5. manual de bacter i

1

MANUAL DE LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA I

AUTORES:

M.C. REYNA DEL CONSUELO ALMIRAY PINZÓN

M.C. GLORIA LEÓN TELLO

M.C. ALMA LÓPEZ GARCÍA

M.C. MARÍA SUSANA PERÉZ FERNÁNDEZ

M.C. PATRICIA GUADALUPE SUÁREZ ALBORES

D.C. FAUSTO TEJEDA TRUJILLO

M.S.P. CLAUDY LORENA VILLAGRÁN PADILLA

BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

2

ÍNDICE

NÚMERO DE

PRÁCTICA

TÍTULO PÁGINA

Práctica 1

Aplicación de los criterios de Cowan y Steel para

la identificación de bacterias

3

Práctica 2

Caracterización de bacterias no fermentadoras 8

Práctica 3

Caracterización del género Pseudomonas

13

Práctica 4

Caracterización del género Haemophilus 15

Práctica 5 Caracterización del género Brucella 17

Práctica 6 Caracterización de bacterias de los géneros

Neisseria y Moraxella

19

Práctica 7

Caracterización de enterobacterias: lactosa

positivas

21

Práctica 8

Caracterización de enterobacterias: lactosa

negativas

25

Práctica 9

Caracterización del género Vibrio

28

Práctica 10 Caracterización de bacterias de los géneros

Streptococcus y Enterococcus

30

Práctica 11

Caracterización de bacterias del género

Staphylococcus

33

Práctica 12

Caracterización de bacilos Grampositivos: Bacillus 36

Bibliografía 38

3

PRACTICA No.1

APLICACIÓN DE LOS CRITERIOS DE COWAN Y STEEL PARA LA

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

Introducción

La identificación de una bacteria es la asignación a un taxón según una clasificación dada y

consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la comparación de

estas características con los diferentes taxones de la clasificación considerada. Las características

a determinar y su número depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en

la identificación.

Cowan y Steel establecen un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las

cuales se puede determinar el género, grupo de géneros o en algún caso, familia a la que

pertenece un aislamiento. Dichas pruebas son:

1.- Tinción de Gram.

2.- Tinción de Shaeffer-Fulton (sólo en caso de tener bacilos Grampositivos (BGP)).

3.- Tinción de Ziehl-Neelsen (sólo en caso de tener bacilos BGP).

4.- Metabolismo (Oxidativo/Fermentativo/Inerte).

5.- Producción de catalasa.

6.- Producción de oxidasa.

7.- Movilidad.

8.- Crecimiento de aerobios.

9.- Crecimiento de anaerobiosis.





4

10.- Producción de ácido a partir de glucosa.

También se pueden incluir pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie.

Estas dependerán del género o familia determinado. (ejem. producción de pigmentos, producción

de indol a partir de triptófano, producción de coagulasa, de fenilalanina desaminasa, etc.)

Objetivo

Realizar tomando como base los criterios establecidos por Cowan y Steel, las pruebas

bioquímicas fundamentales, que permiten la identificación presuntiva de las bacterias de interés

médico.

Material

Equipos de tinción de Gram Tubos con O/F con glucosa

Sensidiscos de oxidasa Placas con agar nutritivo o soya tripticasa

Reactivo para catalasa

Portaobjetos

Benzal

Algodón

Cepas de bacilos gramnegativos fermentadores y no fermentadores

Metodología

Tomar una cepa problema a la cual se le realizará lo siguiente:

1. Inocular por estría cruzada una placa de agar nutritivo, incubar a 37°C durante 24 h.

2. De una colonia aislada realizar la tinción de Gram (ver figura 1)

Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriológica una

pequeña muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un

portaobjetos. Extender esta suspensión y dejar secar.

Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero.

Cubrir el frote con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el colorante

y lavar con chorro suave de agua corriente.

Cubrir el frote con lugol, dejarlo actuar por un min. Escurrir y lavar.

http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html

http://bilbo.edu.uy/~microbio/coagulasa.html

http://bilbo.edu.uy/~microbio/fala.html

5

Decolorar el frote con alcohol-acetona, de 5-30 seg. Escurrir y lavar.

