Dr. JULIO HILARIO VARGASDepartamento de Fisiologa HumanaFacultad de Medicina UNTTcnicas de diagnostico inmunolgicas

* Mtodos de laboratorio usando anticuerpos

* Anlisis de estructura y expresin gentica

* Ratones transgnicos y knockout

Mtodos de laboratorio usando anticuerpos

Cuantificacin de antgenos por inmunoensayos: RIA, ELISA

Purificacin e identificacin de protenas: Inmuno precipitacin, cromatografa de afinidad

Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos: Citometra de flujo, Inmunofluorescencia e inmuno histoqumica

Anlisis de estructura y expresin gentica

Hibridizacion por Southern blot

Hibridizacion por Northern blot

PCR

Ratones transgnicos y knockout

Mtodos de laboratorio usando anticuerpos

Cuantificacin de antgenos por inmunoensayos: RIA, ELISA

Purificacin e identificacin de protenas: Inmuno precipitacin, cromatografa de afinidad

Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos: Citometra de flujo, Inmunofluorescencia e inmuno histoqumica

Cuantificacin de antgenos por inmunoensayos

RADIOINMUNOENSAYOMtodos de laboratorio usando anticuerposEs un mtodo radioinmunomtrico que se basa en la formacin especfica de los complejos Antgeno-Anticuerpo http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/Radioimmunoassay.htmlTcnica desarrollada por Solomon A. Berson y Rosalyn Yalow en 1960 para determinar la concentracin de insulina en el plasma sanguneo

Cuantificacin de antgenos por inmunoensayos

ELISAEnzyme-linked Immunosorbent AssaySe basa en la deteccin de un antgeno (o anticuerpo) inmovilizado sobre una fase slida mediante anticuerpos (o antigenos) que directa o indirectamente producen una reaccin cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectrofotometra

La sensibilidad del ensayo y la especificidad de los diagnsticos son de mas del 97% Mtodos de laboratorio usando anticuerposhttp://www.neb-test.de/

Cuantificacin de antgenos por inmunoensayosMtodos de laboratorio usando anticuerposhttp://thefutureofthings.com/upload/image/articles/2006/biopen/biopen-elisa-schematic.jpg

ELISALas placas estn hechas de polipropileno y poliestirenoCuantificacin de antgenos por inmunoensayosMtodos de laboratorio usando anticuerpos

Materiales usados en ELISA Cuantificacin de antgenos por inmunoensayosELISAMtodos de laboratorio usando anticuerposLaboratory, Department of Dermatology. University of North Carolina at Chapel Hill.

ELISA plate readerCuantificacin de antgenos por inmunoensayosELISAMtodos de laboratorio usando anticuerposLaboratory, Department of Dermatology. University of North Carolina at Chapel Hill.

Cuantificacin de antgenos por inmunoensayosELISAHilario-Vargas J, Vitorio I, Culton D, Kirk J, Prisayanh P, Rivitti E, Aoki V, Hans-Filho G, dos Santos V, Qaqish B, Diaz LA. J Clin Exp Dermatol Res 2014, 5:2.Analysis of Anti-desmoglein 1 Autoantibodies in 68 Healthy Mother/Neonate Pairs from a Highly Endemic Region of Fogo Selvagem in Brazil

Purificacin e identificacin de protenas

INMUNO PRECIPITACIN (IP)Es una tcnica para precipitar una protena antignica de una solucin usando un anticuerpo que especficamente se une a una protena particular. La inmuno precipitacin requiere que los anticuerpos del complejo se unan a una fase slida para formar un complejo insoluble.

Se usa para aislar una protena particular de una muestra que contiene un pool de protenasMtodos de laboratorio usando anticuerpos

Hilario-VargasJ, Dasher DA, Li N, Aoki V, Hans-Filho G, dos Santos V, Qaqish BF, Rivitti EA, Diaz LA; Cooperative Group on Fogo Selvagem Research. Prevalence of anti-desmoglein-3 antibodies in endemic regions of Fogo selvagem in Brazil. J Invest Dermatol. 2006 Sep;126(9):2044-8.

Purificacin e identificacin de protenas

CROMATOGRAFA DE AFINIDADPermite separar una molcula particular de una gran cantidad de molculas que se encuentran en una mezcla tal como la sangre.

El inmuno adsorbente es preparado y la matriz slida puede ser agarosa, sephadex, derivados de celulosa u otros polmeros. Mtodos de laboratorio usando anticuerpos

Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos

CITOMETRA DE FLUJO Permite analizar la expresin de las superficies celulares y molculas intracelulares, caracterizando y definiendo diferentes tipos de clulas en poblaciones celulares heterogneas, evaluando la pureza de las subpoblaciones aisladas y analizando el tamao y volumen celular.

Permite el anlisis multiparametro simultaneo de clulas individuales. Mtodos de laboratorio usando anticuerpos

Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos

CITOMETRA DE FLUJO Mayormente se usa para medir la intensidad de la fluorescencia producida por anticuerpos marcados que se une a protenas o ligandos marcados en forma especificaMtodos de laboratorio usando anticuerposFITC: Fluorescein isothiocyanate

Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos

Inmuno histoqumicaEn muestras tisulares o citolgicas permiten la identificacin de determinantes antignicos caractersticos de distintas lneas de diferenciacin y funcionalismo celular.

