DIAGNOSTICO DE INFECCIONES CON TECNICAS DE BIOLOGIA

MOLECULAR 

Dra. Elizabeth Palavecino RosalesProfesor Auxiliar, UDA Laboratorios Clínicos.

 

Las ventajas de las técnicas moleculares ha sido ampliamente publicitadas en los últimos 7 años, lo que sin duda ha aumentado la presión en los laboratorios clínicos para comenzar a usarlas en una amplia variedad de enfermedades infecciosas, genéticas, oncológicas y neurológicas.

Actualmente existe una variedad de paquetes comerciales, especialmente en el área de las enfermedades infecciosas, que contienen todo lo necesario para realizar un examen, lo que obviamente ha estimulado a los laboratorios a incluir técnicas de biología molecular en el diagnóstico clínico. Sin embargo, y como veremos más adelante, estos métodos moleculares no están exentos de problemas tanto en su ejecución como en su interpretación, por lo que debieran estar reservados para aquellos laboratorios con personal familiarizado con estas técnicas y que tengan la infraestructura necesaria para su realización.

 

Técnicas o métodos usados en biología molecular

En general, las técnicas más usadas son las de detección directa por hibridación, usando un segmento de ADN marcado, y las técnicas de amplificacion. Estas últimas han tenido una verdadera explosión en su metodología, como lo demuestra el que en la actualidad existan por lo menos seis técnicas diferentes, aunque todas tienen como finalidad la amplificación de un segmento de ADN o ARN que ha sido seleccionado como un marcador para una determinada patología.

En este artículo me referiré al uso de estas técnicas en el diagnóstico de enfermedades infecciosas basada en la experiencia personal. Sin embargo, es

importante notar que los fundamentos de las técnicas descritas a continuación son similares en la mayoría de los exámenes usados para diagnóstico clínico.

 

HIBRIDACION POR SONDAS

Las sondas (probes) son segmentos de ADN o ARN que han sido marcados con enzimas, sustratos antigénicos, quimioluminiscencia o radioisópotos, los que se pueden unir con una alta especificidad a una secuencia complementaria de ácido nucleico. Estas sondas pueden ser dirigidas a un segmento de ADN o ARN seleccionado, que puede tener de veinte a miles de bases de largo. Las sondas de menos de 50 pares de bases son denominadas oligonucleótidos y pueden ser sintetizadas y purificadas con relativa facilidad por instrumentos comerciales actualmente disponibles. Las sondas de oligonucleótidos tienen la ventaja de hibridar más rápidamente a las moléculas blanco (target) y pueden, bajo ciertas condiciones, detectar el cambio de un nucleótido dentro de una secuencia de ácido nucleico.

Existen varias condiciones que afectan el proceso de unión o hibridación entre la sonda y el segmento blanco, como temperatura, concentración de sal y pH de la reacción. Por ejemplo bajas concentraciones de sal y altas temperaturas permiten que sólo el segmento blanco se una a la sonda, miestras que, por el contrario, si la temperatura de la reacción es baja, segmentos no complementarios pueden unirse a la sonsa. Por lo tanto, las condiciones deben ser cuidadosamente controladas para evitar falsos positivos.

La detección de la hibridación puede hacerse de varias maneras, dependiendo del método usado para marcar la sonda. Por ejemplo, si se usa una enzima, la hibridación se puede visualizar por un cambio de color y si se usa quimioluminiscencia, por emisión de luz un luminómetro.

Indicaciones para el uso de sondas o probes en el laboratorio. Las pruebas de hibridación a menudo disminuyen el tiempo necesario para identificar organismos fastidiosos. Además, permiten que los laboratorios puedan aumentar el número de patógenos que pueden ser identificados. En el estudio de costos, debe considerarse que aunque los exámenes que usan sondas son más caros que los métodos tradicionales, el hecho de tener un resultado en un mínimo de tiempo puede significar un ahorro para el paciente y el hospital.