Cubrir el frote con safranina y dejarlo actuar por 30 seg. Escurrir y lavar.

Dejar secar al aire.

Observar el frote con objetivo de inmersión.

Determinar la morfología microscópica y la respuesta a la Tinción de Gram de cada

cepa empleada.

Figura 1.Esquema y fundamento de tinción de gram

3. De una colonia aislada hacer la tinción de Shaeffer-Fulton (sólo en caso de tener BGP)

(ver Figura 2).





Cubrir el frote con verde de malaquita a emisión de vapores y dejarlo actuar por un

minuto. Escurrir el colorante y lavar con chorro suave de agua corriente.

Cubrir el frote con safranina, como colorante de contraste dejarlo actuar por 1 min.

Escurrir y lavar.

Observar el frote con objetivo de inmersión y dibújala

6

Figura 2.Esquema y fundamento de tinción de Shaeffer y Fulton

4. De una colonia aislada realizar la tinción de Ziehl-Neelsen (sólo en caso de tener BGP)

(ver Figura 3).





Cubrir el frote con fucsina fenicada a emisión de vapores durante 5 min. Escurrir el

colorante y lavar con chorro suave de agua corriente, no permitir que se seque el

colorante

Decolorar con alcohol-ácido durante 7 min. Enjuagar con agua el portaobjetos y

quitar el exceso.

Aplicar azul de metileno durante 1 min, volver a enjuagar con un leve chorro de agua

e inclinar el portaobjetos hasta drenar el exceso de agua y secar al aire.

Colocar una pequeña gota de aceite de inmersión y observar al microscopio con 100x

7

Figura 3.Esquema y fundamento de tinción de Gram

5. Inocular por picadura el medio O/F e incubar a 37°C por 24 h (ver figura 4)

Figura 4. Metabolismo bacteriano en medio O/F

6. Inocular por picadura el medio MIO e incubar a 37°C por 24 h, si se observa turbidez en

el tubo será movilidad positiva y movilidad negativa cuando crece únicamente en la estría

7. Inocular por picadura una base de CTA con un carbohidrato e incubar a 37°C por 24 h, si

se observa vire a color amarillo será positivo a formación de ácido a partir de glucosa.

8. Del crecimiento en placa realizar las pruebas de oxidasa y catalasa.

9. Comparar los resultados en la tabla 1 e identificar familia o género.

8

Tabla 1. Identificación de bacterias heterótrofas según Cowan y Steel

Tinción de Gram

(cultivo fresco) + + + + + + + + – – – – –

Forma coco Coco coco coco bastón bastón bastón bastón bastón bastón bastón bastón coco

Agrupación racimos Racimos cadenas tetradas pares

Crecimiento aerobio

+ + + + + – + + + + + + +

Crecimiento anaerobio

– + + + + + + – – – + + –

Esporas – – – – – + + + – – – – –

Movilidad – – – – – + o – + o – + o – + o – + o – + o - + –

Catalasa + + – – – – + + + + + + +

Oxidase + + – + +

Fermentación de

glucosa a acido o a acido+gas

– + + + + + (o –) + – – – + + –

O/F – O F F O

Micrococcus X

Staphylococcus X

Streptococcus X

Lactococcus X

Enterococcus X

Leuconostoc X

Pediococcus X X

Aerococcus X

Lactobacillus X

Clostridium X

Bacillus X X

Alcaligenes X

Pseudomonas X

Enterobacterias X

Aeromonas X

Chromobacterium X

Neisseria X

Fuente: 3

Cuestionario:

1. ¿Cuál es la importancia de los criterios de Cowan y Steel?

2. ¿Para qué sirve la tinción de Ziehl-Neelsen y cuál es su fundamento?

3. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de oxidasa y de catalasa y cómo se realiza en el

laboratorio?

9

4. ¿En qué medios se puede realizar la prueba de movilidad y cómo se interpreta?

5. Dé cada uno de los criterios de Cowan y Steel efectuados a la cepa de estudio durante la

práctica, realiza dibujos y menciona tus resultados.

10

PRACTICA No. 2

CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS NO FERMENTADORAS

Introducción

Este grupo abarca microorganismos aerobios, no esporulados, que no utilizan a los carbohidratos

como fuente de energía o los utilizan a través de vías metabólicas diferentes a la fermentación.

