia y cuadro clínico ...................................................................................... 28
2.5.10 Diagnóstico de laboratorio .................................................................................... 29
2.5.11 Factores de riesgo .................................................................................................. 30
2.5.12 Tratamiento ........................................................................................................... 31
2.5.13 Dermatitis acanthamebiana ................................................................................... 31
2.6 Especie Naegleria fowleri .............................................................................................. 32
2.6.1 Patogenia y manifestaciones clínicas ...................................................................... 35
2.6.2 Diagnóstico de laboratorio ...................................................................................... 36
2.6.3 Prueba flagelar ........................................................................................................ 36
2.6.4 Factores de riesgo .................................................................................................... 36
2.6.5 Tratamiento ............................................................................................................. 36
2.7 Métodos de identificación y cultivo ............................................................................... 37
2.7.4 Métodos sugeridos .................................................................................................. 40
2.7.5 Inactivación de E. coli ............................................................................................. 42
2.7.6 Prueba Flagelar ........................................................................................................ 42
2.8 Fundamentación legal .................................................................................................... 42
2.9 Hipótesis ......................................................................................................................... 44
2.10 Sistema de variables ..................................................................................................... 44
2.10.1 Variable independiente .......................................................................................... 44
2.10.2 Variable dependiente ............................................................................................. 44
CAPÍTULO III ......................................................................................................................... 45
Marco metodológico ................................................................................................................ 45
3.1 Diseño de la investigación ............................................................................................. 45
3.2 Población y muestra ....................................................................................................... 46
xiii
3.3 Criterios de inclusión ..................................................................................................... 46
3.4 Criterios de exclusión ..................................................................................................... 46
3.5 Matriz de operacionalización de variables ..................................................................... 46
3.6 Metodología ................................................................................................................... 47
3.6.1 Investigación documental ........................................................................................ 47
3.6.2 Muestreo .................................................................................................................. 47
3.6.3 Procesamiento de las muestras: ............................................................................... 47
3.6.3.1 Examen directo ..................................................................................................... 47
3.6.3.2 Cultivo .................................................................................................................. 48
3.6.3.3 Prueba de flagelación ........................................................................................... 48
3.6.3.4 Medición de las formas ameboides ...................................................................... 48
3.6.3.5 Identificación morfológica ................................................................................... 48
3.7 Técnicas e instrumentos de recolección de datos ........................................................... 48
3.9 Validez ........................................................................................................................... 49
3.10 Técnicas de procesamiento y análisis de datos ............................................................ 49
CAPÍTULO IV ......................................................................................................................... 50
Análisis de resultados ............................................................................................................... 50
4.1 Examen directo ............................................................................................................... 52
4.1.1 Análisis de proporciones y promedios de las muestras en el examen en fresco. .... 52
4.1.2 Tasas de riesgo ........................................................................................................ 60
4.1.3 Análisis del método de limpieza de los balnearios estudiados ............................... 61
4.2 Cultivo ........................................................................................................................ 63
CAPÍTULO V .......................................................................................................................... 74
Conclusiones y Recomendaciones ........................................................................................... 74
5.1 Conclusiones .................................................................................................................. 74
xiv
5.2 Recomendaciones ........................................................................................................... 75
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 78
ANEXOS .................................................................................................................................. 85
xv
Lista de figuras
Figura 1. Clasificación del género Acanthamoeba spp. dentro de los eucariotas. .................. 15
Figura 2. Caracterización de los quistes de Acanthamoeba spp. ............................................ 16
Figura 3. Clases de Acanthamoeba spp. ................................................................................. 19
Figura 4. Estadíos de Acanthamoeba spp. .............................................................................. 21
Figura 5. Rutas de entrada de Acanthamoeba spp. a su hospedero. ....................................... 23
Figura 6. Patogenia de Acanthamoeba spp. ............................................................................ 24
Figura 7. Anillo de infiltración estromal ................................................................................. 29
Figura 8. Cronificación corneal. ............................................................................................. 29
Figura 9. Observación de un quiste en una ulcera cutánea. .................................................... 32
Figura 10. Ciclo de vida. N. fowleri ........................................................................................ 34
xvi
Lista de gráficos
Gráfico 1. Proporción de muestras positivas Acanthamoeba spp. y N. fowleri por balneario. 52
Gráfico 2. Proporción de Acanthamoeba spp. y N. fowleri según sus estadíos. ...................... 53
Gráfico 3. Proporción AVL según el balneario y pH. .............................................................. 54
Gráfico 4. Promedio de AVL por balneario y pH en 50 µl. ..................................................... 55
Gráfico 5. Promedio de AVL según las diferentes zonas dentro de las piscinas. .................... 56
Gráfico 6. Proporción de los estadíos Acanthamoeba spp. en las cada zona de la piscina. ..... 57
Gráfico 7. Proporción de los estadíos N. fowleri en cada zona de la piscina. .......................... 59
Gráfico 8. Proporción de Acathamoeba spp. y N. fowleri antes y después de la limpieza. ..... 61
Gráfico 9. Curvas de crecimiento de quistes y trofozoítos de Acanthamoeba spp. de B1. ...... 64
Gráfico 10. Curvas de crecimiento de quistes y trofozoítos de Acanthamoeba spp. de B2. .... 65
Gráfico 11. Curvas de crecimiento de quistes y trofozoítos de Acanthamoeba spp. de B3. .... 66
Gráfico 12. Curvas de crecimiento de quistes y trofozoítos de N. fowleri de B1. ................... 67
Gráfico 13. Curvas de crecimiento de quistes y trofozoítos de N. fowleri de B2. ................... 68
Gráfico 14. Curvas de crecimiento de quistes y trofozoítos de N. fowleri de B3. ................... 69
Gráfico 15. Tendencia de crecimiento en cada balneario. ....................................................... 70
Gráfico 16. Tendencia de crecimiento de trofozoítos en cada balneario. ................................ 70
Gráfico 17. Porcentaje del crecimiento de AVL en medio de Page. ........................................ 71
xvii
Índice de tablas
Tabla 1. Clasificación de los genotipos de Acanthamoeba spp. empleando 18S Rdna. .......... 17
Tabla 2. Clasificación de especies de Acanthamoeba spp. ...................................................... 22
Tabla 3. Características del LCR en diferentes patologías ...................................................... 26
Tabla 4. Preparación de solución Page .................................................................................... 37
Tabla 5. Componentes del medio proteosa- peptona ............................................................... 38
Tabla 6. Medio Nelson ............................................................................................................. 38
Tabla 7. Composición del medio BM-3 ................................................................................... 39
Tabla 8. Variables .................................................................................................................... 46
Tabla 9. Análisis macroscópico obtenido en el lugar del muestreo ......................................... 51
xviii
Lista de anexos
Anexo A. Árbol de problemas ................................................................................................. 85
Anexo B. Categorización de variables ..................................................................................... 86
Anexo C. Instrumento de recolección de datos ........................................................................ 88
Anexo D. Análisis estadístico de cruces .................................................................................. 92
Anexo E: Imágenes .................................................................................................................. 95
xix
Lista de abreviaturas
AVL: amebas de vida libre
QA: queratitis amebiana
EAG: encefalitis amebiana Granulomatosa
MAP: meningoencefalitis amebiana primaria
LCR: líquido cefalorraquídeo
SNC: Sistema Nervioso Central
SP: Solución de Page
xx
Título: Determinación de Acanthamoeba spp. y Naegleria fowleri mediante un análisis
fenotípico en aguas termales de la provincia de Pichincha-Ecuador.
Autoras: Pico Puebla Adriana Margoth
Lalaguaña Zamora Carolina Mercedes
Tutora: Dra. Isabel Fierro Aguas
Resumen
Las amebas de vida libre son caracterizadas por su ubicuidad y capacidad anfizoica, han sido
aisladas de una amplia gama de superficies, principalmente de aguas naturales y tratadas. Las
especies del género Acanthamoeba spp. son oportunistas, provocan encefalitis amebiana,
queratitis amebiana y enfermedades cutáneas en individuos inmunodeprimidos. Por otro lado,
Naegleria fowleri es considerada la especie más patógena debido a que puede afectar a personas
sanas y enfermas causando meningoencefalitis amebiana primaria. En esta investigación se
determinó la presencia de Acanthamoeba spp. y N. fowleri en las aguas termales ubicadas al
suroriente de la provincia de Pichincha - Ecuador, mediante un estudio descriptivo longitudinal
se recolectaron 360 muestras en varias zonas dentro de cada piscina en tres balnearios, resultado
positivas el 61,11%. El análisis fenotípico de las aguas termales nos permitió concluir que la
especie de mayor incidencia fue Acanthamoeba spp. representado el 58,6%, mientras que N.
fowleri representó el 25,3%. Adicionalmente, se corroboró la tendencia de crecimiento que
presenta cada estadío amebiano según la zona en la piscina y la variación de la carga amebiana
entre días de limpieza y drenaje del agua. Por último, se recurrió al cultivo selectivo para
amebas, con el fin apoyar las observaciones preliminares, aislando las dos especies de amebas
observadas en el fresco, además en el caso N. fowleri se recurrió a la prueba flagelar para su
confirmación.
PALABRAS CLAVES: AMEBAS DE VIDA LIBRE, ACANTHAMOEBA SPP.,
NAEGLERIA FOWLERI, AGUAS TERMALES.
xxi
Title: Determination of Acanthamoeba spp. and Naegleria fowleri through a phenotypic
analysis in hot springs of the province of Pichincha-Ecuador.
Authors: Pico Puebla Adriana Margoth
Lalaguaña Zamora Carolina Mercedes
Tutor: Dra. Isabel Fierro Aguas
Abstract
Free-living amoebas are characterized by their ubiquity and amphizoic capacity, they have
been isolated from a wide range of surfaces, mainly from natural and treated waters. The species
of the genus Acanthamoeba spp. they are opportunistic, they cause amoebic encephalitis,
amoebic keratitis and skin diseases in immunosuppressed individuals. On the other hand,
Naegleria fowleri is considered the most pathogenic species because it can affect healthy and
sick people causing primary amebic meningoencephalitis. In this investigation the presence of
Acanthamoeba spp. and N. fowleri in the hot springs located in the southeast of the province of
Pichincha - Ecuador, through a longitudinal descriptive study, 360 samples were collected in
several areas within each pool in three spas, 61.11% positive. The phenotypic analysis of the hot
springs allowed us to conclude that the most prevalent species was Acanthamoeba spp.
represented 58.6%, while N. fowleri represented 25.3%. Additionally, the growth trend of each
amoebic stage according to the area in the pool and the variation of the amoebic load between
cleaning days and water drainage were corroborated. Finally, selective cultivation for amoebas
was used, in order to support preliminary observations, isolating the two amoeba species
observed in the fresco, and in the case of N. fowleri, the flagellar test was used for confirmation.
KEYWORDS: FREE-LIVING AMOEBAS, ACANTHAMOEBA SPP., NAEGLERIA
FOWLERI, HOT SPRINGS.
1
Introducción
Durante muchos años las AVL fueron consideradas microorganismos inocuos, incapaces de
producir algún tipo de enfermedad en el ser humano. De hecho, Fitz Schaudinn, zoólogo alemán
en 1903, inculpó a Entamoeba histolytica como la única ameba patógena, atribución que perdería
sustentabilidad al pasar el tiempo. En 1958, Clyde Culbertson profesor de medicina, observaba
por primera vez protozoos del género Acanthamoeba spp. en ensayos de cultivos celulares
destinados para la vacuna contra la poliomielitis, tras la inoculación de estos microorganismos en
modelos animales observó que desarrollaron encefalitis con un deceso fulminante, dando lugar a
las primeras sospechas acerca de la capacidad virulenta de estos parásitos. Hoy en día se conoce
que estas amebas son causantes de patologías graves, pudiendo originar infecciones en el SNC,
ojos y piel (Ortega, 2003).
Presentan una amplia distribución, en suelo, aire, agua, superficies artificiales, animales y
personas, por lo que su erradicación es prácticamente imposible. Tienen gran resistencia a
ambientes hostiles, adaptación a temperaturas, pH, niveles de oxígeno, osmolaridad cambiante,
además de capacidades endoparásitas y de reservorio. Los géneros definidos como infecciosos
son: Naegleria, Acanthamoeba y Balamuthia, considerados como agentes etiológicos de
infecciones emergentes que provocan daños a nivel del SNC. Afectan a personas sanas e
inmunodeprimidas de acuerdo al género y especie, su reconocimiento es difícil y confuso al tener
el mismo cuadro clínico de enfermedades causadas por bacterias, virus y hongos; razón por la
cual el tratamiento suele tardar y muchas veces su diagnóstico ha sido post mortem. Dentro de
las patologías asociadas están cuadros de: queratitis, encefalitis granulomatosa e infecciones
diseminadas causadas por especies de Acantamoeba spp. y meningoencefalitis por N. fowleri
(Oddó, 2006).
Desde el primer caso de meningoencefalitis amebiana primaria (MAP) reportado en Australia
en 1965 por Fowler y Carter hasta el año 2002, se registraron 200 casos a nivel mundial (Peralta
Rodríguez & Ayala, 2009). Urribarren (2012), menciona que hasta ese año se conocieron 10 000
casos de queratitis amebiana (QA) producidas por Acanthamoeba spp., asociados en su mayoría
a la falta higiene en los lentes de contacto, a su vez, cita a Visvervara et al. (2007) en donde se
menciona que 5 000 casos de QA se han registrado en EEUU; según Trabelsi et al. (2012) de 150
2
casos registrados de EAG, 84 se reportaron en norteamérica, perteneciendo 50 a personas VIH
positivos; según Budge et al. (2013), se conocieron 118 casos de MAP sólo entre los años 1965 a
2010; Latinoamérica no es la excepción, aunque la incidencia aparentemente es menor, hasta
1995 se registraron 156 casos de encefalitis (Peralta & Ayala 2009). Se recalca que muchos de
los datos que se pueden obtener son subestimados debido a que no se reporta obligatoriamente
todos los casos y al no existir registros actualizados, las cifras varían entre publicaciones y en
general son escasos. Probablemente en muchas situaciones el diagnóstico sea desconocido
debido a la falta de familiarización del personal de salud con estos patógenos (Uribarren, 2012).
Se ha correlacionado la identificación de infecciones con estos agentes causales en países que
previamente ya tenían investigaciones orientadas a la detección de amebas en sus diferentes
hábitats. En el Ecuador no se han realizado aún estudios acerca de su presencia en aguas termales
y se desconoce los índices de morbilidad y mortalidad relacionados con estos organismos.
Por ello, este estudio pretende incluir al país dentro de este tipo de investigaciones con el fin
de conocer la incidencia de estas especies en las piscinas de aguas termales a las que acuden
miles de usuarios por mes con fines recreativos y de esparcimiento, debido a que la mayor
cantidad de registros son de pacientes que manifiestan haber tenido contacto con fuentes
hídricas, afirmando que la causa de contagio más común es por instilación. Finalmente, se busca
hacer hincapié en la importancia de considerar a estos parásitos en el momento de buscar y
otorgar un diagnóstico para lograr una terapia oportuna, tomar medidas de control sanitario y
difundirlas para el conocimiento a la comunidad.
El proyecto de investigación consta de los siguientes capítulos:
Capítulo I: Planteamiento del problema: se resalta una serie hechos que exhiben la realidad
frente al desconocimiento de estas especies en el país, conjuntamente se explica el objetivo
general y los objetivos específicos que se llevaron a cabo en la investigación y su respectiva
justificación e importancia.
Capítulo II: Marco teórico: se exponen y analizan estudios previos relacionados con el tema
que darán apoyo al proyecto, se definen los géneros de amebas a estudiar, su etiología,
3
manifestaciones clínicas, patogenia y tratamiento. De igual manera se expone el marco legal,
hipótesis planteadas y variables presentes.
Capítulo III: Marco metodológico: se describe el diseño de la investigación, población y
muestra, métodos de recolección aplicados y las técnicas de procesamiento de los mismos.
Capítulo IV: Análisis y discusión de resultados: se exhiben los resultados de la
investigación con la ayuda de tablas, porcentajes y graficas con sus respectivas interpretaciones y
discusiones para facilitar la comprensión.
Capítulo V: Conclusiones y recomendaciones: se explica detalladamente los principales
resultados de la investigación y recomendaciones a tomar en próximas investigaciones e incluso
diferentes maneras de abordarlo con el objetivo de que los próximos estudios tengan mayor
alcance.
4
CAPÍTULO I
El problema
1.1 Planteamiento del problema
Según el Centro para el control y la prevención de enfermedades CDC, desde 1962 al 2018 en
EEUU, el número de casos de MAP registrados por posible exposición al agua contaminada es
de 145. De los cuales únicamente 4 personas han sobrevivido a la infección, cuestión que se
atribuye a la similitud de las manifestaciones clínicas con una meningitis bacteriana y la rápida
progresión de la enfermedad (Center for Disease Control and Prevention, 2019).
En Latinoamérica los datos estadísticos no se encuentran agrupados, pero en estudios afines
se puede ver que la relación del diagnóstico tardío con la falla terapéutica es muy acentuada. En
Argentina en el año 2017, se documentó el primer caso de MAP en un niño de 8 años, cuyos
síntomas iniciaron 24 horas después de nadar en una laguna localizada en Vedia, presentó fiebre,
vómitos y cefaleas durante 15 días, cuando el resultado del laboratorio finalmente confirmó la
presencia de protozoos de N. fowleri, el niño ya había entrado en coma cerebral. Este hecho
impulsó a las autoridades pertinentes a realizar muestreos en buscar de este parásito (Asociación
Argentina de Micribiología, 2018). Por otro lado, en Perú se ha indagado en seis casos de EAG
registrados entre los años 1994-2010, todos los casos provenían de departamentos costeros e
ingresaron a la casa de salud con diagnóstico de tumor cerebral, los pacientes fallecieron en
menos de 15 días y los diagnósticos fueron post mortem. En Colombia también existen múltiples
casos, por nombrar alguno, se presenta el de un paciente de 14 años con fiebre, cefalea y
deterioro del estado de conciencia, fue diagnosticado con MAP (Vélez et al., 2013); además de
queratitis por Acanthamoeba spp. en una mujer joven portadora de lentes de contacto
semiblandos (SCL), inicialmente fue diagnosticada erróneamente con queratitis herpética
(Castaño, 2009). En Venezuela se reportó un caso de EAG en un hombre de 44 años, con 8
meses de evolución, que tras la extirpación de la masa de edema en el cerebro generada por
Acanthamoeba spp. y tratamiento con fluconazol logró recuperarse (Matos et al., 2016).
5
En el Ecuador no se conocen reportes de casos asociados a infecciones por AVL y tampoco
estudios preliminares sobre la búsqueda de estos parásitos, no obstante, al ser estas enfermedades
emergentes cada vez más frecuentes, hace cuestionarse sobre su presencia en la región, tomando
en cuenta que en países aledaños existen casos documentados, estudios de incidencia en aguas y
aislamientos en muestras clínicas, las posibilidades de que se alberguen estos patógenos
oportunistas en varios lugares se elevan. Por esta razón, se considera importante investigar qué
tipo de microorganismos están presentes en las aguas del territorio ecuatoriano, con el fin de
aportar en la salud pública, tener una conducta diagnóstica que abarque muchas posibilidades y
brindar una terapia farmacológica precisa.
Este estudio se dirigió hacia la búsqueda de los protozoos del grupo de AVL más frecuentes
en ambientes acuoso, como son: Acanthamoeba spp. y N. fowleri en aguas termales de la
provincia de Pichincha con el fin de obtener información adecuada para una adecuada vigilancia
epidemiológica.