Las sondas pueden ser usadas para detectar microorganismo directamente de una muestra clínica (expectoración, orina, etcétera) o para confirmar la identificación de un cultivo que por otros métodos tarda varios días (Legionella pneumophila, Chlamydia trachomatis, etcétera). Además, las sondas pueden ser usadas para hibridación in situ para evaluar la respuesta del

huésped a un agente infecciosos en particular y también para determinar la extensión de la infección mediante el estudio de muestras de tejidos de varios órganos. La Tabla 1 enumera algunos de los exámenes con sondas disponibles comercialmente. Muchos de ellos han sido desarrollados por varios fabricantes y sólo se diferencian en la secuencia a la cual está dirigida la sonda.

 

TABLA 1EJEMPLOS DE ORGANISMOS QUE PUEDEN SER DETECTADOS POR MEDIO DE SONDAS DE ACIDOS NUCLEICOS DISPONIBLES COMERCIALMENTE.

Tipo de prueba Organismo

Detección directa de la muestra Bacterias

Streptococci grupo A Legionella pneumophila Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrheae Tricomonas vaginalis

Virus

Papiloma humano

Confirmación de cultivo Bacteria

Enterococci Streptococci grupo B Haemophilus influenzae Listeria monocytogenes Neisseria gonorrhoeae Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium avium Otras especies de mycobacteria

Hongos

Cryptococcus neoformans Histoplasma capsulatum Blastomyces dermatidis Coccidioides immitis

Virus

Papiloma humano

TECNICAS DE AMPLIFICACION

Las técnicas de hibridación pueden tener una baja sensibilidad debido a que en algunos casos existe una sola copia de la secuencia en blanco. Por esta razón las técnicas de amplificación, que pueden producir millones de copias de un determinado segmento de ADN o ARN, han tenido un impacto extraordinario en muchas áreas del diagnóstico clínico.

Como fué mencionado anteriormente, existen varias técnicas de amplificación las cuales varían ligeramente en su método de amplificación. Unas de las técnicas de amplificación más usadas en la actualidad, tanto elaboradas en el propio laboratorio como comercialmente, es la reacción de la polimerasa en cadena o PCR. Otra técnica que ha sido evaluada para el diagnóstico es la reacción de la ligasa en cadena o LCR, en la cual pequeños segmentos amplificados son posteriormente ligados. Ambas técnicas se encuentran disponibles comercialmente y pueden ser adquiridas en varios formatos de automatización. Otras técnicas de amplificación, la mayoría sin nombre traducido al español, son strand displacement amplificatión (SDA), isothermal RNA self sustaining sequence replication. reaction, nucleic acid sequence-based amplification (TMA) y la amplificación por QB replicasa. A continuación sólo se analizarán los fundamentos de las técnicas de PCR en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, que el análisis de las otras escapa al objetivo de esta revisión.

Definición y componentes de la PCR

Esta técnica es una amplificación enzimática in vitroque resulta en una acumulación de la secuencia blanco (target). La PCR consiste de un número de ciclos cambios de temperatura que producen:

separación de las hebras de ADN; unión del oligonucleótido (partidor o primer) al segmento

ADN; extensión que permite a la ADN polimerasa sintetizar el

resto de la hebra complementaria.

Estos ciclos se repiten habitualmente 30 ó 40 veces para obtener un producto que puede ser fácilmente detectado por medio de un gel de agarosa o por hibridación en microplacas.

Con esta técnica, practicamente cualquier segmento de ADN de una determinada bacteria, hongo o virus puede ser amplificado y detectado. Sin embargo, los laboratorios deben analizar varios factores, entre los cuales destaca la aplicación clínica que podría tener la detección de un determinado organismo, así como los costos, sensibilidad y especificidad del examen en comparación con las técnicas tradicionales. En general, las técnicas de diagnóstico molecular están indicadas cuando un organismo no puede ser cultivado in vitro, o cuando requiere de un medio complejo y largos períodos de incubación.

Un organismo que cumple los requisitos descritos es el Mycobacterium tuberculosis y es por ello que existen numerosas técnicas de amplificación disponibles comercialmente, algunas de ellas aprobadas por la oficina de Administración de Drogas y Alimentos (FDA) en EE.UU. La sensibilidad de estos exámenes en expectoración varía de 85 a 95% y la especificidad entre 95 y 97%.