La aplicacin directa de anticuerpos policlonales o monoclonales sobre secciones tisulares permite la localizacin microanatmica de su expresin y su correlacin con los parmetros morfolgicos, aumentando la sensibilidad y especificidad del estudio y proporcionando informacin adicional esencial en muchos casos.Mtodos de laboratorio usando anticuerpos

Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos

Inmuno histoqumicaMtodos de laboratorio usando anticuerpos

Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos

InmunofluorescenciaEs una tcnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos.

Los fluorocromos son molculas que al ser excitadas con la energa de una determinada longitud de onda son capaces de emitir energa de una longitud de onda mayor. Mtodos de laboratorio usando anticuerposLi N, Zhao M, Hilario-Vargas J, Prisayanh P, Warren S, Diaz LA, Roopenian DC and Liu Z. Complete FcRn dependence for intravenous Ig therapy in autoimmune skin blistering diseases. J Clin Invest. 2005 December 1; 115(12): 34403450.

Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos Gabbi TVB, Bernardelli IM, Santi CG, Maruta CW, Kodani V, Sotto MN, Li N, Hilario-Vargas J, Diaz LA, Rivitti EA, and Aoki V. Pemphigus foliaceus with neutrophilic spongiosis evolving to an atypical pemphigus phenotype J Am Acad Dermatol 2004; 51:1012-3.

Anlisis de estructura y expresin gentica

Hibridizacion por Southern blot

Hibridizacion por Northern blot

PCR

La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo elctrico.

Las partculas migran hacia el ctodo o nodo (electrodos - y +), dependen de una combinacin de su carga, peso molecular y estructura tridimensional.ELECTROFORESISAnlisis de estructura y expresin gentica

En electroforesis han sido usados una variedad de soportes.

Los mas importantes que se usan ahora son los sistemas de geles de poliacrilamida (Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE) y agarosa

Ambos sistemas permiten una variacin en el tamao del poro del gel, esto es importante para separar o caracterizar macromolculas por tamao.

La agarosa es particularmente til para grandes macromolculas debido a que el tamao del poro es mas grandeELECTROFORESISAnlisis de estructura y expresin gentica

IMPORTANTEacrilamida y bis-acrilamida son POTENTES NEUROTXICOS en disolucin ELECTROFORESISAnlisis de estructura y expresin gentica

ELECTROFORESISInstrumentos usadosDermatologys lab UNC North CarolinaAnlisis de estructura y expresin gentica

ELECTROFORESISFuente: Figure 4-44. Alberts et al. Molecular Biology of the Cell, 3rd edAnlisis de estructura y expresin gentica

BLOTAnlisis de estructura y expresin gentica

BLOTETAPASAnlisis de estructura y expresin gentica

Hibridizacion por Southern blotAnlisis de estructura y expresin genticaFue llamada as por que el procedimiento fue desarrollado por Edward M. Southern en los 70s.

Las molculas de DNA son transferidas desde un gel de agarosa sobre un membrana.

Esta diseada para aislar una secuencia particular de DNA en una mezcla. Ej. Localizar un gen desde el genomaAnlisis de estructura y expresin gentica

Anlisis de estructura y expresin genticaGel coloreado con bromurode etidioL: Marcador de peso molecular. DNA: Extrado de 9 clones de plsmidosSouthern blot. Expuesto a DNAmarcado radiactivamente yluego rayos XRepresentacin esquemticadel autoradiogramaHibridizacion por Southern blotAnlisis de estructura y expresin gentica

Hibridizacion por Northern blotTcnica de deteccin de RNA desde una mezcla. Despus de someterla a electroforesis se marca de forma radiactiva a qumica y realiza la lecturaAnlisis de estructura y expresin genticaAnlisis de estructura y expresin gentica

Northern Blot de RNA total de cDNA de GLUT 4 humano marcado con P32 de pacientes insulino dependientes, no insulino dependientes y controlesAnlisis de estructura y expresin gentica

PCRPolymerase chain reactionAnlisis de estructura y expresin genticaFue descrita en 1986 por Kary Mullis.

El objetivo es obtener un gran numero de copias de un fragmento de DNA a partir de un mnimo; tericamente de una sola copia de fragmento original.Anlisis de estructura y expresin gentica

Anlisis de estructura y expresin gentica

Ratones transgnicosSon aquellos cuyo material gentico es manipulado con el fin de otorgarle alguna caracterstica especfica. Ratones transgnicos y knockout

Ratones transgnicosRatones transgnicos y knockout

Ratones knockoutTcnica que permite crear ratones en los que se suprime un determinado gen, lo que permite estudiar la funcin del mismo y el efecto de su ausencia en el desarrollo del animalRatones transgnicos y knockout

*ING4 in human cancer cell lines. (A) Expression of ING4. Northern blot analysis was performed on 5 g of total cellular RNA by using 32P-labeled full-length ING4 cDNA as probe. (B) Schematic diagram of the ING4 protein showing the locations of plant homeodomain (PHD) and nuclear localization signal (NLS). Arrows mark the mutations found in ING4 transcripts from human cancer cell lines.