1.2 Formulación del problema
Con lo expuesto anteriormente, se planteó el problema con la siguiente interrogante:
- ¿Cuál es el porcentaje de Acanthamoeba spp. y Naegleria fowleri existente en las
aguas termales de la provincia de Pichincha determinado mediante examen directo y
cultivo dirigido a identificar estas especies?
1.3 Preguntas directrices
Para desarrollar esta investigación se formularon las siguientes preguntas:
- ¿Cuál es la probabilidad de que existan amebas pertenecientes a los géneros
Acanthamoeba spp. y N. fowleri en las aguas termales de la provincia de Pichincha?
- ¿Cuál es la incidencia de Acanthamoeba spp. y N. fowleri en las fuentes termales de la
provincia de Pichincha?
- ¿Cómo se podría identificar y aislar a Acanthamoeba spp. y N. fowleri en las aguas
termales de la provincia de Pichincha-Ecuador?
- ¿Existe alguna preferencia de crecimiento de los diferentes estadíos de las especies de
Acanthamoeba spp. y N. fowleri y las condiciones del entorno?
6
- ¿Existe diferencia significativa entre los porcentajes encontrados de las especies de
Acanthamoeba spp. y N. fowleri y los días de limpieza de cada piscina?
1.4 Objetivos de la Investigación
1.4.1 Objetivo General
- Determinar la presencia de Acanthamoeba spp. y N. fowleri mediante un análisis
fenotípico en las aguas termales de la provincia de Pichincha-Ecuador.
1.4.2 Objetivos Específicos
- Identificar y aislar las especies de Acanthamoeba spp. y N. fowleri en las muestras de
agua provenientes de los balnearios de la provincia de Pichincha mediante el examen
directo y cultivo.
- Conocer la relación entre un determinado estadío de las especies de Acanthamoeba
spp. y N. fowleri y la zona de muestreo dentro de cada piscina.
- Comprobar si el mantenimiento sanitario dado en cada balneario influye en la
proliferación de las especies de Acanthamoeba spp. y N. fowleri mediante un análisis
estadístico entre las variaciones presentes según el día de limpieza.
1.5 Justificación e importancia
El Ecuador al ser atravesado por el cinturón de fuego del Pacífico es poseedor de una inmensa
riqueza natural, gracias a la actividad volcánica los atractivos termales que oferta el país son
numerosos. Según el Ministerio de Turismo, el Ecuador posee 105 concesiones de aguas
termales, las cuales son visitadas por miles de personas cada año debido a que el interés acerca
de sus propiedades curativas ha ido aumentando. Al ser las termas, aguas minerales que emergen
de la tierra a un temperatura superior a los 5°C de lo que se registra en el lugar, son un reservorio
idóneo para las AVL, estos patógenos proliferan en temperaturas mayores a 25°C, en especial N.
fowleri se considera termófila, y su virulencia está estrechamente vinculada con su afinidad a
ambientes acuosos de 45°C.
El desconocimiento tanto de las entidades de salud pertinentes como de la población en
general acerca de la posible incidencia y patogenia de Acanthamoeba spp. y N. fowleri se
considera uno de los factores de riesgo importantes a nivel sanitario, es necesario la realización
investigaciones enfocadas a la determinación de estos agentes infecciosos debido al impacto
epidemiológico que podrían causar las infecciones originadas por estos parásitos emergentes.
7
Además, el hecho de que en el Ecuador no existan datos relacionados y tampoco un protocolo
dirigido a la identificación de dichas formas amebianas reduce las posibilidades de brindar un
diagnóstico precoz y confiable.
A pesar de que los reportes de patologías causadas por las especies de Acanthamoeba y
Naegleria es bajo, la eminente tasa de mortalidad, de hasta el 95%, en los casos de infecciones a
nivel cerebral es preocupante, razón por la cual este tipo de enfermedades son un problema de
salud importante. Si bien es cierto, las infecciones atribuidas a estos parásitos no son frecuentes
en el territorio ecuatoriano, el conocer su distribución ayudaría a generar una sospecha temprana
en el caso de no diagnosticar una enfermedad con certeza, de tal manera que el personal médico
pueda redireccionar la búsqueda hacia este amplio grupo de patógenos y así abarcar mayor
porcentaje de posibilidades etiológicas.
Además, la dificultad diagnóstica, imprecisión en el tratamiento farmacológico, inexperticia
del personal clínico, así como también, la morbilidad ponen en manifiesto la relevancia de
conocer la distribución de dichas amebas en el Ecuador. Cabe señalar que la similitud de las
manifestaciones clínicas con otras infecciones de origen bacteriano ocasiona confusión
acompañado con una falla terapeútica, sesgando así los datos reales e imputando dichas
infecciones a patógenos erróneos. Por ende, a nivel de Salud Púbica es importante la difusión
acerca de las enfermedades y daños que pueden causar estos protozoos, con la finalidad de que
se tenga en cuenta la sintomatología dentro de la sospecha diagnóstica. Dado que muchas veces
su descubrimiento es post mortem, es muy probable que los porcentajes de incidencia sean más
elevados que los reportados realmente.
La carencia de datos estadisiticos agrupados, actualizados y organizados contribuyen al
desconocimiento colectivo. Tras la búsqueda bibliográfica, se encontraron reportes
documentados aislados, en la mayoría de los casos las cifras difieren entre fuentes. Debido a
esto, se evidenció que la realización de investigaciones encaminadas a la determinación de las
amebas en cada nación se relaciona directamente con la existencia de registros de infecciones
atribuidas a las mismas, es decir, los países que cuentan con datos epidemiológicos de estos
protozoos tienen a su vez casos reportados, en el Ecuador no se han hecho estudios sobre AVL y
no se encontraron casos registrados de infecciones generadas por este agente causal.
8
Es posible que en nuestro país exista una incidencia considerable de AVL presentes en las
aguas termales de la región, debido a que en países vecinos los estudios dirigidos a su
investigación han sido positivos. Al ser potencialmente patógenas y capaces de generar
infecciones importantes con secuelas irreversibles, es necesario incursionar en la búsqueda,
determinación y aislamiento de las mismas, de esta manera se podría conocer la realidad sobre la
seguridad de las aguas en las piscinas del territorio ecuatoriano, que a pesar de tener controles de
saneamiento, higiene y cloración, no dispone de análisis sobre estos microorganismos
emergentes considerados oportunistas, como es el caso de Acanthamoeba spp. y N. fowleri que
no discrimina el estado inmunológico de las personas.
El desarrollo de la presente investigación es conocer la presencia o ausencia de estos parásitos
en las aguas termales de la provincia de Pichincha para contribuir a la investigación de agentes
etiológicos transmitidos en fuentes hídricas y que sean considerados dentro de las conductas
diagnósticas para dar un tratamiento correcto y efectivo, además de impulsar a mayores
investigaciones en el País.
9
CAPÍTULO II
Marco Teórico
2.1 Antecedentes de la Investigación
Investigaciones realizadas para determinar la presencia de AVL en diferentes tipos de aguas
son mencionadas en los siguientes artículos:
En el año 2014, se realizó un estudio basado en la “Ocurrencia de amebas de vida libre en los
arroyos de la cuenca de México”, publicado por Bonilla P., Caballero A., Carmona J. y Lugo A.,
cuyo objetivo fue caracterizar la distribución y riqueza de especies de AVL en los arroyos de la
Cuenca de México, a través de la identificación morfológica. Durante casi un año se recolectaron
32 muestras de agua pertenecientes a 18 arroyos en diferentes estaciones. Se sembró en placas de
agar no nutritivo con una suspensión termosellada de Enterobacter aerogenes, se incubó a 25°C
y se observó diariamente al microscopio de luz invertida a 10x y 20x. Adicionalmente, se realizó
un análisis fisicoquímico de agua conjuntamente con pruebas bacteriológicas. Al finalizar el
estudio, se pudo evidenciar que dentro de las amebas encontradas Acanthamoeba spp. fue la
especie más prevalente con un 41%, mientras que Naegleria fowleri representó el 28% de las
muestras testeadas (Bonilla, Caballero & Carmona, 2014).
Un estudio realizado en el año 2014 y escrito por L. Carbal, L. Foen, M. Morales y M.
Orozco, con el tema “Amebas de Vida Libre aisladas en aguas superficiales del municipio de
Turbaco, Bolívar-Colombia”, tuvo como objetivo evaluar la presencia de las AVL en fuentes de
agua natural en el municipio de Turbaco. Se realizó un estudio descriptivo, transversal en los
arroyos Matute, Mameyal y Cucumán de la localidad. La identificación se hizo mediante el
estudio de los frescos de las fuentes de agua, observando características morfológicas de las
amebas dando como resultado un total de 54 muestras con una positividad del 55,5 % para una o
más AVL. Se obtuvo una mayor frecuencia la especie N. fowleri con un 44,4 % y Acanthamoeba
spp. en un 7,4%. Además, se encontraron otros microorganismos responsables de parasitosis
intestinales como: Giardia intestinalis, Blastocystis hominis y Retortomonas intestinalis.
Llegando a la conclusión, que efectivamente las AVL están comúnmente presentes en las
piscinas del pueblo, además considerando que Naegleria fowleri puede afectar a las personas sin
10
importar su estado inmunológico es alarmante el elevado porcentaje en el que se encontraron
(Carbal, Foen & Morales, 2014).
En el año 2015 la investigación escrita por M. Gertiser con el tema “Aspectos biológicos y
epidemiológicos de Amebas de vida libre aisladas en la República Argentina, con énfasis en
Acanthamoeba spp.”, llevó a cabo la búsqueda de AVL en distintas fuentes de agua, tanto
tratadas como no tratadas, cuyo objetivo fue realizar la búsqueda, aislamiento e identificación de
AVL en aguas. Se procesó un total de 274 muestras, clasificadas entre aguas tratadas (cloradas o
con otro tipo de tratamiento) y naturales (ríos, lagos, tanques, grifos, etc). Por medio de la
identificación morfológica y molecular se llegó a la conclusión de que el 30% de las aguas
tratadas y el 92,6% de aguas naturales arrojaron resultados positivos en los cultivos. El 98,7%
pertenecieron al género Acanthamoeba spp. mientras que para descartar la especie N. fowleri se
realizó la prueba de Transformación Amebo-flagelar (TAF), adicional a esto se analizaron cuatro
muestras clínicas de casos en donde se sospechaba de queratitis amebiana humana, resultado dos
muestras positivas para Acanthamoeba spp. (Gertiser, 2015).
El estudio realizado en el año 2016 por M. Minnetto y R. Lima, en la Ciudad de Lima con el
tema “Amebas de vida libre en las pozas de los baños termales de Churín”, tuvo como objetivo
determinar la presencia de AVL en las fuentes de aguas termales del poblado. Fue un estudio
descriptivo, prospectivo y transversal en el que se recolectaron 60 muestras de agua y se
analizaron por medio de un examen directo en fresco y cultivo, de las cuales 14 (23,3%) fueron
positivas para AVL, siendo 13 (92,85%) morfológicamente compatibles con la forma de quiste
de la especie Naegleria fowleri. Dentro de los resultados positivos se encontró que en las pozas
que tenían una temperatura de 27°C el porcentaje de amebas era más elevado. Con los datos
estadísticos que arrojó este estudio, se concluyó que las aguas termales del pueblo tenían las
condiciones necesarias para la proliferación de los patógenos (Minetto & Lima, 2016).
El estudio realizado en el año 2017, por E. Gallegos et al., sobre “Amibas de vida libre en
playas de Tuxpan y Arrecife Ingeniero, Veracruz, México”, tuvo como objetivo determinar la
presencia de AVL en dos localidades de Veracruz, las cuales fueron Tuxpan y Arrecife Ingeniero
en Boca del Río, además se recolectó agua, biopelículas y sedimento de la zona intermareal de
colectas en la Planta Termoeléctrica. Se registraron in situ diversos parámetros fisicoquímicos y
las muestras se sembraron en placas de agar no nutritivo con Enterobacter aerogenes a 37°C, la
11
identificación se realizó mediante las claves taxonómicas de Page, logrando determinar 13
géneros de AVL de los tres tipos de muestras, las especies fueron: N. fowleri, Vahlkampfia sp.,
Rosculus sp., Sappinia sp., Vanne lla sp., Korotnevella sp., Mayorella sp., Vexillifera sp.,
Heteramoeba sp., Euglypha sp., Paramphitrema sp., siendo Tuxpan el lugar donde se observó
una mayor riqueza específica (Gallegos, Becerra & Figueroa, 2017).
La investigación realizada en el año 2017, por S. Mazariegos con el título "determinación de
la presencia de amebas de vida libre en piscinas de centros de recreación en los departamentos de
Guatemala y Escuintla que se encuentran aledaños a la carretera internacional al pacífico ca-9
sur” tuvo como objetivo la determinación de estos protozoos mediante la recolección de 198
muestras en nueve centros turísticos durante diferentes estadíos del año. La observación directa
tanto del sedimento como en cultivo en un medio monoxénico concluyó que, en efecto existen
quistes de Acanthameba spp. mayoritariamente en el muestreo correspondiente a la época de
verano, con una frecuencia de 1.01% (Mazariegos, 2017).
En un estudio publicado en el 2018 por M. Benito, titulado “Amebas de vida libre en aguas
residuales y fangos: Su papel como reservorio natural de bacterias potencialmente patógenas”
tuvo como objetivo investigar la presencia de AVL en aguas de 5 EDAR que desembocan en la
cuenca del Ebro, por medio del aislamiento de las amebas, la identificación del género y especie
correspondiente, así como la asociación por simbiosis de las bacterias con la ayuda de técnicas
moleculares. Con los resultados se pudo concluir que del 85 % de las muestras positivas, 13
pertenecieron al género Acanthamoeba spp., 6 a N. fowleri y 2 a Vermamoeba vermiformis. El
53,66 % de las AVL tenían bacterias en su interior como: Mycobacterium spp., L. pneumophila y
Pseudomonas spp. (Benito, y otros, 2018).
No se han encontrado referencias bibliográficas de estudios realizados en el Ecuador.
2.2 Conceptualización de las amebas de vida libre
Las AVL son microorganismos, protozoos, eucariontes, parásitos, cuya ubicuidad le confiere
a esta especie una alta prevalencia en el medioambiente. Su hábitat principal es el suelo y desde
allí se distribuyen por el aire a todo tipo de lugares. Han sido aisladas en agua dulce natural, agua
de mar, agua de piscinas, aguas residuales, sedimentos, agua de uso doméstico y grifos donde a
12
menudo forman biopelículas; ecosistemas artificiales como unidades de diálisis en hospitales,
material odontológico, lavado de ojos, lentes de contacto, empaques y soluciones de los mismos;
como contaminante de cultivos bacterianos y cultivos celulares. También en especies de
mamíferos, acuáticos y reptiles (Castaño, 2009). En humanos han sido aisladas de las vías
respiratorias altas de personas sanas, como secreciones de nariz, tráquea, bronquios, cerumen de
los oídos e incluso muestras fecales de pacientes con diarrea; lesiones de piel en
inmunodeprimidos y de tejido corneal en pacientes con queratitis amebiana. En general
presentan una distribución a nivel mundial (Laconte, Rivero & Lujan, 2013).
Alrededor del sigo XX se dejó de considerar a las amebas microorganismos inocuos y se
empieza a conocer su capacidad para producir enfermedades en los seres humanos que van desde
cuadros agudos hasta daños irreversibles y fatales. Se conocen también como amibas anfizoicas
dada su versatilidad para vivir de manera libre en la naturaleza aprovechando nutrientes disueltos
en el medio por pinocitosis, ser endoparásitos y establecer vínculos simbióticos con otros
microorganismos actuando como reservorio (Bonilla & Ramírez, 2014).
Las AVL generalmente se alimentan de bacterias, por lo que la contaminación del agua está
directamente relacionada con su presencia, no obstante, está demostrado que existen bacterias
resistentes a la depredación de amebas (BRA), en este caso se establece una asociación por
simbiosis, donde existe un beneficio de por medio. Dentro de este grupo se consideran bacterias
como Mycobacterium spp., Vibrio cholerae o Legionella pneumophila, ya que son capaces de
sobrevivir en el interior del fagosoma, logrando de esta manera viajar por ríos, pantanos o
canales de agua potable de manera segura, sin importar que el ambiente sea extremo o de
desinfección, cuando consiguen llegar a los sistemas de agua artificial pueden colonizarlos, es así
como estos lugares se transforman en reservorios idóneos para su proliferación. Por otra parte, la
parasitación de las amebas da lugar a la lisis de su membrana, como en el caso de
Mycobacterium spp., cianobacterias tóxicas, Pseudomonas spp., Legionella pneumophila,
Burkholderia cepacia, Escherichia coli, Listeria mono-cytogenes, Enterobacter aerogenes,
Aeromonas hydrophila o Vibrio cholera; estas capacidades difieren según el género de ameba y
están correlacionadas con el nivel de virulencia e infectividad de las amebas (Benito et al., 2018).
Según Barker y col. (1995), el caso de endosimbiosis mas estudiado es el de Legionella,
agente causal de legionelosis, se ha demostrado que su patogenicidad aumenta
13
considerablemente al estar dentro de Acanthamoeba spp., su crecimiento en el interior del
pulmón es más favorable a comparación de inhalación única la bacteria, todavía no se ha
dilucidado el mecanismo por el cual ocurre este evento, pero por medio de experimentos en el
laboratorio se cree que la presencia de la ameba inhibe la respuesta inmune del infectado
(Ortega, 2003).
Por tanto, no todas las AVL son consideradas patógenas, Acanthamoeba spp., Naegleria
fowleri, Balamuthia mandrillaris, Vermamoeba vermiformis, Paravahlkampfia spp. y
Sappiniapedata3-5., son las especies que han sido descritas como causantes de infecciones de
curso diverso con características necróticas y de reacción inflamatoria granulomatosa a nivel
crónico. Debido al bajo conocimiento de estos agentes los cuadros clínicos no son muy
reconocidos, esto provoca un diagnóstico certero difícil, tratamiento tardío y datos
desactualizados. “Debemos considerar a las amebas de vida libre como agentes infecciosos
emergentes, tanto patógenos primarios como oportunistas, cuyo diagnóstico resulta muy difícil
desde el punto de vista clínico y morfológico” (Oddó, 2006). Desde el punto de vista
epidemiológico y sanitario las especies de Acanthamoeba y Naegleria son las más relevantes
(González Machín, 2018).
Acanthamoeba spp. es el género más abundante, con veinte genotipos distintos (T1-T20) de
los cuales los encontrados con mayor frecuencia en lugares acuáticos, naturales y artificiales son:
T4, T5, T15, T3,T2 y T11. Se ha demostrado que varios de estos genotipos son causantes de
queratitis y conjuntamente con Balamuthia mandrillaris produce encefalitis granulomatosa
amebiana (EGA); e infecciones a nivel de pulmones y piel. El género Naegleria posee una única
especie capaz de producir enfermedades al ser humano, Naegleria fowleri considerada
potencialmente patógena y responsable de la MAP. Vermamoeba vermiformis es también agente
causal de queratitis. En menor proporción se encuentran los géneros Sappiniapedata que causa
encefalitis y Paravahlkampfia spp. causante de un único caso de meningoencefalitis (Benito et
al., 2018).
2.3 Reseña histórica
Según Oddó (2006), las enfermedades producidas por amebas son conocidas desde la
antigüedad, tal es el caso de Entamoeba histolytica, descubierta por Fedor Aleksandrovich en
14
1875, la cual es agente causal de la amebiasis y con un sin número de casos reportados alrededor
del mundo. Por el contrario, las infecciones producidas por AVL han sido de bajo porcentaje, es
apenas en los últimos treinta años que se ha evidenciado el incremento de infecciones. En 1903
Schaudin, declara a esta ameba la única en su género capaz de infectar al hombre (Ortega, 2003).
