6.2 citoquimica e inmunohistoquimica_pdf ok

LA CITOQUIMICA COMO APOYO AL DIAGNOSTICO

HEMATOLOGICO

B.

LA CITOQUIMICA EN LA HEMATOLOGIA

HISTORIALas primeras observaciones citoquímicas datan de 1830 y no fueron usadas hasta más de un siglo después.

En 1853 Perls hace la demostración histoquímica de la hemosiderina, la que constituye una de las reacciones mas valiosas para el estudio de los síndromes anémicos


HISTORIA

La primera reacción enzimática aplicada a la Hematología fue la de las oxidasas y peroxidasas, que adquirió reconocido prestigio en la diferenciación entre células mieloides y linfoides


GENERALIDADES:

La mayorìa,son tècnicas que derivan de modificaciones de tècnicas histoquìmicas.

Nexo entre morfología y bioquímica

Conjuga forma y funciòn.

Brinda resultados de ìndole cualitativo o semicuantitativo.

Apoyo para el diagnòstico de las distintas hemopatìas.


La citoquìmica estudia la composiciòn quìmica de la cèlula

hematopoyética , permitiendo detectar y precisar la localizaciòn topogràfica de diversas sustancias al interior de esta, sean principios inmediatos, enzimas o compuestos inorgánicos, por medio de mètodos tintoriales que permiten la formaciòn de productos coloreados visibles al microscopio òptico.


Es la reacción que por el empleo de uno o más reactivos químicos aplicados a la célula, en condiciones definidas, determina la formación de productos coloreados, insolubles, no difusibles, que permiten el reconocimiento microscópico de sustancias o grupos químicos definidos en su real ubicación citológica, para lo cual no deben destruir la célula o si lo hacen, deben reemplazar la sustancia identificada en su topografía.


FINALIDAD

Reconocimiento y diagnostico celular

Estudio de la fisiología y fisiopatología celulares

Diagnóstico de la patología

LA CITOQUIMICA EN LA HEMATOLOGIAPASOS FUNDAMENTALESA-. Fijaciòn de la extensiòn para preservar las estructuras y

reactividad funcional celulares, evitando fenómenos nocivos para las mismas e impidiendo también la difusión de componentes bioquímicos entre los diferentes compartimientos celulares, así como al medio extracelular.

Existen diversos fijadores: metanol, etanol, acetona, glutaraldehido, formaldehido, etc.

B-.Incubaciòn en el medio de reacción, como consecuencia se liberan productos que por si mismos o al combinarse con otra sustancia presente, dan lugar a un precipitado visible en el lugar de la reaccíón.

C-.Contraste: para resaltar en lo posible el producto de reacción y permitir una óptima visualización del núcleo y de citoplasma.


REQUISITOS PARA UNA REACCION CITOQUIMICA: Los reactivos empleados deben ser asequibles y exentos

de toxicidad. Reacciones deben ser suficientemente sensibles y

especìficas para una lìnea celular. Reacciones deben ser reproducibles. Reacciones no deben ser influenciadas por las condiciones

ambientales.Muestras recientes y en lo posible sin anticoagulante.Interpretación del resultado lo màs objetiva posible.


REQUISITOSDebemos tener exigencia con el material de trabajo a fin deevitar: Falta de reproducibilidad. Falsos positivos por artefactos de difusión. Falsos negativos por contacto con inhibidores (diversos anticoagulantes) o por preparaciones envejecidas.Obligatoriamente deben intercalarse controles positivos y

negativos.Rigurosismo técnico extremo.


ESTANDARIZACION DEL METODO Fundamental para la uniformidad en la lectura e interpretación. Se debe establecer como norma general:

- Preparación de los reactivos con productos de calidad probada.- Práctica permanente de las reacciones con preparados testigo.- Fijación y conservación adecuada de los preparados.- Determinación de tiempos exactos para cada uno de los casos.- Determinación de temperaturas exactas ( en especial para los métodos enzimáticos).- Tipo y condiciones de la inmersión para la lectura.- Conservación idónea de los elementos sobre los cuales se realiza

la determinación.