Otros organismos que pueden ser detectados directamente de una muestra clínica mediante técnicas de amplificación comerciales son Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis, Candida, Tricomonas, virus VIH, virus herpes, virus hepatitis C, enterovirus y virus papiloma. Actualmente se encuentran en evaluación exámenes de amplificación para una variedad de otros organismos. La Tabla 2, enumera los exámenes de PCR que actualmente se ofrecen para diagnóstico de enfermedades infecciosas en el laboratorio clínico de la Universidad Católica.

TABLA 2ORGANISMOS QUE PUEDEN SER DETECTADOS POR AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS EN EL LABORATORIO DEL HOSPITAL DE LA UNIVERSIDAD CATOLICA

Organismos Tipos de muestras

Mycobacterium tuberculosisExpectoración, lavado broncoalveolar, LCR, tejido,orina, líquido articular y peritoneal

Bordetella pertussis Aspirado nasofaríngeo

Chlamydia trachomatis Orina, secreción uretral, secreción y vaginal

Virus herpes simplex 1 y 2 LCR, sangre, lesión cutánea

Virus hepatitis C Sangre

Virus HTLV 1 Sangre

Pneumocystis carinii Lavado broncoalveolar, aspirado nasofaríngeo

Interpretación

Debido a la alta sensibilidad de estos exámenes, la interpretación es en algunos casos díficil, ya que el organismo puede no estar viable pero su ADN

puede todavía ser amplificado. Además, la presencia de un organismo en una determinada muestra no siempre significa infección. Es por ello que para el caso de infecciones virales (VIH y CMV) se recomienda realizar la determinación de la carga viral, la cual determina la cantidad de secuencias blanco presentes en el plasma de un individuo.

Falsos positivos debido a contaminación. Uno de los problemas más graves que enfrenta las técnicas de amplificación para su aplicación en diagnóstico, es la falsa positividad debido a la contaminación con ácidos nucleicos, la que puede provenir de tres frecuentes: de otras muestras clínicas que contienen un número elevado se secuencias blanco (contaminación entre muestras), de la contaminación de reactivos, por amplificaciones anteriores y la más grave de todas, de la acumulación de productos de PCR (amplicones) en el laboratorio por amplificaciones sucesivas de la misma frecuencia.

Por estas razones, los laboratorios que usan técnicas de amplificación deben tener normas estrictas de control de calidad. El Comité Nacional de Normas de Laboratorio Clínico de USA tiene un documento de regulación provisorio que es bastante especifico .En nuestro país no existen regulaciones formales, pero los laboratorios debieran tratar de cumplir el mínimo de requerimientos, como es tener un espacio separado para el procesamiento de la muestra y otro para la amplificación y tener además el personal adecuado para realizar estas técnicas.

 

CONCLUSIONES

A pesar del innegable poder de las técnicas de biología molecular en el diagnóstico clínico, es erróneo pensar que van a reemplazar a los exámenes convencionales para detección de agentes patógenos. Sin embargo, la capacidad de estas técnicas para proporcionar un diagnóstico definitivo en corto tiempo tendrá sin duda, un efecto en el manejo del paciente y nos ayudarán a entender mejor la patogénesis de la infección.

Aunque existe la posibilidad de usarlas en todos los microorganismos, las técnicas de diagnóstico molecular tendrán un mayor impacto en algunos patógenos. Es así que exámenes rápidos para la identificación de Micobacterias y la detección de resistencia a las drogas de primera línea, dará la base para que se tomen más oportunamente las decisiones clínicas adecuadas. También, la identificación rápida de virus Herpes simplex en el LCR de un paciente con encefaliitis dará la oportunidad de comenzar oportunamente la terapia adecuada, eliminando otros procedimientos más invasivos.

A medida que se automaticen, con un costo menor y con regulaciones más precisas, los laboratorios clínicos podrán incorporar estos exámenes en el funcionamiento de rutina y los clínicos podrán familiarizarse aún más con la interpretación y con las ventajas que proporcionan las técnicas de biología molecular en el diagnóstico clínico.