En el año 1943 en Nueva Guinea, un joven soldado japonés falleció tras sufrir durante siete
días un cuadro de amebiasis diseminada. En la autopsia, el patólogo E. H. Derrick reveló que el
agente causal fue un parásito morfológicamente idéntico a Iodamoeba buetschlii. Más tarde se
confirmaría que este fue el primer caso de muerte atribuido a N. fowleri, una especie de ameba
libre (Oddó, 2006).
En 1958, Clyde Culbertson demostró el potencial patógeno de las amebas mediante su
exposición en modelos animales, produciendo un cuadro de EAG en ratones tras la inoculación
de una cepa de Acanthamoeba spp. que había contaminado un cultivo de células de riñón de
mono cuando se elaboraba la vacuna frente a la poliomielitis (Cabello, 2015).
En 1960, en Tucson, Arizona se reporta el segundo caso de infección por AVL, tratándose de
una niña de 6 años de edad, cuyo motivo de muerte fue una lesión cerebral, nuevamente
imputado a I. buetschlii, que posteriormente se comprobaría que el agente causal fue
Acanthamoeba spp. (Oddó, 2006).
En 1965, se reporta el primer caso de N. fowleri, descrito por Malcolm Fowleri y Rodney F.
Carter en Australia, en donde se presenta una meningitis fulminante y un año más tarde en
Estados Unidos se reportaron 4 casos de MAP provocados por elementos amebianos, se confirma
como agente causal a N. fowleri con la ayuda de técnicas histoquímicas, concluyendo que la
afirmación Schaudin en cuanto a la patogenia de las amebas era errónea (Ortega, 2003).
En 1969 se hizo una revisión retrospectiva en Gran Bretaña en donde se sospechó de dos
casos de naeglerosis, la primera se trataba de una preparación histológica perteneciente a un
hombre joven proveniente de Essex, Londres, que falleció a principios del siglo, en la cual se
observaban los protozoos y el segundo caso correspondió a una niña de Belfast que tras sufrir un
accidente en una piscina presentó un cuadro clínico severo de 10 días de evolución que conllevó
a su desenlace (Oddó, 2006).
15
En 1968 Carter aisló por primera vez una ameba de LCR de un paciente que padecía un
cuadro de MAP, dos años más tarde se estableció que N. fowleri producía cuadros de
meningoencefalitis debido al estado ameboflagelado de dicho protozoo (Oddó, 2006).
2.4 Clasificación taxonómica
La clasificación taxonómica clásica va de acuerdo a la jerarquía de reino, filo, clase, subclase,
superorden y orden; en donde figuran cuatro grupos: Sarcodina (amebas), Mastigophora
(flagelados), Sporozoa (esporas y protozoos parásitos), e Infusoria (ciliados) (Cabello, 2015).
Recientemente la Sociedad Internacional de Protozoología instauró un nuevo sistema de
clasificación que se basa en las características morfológicas, rutas bioquímicas y filogenia
molecular de las amebas, clasificándolas en seis grupos, como se observa en la figura 1. El
género Acanthamoeba spp. ha sido ubicado dentro del super grupo Amoebozoa, en la categoría
Acanthamoebidae, cuya principal característica es la presencia de seudopodios, que son
proyecciones espinosas superficiales conocidos también como acantopodios y una forma de
resistencias al someterse a condiciones adversas denominado quiste (Castillón & Orozco, 2013).
Figura 1. Clasificación del género Acanthamoeba spp. dentro de los eucariotas.
Fuente: (Castillón & Orozco, 2013)
16
Sin embargo, para la identificación de estos protozoos aún se mantiene la clasificación
definida por Pussard y Pons (1977), que es una clasificación dividida en tres grupos en base a la
morfología y tamaño de los quistes (Figura 2).
El grupo I incluye las especies cuyos quistes son grandes, es decir, posee un diámetro > 18
µm, ectoquiste liso o rugoso y de forma redondeada mientras que el endoquiste posee un aspecto
estrellado. El grupo II es el más extenso dado que abarca las amebas con mayor distribución,
cuyos quistes tienen un diámetro < 18 µm, su ectoquiste es rugoso y el endoquiste puede ser
redondeado, ovalado, triangular o poligonal. Finalmente, en el grupo III se ubican las especies
cuyos quistes tienen un diámetro < 18 µm, el ectoquiste puede ser delgado u ondulado, mientras
que el endoquiste suele ser redondeado. Cabe mencionar que los criterios morfológicos para
Acanthamoeba spp. suelen ser pocos fiables, debido a que la morfología de estos
microorganismos puede verse alterada por el medio de cultivo. Por ello, la clasificación
molecular basada en la secuenciación del gen ARNr 18S es la mejor opción para establecer los
diferentes genotipos (Gallindo et al., 2016).
Figura 2. Caracterización de los quistes de Acanthamoeba spp.
Fuente: (Castrillón & Orozco, 2013).
17
En la siguiente tabla, se puede observar la clasificación de Acanthamoeba spp., desde su
genotipo T1 hasta T20, basados en su pequeña unidad ribosomal.
Tabla 1. Clasificación de los genotipos de Acanthamoeba spp. empleando 18S Rdna.
Genot
ipo
Infección Especies /Tipo
T1 Encefalitis A. Castellanii
T2A No
patógena
A. Palestinensis
T2B
Queratitis
NA
T3 Queratitis A. griffini, A. pearcei
T4 Queratitis,
encefalitis
A. echinulata, A. divionensis, A.lugdunensis, A.
mauritaniensis, A. polyphaga, A. quina, A, rhisodes, A.
royreba
T5 Queratitis,
encefalitis
A. lenticulata
T6 Queratitis NA
T7 NA A. astronyxis
T8 NA A. tubiashi
T9 NA A. comandoni
T10 Queratitis,
encefalitis
A. culbetsonii
T11 Queratitis A.hatchetti, A. stevensoni
T12 Encefalitis A. healyi
T13 No
patógena
NDA
T14 No NDA
18
patógena
T15 Queratitis A. jacobsi
T16 No
patógena
NDA
T17 No
patógena
NDA
T18 Encefalitis A. byersi
T19 NA Acanthamoeba micheli
T20 NA NDA
Fuente: (Cabello, 2015).
2.5 Género Acanthamoeba spp.
Las especies del género Acanthamoeba spp. forman parte de uno de los grupos de protozoos
más frecuentes, cuyas especies son A. culbertsoni, A. castellanii, A. polyphaga, A. astronyxis, A.
healyi y A. divionensis (Figura 3). Gracias a su distribución cosmopolita han ido ganando gran
importancia en el campo de la salud, debido a que en los últimos años se ha demostrado que son
capaces de causar graves patología a los seres humanos. Esta ameba fue descrita por primera vez
por Castellani en 1930, quien pudo evidenció su presencia como contaminante en un cultivo de
Cryptococcus pararoseus. Sin embargo, no fue hasta el año 1931 que mediante sus
características morfológicas, al presentar proyecciones espinosas conocidos como acantopodios
se pudo establecer su género. Finalmente, en 1970 se confirmó su potencial patógeno en
humanos (Castillón & Orozco, 2013) (Astorga, 2016).
Estas patologías están relacionadas directamente con los tejidos afectados, al colonizar la
córnea producen una queratitis amebiana, forman ulceras a nivel de piel y en el caso afectar el
SNC causan encefalitis amebiana granulomatosa. El termino meningoencefalitis amebiana
primaria se confiere únicamente a las infecciones producidas por N. fowleri (Ortega, 2003).
19
Figura 3. Clases de Acanthamoeba spp.
Fuente: (Hajialilo, Behnia & Tarighi, 2015).
2.5.1 Estadíos
Dentro del ciclo de vida de Acanthamoeba spp. existen dos estadíos: trofozoíto, que
representa su forma activa, puede alimentarse mediante vacuolas digestivas anteriores,
multiplicarse y se considera como la fase invasiva; el quiste está presente en ambientes poco
favorables (Ortega, 2003).
El trofozoíto mide entre 24 y 56 μm, tiene núcleo central y nucléolo esférico, en el citoplasma
se pueden evidenciar múltiples mitocondrias, ribosomas, lisosomas y vacuolas. Su principal
característica son sus seudópodos retráctiles, filamentosos o espinosos llamados acantópodos,
cuyo desplazamiento es lento. La división del núcleo ocurre mediante mitosis en donde
desaparece el núcleo y la membrana nuclear, mientras que los trofozoítos se dividen por fisión
binaria (Figura 4) (Flores, 2005) (Oddó, 2006).
Acanthamoeba spp. en este estadío puede alimentarse por trogocitosis “comer a bocados
pequeñas partes de la célula diana”, por medio de citólosis o apoptosis (Ortega, 2003).
Ventajosamente tiene a su disposición una amplia posibilidad de nutrientes, ya que puede
sintetizar diversas enzimas para degradar la celulosa, así como también la alginatoliasa que le
20
confiere ingreso a la matriz extracelular bacteriana; polihidroxibutirato despolimerasa para la
utilización del PHA; y la sintasa trehalosa-6-fosfato para adaptarse (Castrillón & Orozco, 2013).
El quiste de Acanthamoeba spp. se forma en respuesta a un ambiente austero, reduciendo su
metabolismo al estar expuestas a cambios de temperatura, presiones bajas de oxígeno y aún pH
inadecuado, esta fase latente le confiere resistencia frente a la desecación y agentes químicos
(Pereira & Pérez, 2003). El proceso de enquistación no está bien descrito, pero se ha realizado
experimentos in vitro, sometiendo a la especie a condiciones desfavorables como deficiencia de
nutrientes o adición de cloruro de magnesio y se ha observado cambios a partir de las 20 horas,
con la aparición de celulosa, disminución de actina, lípidos, síntesis y traducción de ARNm.
Adicionalmente, se ha observado que los quistes siguen viables hasta 25 años en agua a 4°C, 25
años en medio natural y 8 años cultivadas (Ortega, 2003).
Mide entre 11 y 25,3 μm de diámetro. Su citoplasma es de tipo granular, alrededor del núcleo
se pueden observar vacuolas, en donde se almacena el contenido alimenticio y aproximadamente
cada 40 a 50 segundos es vaciado (Oddó, 2006). Posee una pared doble, su lado externo es
denominado ectoquiste o ectocisto, el cual presenta una forma ondulada y arrugada, mientras que
el lado interno se denominada endoquiste o endocisto y puede ser de diversas formas, oval,
estrellada o poligonal (Flores, 2005). Dentro de los criterios descritos por Pussard & Pons
(1977), el opérculo recubre los poros que se forman entre las envolturas. Según Mazur y col.
(1995), “Acanthamoeba spp. puede permanecer en este estado de latencia durante años y seguir
siendo viable; si se expone a los quistes en un medio que les sea favorable, donde encuentren
alimento, volverán a recuperar su forma activa de trofozoíto” (Ortega Rivas, 2003).
21
Figura 4. Estadíos de Acanthamoeba spp.
Fuente: (Ortega, 2003)
22
Tomando en cuenta la clasificación de Pussard & Ponds (1977), las distintas especies de
Acanthamoeba spp. se clasificación de la siguiente manera:
Tabla 2. Clasificación de especies de Acanthamoeba spp.
Grupo I Grupo II Grupo III
A. astronixis (Lewis
& Sawyer, 1979)
A. castellanii
(Douglas,1930;
Volkonski, 1931)
A. palestinensis
(Reich, 1933;
Page; 1977)
B. comandoni
(Pussard, 1964)
A. mauritaniensis
(Pussard & Ponds,
1977)
A. culbertsoni (Singh
& Das, 1970;
Griffin 1972)
A. polyphaga
(Pushkarew, 1913;
Volkonsky,1931)
A. lenticulata (Molet
& Ermolieff-
Braun; 1976)
A. lugdumensis
(Pussard & Ponds,
1977)
A. pustulosa
(sinónimo de A.
palestinensis)
A. quina (Pussard &
Ponds, 1977)
A. royreba (Wiallert,
Stevens & Tyndall,
1978)
A. rhysodes (Singh,
1952; Griffi, 1972)
A. divionensis (Pussard
& Ponds, 1977)
A. paradicidionensis
(Pussard & Ponds,
1977)
A. griffini (Sawyer,
1971)
A. triangularis (Pussard
& Ponds, 1977)
Fuente: (Ortega, 2003).
2.5.2 Patología
Las infecciones que puede causar Acanthamoeba spp. en los seres humanos dependerá
principalmente del sistema inmunológico de cada persona, por tanto las que afectan al SNC se
23
producirán únicamente en personas inmunodeprimidas, mientras que las infecciones a nivel
ocular pueden ocurrir en personas sanas, que tengan una inmunosupresión local, como por
ejemplo traumatismos corneales, que usen lentes de contacto o tengan contacto previo con agua
contaminada (Pereira & Pérez, 2003).
Existen dos vías de entrada de este protozoo, en el caso de queratitis es a través de los ojos y
para EAG es mediante las fosas nasales o de ulceraciones en la piel (Figura 5) (Castillón &
Orozco, 2013).
Figura 5. Rutas de entrada de Acanthamoeba spp. a su hospedero.
Fuente: (Castillón & Orozco, 2013).
Dentro de la patogénesis se destaca la capacidad de esta ameba para fagocitar la célula del
tejido de interés, bloquear la división celular con la finalidad de evitar la regeneración tisular, y
producir la apoptosis de la misma. Se ha demostrado in vitro, que la aparición de amoebastomas
en la superficie del protozoo al ser inoculado en cultivos celulares epiteliales de córnea causa la
deformación a conveniencia del cito-esqueleto favoreciendo la capacidad fagocitaria y
aumentando su patogenicidad. Este proceso también ha sido revertido con la adición de
24
citocalasina D, inhibidor de la polimerización de actina, que causa la detención de la fagocitación
(Figura 6) (Castillón & Orozco, 2013).
El mecanismo por el cual Acanthamoeba spp. se alimenta de células humanas, incluso si son
cancerígenas, es muy similar al efectuado por los linfocitos T citotóxicos. Los trofozoítos ejercen
su acción citotóxica provocan en la célula apoptosis, que con lleva formación de cuerpos
apoptóticos, flacidez, desorden iónico, condensación del núcleo y fragmentación de ADN; es el
caso de A. culbertsoni que causa apoptosis de las células microgliales y desarrollando EGA. La
citólisis se lleva a cabo perforando la membrana celular con el fin de perder el equilibrio
osmótico y provocando la muerte (Ortega, 2003).
Figura 6. Patogenia de Acanthamoeba spp.
Fuente: (Castillón & Orozco, 2013).
Para generar la amebiasis, Acanthamoeba spp. debe llevar a cabo una serie de pasos. El
primero es la adhesión, para esto se genera la expresión de la proteína de unión a manosa (PUM),
la cual es una proteína transmembranal de 400 kDa que se une a las glicoproteínas de las células
del tejido de interés, la cisteína presente en su porción extracelular ayuda a la agregación de las
amebas y conjuntamente de la laminina potenciar su patogenicidad. Como segundo paso se
producen proteasas y fosfolipasas, estas enzimas hidrolíticas ayudan a aumentar la concentración
25
del ion calcio y cambiar la estructura del cito-esqueleto; a nivel celular ocurren alteraciones en la
morfología, permeabilidad membranal, y mitocondrial dando lugar a la muerte de la célula por la
degradación de su matriz. La hidrolización del ATP en ADP mediante la expresión de ecto-
ATPasas a nivel membranal también favorece el aumento en la concentración de Ca++
, activando
diferentes cascadas de señalización propiciando la apoptosis celular (Castillón & Orozco, 2013).
Por el contrario, el mecanismo que le confiere protección al humano es su barrera inmunitaria
innata y adaptativa. La primera se lleva a cabo en presencia de anticuerpos y citoquinas que
abren paso a la activación de la vía del complemento por la ruta alternativa generando protección
en individuos sanos con la concurrencia de neutrófilos en el sitio de inflamación, produciendo
mieloperoxidasas y macrófagos listos para fagocitar a las amebas; evita la infiltración de
trofozoítos en la córnea y la formación del quiste. Los factores inflamatorios: IL8, FNT-α e IFN-
β son inducidos a través del receptor tipo Toll 4 con el fin de regular la producción de citoquinas
inflamatorias como respuesta a la infección ocular. Se cree que la respuesta inmune adaptativa
no es la adecuada, y la posible razón de que no se genere memoria inmunológica sea debido a la
ausencia de células presentadoras de antígeno a nivel corneal, dando lugar a reinfecciones. Cabe
recalcar que las lágrimas contienen lactoferrina, lisozimas, lactoperoxidasas, IgG, IgA, IgE, IgM
e IgA como sustancias protectoras, que podrían inhibir la adhesión del protozoo y neutralizar sus
factores citotóxicos (Castillón & Orozco, 2013).
2.5.3 Encefalitis amebiana granulomatosa
Se trata de una infección que ataca al SNC de personas inmunosuprimidas, cuyos agentes
etiológicos más comunes son Acanthamoeba spp. y B. mandrillaris (Pearson, 2015).
2.5.4 Patogenia y cuadro clínico
El ingreso del protozoo al hospedero puede ser por la sangre o a través del pasaje nasal. A
continuación, debe penetrar la barrera hematoencefálica para poder infestar al hospedero
invadiendo vasos sanguíneos alveolares que más tarde darán lugar a una diseminación
hematógena. En el primer caso, se puede atribuir a lesiones de la piel, mientras que en el caso de
invadir los focos primarios de las vías respiratorias, debe continuar por la ruta neuroepitelial
olfatorio, migrar por las fibras nerviosas e invadir el bulbo olfatorio. Una vez dentro, se genera la
apoptosis de las células endoteliales (Khan, 2008).
26
Su cuadro evolutivo es subagudo y crónico, con un periodo de incubación de dos semanas,
tiempo en el cual se presentan tejido necrosado, abscesos debido a la presencia de trofozoítos y
quistes. Dependiendo del lugar afectado se podrán evidenciar diferentes signos y síntomas a
nivel neurológico, dentro los cuales se tiene: aumento de la presión intracraneal, parálisis de los
nervios craneales acareando un desequilibrio, deterioro en el estado de conciencia, convulsiones,
coma y la muerte (Ortega, 2003).
2.5.5 Diagnóstico de laboratorio
Las muestras más recomendables para dichas enfermedades son el LCR y tejido (biopsias),
estas muestras deben ser tomadas de forma aséptica y transportadas a temperatura ambiente. El
personal de laboratorio debe tomar las medidas de protección adecuadas entre ellas una
mascarilla y guantes para procesar las muestras, el diagnóstico más efectivo para EAG y MAP es
el examen microscópico directo del LCR, en el cual se buscan las amebas móviles y la
diferenciación entre ellas morfológicamente, con la finalidad de discernir entre infecciones
bacterianas, fúngicas o virales (Tabla 3).
Tabla 3. Características del LCR en diferentes patologías
Condició
n
Apecto Células Tipo Glucosa Proteínas Observ.
directa
Cultivo
Nomal Transparent
es
0-10 Monocitos 40-50 15-45 No No
Bacteria
na
Opalino
Turbio
Purulento
30-50
500-1000
Incontabl
es
Polimorfo
nucleares
(PMN)
Baja o
ausente
>100 - Bacterias
Viral Transparent
e
Opalino
Claro
100>500
Monocitos
Norma
l o alta
60-150 - Virus
Tubercul
osa
Opalino
Xantocrómic
o
>100 PMN
Monocitos
Baja
muy baja
>100 - -
Tumoral Claro
Opalino
Xantocrómic
o
100-500 PMN
Monocitos
40-80 Nomal
50-100
- -
27
Menin
gitis por
amibas
de vida
libre
Opalino
Turbio
Purulento
Aumentad
a
PMN
Monocitos
Baja Aumentad
a
0 Amebas
Fuente: (Martinez, 1985).