EMPLEO DE KITS PARA CITOQUIMICA-Son de marcas reconocidas y dan buenos resultados cuando se les usa según las indicaciones y dentro de los tiempos indicados.-Los costos en comparación con los reactivos preparados en el propio laboratorio, son equivalentes y a veces menores , en centros que tienen suficiente demanda de pruebas.-Sin embargo, para un adecuado aprendizaje el usuario debe conocer la preparación de los reactivos, en forma previa al uso del kit, lo cual le dará un conocimiento más profundo de las reacciones y de las causas de falla o error de estos.


¿QUE MUESTRAS PODEMOS USAR?

* Frotices de sangre perifèrica.* Extensiones de mèdula òsea.* Improntas de tejidos.* Muestras delìquidos biològicos obtenidas por

citocentrifugación.


COMPUESTOS A ESTUDIAR-Carbohidratos, detectados mediante la reacción de ácido peryódico de Schiff o reacción de PAS.-Enzimas oxidantes, evidenciadas mediante la reacción de la peroxidasa.-Enzimas hidrolíticas, como las fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, beta glucoronidasa,esterasas, etc.-Lípidos, detectados con la reacción de Sudan Black.-Componentes inorgánicos, fundamentalmente hierro, puesto de manifiesto mediante la reacción de azul de Prusia o de Perls .


IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOSREACCION DEL ACIDO PERYODICO DE SCHIFF (PAS) FUNDAMENTO:El ácido periódico oxida carbohidratos (glicoles) y componentes similares, rompe el enlace entre los átomos de carbono transformando los grupos OH en aldehídos, los que reaccionan con el reactivo de Schiff (leuco-fucsina), liberando fucsina y tiñendo los componentes celulares que contienen los compuestos oxidados. Una variedad de compuestos intracelulares reacciona con el PAS; pero el glucógeno es el componente principalmente reaccionante.


REACCION DEL ACIDO PERYODICO DE SCHIFF (PAS) INTERPRETACION:(+) : Toda la serie linfoide con un patròn de distribuciòn

intracitoplasmàtico de tipo granular fino ,mediano o grueso.

(+) : Los neutrófilos y eosinófilos en todos sus estadíos de desarrollo y con mayor intensidad en el estadío maduro, de distribuciòn homogènea difusa .

(+) : Serie monocìtica con patrón de distribución homogéneo o mixto.

(+) : Megacariocitos y plaquetas patrón granular difuso (- ) : Serie eritroide


REACCION DEL ACIDO PERYODICO DE SCHIFF (PAS)APLICACION Eritroleucemia: eritroblastos y eritrocitos anormales

positivos. Transtornos madurativos de serie eritroide presentan

precursores positivos. Células linfoides neoplásicas de leucemias linfáticas

crónicas y linfomas no Hodgkin pueden exhibir intensa positividad.

Se usó para la diferenciación de diferentes tipos de leucemias linfoblásticas (FAB).

PAS ( + )

PAS (+)


IDENTIFICACIÒN DE ENZIMAS OXIDANTES

MIELOPEROXIDASA: Introducida en 1918,fue la primera reacciòn citoquìmica usada.

FUNDAMENTO : La demostraciòn de esta enzima localizada en los grànulos

azuròfilos, se basa en su acciòn oxidante sobre el sustrato, la bencidina, en presencia de H2O2.

La positividad de la reacciòn se pone de manifiesto por la apariciòn de un precipitado pardo-oscuro en el citoplasma celular.


MIELOPEROXIDASAINTERPRETACIÒN:

(+) : Serie neutròfila en todos sus estadìos de desarrollo.(++) : Eosinófilos(+/d+/-) : Serie monocìtica (-) : Linfocitos y eritrocitos (-) : Basòfilos maduros de individuos normales (-) : Megacariocitos y plaquetas (demostrable solo por citoquímica ultraestructural)


MIELOPEROXIDASAAPLICACIÓN• Diferenciación de celularidad blástica mieloíde (+) y

linfoíde (-)• En las leucemias mieloides la mayoría de los blastos

(+/- 85%) y los promielocitos son positivos.• Los cuerpos de Auer también son positivos.• En las leucemias monocíticas, los blastos y monocitos

precursores son dèbilmente positivos a negativos.• En eritroleucemias los precursores eritroides son

negativos• En leucemias megacariocíticas sòlo es demostrable por

microscopía electrònica.