 

Métodos de biología molecular

Reacción de polimerasa en cadena

El método de PCR se basa en ciclos de amplificación exponencial de un fragmento especifico de ADN. Este fragmento está determinado por secuencias introducidas en la reacción, denominadas "partidores", y a partir de los cuales la enzima ADN polimerasa, realiza la síntesis exponencial (Figura 2). Cada ciclo de amplificación consta de tres etapas: denaturación, alineamiento y extensión. La denaturación se realiza a 95o C y la separación conseguida permitirá que cada hebra sirva como molde o templado para la síntesis de una nueva molécula de ADN. El tiempo de denaturación depende del largo del templado, y generalmente dura entre 30 segundos y 1 minuto. Debido a que al comienzo de la amplificación es necesario separar todo el ADN de la muestra analizada, inicialmente se realiza una incubación de 5 minutos a 95o C por una sola vez. Después de la denaturación sigue la etapa de alineamiento entre el ADN templado y los partidores. Esta etapa se basa en el principio de la renaturación de Doty et al8 ya que ocurre al llevar la reacción a 45o C - 60o C. Sin embargo, dado que los partidores están en mayor concentración que el templado, se favorecerá el alineamiento entre templado: partidor por sobre templado: templado. El ADN doble hebra formado (templado: partidor) definirá el sitio de acción de la ADN polimerasa o extensión, etapa en la cual esta enzima unirá nucleótidos libres en forma complementaria a la secuencia del templado. La extensión ocurre a 72o C que es la temperatura de máxima eficiencia de la enzima y el tiempo de la extensión dependerá de la distancia de los partidores entre sí. En general se ha calculado que la ADN polimerasa es capaz de incorporar 60 nucleótidos por segundo a 70o C,15 por lo que un minuto es tiempo suficiente para incorporar alrededor de 1.000 pares de bases. Ya que se ocupan dos partidores en la reacción, uno para cada hebra, y que estos quedan a una distancia de entrecruzamiento durante la síntesis de ADN, el segmento definido será amplificado en forma exponencial (Figura 2). Esto significa que en cada ciclo de amplificación se producirá una número de copias equivalente al exponente del número de hebras de ADN templado. Así por ejemplo, si al momento de iniciarse la amplificación sólo hay una molécula de ADN doble hebra (2 templados), después de 30 ciclos de amplificación se habrán generado 230 copias de ADN. Este número corresponde a 1,097,736,000 copias del segmento flanqueado por los partidores. El elemento mas crítico de la amplificación por PCR es el alineamiento. Dado que este fenómeno se basa en la complementariedad entre las bases nitrogenadas del templado y del partidor, ésta es una unión alterada por varios factores, entre otros la temperatura (Figura 3). La figura muestra el impacto de la variación de 5o C con relación a la cantidad de templado en la especificidad de la reacción. La importancia de la amplificación por PCR en Infectología se basa en que con esta magnitud de amplificación es posible el análisis de moléculas de ADN o ARN, a partir de mínimas cantidades de muestras. Así por ejemplo, si consideramos que una bacteria contiene 1 fg (10-9 g) de ADN, la amplificación por PCR permitirá generar alrededor de 0,1 µg (10-6 g) de una región especifica de ADN bacteriano. En la práctica, este método permite identificar secuencias presentes entre 10 y 50 copias en una muestra clínica y sin condiciones especiales de mantención. Aunque la PCR permite la amplificación de ácidos nucleicos, la visualización del producto amplificado requiere de otras metodologías posteriores a la amplifi-cación. El método más