Lastimosamente el diagnóstico generalmente se da post mortem, en donde la autopsia revela
irritación meníngea, edema grave y necrosis hemorrágica, mientras que a nivel microscópico se
puede observar quistes en los espacios peri vasculares en el parénquima confirmando que los
sitios de entrada son los capilares cerebrales (Khan, 2008) (Méndez, Pinzón & Rodíguez, 1993).
2.5.6 Tratamiento
Hay que tener en cuenta que la prevalencia de la infección estaría relacionada con la presencia
de quistes, debido a que los trofozoítos son susceptibles a la quimioterapia amebiana,
antimicrobianos, antivirales, antiprotozoos, etc. Se conoce que las diamidinas y biguanidas como
el polihexametileno biguanida-PHMB; son potentes cisticidas. El éxito del tratamiento está
determinado por el momento en que es administrado la medicación, el estado inmunitario del
paciente, la dosis infecciosa de las amebas, susceptibilidad al fármaco, y virulencia de la cepa
causante de la infección (Castrillón & Orozco, 2013).
No existe un tratamiento seguro, al afectar a pacientes con el sistema inmunitario
comprometido por lo general fallecen. Este hecho se debe a la falta de especificidad en los
síntomas causando un diagnóstico tardío, el enquistamiento del protozoo y el tratamiento
antiparasitarios no penetra fácilmente al LCR (Ortega, 2003).
2.5.7 Factores de riesgo
Personas inmunocomprometidas como trasplantados, conectados a alguna máquina, tratados
con antibióticos de amplio espectro y cualquier tipo de inmunodeficiencia (Méndez et al., 1993).
La combinación entre un estado inmunológico deteriorado y el contacto con agua contaminada
aumenta las probabilidades, no obstante, existen casos en donde no ocurrió instilación (Chambi
& Morales, 2014).
28
2.5.8 Queratitis y queratoconjuntivitis acanthamebiana
Es una infección de curso crónico caracterizada por una marcada reacción inflamatoria
granulomatosa con células mononucleareas y polimorfonucleares situadas en las estructuras
oculares, como pueden ser la córnea y la conjuntiva, siendo afectados seres humanos, cerdos y
roedores (Oddó, 2006). Se ha atribuido a varias especies de este género, las cuales son:
Acanthamoeba cultbersoni, A. castellani, A. hatchetti y A. quina (Pereira & Pérez, 2003).
2.5.9 Patogenia y cuadro clínico
Tras la infección por la ameba del género Acanthamoeba spp., se origina un cuadro
progresivo de necrosis en la córnea, siendo la primera línea de defensa los macrófagos. En
estudios in vitro de A. castellani se ha logrado percibir que la colagenasa juega un papel
importante al rato de ocasionar una lesión corneal, en contraste a esto, también se ha demostrado
la importancia de las células de Langerhans, cuya función en el epitelio corneal es la prevención
de lesiones, dado que los protozoos pueden atacar únicamente cuando esta estructura se
encuentra dañada. Esta infección raramente evoluciona hasta una uveítis. Por lo general, la
inflamación del iris e incluso de retina (retinitis) se ha diagnosticado en personas
inmunocomprometidas e incluso sin compromiso corneal, es el caso de pacientes que presentan
encefalitis amebiana o SIDA (Oddó, 2006). Es importante mencionar que esta patología se
asocia a un epitelio corneal atrofiado más que al estado inmunitario de cada individuo (Ortega,
2003).
Los síntomas empiezan con una incomodidad en el momento de colocarse los lentes, dolor,
enrojecimiento, ausencia de lagrimeo conocido como epifora y fotofobia. En el examen físico se
puede evidenciar erosiones, opacidades epiteliales o infiltrados, irregularidades. Conforme va
progresando la infección se observa queratitis e iritis con una disminución de la visión y daño
grave en la córnea, probablemente se genere un absceso corneal debido al anillo de infiltrado
estromal (Figura 7A), seguido de un proceso de cronificación central (Figura 7B) (Ortega, 2003);
esta condición es típica de la queratitis amebiana y dependiendo de la experticia del médico se
podría dar un diagnóstico temprano (Oddó, 2006).
29
Figura 7. Anillo de infiltración estromal
Fuente: (Ortega, 2003).
Figura 8. Cronificación corneal.
Fuente: (Ortega, 2003).
2.5.10 Diagnóstico de laboratorio
Existen varios métodos dirigidos a la búsqueda de este protozoo en las muestras, las cuales
son:
1. La observación directa a través de microscopia es la más común y ha sido empleada para
las muestras de raspado corneal.
2. Los cultivos en placas se han utilizado en muestras de líquido cefalorraquídeo, tejido
cerebral, raspados corneales, material cutáneo son generalmente cultivados con medios
destinados para el crecimiento de amebas, los cuales pueden ser: agar no nutritivo, de
30
baja concentración de nutrientes (peptona 0,05%, extracto de levadura 0,05% y glucosa al
0,1%), axénicos o monoxénicos; dentro de las suspensiones amebianas utilizadas están
especies no mucoides y fáciles de fagocitar como Klebsiella pneumoniae, Enterobacter
aerogenes, Enterobacter cloacae y Escherichia coli. En el caso de aislamiento se
recomienda usar únicamente un medio con agar no nutritivo con la finalidad de inhibir la
proliferación bacteriana y fomentar la amebiana.
3. Las tinciones se emplean en los cortes histológicos, dentro de las no diferenciales está la
tinción de hematoxilina-eosina; para la identificación de quistes se puede recurrir a
tinciones como: PAS que colorea de color rojo la pared quística, la tinción Gomori
Grocott (metenamina-plata) que tiñe de negro el quiste o la tinción fluorescente de
calflúor blanco que tiene afinidad a la celulosa del quiste.
4. Los métodos de inmunofluorescencia usando anticuerpos específicos han sido usados en
cortes histológicos, así como también métodos más sensibles como la reacción en cadena
de la polimerasa-PCR, secuenciación de ADN a través de la técnica de polimorfismos de
longitud de fragmentos de restricción-RFLP.
(Castillón & Orozco, 2013).
2.5.11 Factores de riesgo
El uso de lentes de contacto se considera como el factor de riesgo por excelencia, los
trofozoíto de Acanthamoeba spp. presentan mayor capacidad adherentes que los quistes. Según
Kelly y col. (1995) se necesita apenas diez segundos de contacto con el lente para poderlo
colonizar, hecho que esta íntimamente ligado al material con el que se haya fabricado el lente,
aunque según Sharma y col. (1995) es necesario de 1x102 protozoos (concentración mínima
efectiva- CIM) para lograr una adherencia al lente. Se han aislado protozoos de lentes con
pacientes sin aparente sintomatología, es por ello, que se puede decir que la incidencia del agente
causal es baja, por tanto su virulencia también (Ortega, 2003) (Pérez, Martinez & Isasa, 2006).
En la mayoría de los casos las personas afectadas son las que utilizan lentes de contacto
(especialmente blandos), debido a su incorrecta manipulación, forma de lavado y almacenaje; las
lesiones oculares causadas por traumatismos corneales anteriores debido a algún agente externo
o incluso por microtraumatismos al colocarse los lentes y ser expuestas a polvo o agua
contaminada también se consideran como factores de riesgo. Considerando que la infección
31
puede propiciarse en personas inmunodeprimidas y sanas, son varias las especies que con
frecuencia son aisladas, posiblemente porque son resistentes a las soluciones destinadas para la
desinfección de los lentes, entre las destacadas están: A. polyphaga (principalmente), A castellani
y A. griffini. Cabe mencionar que no se pude afirmar que B. mandrillaris, no sea otro agente
etiológico de QA, debido a que para el aislamiento de esta especie se necesitan cultivos celulares
y podría ser que dentro del diagnóstico de laboratorio no se inocule en todos los medios
necesarios (Oddó, 2006).
2.5.12 Tratamiento
Está comprobado que los desinfectantes pertenecientes al grupo de las binguanidas como son:
el desinfectante catiónico polihexametilenbiguanida (PHMB) al 0,02% ya sea solo o combinado
con diaminidas como la propamidina es altamente eficaz para eliminar los dos estadíos de
Acanthamoeba spp., sin presentar efectos tóxicos; al igual que la clorhexidina en la misma
concentración (Ortega Rivas, 2003) (Pereira & Pérez, 2003).
Se tiene buenos resultados con soluciones oftalmológicas, como isotianato de propamidina y
dibromo propamidina. De igual forma el uso de polimixina B, nitrato de miconazol, neomicina,
neosporina, ketoconazol y clotrimazol, asociados al isotianato de propamidina. Sin embargo, un
diagnóstico tardío solo se puede reparar con queratoplastia (Oddó, 2006).
Los corticoides son utilizados solo casos de infecciones prevalentes, dado que inhiben el
enquistamiento y desenquistamiento, entonces se elimina fácilmente los trofozoítos pero ante la
inhibición del proceso de desenquistamiento se pueden presentar resistencias dado que los
agentes antiamebianos no son tan efectivos frente a un quiste (Ortega, 2003).
2.5.13 Dermatitis acanthamebiana
Se trata de una rara infección oportunista capaz de comprometer la dermis, epidermis, e
hipodermis de personas con SIDA, ancianos, desnutridos, individuos con cáncer sometidos a
quimioterapia o radioterapia, etc. Puede ser primaria o secundaria, es decir, derivada de una
infección hematógena diseminada. Típicamente se observan ulceras inflamadas con infiltrados
de trofozoítos o quistes (Figura 8), abundante exudado purulento, aunque también se ha
observado en lesiones cutáneas sin daño previo de la piel, generalmente preceden una infección
del SNC. Para el diagnostico se realiza una biopsia de piel, en donde es posible observar células
gigantes, conformaciones granulomatoides y tejido necrosado. Su índice de mortalidad es
32
elevado, llegando al 73% sin compromiso del SNC y del 100% en casos combinados.
Nuevamente una detección precoz favorece el pronóstico de la enfermedad evitando el
compromiso neurológico (Oddó, 2006). Esta infección no tiene aún un tratamiento definido, y
por lo general se administra pentamidina (Ortega, 2003).
Figura 9. Observación de un quiste en una ulcera cutánea.
Fuente: (Ortega, 2003).
2.6 Especie Naegleria fowleri
Fue descrita como patógena para el hombre y causante de la MAP, infección que afecta al
sistema nervioso central, también es conocida como N. aerobia y N. invadens. Existen muchas
especies del género ya identificadas pero que aún queda por esclarecer si corresponden a
variantes o no de una misma especie. La especie N. lovaniensis es considerada una variante
homóloga de N. fowleri, y conjuntamente con N. gruberi se encuentran en estudios
comparativos, al no ser patógenas y ser los géneros más conocidos (Sierra, 2008).
N. fowleri es conocida como “come cerebros”, ingresa a través de la nariz y se dirige hasta el
tejido cerebral donde causa una hemorragia severa e inflamación produciendo un daño cerebral
dentro de pocos días (Figura 9). Esta enfermedad afecta principalmente a individuos sanos ya
sean niños y adultos, que asisten regularmente a centros recreativos como piscinas, se han
descrito numerosos casos de MAP, con tasas muy altas de mortalidad hasta de un 95% debido a
33
que se pueden confundir con otras como meningitis bacterianas (Ridwane, Ahmed & Siddiqui,
2019).
A diferencia de Acanthamoeba spp., esta especie presenta tres estadíos: trofozoíto, quiste y
una forma flagelar. El trofozoíto mide aproximadamente entre 15 a 25 μm, su estructura presenta
un núcleo central y su citoplasma vacuolado o granular; su núcleo es redondeado ubicado en la
parte central y su nucleolo es prominente y refringente. Su temperatura óptima para su
reproducción es de 40 a 45 °C, y en condiciones extremas suele enquistarse; el quiste mide de 8 a
12 μm, tiene forma esférica, contorno liso con pared densa con poros aplanados (Hinestroza,
2010). Carter (1970) manifestó que la reproducción se da por fisión binaria, por el contrario, la
división del núcleo se lleva a cabo por promitosis, en contraste Robles y col. (2009) considera
que se divide por critomitosis, proceso en el cual la membrana nuclear no desaparece y los
centriolos rodean al núcleo (Sierra, 2008).
La forma flagelada que pertenece a la familia Vahlkampfiidae, está presente en el suelo y
aguas dulces (Sierra, 2008), es un estadío únicamente temporal, en el cual su capacidad
reproductiva se anula, no se divide, generalmente es biflagelada y piriforme, en ocasiones puede
presentar hasta 10 flagelos, al exponerse el trofozoíto a agua destilada (solución baja en iones)
cambia su morfología a forma flagelada (Oddó, 2006). El estadío flagelar únicamente se efectúa
al buscar una nueva fuente de alimento (Peralta & Ayala, 2009).
Es una especie patógena para el ser humano, al tener en su ciclo de vida una forma flagelar se
las conoce como ameboflagelados, su crecimiento óptimo está en una temperatura entre 37 a 45
°C, siendo una especie termófilas por las altas temperaturas que alcanza, característica que está
ligada a su virulencia, es decir, las especie más patógenas puede vivir en temperaturas hasta de
45°C (Pearl, Govinda & Martinez, 1990). Ademas sus quistes pueden supervivir a 4°C
conservando aún su virulencia (Sierra, 2008).
Los estudios sobre el hábitat realizados por Jonckheere y col. (1975), demostraron la
importancia de las altas temperaturas para el desarrollo de las amebas, N. fowleri se aisló de
canales termales contaminados y se observó que su número aumentaba en verano. El mismo
autor afirmó que la MAP es una enfermedad creada por el hombre al contaminar su ambiente y
que al pasar el tiempo su agente etiológico se dispersaría hacia áreas de clima moderado. Es así
que para el año 1981, recopiló datos de aislamientos en Autralia, Nueva Zelanda, Polonia,
34
EEUU, Bélgica, Corea del Sur y Unión Soviética en diferentes fuentes de agua, fangos, suelo y
piscinas cloradas (Sierra, 2008).
Según Cerva (1971), existen factores químicos que inciden en la proliferación de las amebas,
en aguas con una alta salinidad y bajo contenido de fosfatos (menor que 7.4 mg.L-1
) no se han
encontrado estos microorganismos. Se ha aislado N. australiensis en piscinas con temperaturas
de 32 – 35 °C lo que confirma su crecmiento favorable en conjunto con una calidad
bacteriológica buena. Sin embargo, Griffin (1977) mencionó que N. fowleri y N. gruberi han
crecido en medios completamente axénicos, ademas ésta última también es biflagelada. En
cuanto a la temperatura los géneros termoresistentes además de Naegleria son Acanthamoeba,
Hartamannella y Valhkampfia, las cuales pueden interferir en la detección de Naegleria y
competir por alimento (Sierra, 2008).
Figura 10. Ciclo de vida. N. fowleri
Fuente: (Uribarren, 2019).
35
2.6.1 Patogenia y manifestaciones clínicas
La MAP, se confunde con otros tipos de encefalitis ya que cursa por síntomas semejantes
como, fiebre, dolor de cabeza, dolor de espalda, rigidez en el cuello, convulsiones, alucinaciones,
los cuales pueden llegar a ocasionar la muerte del individuo antes de los quince días de su
exposición (Ridwane et al., 2019). Este protozoo ha sido aislado de individuos sanos en contacto
con agua contaminada, especialmente aguas termales naturales (Oddó, 2006).
La MAP es una enfermedad que afecta específicamente las meninges, su período de
incubación es de 3 a 7 días, el ingreso del parasito a través del neuroepitelio olfatorio migrando
por la lámina cribosa del hueso etmoides, utilizando la ruta neuroepitelial para posteriormente
dirigirse hacia el espacio subaracnoideo donde se desarrolla la enfermedad ocasionando una
necrosis hemorrágica a nivel del sistema nervioso central (Hinestroza, 2010). Es necesario que
en primera estancia el parasito se fije a la matriz extracelular del huésped, debido a su alta
afinidad por la fibronectina, laminina y colágeno I, siendo la laminina muy importante para la
adhesión celular mediante receptores y componentes de la matriz extracelular (Ridwane et al.,
2019).
En estudios in vitro se ha observado que las cepas de N. fowleri ingieren pedazos de células
mediante su amebostoma, el cual tiene una apariencia de copa con centro deprimido,
generalmente en la superficie del protozoo, según la virulencia de la cepa puede producir la lisis
celular del hospedero, posiblemente atribuible a agentes infecciosos endosimbióticos o una
proteína de 50kDa propia del protozoo (Oddó, 2006). Según John y col. (1984) existe una
relación inversa entre la cantidad de amebostomas y la virulencia de la ameba, a pesar que la
temperatura de incubación y fase de crecimiento influye mucho (Sierra, 2008).
Frecuentemente se confunde el cuadro clínico con una meningoencefalitis piógena, con
deterioro neuronal, somnolencia y convulsiones. El LCR por lo general es turbio y su deceso se
da por insuficiencia respiratoria en menos de 10 días. Post mortem se puede observar el cerebro
hinchado, edematización, meninges hiperémicas, exudado purulento, bulbos olfatorios friables y
con necrosis (Oddó, 2006).
36
2.6.2 Diagnóstico de laboratorio
Para efectuar el diagnóstico de laboratorio de MAP, se observa en el líquido cefalorraquídeo,
aumento de leucocitos, células mononucleares, hematíes y las formas flagelares, al realizar la
siembra en ANNE se observan pueden haber quistes debido a la ausencia de nutrientes, otros
métodos que se utilizan para la determinación de esta especie es inmunofluorescencia indirecta,
citometría de flujo y PCR siendo este el método de elección, ya que es un método rápido y
sensible para la identificación del parasito (Oddó, 2006)(Ridwane et al., 2019).
Es necesario que las muestras de LCR se observen en un examen fresco y teñirlas con el fin
de visualizar las características morfológicas de los trofozoítos. Por el contrario, si el LCR es
centrifugado y el sedimento suspendido en agua, se podrá observar el estado flagelar,
confirmando que se trata de N. fowleri. Se recomiendan las tinciones tricrómicas o con Giemsa,
hematoxilina, y eosina (Oddó, 2006).
2.6.3 Prueba flagelar
Es una prueba confirmatoria de N. fowleri, en donde se puede evidenciar esta forma
transitoria mediante la adición de 2 a 3 gotas de agua destilada estéril en un tubo de ensayo e
incubar a 37°C se van a observar los flagelos microscópicamente directamente entre lamina y
laminilla (VITAE, 2012).
2.6.4 Factores de riesgo
En el caso de N. fowleri el contagio es indistinto entre personas inmunocomprometidas o
sanas, pero se ha visualizado que las personas jóvenes que realizan actividades deportivas
acuáticas son el grupo más vulnerable (Abrahams & Retana, 2014).
2.6.5 Tratamiento
El éxito del tratamiento se ve afectado debido a la dificultad para otorgar un diagnóstico
precoz, dado que su acción es muy rápida ya que las personas pueden llegar a morir en pocos
días, son pocos los casos en los que se logra el diagnostico etiológico en etapas tempranas. Sin
embargo, en caso de una intervención rápida, el tratamiento que se usa es la administración de
anfotericina B por vía venosa junto con rifampicina (Ridwane et al., 2019).
37
En varios casos clínicos se ha utilizado con éxito la anfotericina B frente a N. fowleri, se
utiliza mucho como un fármaco antifúngico, actúa frente a virus, su mecanismo de acción es
provocar poros en la membrana induciendo la muerte celular, para N. fowleri, la concentración
mínima inhibitoria es de 0,25 a 1,5 mg/kg/día, otros medicamentos como la rifampicina actúan
inhibiendo el crecimiento del parasito es por ello que estos dos medicamentos se los administra
en conjunto (Ridwane et al., 2019).