La importancia de estas bacterias radica fundamentalmente en su capacidad para infectar

hospederos inmunocomprometidos, por lo que cobran especial interés a nivel intrahospitalario,

donde además es común la presencia de cepas con marcadas características de resistencia a los

antimicrobianos de uso convencional. Dentro de este grupo se encuentran los siguientes géneros:

Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Alcaligenes, Flavobacterium, Agrobacterium, entre

otros.

Algunos de los indicios tempranos para detectar a un microorganismo no fermentador

serían los siguientes:

1. Falta de evidencias de fermentación de la glucosa.

2. Positiva la prueba de oxidasa.

3. Carencia de crecimiento en el agar de Mac Conkey.

En la rutina bacteriológica es necesario rapidez y bajo costo en la identificación de este

grupo de bacterias, por lo que se sugiere se siga el esquema de King-Weaver para su

identificación, el cual se basa en 4 pruebas (ver tabla 2):





11

1. Utilización de glucosa (fermentador (F), oxidador (O) o no sacarolítico (NS)).

2. Capacidad de crecer en Mac Conkey.

3. Producción de citocromo oxidasa.

4. Movilidad.

Tabla 2. Características de algunos géneros gramnegativos no fermentadores

GÉNERO METABOLISMO MOVILIDAD OXIDASA

CREC

MAC

CONKEY

OTRAS

CARACTERÍSTICAS

Pseudomonas O

+

flagelos polares

+ + Desnitrifican nitratos

a N2

Acinetobacter O ó NS

-

- + Parecen diplococos

Flavobacterium O

V

algunos

presentan

flagelos

perítricos

+ Escaso o

negativo Requieren complejo B

Bordetella O V + Escaso o

negativo

Requiere factores de

crecimiento

Moraxella O ó NS - + Escaso o

negativo

Cocobacilar, difícil de

crecer.

Stenotrophomonas O +

un solo flagelo - +

Prueba de DNasa +

Producción de ácido a

partir de O/F con

maltosa

Alcaligenes O ó NS

+

flagelos

perítricos

+ - Aerobio estricto

Fuente: 3

Objetivo

Comprobar por medio de análisis de laboratorio, el comportamiento característico de cepas

bacterianas no fermentadoras de carbohidratos.

Material


Sensidiscos de oxidasa Placas con agar sangre de carnero

Reactivo para catalasa Placas con agar Mac Conkey

Portaobjetos Tubos con Medio MIO

12

Benzal

Algodón

Caldos con BGNnF

Metodología

1.- Sembrar por estría cruzada los medios en placa, procurando perforar el medio en la parte del

estriado masivo, en el caso del agar sangre carnero.

2.- Sembrar por picadura los medios O/F y MIO.

3.- Incubar 24 h a 37° C.

4.- Leer morfología colonial.

5.- Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tinción de Gram.

6.- Leer pruebas bioquímicas.

Cuestionario:

1. ¿Por qué es importante identificar a los BGNnF y qué géneros conforman dicho grupo?

2. ¿Cuáles son las pruebas claves para sospechar de un BGNnF?

3. Mencione un esquema diferente al de King-Weaver para identificar a los BGNnF

4. ¿De los BGNnF que géneros dan la prueba de oxidasa negativa, quiénes movilidad

negativa y quiénes son capaces de crecer en Mac Conkey?

5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos:

a) Morfología colonial

b) Tinción de Gram

c) Pruebas de catalasa y oxidasa

d) Pruebas bioquímicas

e) Establecer si la cepa pertenece al grupo de BGNnF

13

PRÁCTICA No.3

CARACTERIZACIÓN DEL GÉNERO Pseudomonas

Introducción

Este género se encuentra ubicado dentro del grupo de BGNnF y ocupa dentro de éstos, el primer

lugar como agente causal de infecciones intrahospitalarias, resaltando la capacidad de resistencia

presente en algunas cepas a desinfectantes elaborados a partir de sales cuaternarias de amonio.