MIELOPEROXIDASAAPLICACIÓN

• En síndromes mielodisplásicos, leucemias mieloides agudas y leucocitosis debida a infecciòn, los neutròfilos pueden mostrar una disminuciòn de la actividad peroxidàsica.

• En leucemia mieloide crónica tambièn hay disminuciòn de la actividad.

• Existen también raros casos de deficiencia congénita de mieloperoxidasa.

PX ( + )

PEROXIDASA (-)

.PEROXIDASA(+)

.MPO (+)


IDENTIFICACION DE ENZIMAS HIDROLITICASFOSFATASA ACIDA

FUNDAMENTO:

Es una enzima hidrolìtica de localización lisosómica del grupo de las fosfoesterasas, que provoca la hidrolisis del sustrato a pH ácido, liberando productos intermedios, que al unirse con la sal diazoica dan un precipitado rojo-naranja en el citoplasma celular.

LA CITOQUIMICA EN LA HEMATOLOGIAFOSFATASA ACIDA INTERPRETACION

(++) : Osteoclastos , macròfagos. (+) : Plasmocitos, megacariocitos, monocitos ( - /+) : Neutròfilos y sus precursores ( - /+) : Eritroblastos ( - /++) : Linfocitos normales


FOSFATASA ACIDA APLICACIÓN Diagnóstico diferencial de sìndromes linfoproliferativos

agudos y crònicos: reacción positiva polar en los de fenotipo T y reacción positiva multifocal en los de fenotipo B, donde tiende a descender la actividad.

En las patologías anteriores la fosfatasa es tartrato sensible.

Es tartrato resistente en las leucemias de células peludas (tricoleucemias), donde es de utilidad para el diagnóstico diferencial.


IDENTIFICACION DE ENZIMAS HIDROLITICASFOSFATASA ALCALINA LEUCOCITARA (FAL)

FUNDAMENTO: Es una enzima que se encuentra en los grànulos

secundarios de los neutrófilos y se localiza en ellos desde el metamielocito hasta el estadío segmentado.

Hidroliza monoésteres de ácido fosfórico, siendo activa a pH alcalino (9,1-9,6) liberando productos intermedios los cuales combinados con una sal diazoica originan un precipitado coloreado en el citoplasma de la cèlula.

LA CITOQUIMICA EN LA HEMATOLOGIAFOSFATASA ALCALINA (FAL) INTERPRETACION

(+) : Neutrófilos desde metamielocitos hasta las formas segmentadas. (-) : Todas las demás células de sangre periférica y médula ósea


FOSFATASA ALCALINA (FAL) INTERPRETACION OBTENCION DEL SCORE LAPA

Se realiza el conteo de 100 células polimorfonucleares maduras o las células en banda.

Se asigna 5 grados de reacciòn:

0+ : No hay reacciòn

1+ : Escasa presencia de precipitado visible

2+ : Reacciòn moderada

3+ : Reacciòn fuerte

4+ : Reacciòn muy fuerte, precipitado cubre casi toda la

superficie celular.

FOSFATASA ALCALINA (FAL)OBTENCION DEL SCORE LAPA

Se establece el ìndice de FAL o score LAPA:* Multiplicando el nùmero de cèlulas contadas por su grado

de intensidad.* Luego se suman los valores obtenidos.* Valor normal promedio varía deacuerdo a cada laboratorio

y al cromògeno usado: Fast Red Violet = 20-146 Fast Blue BB = 25-180



FOSFATASA ALCALINA (FAL)

INTERPRETACION:El test es óptimo en sangre periférica y debe realizarsedentro de las 48 horas.

Los extendidos pueden congelarse por dos a tres semanascon una pequeña pérdida de la actividad


FOSFATASA ALCALINA (FAL)

APLICACION:* La determinaciòn semicuantitativa de FAL permite el diagnòstico diferencial de diversas hemopatìas.* La mayor utilidad está en la diferenciaciòn de leucemia

mieloide crónica, donde el score es bajo versus las reacciones leucemoides en respuesta a una infección y otros transtornos mieloprolifereativos crónicos, que presentan un score elevado , aunque no es 100% específico.

1 + 2 +

3 + 4 +

ESTERASAS: FUNDAMENTO: Son enzimas de localización no lisosómica que

hidrolizan los ésteres de cadena corta de los ácidos grasos.

Actúan sobre un sustrato sintético liberando naftol, el cual se acopla a la sal diazoica formando un precipitado citoplasmático altamente coloreado.