2.7 Métodos de identificación y cultivo
Los métodos de cultivo destinados para AVL, en especial Acanthamoeba spp. y N. fowleri
pueden ser de dos tipos:
2.7.1 Cultivo monoxénico
Según la definición de National Agricultural (2007), significa “Cultivo que contiene una
especie que crece en presencia de otra especie”. Generalmente se emplea una suspensión de la
especie empleada es E. coli en agua estéril o solución de page, la cual es vertida en un medio
previamente solidificado compuesto por agar base al 2% y SP 10X (Cabello, 2015).
2.7.2 Medio de cultivo de Page
Es el medio de cultivo de elección para el aislamiento de Acanthamoeba spp. y N. fowleri
Según Cabello (2015), las sales empleadas para la preparación del cultivo se deben disolver
en orden de lista y verter en 900ml de agua (Tabla 4). Pero se recomienda disolver el cloruro de
calcio en un matraz aparte para asegurar su completa disolución, mantener agitación constante y
de ser necesario preparar la solución inicial a una concentración de 50x debido a las cantidades
tan pequeñas de sales (Pérez, Martinez & Isasa, 2006).
Tabla 4. Preparación de solución Page
Cloruro sódico
Sulfato magnésico (MgSO4.7H2O)
Fosfato sódico, dibásico (Na2PO4H)
Fosfato potásico monobásico (KPO4H2O)
Cloruro cálcico (CaCl2.2H2O)
Agua bidestilada
120 mg
4 mg
142 mg
136 mg
4 mg
1000 ml
Fuente: (Cabello, 2015).
38
2.7.3 Cultivo axénico
Son de naturaleza líquida, ideales para obtener trofozoítos libres de bacterias, los cuales son:
2.7.3.1 Medio de proteosa-peptona
Ideal para aislar protozoos pertenecientes al género Acanthamoeba spp. Se deben mezclar y
enviar a la autoclave, excluyendo la glucosa que se añadirá después.
Tabla 5. Componentes del medio proteosa- peptona
Proteosa-peptona
Extracto de levadura
Glucosa
Sol Page
Suero bovino (opcional)
Penicilina
20,0 g
2,0 g
18,0 g
1000 ml
10%
500 μg/ml
Fuente: (Cabello, 2015).
2.7.3.2 Medio Nelson
Es un medio básico, destinado principalmente para el aislamiento de N. fowleri.
Tabla 6. Medio Nelson
Panmede (digerido de hígado)
Glucosa
Sol. Page 10x
Agua destilada
Penicilina
Estreptomicina
Suero bovino fetal
10g
10 g
100 ml
900 ml
20 U/ml
200 ug/ml
10%
Fuente: (Cabello, 2015).
2.7.3.3 Medio BM-3
Este método es empleado con mayor frecuencia para el aislamiento de B. mandrillaris, en
especial cuando se quiere aislar de muestras de piel o cerebro, ya que precede al cultivo celular
39
usado para multiplicar a dichos protozoos dada su difícil axenización. Tiene la particularidad de
poseer una gran cantidad de suplementos dentro de sus componentes (Tabla 7) y se recomienda
reemplazarlo cada cierto tiempo; 3 días para B. mandrillaris y 5-7 días para Acanthamoeba spp.
Tabla 7. Composición del medio BM-3
Medio base
Biosato peptona (BBL)
Extracto de levadura (Difco)
ARN de levadura Torula (Sigma)
H2O bidestilada
Suplementos
Sales balanceadas de Hnk10x
Digerido de hígado en sales de Hank
Mezcla de vitaminas MEM100x
Mezcla de lípidos 1,000x (Gibco)
Aminoácidos no esenciales MEM
100x
Glucosa 10x
Hemina, 2mg/ml (Mann Research)
Taurina 5% (Sigma)
Suero bovino fetal o ternera
2,0 g
2,0 g
0,5 g
345,0 ml
34,0 ml
100,0 ml
5,0 ml
0,5 ml
5,0 ml
5,0 ml
0,5 ml
5,0 ml
50,0 ml
Fuente: (Cabello, 2015).
De manera excepcional también se utilizan dos tipos de agares más, el agar Myast que
contiene extracto de levadura, extracto de malta y se solidifica con agar base. Y por su parte el
agar Napolitano preparado con extracto de levadura, glucosa, cloruro de sodio y agar-agar
(Suárez, y otros, 2002).
El medio de cultivo PYG, es un medio al cual se le añade antibióticos como penicilina o
esteptomicina, con la finalidad de evitar el crecimiento de otro tipo de organismos que funjan
como contaminantes |(González Machín, 2018).
40
Factores como pH, temperatura, viscosidad y presencia de sales orgánicas pueden afectar el
crecimiento de N. fowleri, se considera el pH óptimo en cultivos axénicos debe oscilar entre 5,5
u 6,5. Y la temperatura óptima depende de la concentración y composición del medio (Sierra,
2008).
2.7.4 Métodos sugeridos
En la literatura se describen diversas formas de transporte, conservación, cultivo e
identificación de las AVL en aguas.
Muestreo: Se realiza directamente en la fuente, ya sea esta agua de piscinas, ríos, grifo,
embotellada, etc. El volumen de la muestra es diverso, con rangos entre 50 ml hasta volúmenes
de 6 litros, adicionalmente se toman valores fisicoquímicos, pH, temperatura y cloro residual
(González Machín, 2018).
El medio de transporte de la muestra debe ser un recipiente estéril de boca ancha, junto a 1ml
de solución de Page (SP) y su transporte se realizará bajo temperatura ambiente, es primordial
que la muestra se conserve húmeda (Pérez, Isasa, Barrón, & colaboradores, 2006).
Para el cultivo de la muestra, se pueden emplear medios de agar no nutritivo solidificados más
SP (medio de page- MP) en placa o en tubo de ensayo; cabe señalar que el cultivo en caja Petri
suele ser más sensible pero tiene el inconveniente principal de desecarse con facilidad, para esto
se debe rehidratar añadiente solucion de Page cada 1 a 2 días. Entonces, si se trata de una
muestra corneal se la tritura con SP y se prepara una emulsión de 1-2 colonias de E. coli o
Enterobacter aerogenes de un cultivo reciente con 1ml de SP, como fuente de alimento, se
inocula en la caja Petri 0,2ml de la emulsion con la ayuda de una asa que nos permita extender
por todo el medio (en el caso de lentes de contacto, el volumen de la emulsion debe ser 0,3ml).
Finalmente, se añade unas gotas de la muestra disgregada con SP e incubar a 35-37°C. El autor
aconseja, en caso de disponer de más muestra, realizar un examen en fresco, y observarlo en
aumento de 10 y 20x tomando de 25 a 50μm de la fase líquida y conservarlas en un rango de 4-
8°C (Pérez, Isasa, Barrón, & colaboradores, 2006).
La filtración está sugerida en caso de obtener las soluciones con grandes cantidades de
sedimento, aun así dentro de las fuentes bibliográficas revisadas, la muestra también se puede
41
centrifugar o añadir al medio de cultivo directamente. La centrifugación debe ser suave y
preferiblemente luego de la realizacion del examen directo. Después de descartar el sobrenadante
se emulsiona con SP el sedimento y posteriormente se inocula. De inicio se examinan las
muestras cada 24-48h por una semana durante 4 a 6 semanas. En caso de cultivos negativos, se
recomienda realizar subcultivos, traspasando una parte del agar en un tubo con MP inclinado y
E. coli más 0,3ml de SP, y si se trata de un tubo, traspasar 0,1ml de la porción líquida (González
Machín, 2018).
Astorga (2016), para el aislamiento de AVL de muestras ambientales, empleó ligeros cambios
en la preparación de la solución Page, mezclo todos los reactivos, y aforó a 1000 ml.
Posteriormente, colocó en tubos tapa rosca con 10 ml de dicha solución y esterilizó durante 15
minutos a 121°C. Luego añadió 15 g de agar no nutritivo y esterilizó nuevamente bajo las
mismas condiciones. La emulsión de E. coli. se realizó con 5 ml de SP y se inoculó por todo el
agar. Finalmente se prosigue a la siembra o traspaso de los protozoos. En el caso de la utilización
del filtro, se debe colocar invertido sobre el MP. La incubación se realiza a temperaturas de 25ºC
y 37ºC ± 0,5ºC. Para el reporte de los resultados, si no se observa crecimiento después de 10 días
de incubación se consideran muestras negativas. De lo contrario está recomendado el subcultivo,
se debe marcar la zona en la cara posterior de la placa y con la ayuda de un bisturí se cortar el
agar en la zona marcada y de igual manera de coloca de forma invertida en una nueva placa,
incubar a la temperatura respectiva (25ºC ó 37ºC) y se observa diariamente al microscopio
(Astorga, 2016).
Según Muñoz (2003), primero se dejó decantar las muestras por tres a cuatro horas,
desechado el sobrenadante, se centrifugó el sedimento a baja velocidad (1.000 r.p.m.). Se
procedió a sembrar la muestra inoculando dos gotas del sedimento en cada caja de Petri que
contenían medio de agar no nutritivo (ANNE) en cuya superficie se depositó previamente una
película de Escherichia coli inactivadas, se incubó a 37°C y 42°C durante 7 días y se observó en
10 campos diariamente en objetivos de 10 y 40x con la ayuda de un microscopio y lupa
esteroscópica. Pasado este tiempo se consideró negativo si no se observaba crecimiento alguno.
De la misma manera se realizó subcultivos en caso de crecimiento.
42
Según Carbal (2016), para realizar los exámenes en fresco se centrifugaron 2 mL de la
muestra (con duplicado), a 2500 rpm por 5 min, se descartó el sobrenadante y se depositó una
gota del sedimento para observar a 10 X y 40 X (Carbal, Foen, & Morales, 2016).
De igual forma la temperatura de incubación de los medios es variable según el objetivo de
estudio y de las especies a determinar, por lo que se puede someter a temperaturas desde 23°C
hasta 44°C, se relaciona el potencial patógeno de las amebas con la temperatura de crecimiento,
ya que las especies que proliferen a temperaturas de 22°C y 37°C demuestran su capacidad de
adaptarse a la temperatura corporal, por lo tanto este parámetro es determinante en cada
experimento (González Machín, 2018).
2.7.5 Inactivación de E. coli
Preparar una suspensión bacteriana al 2 de escala McFarland en suero fisiológico y calentar a
65°C por 10 min. Someter a la bacteria a 56°C durante 2-4 horas e incubar a 37°C (añadir 0,5ml
de la suspensión bacteriana, ajustada al 27% de turbidez, 36% de transmitancia y 0,56-0,25 de
absorbancia) esto al unirlo con el medio de page con ANNE al 2% se obtiene un cultivo bifásico,
que luego de la siembra debe ser incubado a 37°C y 42°C (Muñoz, Reyes, Toche, &
colaboradoes, 2003).
2.7.6 Prueba Flagelar
Según Sandoval, y otros (2007), se debe lavar dos veces con solución tamponada la muestra
que contiene los trofozoítos, se incuba previa agregación de solución salina, por 2 a 4 horas a
35.5°C. Mientras que Lares (2009) explica que en caso de cultivos positivos de trofozoítos, se
debe inocular sobre la película formada 1 ml de agua destilada estéril e incubar a 37°C con
observación en intervalos de media hora (Lares & Lares, 2009).
2.8 Fundamentación legal
De acuerdo con la constitución de la República del Ecuador 2008 este proyecto se fundamenta
en:
Art. 32.- La salud es un derecho que garantiza el Estado, cuya realización se vincula al
ejercicio de otros derechos, entre ellos el derecho al agua, la alimentación, la educación, la
cultura física, el trabajo, la seguridad social, los ambientes sanos y otros que sustentan el buen
vivir. El Estado garantizará este derecho mediante políticas económicas, sociales, culturales,
43
educativas y ambientales; y el acceso permanente, oportuno y sin exclusión a programas,
acciones y servicios de promoción y atención integral de salud, salud sexual y salud
reproductiva. La prestación de los servicios de salud se regirá por los principios de equidad,
universalidad, solidaridad, interculturalidad, calidad, eficiencia, eficacia, precaución y bioética,
con enfoque de género y generacional.
Además, está respaldado por la ley de aguas:
Ley de Aguas
Artículo 84.- Obligaciones de corresponsabilidad. El Estado en sus diferentes niveles de
gobierno es corresponsable con usuarios, consumidores, comunas, comunidades, pueblos y
nacionalidades del cumplimiento de las siguientes obligaciones:
a) Reducir la extracción no sustentable, desvío o represamiento de caudales
b) Prevenir, reducir y revertir la contaminación del agua
c) Vigilar y proteger las reservas declaradas de agua de óptima calidad
d) Contribuir al análisis y estudio de la calidad y disponibilidad del agua
e) Identificar y promover tecnologías para mejorar la eficiencia en el uso del agua
f) Reducir el desperdicio del agua durante su captación, conducción y distribución
g) Adoptar medidas para la restauración de ecosistemas degradados
h) Apoyar los proyectos de captación, almacenamiento, manejo y utilización racional,
eficiente y sostenible de los recursos hídricos
i) Desarrollar y fomentar la formación, la investigación científica y tecnológica en el ámbito
hídrico.
Art. 387.- Será responsabilidad del Estado:
1. Facilitar e impulsar la incorporación a la sociedad del conocimiento para alcanzar los
objetivos del régimen de desarrollo.
2. Promover la generación y producción de conocimiento, fomentar la investigación científica
y tecnológica, y potenciar los saberes ancestrales, para así contribuir a la realización del buen
vivir, al sumak kawsay.
3. Asegurar la difusión y el acceso a los conocimientos científicos y tecnológicos, el usufructo
de sus descubrimientos y hallazgos en el marco de lo establecido en la Constitución y la
Ley.
44
4. Garantizar la libertad de creación e investigación en el marco del respeto a la ética, la
naturaleza, el ambiente, y el rescate de los conocimientos ancestrales.
5. Reconocer la condición de investigador de acuerdo con la Ley.
2.9 Hipótesis
Hipótesis nula
Ho: En las aguas termales de la provincia de Pichincha-Ecuador, se evidencia la
presencia de amebas Acanthamoeba spp. y N. fowleri potencialmente patógenas para
el ser humano.
Hipótesis alterna
Hi: En las aguas termales de la provincia de Pichincha-Ecuador, no se evidencia la
presencia de amebas de Acanthamoeba spp. y N. fowleri potencialmente patógenas
para el ser humano.
2.10 Sistema de variables
2.10.1 Variable independiente
Agua de las piscinas termales de la provincia de Pichincha
Las aguas termales pueden ser un reservorio idóneo para la proliferación de AVL, debido a
que las temperaturas de estas aguas son óptimas para que Acanthamoeba spp. y N. fowleri, actuar
como nicho ecológico para posteriormente infectar a huéspedes de forma accidental y provocar
varias enfermedades como queratitis amebiana, encefalitis amebiana granulomatosa y
meningoencefalitis amebiana primaria, en personas sanas como inmunocomprometidas.
2.10.2 Variable dependiente
Inciencia amebiana
El tipo de protozoo presente, cantidad, estadío y virulencia varía según el medio ambiente en
el que se encuentre.
45
CAPÍTULO III
Marco metodológico
3.1 Diseño de la investigación
Según Hernández (2010) “con los estudios cuantitativos se intenta explicar y predecir los
fenómenos investigados, buscando regularidades y relaciones causales entre elementos. Esto
significa que la meta principal es la construcción y demostración de teorías”.
Tomando en cuenta este concepto, la presente investigación tuvo un paradigma cuantitativo,
ya que se buscó evidenciar la presencia de AVL en las aguas termales del Ecuador, al conocer
los antecedentes en países vecinos. De esta manera, se lograron observar los protozoarios
mediante la recolección del agua termal y el reconocimiento en examen en fresco y de cultivo.
Se distinguieron dos de las especies más importantes y se interpretaron los datos más relevantes,
confirmando la existencia de estos microorganismos que pueden llegar a ser patógenos para el
ser humano.
Según Hernández (2010) “Lo que hacemos en la investigación no experimental es observar
fenómenos tal como se dan en su contexto natural, para posteriormente analizarlos.” Por lo tanto,
esta investigación fue no experimental ya que no se manipuló ninguna de las variables, las
muestras de aguas termales no recibieron ningún tipo de tratamiento, estímulo ni condición.
Según Ramos (2015) “El diseño descriptivo busca caracterizar, exponer, describir, presentar o
identificar aspectos propios de una determinada variable”.
Esta investigación tuvo como fin conocer la presencia de AVL en aguas termales de la
provincia de Pichincha expresando en forma de porcentajes el número de amebas encontradas
pertenecientes al grupo de interés y se evidenció su prevalecía en las muestras tomadas durante
el periodo de tiempo que se estipuló, permitiendo así alcanzar los objetivos propuestos en el
estudio y confirmando la hipótesis.
Según Hernández (2010) “los diseños longitudinales, recolectan datos a través del tiempo en
puntos o periodos, para hacer inferencias respecto al cambio, sus determinantes y consecuencias.
Tales puntos o periodos por lo común se especifican de antemano.”
46
En base a este concepto el presente estudio fue de tipo longitudinal, ya que los datos fueron
recolectados en un lapso previamente definido de tres meses, mediante salidas definidas y se
realizó el mismo proceso en cada muestreo, para determinar la incidencia de las AVL en las
aguas termales de cada balneario, se realizó un seguimiento durante siete días y se logró
confirmar los datos.
Esta investigación se fundamentó en varios hallazgos, realizadas alrededor de América del
Sur como el Perú la investigación realizada por (Garaycochea, Beltrán, & Morón, 2008), en la
cual investigan sobre “Patogenicidad de las amebas de vida libre aisladas de fuentes de agua en
Lima”, varios de estos estudios son de tipo descriptivo, ya que analizan la presencia o ausencia
de las AVL.
3.2 Población y muestra
Tres balnearios de aguas termales localizados en el suroriente de la provincia de Pichincha.
3.3 Criterios de inclusión
Piscinas ubicadas en la zona Sur Oriente del Distrito Metropolitano de Quito.
Muestras de agua con temperatura entre 25 y 45 °C.
Piscinas cubiertas y descubiertas.
3.4 Criterios de exclusión
Muestras de agua cuyas temperaturas sean inferiores a 25 °C.
3.5 Matriz de operacionalización de variables
En la tabla que se presenta a continuación se muestra la operacionalización de las variables
Tabla 8. Variables
VARIABLES
Variable Dimensiones Indicador
categórico
Instrumento
Agua de las
piscinas termales
Amebas totales
Número de
quistes, trofozoítos y
forma flagelar
Guía
observacional
Incidencia Naegleria fowleri Porcentual Guía
47
amebiana y Achatamoeba spp. observacional
Elaborado por: Autoras de la investigación.
3.6 Metodología
El método presentado a continuación es una combinación de los procedimientos expuestos en
el apartado de métodos sugeridos de determinación en el marco teórico.
3.6.1 Investigación documental
Se recopiló información en varias fuentes bibliográficas, entre ellas, libros, artículos, revistas,
monografías, tesis, etc., con el objetivo de obtener la mayor información posible que sustenten y
apoyen el tema que se investigó.
3.6.2 Muestreo
Análisis in situ: se registró el pH y la temperatura de cada piscina.
El muestreo inició en abril del 2019, las muestras de aguas termales fueron recolectadas en
frascos estériles de vidrio color ámbar de boca ancha en varias zonas de cada piscina, se
realizaron 6 visitas.
En la zona superficial se provocaron pequeñas olas colocando el frasco en dirección
horizontal, para la zona profunda de la piscina se introdujo el frasco tapado hasta llegar al fondo,
para las muestras del desagüe y de la vertiente se colocó el frasco en el orificio pegado al filtro.