De las especies que integran este género destacan: Pseudomonas aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps.

alcaligenes, Burkholderia cepacia (anteriormente llamada Pseudomonas cepacia). Siendo en el

ambiente clínico P. aeruginosa la especie aislada con mayor frecuencia (ver tabla 3).

Tabla 3. Características importantes del grupo fluorescente

Objetivo

Demostrar las particularidades bioquímicas y de cultivo del género Pseudomonas.

Material


Sensidiscos de oxidasa Placas con agar sangre de carnero

Prueba Pseudomonas

aeruginosa

Pseudomonas

fluorescens

Pseudomonas

putida

Piocianina + - -

Pioverdina + + +

Reducción de nitratos V (74 %) V (19 %) -

Desarrollo a 42 °C + - -





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Reactivo para catalasa Placas con agar Mac Conkey

Portaobjetos Tubos con agar MIO

Benzal Tubos con agar Seller’s

Algodón

Cepas con diferentes especies de Pseudomonas

Metodología

1. Sembrar por estría cruzada los medios en placa, procurando perforar el medio en la parte

del estriado masivo, en el caso del agar sangre carnero.

2. Sembrar por picadura los medios O/F y MIO.

3. Sembrar por picadura y estría el medio Seller’s.

4. Incubar 24 h a 37° C.

5. Leer morfología colonial.

6. Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tinción de

Gram.

7. Leer pruebas bioquímicas e identificar especie utilizando la tabla 3.

Cuestionario

1. ¿Cuál es la importancia del género Pseudomonas?

2. ¿Qué pruebas de laboratorio permiten diferenciar una enterobacteria del género

Pseudomonas?

3. ¿Para qué es útil el medio O/F y cuál es su fundamento?

4. ¿Por qué es importante utilizar el medio Seller´s, en la identificación de Pseudomonas?

5. ¿Qué pruebas de laboratorio son útiles para diferenciar especies de Pseudomonas?

15

PRÁCTICA No. 4

CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS DEL GÉNERO Haemophilus

Introducción

Los miembros del género Haemophilus son bacilos gramnegativos pequeños, inmóviles, que

requieren de factores de crecimiento presentes en la sangre como el factor X, que es un grupo de

compuestos tetrapirrólicos termoestables, como la hemina. Mientras que el factor V, es el

dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD). Estos dos factores están contenidos en los

eritrocitos, por lo tanto el agar chocolate es un buen medio de cultivo para la recuperación de

Haemophilus. Las especies de Haemophilus humanos, están vinculadas en su mayoría con

infecciones del tracto respiratorio superior a excepción de H. ducreyi que es un patógeno de

tracto genital.

Objetivo

Identificar el género Haemophilus

Material

Equipos de tinción de Gram Placas de agar chocolate

Sensidiscos de oxidasa Placas con agar soya tripticasa

Reactivo para catalasa Sensidiscos con factores V y X

Portaobjetos Benzal

Algodón Cepas de Haemophilus spp

Placas con agar sangre de carnero

Tubos con medio urea





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Metodología

1. Sembrar por estría cruzada una placa de agar chocolate.

2. Incubar 48-72 h a 37° C.



Gram.

5. Realizar pruebas de identificación de especie en agar soya tripticasa con sensidiscos

impregnados de los factores V y X.

Cuestionario:

1. ¿Cuál es la importancia clínica de Haemophilus?

2. ¿Existe algún agar comercial para el aislamiento de Haemophilus?

3. Menciona la(s) especies de Haemophilus que requieran el factor V, la(s) que requiera el

factor X y la(s) que requiera ambos factores.

4. ¿Cómo definen Cowan y Steel a éste género?

5. ¿Existe otras pruebas en la actualidad más rápidas que el cultivo convencional para el

diagnóstico de Haemophilus?

17

PRÁCTICA No. 5

CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS DEL GÉNERO Brucella

Introducción

El género Brucella abarca un grupo de microorganismos que son cocobacilos diminutos de

tinción débil, considerados como parásitos intracelulares facultativos y desarrollo lento en agar

sangre. Son responsables de la brucelosis, considerada enfermedad zoonótica, que se adquiere por

estar en contacto con animales infectados o por la ingesta de productos lácteos no pasteurizados,

la cual es difícil de diagnosticar, debido al amplio espectro de manifestaciones clínicas asociadas.