ESTERASAS:

Existen varias clases de esterasas . Se diferencian por: Sustrato donde actúan Los niveles òptimos de pH


ESTERASAS:ESTERASAS ESPECIFICASCLOROACETATO ESTERASA (CAE)

Su sustrato: Naphthol-AS-D-cloroacetato


ESTERASAS:ESTERASAS ESPECIFICASCLOROACETATO ESTERASA (CAE)INTERPRETACION:(++) : Casi exclusiva de toda la serie neutrofílica, células cebadas .( - ) : Eosinòfilos, monocitos maduros (+) : Cuerpos de Aûer


ESTERASAS ESPECIFICAS:CLOROACETATOESTERASA (CAE) APLICACIÓN:

El CAE no es tan sensible como la MPO para la detecciòn de las etapas tempranas de la diferenciaciòn granulocìtica, por lo que los blastos mieloides más inmaduros pueden ser negativos.


CAE (+)

ESTERASASESTERASAS INESPECIFICASTenemos:

* Alfa-naftil-acetato esterasa (ANAE) * Alfa-naftil-butirato esterasa (ANBE) * Naftol-AS-D-acetato esterasa (NASDA) * Naftil-AS-acetato esterasa (NASA)



ESTERASAS INESPECIFICAS:INTERPRETACIONCon cualquiera de ellas, màs frecuentemente con el ANAE, se demuestra la existencia de esterasas inespecìficas en pràcticamente todas las cèlulas de las tres series hematopoyèticas, pero con mucha mayor intensidad en los monocitos

ESTERASAS:ESTERASAS INESPECIFICASINTERPRETACIONLa reacción positiva en los monocitos escaracterísticamente inhibida por la adición defluoruro de sodio al medio de incubación.

Permiten diferenciar los mieloblastos ypromielocitos de los monoblastos ypromonocitos.



ESTERASAS: ESTERASAS INESPECIFICASAPLICACIONPermiten diferenciar los mieloblastos y demás elementos de la serie granulocítica que no presentan fluorosensibilidad de los monoblastos y promonocitos cuya reactividad es fluorosensible.

ANAE (+)

ANBE(+)

IDENTIFICACION DE LIPIDOS:TINCION DEL NEGRO SUDAN BFUNDAMENTO: Se basa en la solubilidad del colorante empleado e los lìpidos. Tiñe grasas neutras, fosfolìpidos y esteroles. Tambièn colorea componentes celulares no lipìdicos tales como grànulos azuròfilos especìficos y cuerpos de Auer.



TINCION DEL NEGRO SUDAN B:INTERPRETACION

La sudanofilia es equivalente a la reacciòn de la mieloperoxidasa.


TINCION DEL NEGRO SUDAN B :APLICACION

Distingue la celularidad blástica mieloíde (+) de la linfoíde (-).


COMPONENTES INORGANICOS:REACCIÓN DE AZUL DE PRUSIA O DE PERLSFUNDAMENTO El hierro de depósito se encuentra en el interior de las células en forma de agregados de hemosiderina detectable por la reacción de Perls.

Esta se basa en la acción del ácido clorhídrico para liberar los iones férricos, que reaccionan con el ferrocianuro de potasio dando un precipitado azul verdoso de ferrocianuro férrico.


REACCIÓN DE AZUL DE PRUSIA O DE PERLS:INTERPRETACION En condiciones normales se observan los gránulos

hemosiderínicos en los eritroblastos (sideroblastos).

Igualmente en algunos eritrocitos (siderocitos) y macrófagos de la médula ósea, hìgado y bazo.

En condiciones normales se ve un 30-60% de sideroblastos con 1 a 4 gránulos en la superficie del citoplasma.


REACCIÓN DE AZUL DE PRUSIA O DE PERLS:INTERPRETACION Un nùmero mayor indica disfunción del metabolismo del

hierro. Ello puede conducir al depósito de este en las

mitocondrias,característico de una anemia refractaria sideroblástica.

Los depòsitos de hemosiderina pueden informarse como (+) , (-) o en porcentaje.

.


REACCIÓN DE AZUL DE PRUSIA O DE PERLS: APLICACION Sirve para diagnosticar anemias carenciales y síndromes

mielodisplásicos.

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