Finalmente se hisopó las paredes de cada piscina e inmediatamente se guardó en un frasco de
vidrio estéril.
Las muestras fueron rotuladas y transportadas a temperatura ambiente.
3.6.3 Procesamiento de las muestras:
El análisis de estas muestras se llevó a cabo en el Centro de Biología de la Universidad
Central del Ecuador, por dos métodos: examen directo y por cultivo.
3.6.3.1 Examen directo
Se efectuó el mismo día de la recolección, tomando 50 μl de cada muestra se colocó entre
cubre y portaobjetos; se prosiguió a observar en el microscopio óptico a 10x y 40x en diez
campos de la placa; cuyo objetivo fue la discriminación entre la posible presencia o ausencia de
AVL.
48
3.6.3.2 Cultivo
Las muestras se dejaron en reposo durante 24 horas en frascos Erlenmeyer estériles y
protegidos del polvo para evitar algún tipo de contaminación.
Se colocó 100uL del sedimento en los tubos de ensayo y cajas Petri que contenían un medio
monoxénico de 800ml de SP 10x, 200ml de agar no nutritivo al 2% más 100 μl de emulsión de
Escherichia coli. Se incubó a 37°C y se examinó cada 24 horas durante 7 días con la ayuda de un
microscopio óptico a 10x, 40x y un estereoscopio para corroborar el crecimiento de amebas. Se
anotó la cantidad de trofozoítos, quistes y formas flagelares en la guía de observación.
Diariamente se adicionaba 200μl de la E.coli como fuente de alimento. Una vez transcurrido el
tiempo de observación se descartaron los tubos y las cajas tomando como muestra negativa en
caso de no haber observado formas compatibles con los protozoos.
3.6.3.3 Prueba de flagelación
En un tubo de ensayo se adicionó 100μl del líquido contenido en cada tubo con 2 ml de agua
destilada estéril, se incubó a 37°C y se observó en intervalos de 30 min por 2 horas.
3.6.3.4 Medición de las formas ameboides
Con la ayuda de una regla micrométrica se tomaron las medidas de quistes y trofozoítos
encontrados para comparar las mediciones con las indicadas en la literatura.
3.6.3.5 Identificación morfológica
La identificación morfológica de las amebas se basó en el Boletín AMM de la Asociación
Argentina de Micribiología del 2018 y en el atlas “Guide to the methods of study and
identification of soil gymnamoebae”.
3.7 Técnicas e instrumentos de recolección de datos
En la presente investigación se utilizó la técnica de observación, se registraron los datos de
quistes, trofozoítos y formas flagelares compatibles con la morfología de AVL en una guía
observacional, de igual manera para cultivo se diseñó otra guía en la que figuraban los hallazgos
encontrados cada día. Los datos fueron transcritos en tablas elaboradas en Excel, instrumento
que fue utilizado durante toda la investigación (Anexo C).
49
3.9 Validez
Se buscó valorar la guía observacional con la ayuda de dos profesionales que conocían el
tema a investigar, tomando en cuenta la definición de Espinel (2014) “El grado en que un
instrumento logra medir lo que pretende medir”, y de esta manera se corroboró si cumplía y
abarcaba todos los datos relevantes según las variables, dimensiones y objetivos propuestos.
3.10 Técnicas de procesamiento y análisis de datos
Se utilizó como referente las técnicas de procesamiento y análisis de datos de las siguientes
investigaciones: “Isolation of Free-Living Amoebae from Sarein Hot Springs in Ardebil
Province, Iran”, “Amebas de vida libre en fuentes de agua natural del municipio de
Turbaco” y “Amebas de vida libre en las pozas de los baños termales de Churín”.
Se recurrió al programa de Office, Microsoft Excel para agrupar los diferentes resultados que
fueron arrojados de los análisis, y se ilustró a través de cuadros, gráficos y proporciones.
Los datos se expresaron aplicando la distribución de probabilidad de Poisson, y para cumplir
con los demás objetivos se empleó Odds Ratio como medida estadística para conocer las
posibilidades de que ocurran cierto evento.
50
CAPÍTULO IV
Análisis de resultados
En este capítulo se muestran los resultados obtenidos tras examinar la totalidad de las
muestras en base al procedimiento ejecutado tanto in situ como en el laboratorio. Se utilizó el
programa Microsoft Excel para la recopilación de datos, cálculo de valores y representaciones
gráficas, los resultados se agruparon en un universo común según cada balneario, pH y zona de
muestreo en cada piscina, con la finalidad de representar la presencia e incidencia de los géneros
de AVL identificados.
Se tomaron como referencia las siguientes investigaciones: “Isolation of Free-Living
Amoebae from Sarein Hot Springs in Ardebil Province, Iran”, “Amebas de vida libre en fuentes
de agua natural del municipio de Turbaco” y “Amebas de vida libre en las pozas de los baños
termales de Churín”, en donde se indicaban las zonas de muestreo que se deben contemplar para
abarcar un área representativa en cada piscina. De esta manera, se tomó agua de la superficie (S),
fondo (F), desague (D), entrada (E) e hisopado (H); de igual forma se aplicaron los métodos
propuestos para la identificación y aislamiento.
Los resultados se expresaron por medio de proporciones utilizando gráficas de intervalos de
altura con un nivel de confianza del 95%, y se analizó la incidencia de las especies de
Acanthamoeba spp. y N. fowleri en los tres balnearios, tomando en cuenta variables como pH,
zona de la piscina y estadíos amebianos, en función de dichos intervalos de confianza se evaluó
si existen o no diferencias significativas.
Para conocer la cantidad de AVL presentes en el agua recolectada de cada balneario se utilizó
la distribución de Poisson, que es una distribución de probabilidad de una variable aleatoria
discreta, la cual permite ver la probabilidad de que ocurra determinado suceso un número de
veces durante un intervalo determinado de tiempo o espacio (Arroyo, Bravo M., Llinás, &
Muñóz, 2014). En este caso, se calculó el promedio de dichas amebas en cada piscina según las
variables ya mencionadas, con la finalidad de conocer si existe una relación zona-estadío que
favorezca la adaptación de estos microorganismos.
51
Complementariamente, se calcularon las tazas de riesgo aplicando como medida de
asociación Odds Ratio, que supone la comparación de dos razones condicionales para conocer la
medida de la intensidad y asociación entre las casillas de las tablas que se comparen (Sánchez
Carrion, 1989). Se midió la probabilidad de encontrar un determinado estadío en determinada
zona dentro de la piscina, con el propósito de conocer no sólo la significación sino también la
estrecha asociación entre las variables. Además para conocer si existe diferencia o no en la
cantidad de amebas encontradas durante los diferentes días que se efectuó cada recolección, con
el objetivo de conocer si el drenaje y limpieza de las piscinas influye en la incidencia de dichos
microorganismos.
Finalmente, para el análisis del cultivo se evaluaron las tasas de cambio en cuanto a los
diferentes estadíos de las amebas observadas en un periodo de siete días posteriores a la
inoculación del agua en el medio de elección ya mencionado.
Tabla 9. Análisis macroscópico obtenido en el lugar del muestreo
Balneario Piscinas T, °C pH
Visitas 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
1 Grande
Pequeña
34
33
34
34
36
37
35
33
36
33
35
33
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
2 Grande
Pequeña
34,5
34
34
34
36
35
34
34
36
37
38
37
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
3 Piscinas
generales
Hidromasajes
35
35
35
35
41
40
40
40
35
34
34
34
40
40,5
40
40
36
38
38,5
37
42
42
42
41
38
37
37
37
40
41
40
40
36
38
38
37
42
42
42
41
38
39
39
39
42
42
41
42
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
8
8
8
8
7
7
7
7
8
8
8
8
7
7
7
7
8
8
8
8
7
7
7
7
8
8
8
8
7
7
7
7
8
8
8
8
Elaborado por: Autoras de la investigación.
En la tabla 9 se observan las temperaturas del agua en las piscinas de cada balneario a lo largo
de la investigación, el rango oscila entre los 34 a 42°C, los valores más elevados registrados
52
pertenecieron a los hidromasajes, además se puede observar un incremento de 1 a 2 grados
centígrados en las últimas visitas efectuadas en el mes de mayo. Peralta & Ayala (2009) afirma
que las AVL se desarrollan en temperaturas mayores a 25°C, por ende, la temperatura del agua
que se registró en cada fuente hídrica sí propicia un ambiente ideal para la adaptación y
proliferación de estas formas parasitarias. Adicionalmente, Rosas (2018) asevera que la
tendencia alcalina en muestras con un pH entre 7-9 se asocia con la presencia de AVL en aguas
recreacionales, concordando con los rangos de pH encontrados.
4.1 Examen directo
Durante todo el estudio, se observaron en fresco 360 muestras bajo el microscopio óptico de
las cuales el 61,11% resultaron positivas para uno o varios estadíos amebianos.
4.1.1 Análisis de proporciones y promedios de las muestras en el examen en fresco.
Gráfico 1. Proporción de muestras positivas Acanthamoeba spp. y N. fowleri por balneario.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
En el gráfico 1 muestra un análisis proporcional con relación a los tres balnearios ubicados en
el sur oriente del Distrito Metropolitano de Quito, se agrupan los géneros encontrados sin
discernir entre sus estadíos, con el objetivo de una mejor visualización. Se observa que las
especies del género Acanthamoeba spp. representan el 58,6% mientras que, N. fowleri
corresponde al 25,3%, mostrando una diferencia significativa entre la proporción estas dos
53
especies debido a que la distancia entre dichos intervalos es considerable, hallazgo que coincide
con los resultados de un estudio realizado en Bélgica por De Jonckheere, en 1981, donde señala
que Acanthamoeba spp. constituye el 43,6% de la población amebiana en los balnearios y el
43,1% de N. fowleri (Suárez, Espinosa, Villanueva, & Colaboradores, 2002).
Gráfico 2. Proporción de Acanthamoeba spp. y N. fowleri según sus estadíos.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
En el gráfico 2 se observa la proporción de Acanthamoeba spp. y N. fowleri por sus estadíos
con respecto al total de las muestras, el trofozoíto de Acanthamoeba spp. se encuentra en una
proporción significativamente diferente con respecto al quiste compatible morfológicamente
similar al de las especies de dicho género con un 87,73% y 53,18% respectivamente. De las
formas encontradas de N. fowleri, el quiste representa el porcentaje más bajo 5,4%, mientras que
en cuanto a los estadíos de trofozoíto y ameboflagelar de N. fowleri se logra observar una
diferencia significativa al estar en un 23,6% y 30,45% respectivamente, esto se debe a que el
trofozoíto en medio acuoso tiende a cambiar a su forma flagelar temporalmente.
54
Gráfico 3. Proporción AVL según el balneario y pH.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
El gráfico 3 muestra de manera general las proporciones de AVL en cada balneario tomando
en cuenta el pH registrado en el momento del muestreo. Se puede observar que la mayor
cantidad de amebas se encontraron en el balneario 3 (B3) a pH 8, es decir en los hidromasajes,
con un porcentaje del 74,3%, mientras que en el mismo balneario a pH 7 la cantidad corresponde
al 54,1%, existiendo una diferencia significativa a diferente pH, confirmando así, la influencia de
dicho parámetro en el crecimiento de las AVL. Conjuntamente, se puede observar que en los tres
balnearios hay diferencias en cuanto al número de protozoos encontrados, a pesar de que en
todas las piscinas con pH 7 se confirmó su presencia, las proporciones difieren, este hecho se
puede atribuir a las demás condicionantes que afectan al número de amebas y causan tal
heterogeneidad, como la biología del parásito, tipo de recirculación del agua, material utilizado
en su construcción, tipos de desinfectantes usados y frecuencia de bañistas (Muñoz, Reyes,
Toche, & colaboradoes, 2003).
La mayor cantidad de muestras se obtuvieron del balneario 3, debido a que en esta localidad
había mayor cantidad de piscinas y contaban con hidromasajes, las muestras provenientes de
estos últimos presentaban mayor cantidad de formas amebianas, pero según Jiménez (2009), no
se puede imputar este hallazgo totalmente a la temperatura, debido a que factores como
disponibilidad de nutrientes y falta de competencia de otros organismos juegan un papel
importante en cada ambiente.
0,625
0,817
0,730
0,584
0,693
0,541
0,743
0,650
0,500
0,611
0,457
0,669
0,570
0,416
0,529
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
B3pH7 B3pH8 B2pH7 B1pH7 Total
Pro
po
rció
n A
VL
pH de cada balneario
55
Gráfico 4. Promedio de AVL por balneario y pH en 50 µl.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
El gráfico 4 nos permite ver cuál es la cantidad de amebas que se encuentran
aproximadamente en una gota de agua (50μl). En primera instancia, se puede discutir la
influencia del pH, aparentemente la tendencia a la alcalinidad no interfiere en la proliferación de
amebas debido a que se encontraron al menos 2,8 amebas en una gota de agua del balneario 2 a
pH 7 el hecho que al mismo pH pero en diferente balneario el promedio sea significativamente
diferente, como es el caso del balneario 1, en donde a pH7 se pueden encontrar un promedio de 1
ameba por gota de agua, nos permite ver que las condiciones del ambiente en donde dichos
microorganismos puedan proliferar, se conoce que las AVL crecen en un rango de pH amplio,
por tanto, se puede atribuir a que la contaminación bacteriana en determinado momento sea
mayor dando como resultado que lugares como piscinas sean un reservorio idóneo para albergar
estos parásito.
56
Gráfico 5. Promedio de AVL según las diferentes zonas dentro de las piscinas.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
El gráfico 5 nos permite corroborar las afirmaciones anteriores, se puede observar que no
existe diferencia significativa entre el fondo, hisopado y superficie del agua contenida en la
piscina, en promedio se pueden encontrar de 1 a 2 amebas. Según Reyes & Alarcón (2014), el
fondo se considera un lugar rico en nutrientes y bacterias, el hisopado recoge las bacterias
adheridas en las paredes y nos permite hacer ciertas conjeturas, la capacidad de adhesión de las
amebas es elevado contribuyendo las paredes rugosas de las piscinas en estudio, es posible que el
tratamiento higiénico no sea lo suficientemente minucioso como para reducir la presencia de
estos microorganismos. En cuanto a la superficie, la contaminación exógena ayuda a que la
cantidad de amebas sea mayor (Muñoz, Reyes, Toche, & colaboradoes, 2003). Por otro lado, la
cantidad casi nula de amebas en la entrada y desague confirma el hecho que existe una tendencia
de crecimiento.
57
A: Acanthamoeba spp., Q: quiste, T: trofozoíto.
Gráfico 6. Proporción de los estadíos Acanthamoeba spp. en las cada zona de la piscina.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
En el gráfico 6 se puede observar que la fase de quiste de Acanthamoeba spp. se encuentra
con mayor proporción en la superficie de las piscinas con un 68,06%, posiblemente las
condiciones en esta zona no son favorables para mantener su estadío de trofozoíto, debido a que
está expuesta a la contaminación exógena. Según Reyes & Alarcón (2014) los quistes tienen la
facultad de viajar con las ráfagas de viento en el aire, concepto que sustenta los porcentajes
registrados. Cabe mencionar que el diseño de la piscina en este balneario es de tal manera que el
filtro de entrada se sitúa en la parte superior, por lo que en las muestras de las entradas de agua
también se registraron porcentajes representativos de este estadío. Según Muñoz y col. (2003),
los balnearios sin cubierta tienen la tendencia a la contaminación exógena, hecho que respalda la
distribución extendida de las amebas en todas las zonas, a pesar de ser en bajas cantidades.
Según las características de los quistes de Acanthamoeba spp. en la clasificación de Pussard y
Pons (1977), los quistes observados presuntamente pertenecerían al grupo II, dado que su
diámetro es menor a 18 μm, se observó un endoquiste redondeado y ectoquiste rugoso (Anexo E,
imagen 8) (Costamagna, 2010). Sin embargo, Ortega (2003) afirma que, la morfología puede
alterarse de acuerdo con la preparación del cultivo, por lo recomienda realizar exámenes
moleculares para determinar de manera concreta la especie.
58
El trofozoíto predomina en el fondo e hisopado con un 68,06% sin existir diferencia
significativa alguna entre estas dos zonas, seguido de la superficie con un 61,11%. Este estadío
constituye la fase activa de la ameba, por ende, el hecho de encontrar cantidades elevadas en
diferentes zonas se relaciona con su capacidad adaptativa. Tomando en cuenta los resultados, el
lugar más propicio es el fondo, según Muñoz y col. (2003) el trofozoíto de Acanthamoeba spp.
aumenta su viabilidad conforme las condiciones de sedimentación y reposo del agua sean
mayores, debido a que la materia orgánica se acumula y las bacterias adheridas al fondo sirven
como fuente de alimento resulta ser un ambiente óptimo para su reproducción. Se debe tener en
cuenta que el desagüe en las piscinas tiende a encontrarse en la parte inferior, el flujo de agua
ayuda a que en esta zona se depositen desechos y residuos que proveen mayor cantidad de
nutrientes, entre ellos las bacterias no encapsuladas (Reyes & Alarcon, 2014). Según Peralta &
Ayala (2009), los residuos orgánicos tapizan a las piscinas con una biopelícula constituida por
microbios, afirmación que concuerda con la incidencia amebiana en las muestras del desagüe e
hisopado tomados de los laterales de la piscina.
59
N: N. fowleri, Q: quiste, T: Trofozoíto, F: forma flagelar.
Gráfico 7. Proporción de los estadíos N. fowleri en cada zona de la piscina.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
En el gráfico 7 se puede observar que el estadío predominante es la forma de trofozoíto en el
fondo de la piscina representando el 44,4% al igual que la forma flagelar de N. fowleri con un
33,3%. Los bajos porcentajes de quistes son generalizados, y únicamente se puede encontrar en
la superficie un 12,5%.
El estadío más prevalente para N. fowleri es el trofozoíto seguido por su forma ameboflagelar
en el fondo de la piscina, este último estadío es parte de su ciclo de vida y es conocido como una
fase transicional de la ameba, frente a variaciones ambientales (Uribarren Berrueta, 2019), este
cambio se ha atribuido a condiciones acuosas hipotónicas como el agua destilada generalmente
sometidos en el laboratorio (Gertiser, 2015).
60
4.1.2 Tasas de riesgo
Se calculó el Odds Ratio, con el fin de sustentar la relación que se evidenció entre la zona de
muestreo y los datos proporcionales de los estadíos amebianos, y confirmar si existe o no dicha
dependencia.
Se pudo calcular las tasas de riesgo en los tres balnearios que se muestrearon (Anexo)
comprobando estadísticamente las siguientes afirmaciones:
- En promedio es 20 veces más probable encontrar especies de Acathamoeba spp. en los
balnearios estudiados a diferencia de N. fowleri.
- Es infinitamente más probable encontrar la forma ameboide de Acanthamoeba spp. y N.
fowleri en el fondo de la piscina que sus estadíos de quiste.
- Es 5,19 veces más probable encontrar el estadío de quiste de Acanthamoeba spp. en la
superficie de la piscina que encontrar su trofozoíto.
- Es 4,8 veces más probable encontrar el estadío quiste de N. fowleri en la superficie de la
piscina que encontrar su trofozoíto.
- Es 17,81 veces más probable encontrar el estadío de quiste de N. fowleri en la superficie
de la piscina que encontrar la forma flagelar.
- Es 5,34 veces más probable encontrar el estadío trofozoíto de N. fowleri en el fondo de la
piscina que encontrar la forma flagelar.
De esta manera se confirma la asociación entre las variables analizadas, el quiste se
encontrará con mayor probabilidad en las zonas superficiales, al contrario, de los trofozoítos que
tienden a proliferar más en las zonas sedimentadas de una piscina.