utilizado es la electroforesis de agarosa, técnica descrita por Southern12 en el que el producto, sometido a corriente eléctrica, migrará de acuerdo a su tamaño. Sin embargo, este es un método indirecto, porque sólo indica el tamaño del amplificado. La visualización directa requiere de métodos que "lean" la secuencia del amplificado. Entre estos métodos están cortes con enzimas de restricción, hibridación con sondas específicas (Southern-blot) o secuenciación del producto de PCR. El corte con enzima de restricción consiste en incubar el producto con enzimas de restricción que reconozcan secuencias palindrómicas dentro del producto amplificado y luego visualizarlo por electroforesis. Después de la digestión se observarán dos fragmentos, los que sumados equivaldrán al fragmento del producto sin digestión. La hibridación con sondas es el más utilizado en los kitscomerciales y aunque tradicionalmente consiste en la técnica de Southern-blot, en los métodos comerciales se utiliza el formato ELISA, en el que la sonda esta fijada en los pocillos de la microplaca (Figura 4). La secuenciación (ver más adelante) sólo se ocupa como método de referencia. Uno de los mayores problemas de la amplificación por PCR es la inhibición, esto porque existen numerosos factores que anulan la actividad de la ADN polimerasa.16 En general la proporción de inhibición reportado es de alrededor del 5%, sin embargo, esta varía desde 3% para muestras de sangre periférica hasta 18,5% para muestras de anatomía patológica (tejido fijado en formalina e incluido en parafina) (Tabla 2). Una variación y automatización de la PCR es la amplificación en tiempo real o Light-Cycler System. Esta tecnología desarrollada en 199617, 18 se basa en la emisión de fluorescencia durante la extensión de la ADN polimerasa,19 lo cual permite el monitoreo continuo en cada ciclo de amplificación (Figura 5). Dado que la cantidad de fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de amplificación, este método es ideal para la cuantificación de ADN y ARN. Además una vez generado el producto, es posible monitorear su secuencia dado que la cinética de denaturación / renaturación del producto es secuencia dependiente y por lo tanto no son necesarios métodos adicionales para su visualización.19 En este método también es posible introducir sondas específicas para confirmar el producto amplificado lo cual aumenta su especificidad. Dado que este sistema utiliza tubos capilares, cada etapa de amplificación es significa-tivamente más corta que en la amplificación convencional, reduciendo el tiempo total de amplificación a sólo 30 minutos.20

Figura 3. Efecto de la temperatura de alineamiento en la especificidad de la reacción de polimerasa en cadena. La amplificación se realizó para citomegalovirus (100 copias) en tres condiciones de alineamiento (63, 65 y 68° C). Se observa que a mayor temperatura desaparecen las amplificaciones inespecíficas, quedando sólo la banda específica de citomegalovirus.

Figura 4. Hibridación en microplaca tipo ELISA. Este método de confirmación de la reacción de polimerasa en cadena se basa en etapa 1: unión de la sonda marcada con biotina (B) al pocillo de ELISA a traves de streptoavidina (S), etapa 2: hibridación, del producto amplificado marcado con digoxigenina (D) a la sonda, etapa 3: inmunodetección del producto amplificado por anticuerpos antidigoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina (E) y etapa 4: revelado, en el que se agrega un sustrato el cual precipita generando un color que es visualizado por lectura espectrofotométrica. (Cortesía BIOS-Chile I.G.S.A.)

Amplificación isotérmica

La amplificación isotérmica consiste en convertir, en forma cíclica, una molécula de ARN a ADN doble hebra y a partir de ella, realizar la transcripción a ARN, el cual sirve de templado para un nuevo ciclo de amplificación21,22(Figura 6). En la amplificación isotérmica se requieren dos partidores, que definen el ARN mensajero a amplificar, y uno además contiene una secuencia denominada "promotora" para la enzima que realiza la transcripción (ARN polimerasa). Además de la ARN polimerasa participan otras dos enzimas, la transcriptasa reversa y la ARNasa H (Figura 6). Este método sólo amplifica ARN y su principal aplicación clínica está en el diagnóstico de agentes infecciosos23,24 y la cuantificación de la carga viral de virus ARN (VHB, VHC y VHI).25,26 La cuantificación de ARN se realiza co-amplificando el ARN de la muestra en forma conjunta con calibradores internos o ARN de concentración conocida y se mide mediante electroquimio-luminiscencia.27

Tabla 2. Inhibiciones en amplificación por reacción de polimerasa en cadena

Figura 5. Método de amplificación en tiempo real. Este sistema se caracteriza por la presencia de una sonda doblemente marcada en 5` con un fluoróforo de reporte y en 3` con un fluoróforo de ocultamiento (etapa 1). Durante la extensión, la ADN polimerasa hidroliza esta sonda liberando el fluoróforo de reporte (etapa 2). La cantidad de fluoróforo liberado es proporcional a la cantidad de producto de PCR amplificado.

Figura 6. Método de amplificación isotérmica. En este método, el proceso comienza con la hibridación entre el ARN en estudio y el partidor 1, que contiene el sitio promotor para la ARN polimerasa (etapa 1). A partir de esta hibridación, la transcriptasa reversa genera una hebra simple de ADN, denominado ADN copia (cADN), creando un híbrido ARN: cADN (etapa 2). El ARN de este híbrido es degradado por la ARNasa H, quedando el cADN hebra simple, el cual se une al partidor 2 (etapa 3). A partir de este partidor y por acción de la transcriptasa reversa se

produce la hebra complementaria generando ADN doble hebra. A partir del sitio promotor contenido en el partidor 1, se realiza la transcripción a ARN por la ARN polimerasa (etapa 4) generando múltiples templados de ARN, los cuales son utilizados como templados para repetir el proceso.

Hibridación de ADN ramificado

(Branched DNA)

La metodología de hibridación con ADN ramificado o branched DNA (bDNA) se basa en hibridaciones consecutivas de sondas que reconocen por una parte la secuencia de ADN o ARN en estudio y por otra, secuencias introducidas a la reacción para amplificar la señal de hibridación (Figura 7).28 En este método la visualización del ADN blanco no depende de un proceso enzimático, como en la reacción de polimerasa en cadena, sino de la amplificación de la señal de hibridación. Esta metodología es altamente reproducible y se utiliza clínicamente en la cuantificación de carga génica en pacientes portadores del VIH, VHB y VHC.30, 31

cDNA microarray

La tecnología de cDNA microarray se basa en la incorporación en un chip, similar al utilizado en computación, de 5.000 a 8.000 sondas que representan la totalidad de los genes expresados por un microorganismo.32,33 De este modo se puede identificar los patrones de expresión bacteriana de acuerdo a distintas condiciones fisiológicas o patológicas. El principio de cDNA microarray es la hibridación, pero a diferencia de los métodos tradicionales, se utilizan múltiples sondas, las que unidas a un sistema cuantitativo de análisis, permiten identificar patrones de expresión génica.33 Esta metodología, aunque aún se encuentra a nivel experimental, tiene una proyección tan importante en clínica como la PCR.

Figura 7. Método de ADN ramificado (branched DNA) para cuantificación de ácidos nucleicos. El proceso comienza con la hibridación de las sondas de captura a una fase sólida. A continuación se produce la reacción de hibridación entre las sondas de captura y el ADN o ARN en estudio, lo cual es seguido de la introducción de la sonda de amplificación que contiene múltiples sitios para las sondas de revelado. Estas últimas están conjugadas con moléculas quimioluminiscentes de modo que la cantidad de luz emitida es proporcional a la cantidad de ADN o ARN hibridado.

Figura 8. Potenciales aplicaciones clínicas de la secuenciación de genomas de microorganismos

Secuenciación

Los métodos de secuenciación permiten "leer" el código genético de un microorganismo. Las principales aplicaciones de la secuenciación en Infectología están en la identificación de nuevos patógenos, la caracterización de brotes epidémicos y la identificación de patrones genéticos que determinan la resistencia a terapia.34 Específicamente, la resistencia de la transcrip-tasa reversa y proteasa a fármacos antivirales en pacientes VIH,35 resistencia a ganciclovir en citomegalovirus36 y resistencia a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis,37 son algunas las aplicaciones clínicas más importantes de la secuenciación. Finalmente la secuenciación ha permitido conocer el genoma completo de microorganismos tales como Neisseria menin-gitidis,38M. tuberculosis,39 Clostridium perfrin-gens,40 Streptococcus pyogenes41 y Helicobacter pylori.42 La posibilidad de analizar el genoma completo de micro-organismos está permitiendo estudiar las interacciones microorganismo-huésped y con la ayuda de herramientas computacionales (bioinformática) desarrollar nuevos agentes terapéuticos y vacunas.43