61
4.1.3 Análisis del método de limpieza de los balnearios estudiados
A continuación, con la ayuda de un gráfico en barras se valoró la cantidad de protozoos
encontrados de las dos especies en el estudio en días distintos de recolección de las muestras.
Gráfico 8. Proporción de Acathamoeba spp. y N. fowleri antes y después de la limpieza.
En el gráfico 8 se comprobó que existe una diferencia estadísticamente significativa entre la
cantidad determinada de Acanthamoeba spp. y N. fowleri los días previos al cierre de cada
piscina, asociada a la limpieza y drenaje de la piscina, al comparar los valores porcentuales. Las
determinaciones se realizaron en días previamente definidos, en base a la disponibilidad del
centro de recreación y de la cantidad de personas usando las instalaciones. Dentro de las seis
visitas para el muestreo se acudió el primer día tras la limpieza o drenaje de las piscinas, así
como también el sábado, siendo este el día con más afluencia de personas. Paralelamente se
entrevistó a los encargados de los tres balnearios muestreados a cerca del método de limpieza, la
62
cloración es empleada en el balneario 2 y 3, a diferencia del balneario 1 que drenan la piscina a
diario.
Por consiguiente, se llega a la conclusión que la diferencia significativa entre la cantidad de
amebas encontradas en cada recolección está ligado a los días de limpieza de las piscinas, ya que
el día siguiente al baldeo del agua la cantidad de formas parasitarias disminuye. Sin embargo, la
estancia de las amebas prevalece debido a que las acciones destinadas a la higiene de cada lugar
no son suficientes, en un estudio realizado por Muchesa et al. (2014), se aislaron amebas a partir
de aguas cloradas, lo que deja entrever la resistencia a este tipo de tratamiento, capacidad que se
atribuye a la celulosa presente en los quistes que actúa como barrera protectora. Además, a nivel
de superficies artificiales los quistes tienen gran resistencia a diferentes técnicas como cloración,
filtración rápida, ultrafiltración, tratamientos biocidas como el cloro, dióxido de carbono,
monocloramina, ozono y luz ultravioleta, promoviendo su prevalencia y riesgo de contagio
(González Machín, 2018).
Schuster (2002), planteó que el hábitat para N. fowleri es un lago natural o artificial con agua
termalmente contaminada o inadecuadamente clorinada de modo que las amebas puedan
alimentarse de bacterias y proliferar. Anderson y Jamieson (1972) señalaron que en un período
de supercloración de 10ppm no se erradicó a Naegleria sp. y que existen enfermedades
contraidas en aguas cloradas pero no filtradas (Sierra, 2008).
En los estudios efectuados en piscinas por Jonckheere (1979) observó que los quistes de
Acanthamoeba presentan mayor resistencia a la cloración que los de Naegleria e hizo énfasis en
que la importancia de las AVL podría estar siendo menospreciada debido a la controversia que
existe acerca de la concentración y virulencia de estos parásitos (Sierra, 2008). Actualmente
paises que no tenían reportes de casos asociados se han sumado a la investigación de AVL,
incrementando su determinación.
Según Ettinger et al. (2003), los cambios estacionales afectan a la prevalencia de las AVL en
agua debido a que la temperatura del agua fluctúa, de hecho, en el estudio realizado por el mismo
autor únicamente durante primavera y verano se aislaron amebas pertenecientes al género
Acanthamoeba, lo que corrobora que a mayor temperatura registrada los valores también se
incrementaron.
63
4.2 Cultivo
Todas las muestras recolectadas se inocularon en el medio de cultivo en tubos de ensayo y
cajas de Petri y durante siete días se registraron las observaciones, transcurrido dicho tiempo se
desechó el medio tomando como negativos los casos de no haber observado ningún tipo de
crecimiento.
Se realizó el cultivo en ANN para corroborar el examen en fresco, los cultivos dieron
positivos a 37°C a las 24 horas, a partir del día cinco disminuyó el crecimiento de las AVL en
todos sus estadíos datos que concuerdan con el estudio realizado por Astorga Leiva (2016).
El crecimiento en el cultivo es generalizado en los tres balnearios y en los dos géneros
encontrados, los quistes de Acanthamoeba spp.y N. fowleri están presentes en el primer día de
cultivo, es por ello que se examinó los cultivos cada 24 horas por 7 días, debido a que los quistes
tardan en transformarse en trofozoítos y multiplicarse hasta alcanzar un número suficiente para
ser detectados (Pérez, Isasa, Barrón, & colaboradores, Queratitis por Acanthamoeba, 2006).
El crecimiento de los trofozoítos en los géneros antes mencionados son más prevalentes entre
el tercer y cuarto día, para confirmar el crecimiento de trofozoítos del género N. fowleri se
realizó la prueba de transformación flagelar, por lo tanto, si el trofozoíto cambiaba a forma
flagelar estos pertenecian al género N. fowleri (Gertiser, Visciarelli, & colaboradores, 2010).
64
Gráfico 9. Curvas de crecimiento de quistes y trofozoítos de Acanthamoeba spp. de B1.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
En el gráfico 9 se puede observar la curva de crecimiento de Acanthamoeba spp. del balneario
1 en el cultivo con medio de Page, se muestra que el estadío de trofozoíto presenta el mayor pico
de crecimiento el tercer día con un promedio de cuatro trofozoítos visualizados por campo, de la
misma forma se observa que el estadío quiste el primer día de cultivo muestra mayor
crecimiento.
65
Gráfico 10. Curvas de crecimiento de quistes y trofozoítos de Acanthamoeba spp. de B2.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
En el gráfico 10 se puede observar el crecimiento del género Acanthamoeba spp. del balneario
2, se muestra que el estadío trofozoíto presenta el mayor pico de crecimiento en el segundo día
con un promedio de dos trofozoítos por campo, de la misma forma se observa que el estadío
quiste el primer día de cultivo muestra mayor crecimiento.
66
Gráfico 11. Curvas de crecimiento de quistes y trofozoítos de Acanthamoeba spp. de B3.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
En el gráfico 11 se puede observar el crecimiento del género Acanthamoeba spp. del balneario
3, se muestra que el estadío trofozoíto presenta el mayor pico de crecimiento en el tercer día con
un promedio de un trofozoíto por campo, de la misma forma se observa que el estadío quiste el
primer día de cultivo muestra mayor crecimiento.
67
Gráfico 12. Curvas de crecimiento de quistes y trofozoítos de N. fowleri de B1.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
En el gráfico 12 se puede observar el crecimiento del género N. fowleri del balneario 1, se
muestra que el estadío trofozoíto presenta el mayor pico de crecimiento el tercer día con un
promedio de un trofozoíto, de la misma forma se observa que el estadío quiste el primer día de
cultivo muestra mayor crecimiento.
68
Gráfico 13. Curvas de crecimiento de quistes y trofozoítos de N. fowleri de B2.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
En el gráfico 13 se puede observar el crecimiento del género N. fowleri del balneario 2, se
muestra que el estadío trofozoíto presenta el mayor pico de crecimiento el tercer día con un
promedio de un trofozoíto, de la misma forma se observa que el estadío quiste el primer día de
cultivo muestra mayor crecimiento.
69
Gráfico 14. Curvas de crecimiento de quistes y trofozoítos de N. fowleri de B3.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
En el gráfico 14 se puede observar el crecimiento del género N. fowleri del balneario 3, se
muestra que el estadío trofozoíto presenta el mayor pico de crecimiento en el segundo día con un
promedio de un trofozoíto, de la misma forma se observa que el estadío quiste el primer día de
cultivo muestra mayor crecimiento.
70
Gráfico 15. Tendencia de crecimiento en cada balneario.
Gráfico 16. Tendencia de crecimiento de trofozoítos en cada balneario.
En los gráficos 15 y 16 son gráficos modelados, en base a las ecuaciones obtenidas de las
curvas de crecimiento, puede observar que el comportamiento en cuanto al crecimiento de los
quistes como de los trofozoítos en los tres balnearios es similar, los gráficos modelados las tasas
de cambio en cada balneario permiten evidenciar que no existe una diferencia significativa con lo
que se puede concluir que el primer día luego de haber sembrado la muestra de agua se observó
71
mayoritariamente quistes y con forme pasaban los días hubo la cantidad de trofozoítos se
incrementaba con un pico de crecimiento en el tercer día.
Gráfico 17. Porcentaje del crecimiento de AVL en medio de Page.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
En el gráfico 17 se observa la positividad de los cultivos con trofozoítos y quistes de
Acanthamoeba spp. y N. fowleri en relación a los días de incubación a 37°C. El mayor porcentaje
de AVL encontrado fue el tercer día con un 33,48%, obteniéndose el menor crecimiento en el
sexto día de cultivo.
Discusión del método de cultivo
El aislamiento de las amebas en el método de cultivo se realizó con el objetivo de corroborar
los resultados obtenidos en primera instancia, por lo tanto, se esperaba que si en el examen en
fresco se encontraban formas compatibles con los géneros de Acanthamoeba spp. y N. fowleri, en
el cultivo se confirmen estos hallazgos.
Según Astorga (2016), no se siguen las metodologías estandarizadas e incluso en la búsqueda
bibliográfica se observa que cada autor tiene diferentes maneras de emplear el experimento sobre
todo en cuanto al aislamiento mediante cultivo. De igual forma en la presente investigación los
cultivos se realizaron con una técnica modificada según criterio de las autoras a partir de la
72
bibliografía existente. Tras ejecutar varios ensayos, se logró optimizar el método de acuerdo con
las condiciones intrínsecas del laboratorio, los resultados obtenidos son en base a la sistemática
expuesta en el tercer capítulo.
Se corroboró que la inoculación de las muestras de agua en agar no nutritivo solidificado en
tubos de ensayo en “pico de flauta” ayudaba a retener la humedad del medio durante
aproximadamente 20 horas, tiempo en el que se inoculaba nuevamente la suspensión
bacteriológica requerida para alimentar a las amebas (Anexo E, imagen 5). De hecho, Pérez
(2006) recomienda la preparación del medio en 0,5% de agar (medio semisólido) con la finalidad
de obtener grandes cantidades de trofozoítos. El crecimiento quístico fue evidente en las cajas de
Petri, en donde se pudo observar de manera clara los quistes de los dos géneros amebianos
encontrados en el examen directo. Además, se observaron canales en el agar (Anexo E, imagen
6), concordantes con lo que menciona Cabello (2015) que corresponde a la formación de rieles
debido al desplazamiento amebiano.
Según Pearl, Govinda & Martinez (1990), las especies de N. fowleri más patógenas puede
vivir en temperaturas de hasta 45°C, concepto que se extrapola al cultivo, por ende, la incubación
única a 37°C no permite conocer el grado patogénico de las especies aisladas en las muestras.
Este hecho no se correlaciona con las especies aisladas del otro género; de acuerdo al criterio de
Jiménez (2009), las cepas termófilas de Acanthamoeba spp. no están relacionadas con su
potencial patogénico.
Los quistes de las amebas se observaron generalmente entre el primero y segundo día tras la
inoculación de las muestras de agua, principalmente los pertenecientes al género Acanthamoeba.
Se evidenció un descenso significativo en los días siguientes ya que al favorecer las condiciones
del medio mediante inoculaciones sucesivas de la suspensión de E.coli, el densenquistamiento es
más probable y por eso la presencia de los trofozoítos se incrementa en el segundo y tercer día
(Teixeira, Rocha, & colaboradores, 2009).
Según Shibayama Salas & Martínez Castillo (2018), se debe tener en cuenta la importancia de
los quistes presentes en el agua, a pesar de que sus formas infectivas son el trofozoíto y la forma
flagelar, sin descartar que los quistes una vez inhalados, puedan adoptar la forma infectante en el
epitelio nasal.
73
Según González (2018), la prueba de flagelación se emplea para descartar la presencia de
especies pertenecientes al género Naegleria. Tras la adición del agua destilada al tubo de ensayo
se evidenció la tranformación de trofozoíto a la forma flagelar de la especie de N. fowleri, hecho
que comprobó que las formas ameboides observadas si pertenecían a dicho género afirmando la
presencia en las aguas analizadas. Generalmente esta forma infectiva presenta dos flagelos, a
pesar de que eventualmente pueden contener hasta 10 lopodías, según lo afirma Hinestroza
(2010). En este caso se generó una forma biflagelada como se puede observar en la imagen 11 en
la sección de anexos.
Finalmente, con el fin de determinar si los 7 días de incubación fueron suficientes, se
evaluaron los días de positividad de los cultivos, conociendo que al sexto día del cultivo ya no se
observaba ninguna forma compatible con AVL.
74
CAPÍTULO V
Conclusiones y Recomendaciones
5.1 Conclusiones
Se determinó la presencia de parásitos morfológicamente compatibles con las especies de
Acanthamoeba spp. y N. fowleri en los tres balnearios estudiados en la provincia de Pichincha –
Ecuador. El análisis fenotípico de las aguas termales nos permitió concluir que las especies de
mayor incidencia pertenecieron al género Acanthamoeba representando el 58,6% de las muestras
examinadas, mientras que N. fowleri representó el 25,3% de las muestras positivas. Además, los
datos de temperatura oscilantes entre 34 – 40°C y pH de 7 – 8 tomados in situ, permiten afirmar
que las aguas del territorio ecuatoriano también son parte de la distribución de AVL, en donde el
entorno es adecuado para su proliferación.
Se identificaron las especies de Acanthamoeba spp. y N. fowleri en las muestras de agua de
cada balneario por medio de análisis directo, con el objetivo de estimar la presencia de las
amebas en sus diferentes estadíos. Se concluyó que la mayor cantidad de trofozoítos
pertenecieron a las especies de Acanthamoeba spp. con un 87,73% y 53,18% de quistes.
Mientras que para N. fowleri el quiste representa el porcentaje más bajo 5,4%, mientras que en
cuanto a los estadíos de trofozoíto y ameboflagelar de N. fowleri se logra observar una diferencia
significativa al estar en un 23,6% y 30,45% respectivamente. Se recurrió al cultivo selectivo para
amebas con el fin apoyar las observaciones preliminares, aislando de manera exitosa especies de
los dos géneros de amebas observadas en el fresco.
Se conoció la relación entre las muestras observadas en fresco y el cultivo en medio de Page
mediante la mediación estadística de probabilidades con Odds Ratio, en donde se demostró la
tendencia por parte de las amebas a permanecer en su forma ameboide y ameboflagelada (en el
caso de N. fowleri) en el fondo de las piscinas, mientras que los quistes se encontraban
mayoritariamente en la superficie y entrada, confirmando la asociación entre la zona de muestreo
y los estadíos presentes.
75
Se comprobó que el mantenimiento sanitario dado en cada balneario influye en la
proliferación de las especies de Acanthamoeba spp. y N. fowleri, debido a que se evidenció un
descenso en la cantidad de dichas amebas en el día siguiente a la limpieza o drenaje de cada
piscina, mientras que las muestras recolectadas el día más lejano a la cloración y al mismo
tiempo coincidía en ser el día de más afluencia de personas, los valores se incrementaban.
5.2 Recomendaciones
De la experiencia adquirida en el presente estudio y en base a los datos obtenidos, nos
permitimos recomendar:
- Ampliar el número de investigaciones enfocadas a este tema, debido a que la zona
geográfica en la que se encuentra el Ecuador es aledaña a los demás países que poseen
estudios positivos. Además, nuetro territorio posee un sinnúmero de balnearios de
aguas naturales y termales, con entornos ideales para albergar AVL especialmente las
especies patogénicas de Acanthamoeba spp. y N. fowleri, y que al ser lugares visitados
por personas tanto sanas como enfermas, el riesgo de contraer alguna infección por
estos parásitos es viable. Cabe mencionar que las infecciones de este tipo suelen
confundirse con las de origen bacteriano, por eso los datos epidemiológicos de
exposición al agua pueden ser útiles para orientar el diagnóstico.
- Adoptar una normativa encaminada a la vigilancia de aguas térmicas, dado que
brindan un ambiente propicio para albergar AVL, por ello sería importante disponer de
un protocolo definido para el análisis de las aguas de sitios recreativos privados y
públicos y que se considere el tratamiento antiamebiano dentro de las acciones de
salubridad importantes.
- Profundizar el estudio en busca de AVL en muestras clínicas y ambientales, además
de incluir los cultivos de AVL dentro del algoritmo diagnóstico, debido a que la mayor
parte de los casos de amebiasis no son correctamente diagnosticados por su similitud
en las manifestaciones clínicas de otros agentes causales. De acuerdo al criterio de
Astorga Leiva (2016) en caso de presentarse un resultado negativo para encefalitis,
meningitis piógena, leptomeningitis bacteriana, encefalitis viral, meningitis
tuberculosa y queratitis herpética se debe considerar la posibilidad de que se trate de
76
alguna infección causada por especies de AVL. De la misma manera, Cabello (2015)
sugiere que cuando los cultivos para microorganismos bacterianos, virales, fúngicos,
pruebas de leishmaniasis o TB cutánea sean negativos se piense en un diagnóstico de
amebas como agentes causales, el mismo que es primordial realizarlo antes de que
ocurra la diseminación hematógena, puesto que en la fase temprana de la enfermedad
los protozoos se encuentran en la superficie de la piel. Por ende, es necesario que el
patólogo tenga experticia en el reconocimiento de estas formas parasitarias en todo
tipo de muestras. Por ejemplo, en el caso de B. mandrillaris, los trofozoítos se pueden
confundir con células macrófagicas o histiocitos (Oddó, 2006).
- Realizar un análisis para determinar la presencia de Acanthamoeba spp. en los lentes
de contacto, soluciones destinadas a su desinfección y contenedores, con la finalidad
de abarcar todos los posibles grupos susceptibles, tomando en cuenta que la mayoría
de los usuarios de este tipo de lentes no posean un epitelio corneal intacto que pueda
actuar debidamente como barrera ante estos patógenos (Ortega Rivas, 2003).
- Realizar el estudio a nivel de laboratorio empleando diferentes temperaturas, para
comprobar si las especies aisladas son termófilas ya que en el caso del género
Naegleria, el potencial virulento es medido por la capacidad de la ameba de sobrevivir
a temperaturas mayores a 45 °C (Hinestroza Gil B. P., 2010).
- Efectuar un análisis bacteriológico tanto de coliformes fecales, debido a que la alta
contaminación por E.coli da lugar a la proliferación de AVL, así como también la
determinación de bacterias endosimbióticas que aportaría datos epidemiológicos
relevantes ya que las bacterias en el interior de la ameba pueden persistir a la
desinfección y ambientes hostiles, incrementando su virulencia y tiempo de
sobrevivencia, como es el caso de Mycobacterium spp., Vibrio cholerae o Legionella
pneumophila (Benito, y otros, 2018) (Fernández Rodrigo, 2014).
- Realizar posteriormente estudios dirigidos a la determinación de anticuerpos contra
Acanthamoeba spp., para conocer el porcentaje de personas que posiblemente
estuvieron expuestas a estos microorganismos. Muchos estudios realizados en otros
países aseguran que todas las personas tienen anticuerpos contra Acanthamoeba spp.
debido a su gran distribución en la naturaleza (Cabello Vilchez, 2015).
77
- Caracterizar en base a técnicas moleculares, con el fin de identificar de manera más
precisa las distintas especies de los géneros de Acanthamoeba. y Naegleria. ya que
estas técnicas por medio de la amplificación de fragmentos específicos permiten
identificar el género, especie y genotipos. De hecho la clasificación propuesta es en
base al análisis filogenéticos se realiza mediante la comparación del fragmento 18s
rDNA.
78
BIBLIOGRAFÍA
Abrahams Sandi, E., & Retana Moreira, L. (2014). Amebas de vida libre como agentes de
encefalitis en el ser humano. Revista del clegio de Microbiólogos y Químicos Clínicos de
Costa Rica, 4-8.
Arroyo, I., Bravo M., L. C., Llinás, H., & Muñóz, F. (2014). Distribuciones Poisson y Gamma:
Una Discreta y Continua Relación . Prospect Vol. 12, 99-107.
Asociación Argentina de Micribiología. (2018). ¿Meningoencefalitis amebiana primaria (MEAP)
por Naegleria fowleri, emergente en Argentina? aam Boletín 220, 26-35.
Astorga Leiva, B. (2016). ECOLOGÍA DE ACANTHAMOEBA SPP. EN CHILE:
IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA Y GENOTÍPICA EN AGUA, SUELOS Y VEGETALES
(TESIS DOCTORAL). Univesidad de Zaragoza, Zaragoza.
Astorga Leiva, B. (2016). Ecología de Acathamoeba spp. En chile: Identificación fenotípica y
genotípica en agua, suelos y vegetales. Obtenido de http://www.zaraguan.unizar.es
Ávila, I., Rodríguez, M., Infante, D., & Llovera, V. (2006). Amibas de vida libre potencialmente
patógenas en aguas del parque #Las Cocuizas", Maracay, Venezuela. Scielo, 6.
Benito, M., LaPlante, D., Fernández, M. T., Natividad, M., Lasheras, A. M., & Gómez , J.
(2018). Amebas de vida libre en aguas residuales y fangos:Su papel como reservorio
natural de bacterias potencialmente patógenas. Difunditt.com, 1-9.
Bonilla Lemus, P., & Ramírez Flores, E. (2014). Capítulo 5: Amibas de vida libre patógenas y
oportunistas. En M. A. Becerril Flores, Parasitología médica (pág. 465). México:
McGraw-Hill.
Bonilla Lemus, P., Caballero Villegas , A., Carmona Jiménez, J., & Lugo Vázquez, A. (2014).
Ocurrence of free-living amoebae in streams of the Mexico Basin. Elsevier, S28-S33.
Cabello- Vilchez, A. M. (2015). Balamuthia mandrillaris en el Perú, lesiones cutáneas,
meningoencefalitis y métodos de cultivo. ELSEVIER, 107-119.
Cabello Vilchez, M. (2015). ACANTHAMOEBA SPP. AN OPPORTUNISTIC. Revista de
Investigación de la Universidad Norbert Wiener, 11-32.
79
Cabello-Vílchez, A. M. (2015). Acanthamoeba spp. un agente oportunista de infecciones
humanas. Revista de investigación de la Universidad Norbert Wiener, 12-32.
Carbal Reyes, L., Foen Alarcón, L., Morales Aleans, M., & Orozco Ugarriza, M. (2014).
Amebas de Vida Libre aisladas en aguas superficiales del municipio de Turbaco,
Bolíviar- Colombia. Revista Cubana de Medicina Tropical, 59-69.
Carbal Reyes, L., Foen Alrcón, L., & Morales Aleans, M. (2016). Free- living amoebae isolated
from surface water in the municipality of Turbaco, Bolivia, Colombia. Revista Cubana de
medicina tropical, 69.
Castaño Osorio, J. C. (2009). Presentación de un caso de queratitis por Acanthamoeba, su
aislamiento clínico y tratamiento exitoso con antisépticos en el departamento de Quindio
y revisión de la literatura. univ.quindio, 166-167.
Castillón, J., & Orozco, L. (2013). Acanthamoeba spp. como parásito y oportunista. Chilena
Infectol, 147-155.
Castrillón Betancur, J. C., & Orozco, L. (2013). Acanthamoeba spp. como parásitos patógenos y
oportunistas. Rev Chilena Infectol , 147-155.
Center for Disease Control and Prevention. (30 de abril de 2019). Center for Disease Control
and Prevention. Obtenido de www.cdc.gov
Chambi Torres, J., & Morales, N. (2014). Reporte de caso: Encefalitis granulomatosa en un
Hospital Nacional, Callao-Perú. CIMEL, 79-83.
Costamagna, S. R. (2010). Acanthamoeba spp.: Ecoepidemiología, biología, ultraestructura,
patogénesis y diagnóstico en el hombre. Universidad Nacional del Sur.
Dávila, Á. M. (2014). Epidemiología y diagnóstico de amebas de vida libre implicado en salud
humana. Madrid.
Delgado Rodríguez , M., & Llorca Díaz, J. (2004). Estudios longitudinales: concepto y
particularidades. Revista Española de Salud Pública, 8.
80
Espinel, E. (12 de 05 de 2014). La investigación científica. Obtenido de
virtual.uce.edu.ec/access/content/group/CCQ_63_1207_1_78527/unidad%203%20de%2
0metodologia.pdf
Ettinger, M., Weeb, S., Harris, S., & Mclninch, S. (2003). Distribution of free living amoebae in
James River Virginia, USA. Parasitology Research vol 89, 6-15.
Fernández Rodrigo, M. T. (2014). Caracterización molecular de Amebas de vida libre e
identificación de otros parásitos en aguas de red de la provincia de Zaragoza.
Fernández, M. T. (2014). Caracterización molecular de Amebas de Vida Libre e identificación
de otros parásitos en aguas de red de la provincia de Zaragoza. Dialnet.
Flores Becerril, R. C. (2005). Parasitología médica, de las moléculas a la enfermedad. México:
McGraw-Hill Interamericana.
Gallegos Neyra, E., Becerra Cigarroa, J., Figueroa Méndez, M., & Fuentes Zuno, S. A. (2017).
Amibas de vida libre en playas de Tuxpan y Arrecife Ingeniero, Veracruz, México.
Redalyc.org, 1-15.
Gallindo , M., Vethencourt, M. A., Nessi, A., Conde, C., Luongo, V., & Machado Raibeth.
(2016). Identificación de aislados de Acanthamoeba spp. mantenidos en el laboratorio de
amibiasis UCV, mediante PCR, RFLP. VITAE, 1-8.
Garaycochea, M., Beltrán, M., & Morón, C. (2008). Patogenicidad de las amebas de vida libre
aisladas de fuentes de agua en Lima. Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud
Pública, 204-207.
Gertiser, M. L. (2015). “Aspectos biológicos y epidemiológicos de Amebas de Vida Libre
aisladas en la República Argentina, con énfasis en Acanthamoeba spp.” (Tesis doctoral).
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SUR, Argentina.
Gertiser, M. L. (2015). Aspectos biológicos y epidemiológicos de Amebas de Vida Libre
aisladas en la República Argentina, con énfasis en Acanthamoeba spp. Repostorio digital
Universidad del Sur, 206.
81
González Machín, G. (2018). Amebas de vida libre: detección en aguas y alimento. Repositorio
Universidad de la Laguna, 23.
Hernández Sampieri, R., Fernández Collado, C., & Baptista Lucio, P. (2010). Metodología de la
investigación. México: McGraw-Hill.
Hinestroza Gil, B. (2010). Acercamiento al estado actual de meningoencefalitis amebiana
primaria en Colombia producida por Naegleria fowleri. (Tesis de Pregado).
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA, Bogota.
Hinestroza Gil, B. P. (2010). Acercamiento al estado actual de meningoencefalitis amebiana
primaria en Colombia producida por Naegleria fowleri (Tesis de Pregrado). Pontificia
universidad javeriana, Bogotá.
Khan, N. (2008). Acanthamoeba and the blood-brain barrier: the breakthrough. Journal of
medical Microbiology, 1051-1057.
Laconte, L., Rivero , F., Lujan, H., & Casero, R. (2013). Caracterización morfológica, fisiológica
y molecular de aislamientos de amebas de vida libre (Acanthamoeba) obtenidas del
medio ambiente y de pacientes con queratitis amebiana. Cobico.
Lares Jiménez, L. F., & Lares Villa, F. (2009). Aislamiento de amebas de vida libre en aguas
superficiales del valle de Mayo, Sonora. Revista Latinoamericana de Recursos Naturales,
161-167.
Matos, R., Ruiz, J., Casanova, L., & González, G. (2016). Encefalitis Granulomatosa amibiana
en pacuente inmunocompetente. Revista Venezolana de Salud Pública, 69-72.
Mazariegos Rodríguez, S. (2017). determinación de la presencia de amebas de vida libre en
piscinas de centros de recreación en los departamentos de Guatemala y escuintla que se
encuentran aledaños a la carretera internacional al pacífico ca-9 sur. biblioteca-
farmacia.usac.edu.gt, 59.
Méndez Rico, I., Pinzón Cárdenas, A., & Rodíguez Viliamizar. (1993). Búsqueda de amebas de
vida libre en el tracto respiratorio en individuos con afecciones pulmonares. Laboratorio
actual.
82
Minetto Peralta, M. Y., & Lima García, R. H. (2016). Amebas de vida libre en las pozas de los
baños termales de Churín. repositorio.uwiener, 80.
Muchesa, P., Mwamba, O., Barnard, T., & Bartie C. (2014). Detection of Free - Living Amoebae
Using Amoebal Enrichment in a Wasterwater Treatment Plant of Gauteng Province,
South Africa. Biomed Research International, 10.
Muñoz , V., Reyes, H., Toche, P., Cárcamo, C., & Gottlieb, B. (s.f.). ISOLATION OF FREE
LIVING AMOEBAE FROM PUBLIC SWIMMING POOL IN SANTIAGO, CHILE.
Muñoz Zapata, X., & Quintero Ruiz , G. (2011). Determinación de Acanthamoeba spp. en
piscinas públicas del municipio de Chinchiná (Caldas). repositorio.ucm.edu.co, 42.
Muñoz, V., Reyes, H., Toche, P., & colaboradoes, &. (2003). Aislamiento de amebas de vida
libre en piscinas públicas de Santiago de Chile. Parasitol Latinoam, 106-111.
National Agricultural library. (2007). Glosario 2007. Obtenido de www.loc.gov
Oddó, D. (2006). Infecciones por amebas de vida libre. Comentarios históricos, taxonomía y
nomenclatura, protozoología y cuadros anátomos clínicos. Rev Chil Infect, 200-214.
Ortega Rivas, A. (2003). Aplicación de la técnica de Rapd para la caracterización. Dialnet, 1-
188.
Pearl, M., Govinda , S., & Martinez, A. (1990). Naegleria and Acanthamoeba Infections:
Review. REVIEWS OF INFECTIOUS DISEASES, 1-24.
Pearson, R. (Marzo de 2015). Manual MSD Versión para público general. Obtenido de Manual
MSD: www.msdmanuals.com
Peralta Rodriguez, M. L., & Ayala Oveido, J. d. (2009). Amibas de vida libre en seres humanos.
Salud Uninorte, 280-292.
Pereira, Á., & Pérez, M. (2003). Amebas de vida libre. Elsevier, 114-117.
Pérez Irezábal, J., Martinez, I., Isasa, P., & Barrón, J. (2006). Queratitis por Acanthamoeba.
ELSEVIER, 46-52.
83
Pérez, I. J., Isasa, P., Barrón, J., & colaboradores, &. (2006). Queratitis por Acanthamoeba.
Control Calidad SEIMC, 1-9.
Ramos, C. (2015). Paradigmas de la investigación científica . Unife.edu, 9.
Reyes , C., & Alarcon, F. (2014). AMEBAS DE VIDA LIBRE EN FUENTES DE AGUA
NATURAL DEL MUNICIPIO DE TURBACO. Universidad de San Buenaventura,
Cartagena.
Ridwane Mungroo, M., Ahmed Khan, N., & Siddiqui, R. (2019). Naegleria fowleri: diagnosis,
treatment options and pathogenesis. Expert Opinion on Orphan Drugs, 67-80.
Sánchez Carrion, J. J. (1989). Análisis de tablas de contingencia. Madrid.
Sandoval, I., Serrano Luna, J. J., Tapia Malagón, J. L., Pacheco Yéez, J., Silva, A., Galindo, S., .
. . Mineko, S. (2007). Characterization oj Naegleria fowleri strains isolated from huma
cases of primary amoebic meningoencephatilis in México. Investigación científica, 342-
347.
Shibayama Salas, M. M., & Martínez Castillo, M. (2018). Modelos animales para el estudio de
la meningoencefalitis amebiana primaria. UNIVERSITARIOS POTOSINOS.
Sierra, L. (2008). Demostración de la presencia y patogenicidad de Naegleria fowleri en Santiago
de Cuba. Researchgate.
Suárez, R., Espinosa, Y., Villanueva, C., & Colaboradores, &. (2002). Aislamiento de amebas de
vida libre del género Acanthamoeba a partir de fuentes de agua en la ciudad de Ica.
Anales de la Facultad de Medicina, 17-21.
Suárez, R., Espinoza, Y., Villanueva, C., Ramos, J., Huapaya, P., & Marquina, R. (2002).
Aislamiento de amebas de vida libre del género Acanthamoeba a partir de fuentes de
agua de la ciudad de Ica. Redalyc, 101-105.
Teixeira, L. H., Rocha, S., & colaboradores, &. (2009). Prevalencia de potencialmente
patógenas de vida libre de amebas Acanthamoeba y Naegleria géneros en no
hospitalarios, Público, ambientes internos de la ciudad de Santos, Brasil. Universidad
Católica de Santos, Brasil.
84
Uribarren Berrueta, T. (3 de Julio de 2019). NAEGLERIA, ACANTHAMOEBA, BALAMUTHIA.
Obtenido de Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina,
UNAM: http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasitologia/amibas-vida-
libre.html
Vélez, M., Zapata, A., Ortiz , D., Trujilo, M., Restrepo, A., & Garcés, C. (2013). Reporte de caso
y revisión de la literatura de caso de paciente con meningoencefalitis por amebas de vida
libre. ELSEVIER DOYMA, 153-159.
Visvervasa, G., & Stehr-Green , J. (1990). Epidemiology of free-living ameba infections. NCBI.
VITAE. (2012). Hallazgos de amibas de vida libre de los géneros Acanthamoeba y Naegleria.
Una experiencia Venezolana. VITAE, 1-16.
85
ANEXOS
Anexo A. Árbol de problemas
86
Anexo B. Categorización de variables
Variable dependiente:
87
Variable independiente:
88
Anexo C. Instrumento de recolección de datos
Hoja de registro 1
CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DEL AGUA DE CADA PISCINA
Fecha:………
Balneario Piscina Zona de
muestre
T, °C pH Cantidad
recolectada, ml
Observacion
es
Elaborado por: Autoras de la investigación.
89
Hoja de registro 2
OBSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS EN EL EXAMEN EN FRESCO
Acathamoeba spp Naegleria fowleri
Código
muestra
Zona C1 C2 C3 C4 C5 Total Promedio Zona C1 C2 C3 C4 C5 Total Promedio
S S
F F
D D
E E
H H
Total Total
Promedio Promedio
S:superficie, F: fondo, D: desagüe, E: entrada, H: hisopado.
Elaborado por: Autoras de la investigación.
90
Hoja de registro 3
OBSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS EN EL CULTIVO
Acanthamoeba spp.
Codigo Zona QUISTE TROFOZOÍTO
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 Suma % D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 Suma Porcentaje
S
F
D
E
H
TOTAL
Porcentaje
D: día
Elaborado por: Autoras de la investigación.
91
Hoja de registro 4
OBSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS MEDIANTE EL CULTIVO
N. fowleri
Quiste Trofozoíto Forma flagelar
COD Zona D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 T % D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 T % D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 T %
S
F
D
E
H
T
%
Elaborado por: Autoras de la investigación.
92
Anexo D. Análisis estadístico de cruces
Acanthamoeba spp. Vs N. fowleri en el balneario 1.
Acanthamoeba spp.
N. fowleri
SI NO
S
I
45 6
N
O
10
0
89
45 ∗ 89
100 ∗ 6= 6,67
En el balneario 1 es siete veces más probable encontrar especies de Acanthamoeba spp.
que encontrar la especie de N. fowleri.
Acanthamoeba spp. Vs N. fowleri en el balneario 2.
Acanthamoeba spp.
N. fowleri
SI NO
S
I
2
0
17
N
O
2 21
20 ∗ 21
2 ∗ 17= 12,35
En el balneario 2 es doce veces más probable encontrar especies de Acanthamoeba spp.
que encontrar la especie de N. fowleri.
Acanthamoeba spp. Vs N. fowleri en el balneario 3.
Acanthamoeba spp.
SI NO
93
N. fowleri
S
I
1
7
12
N
O
1 30
17 ∗ 30
1 ∗ 12= 42,5
En el balneario 3 es cuarenta y tres veces más probable encontrar especies de
Acanthamoeba spp. que encontrar la especie de N. fowleri.
Quiste vs trofozoíto de Acanthamoeba spp. en el fondo de la piscina
Trofozoíto
Quist
e
S
I
NO
SI 8
N
O
4
1
23
Quiste vs trofozoíto de Acanthamoeba spp. en la superficie de la piscina
Quiste
Trofoz
oíto
S
I
NO
SI 3
6
8
N
O
1
3
15
36 ∗ 15
13 ∗ 8= 5,19
94
Es 5,19 veces más probable encontrar el estadío de quiste de Acanthamoeba spp. en la
superficie de la piscina que encontrar su trofozoíto.
Quiste vs trofozoíto de N. fowleri en la superficie de la piscina
Quiste
Trofoz
oíto
S
I
NO
SI 4 9
N
O
5 54
4 ∗ 54
5 ∗ 9= 4,8
Es 4,8 veces más probable encontrar el estadío quiste de N. fowleri en la superficie de la
piscina que encontrar su trofozoíto.
Trofozoíto vs quiste de N. fowleri en el fondo de la piscina
Trofozoíto
Quist
e
S
I
NO
SI 24
N
O
48
Quiste vs forma flagelar de N. fowleri en la superficie de la piscina
Quiste
Form
a
flagelar
S
I
NO
SI 5 2
N 8 57
95
O
5 ∗ 57
8 ∗ 2= 17,81
Es 17,81 veces más probable encontrar el estadío de quiste de N. fowleri en la superficie
de la piscina que encontrar la forma flagelar.
Trofozoíto vs forma flagelar de N. fowleri en el fondo de la piscina
Trofozoíto
Form
a
flagelar
S
I
NO
SI 1
7
7
N
O
1
5
33
17 ∗ 33
15 ∗ 7= 5,34
Es 5,34 veces más probable encontrar el estadío trofozoíto de N. fowleri en el fondo de
la piscina que encontrar la forma flagelar de N. fowleri.
Anexo E: Imágenes
Imagen 1. Recolección de agua superficial según el procedimiento mencionado.
96
Imagen 2. Recolección de agua la entrada de la piscina.
Imagen 3. Recolección del agua en el orificio de la salida de la piscina.
97
Imagen 4. Placas para el examen directo del agua recolectada.
98
Imagen 5. Observación del sedimento en el tubo al 3er día tras la adición de la muestra.
Imagen 6. Observación de colonias en el medio de cultivo en caja Petri.
99
Imagen 7. Observación por medio del estereoscopio de la cajas Petri.
100
Imagen 8. Quiste de Acanthamoeba spp. compatible morfológicamente, en cultivo en
caja.
101
Imagen 9. Observación de Trofozoíto de Acanthamoeba spp. morfológicamente
compatible, en cultivo en tubo.
102
103
Imagen 10. Trofozoíto de Acanthamoeba spp. en examen en fresco en donde se pueden
observar los acantapodios.
104
Imagen 11. N. fowleri en forma biflagelada tras la prueba flagelar.
105
Imagen 12. Trofozoíto de N. fowleri en el cultivo en tubo de ensayo.
106
Imagen 13. Formas compatibles con quiste de N. fowleri en el cultivo en tubo de
ensayo.
107