Se conocen pocas especies de Brucella, con ligera especificidad del huésped: B.

melitensis infecta cabras y ovejas, B. abortus infecta vacas, B. suis infecta cerdos, B. ovis infecta

ovejas y B. neotomae infecta cerdos.

Objetivo

Identificar al género Brucella.

Material

Equipos de tinción de Gram.

Sensidiscos de oxidasa .

Reactivo para catalasa.

Cepas de Brucella spp.

Botellas para hemocultivo

Placas de agar sangre





http://es.wikipedia.org/wiki/Cabra

http://es.wikipedia.org/wiki/Oveja

http://es.wikipedia.org/wiki/Vaca

http://es.wikipedia.org/wiki/Cerdo

http://es.wikipedia.org/wiki/Oveja

18

Tubos para prueba de urea

Colorantes fucsina básica, tionina y azul de tionina.

Metodología

1. Sembrar en botellas para hemocultivo.

2. Incubar a 35° C durante 4-6 semanas.

3. Hacer subcultivos en agar sangre y chocolate.

4. Identificar especies, mediante pruebas bioquímicas como necesidad de CO2, producción

de ureasa y sensibilidad a los colorantes fucsina básica, tionina y azul de tionina.

Cuestionario:

1 ¿Cuál es la importancia clínica del género Brucella?

2 ¿Qué especies de Brucella requieren CO2 para crecer, cuales producen H2S y cuales

ureasa?

3 ¿Cuál es la dosis infectiva de Brucella?

4 ¿Qué daño les puede causar Brucella a las vacas?

5 ¿En qué consiste la prueba de Rosa de Bengala?

19

PRÁCTICA No.6

CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS DE LOS GÉNEROS Neisseria y

Moraxella

Introducción

Los miembros del género Neisseria son microorganismos gramnegativos cocoides o baciliares

que pueden encontrarse en pares o en cadenas cortas. Son inmóviles, no forman esporas y

producen ácido a partir de carbohidratos lo que permite identificar especies. Neisseria

gonorrhoeae es la especie de importancia en salud publica ya que se adquiere por transmisión

sexual.

Neisseria catarrhalis ahora conocida como Moraxella catarrhalis, puede ser responsable

de infecciones respiratorias principalmente en niños y ancianos, crece en agar chocolate y agar

nutritivo, no produce ácido a partir de glucosa, maltosa, fructosa, sacarosa no lactosa.

Objetivo

Identificar los géneros Neisseria y Moraxella.

Material

Equipos de tinción de Gram Placas de agar Thayer-Martin

Sensidiscos de oxidasa Placas con agar chocolate

Reactivo para catalasa Placas con agar nutritivo

Portaobjetos Benzal

Algodón Placas con agar DNAsa

Cepas de Neisseria spp





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Cepas de Moraxella spp.

Tubos con CTA con diferentes carbohidratos

Metodología

Para Neisseria

1. Sembrar una placa de Thayer-Martin en forma de Z y luego estriar.

2. Incubar 24-48 horas a 37° C.



Gram.

5. Realizar pruebas de identificación de especie en bases de CTA con diferentes

carbohidratos.

Para Moraxella

1. Sembrar en agar chocolate y agar nutritivo.

2. Incubar 24-48 horas a 37° C.


4. Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa, tinción de Gram

y DNAsa.

Cuestionario:

1. ¿Cuál es la importancia clínica de Neisseria gonorrhoeae?

2. ¿Qué tipo de medio es el Thayer-Martin?

3. Menciona las especies de Neisseria y su comportamiento frente a los diferentes

carbohidratos.

4. ¿Cuál es la importancia clínica de Moraxella catarrhalis?

5. ¿Qué tipo de muestra debe utilizarse para la búsqueda de Neisseria gonorrhoeae y cual

para Moraxella catarrhalis?

21

PRÁCTICA No.7

CARACTERIZACIÓN DE ENTEROBACTERIAS: LACTOSA POSITIVAS

Introducción

La familia Enterobacteriaceae está conformada por un número importante de especies, que

incluyen bacilos gramnegativos, con metabolismo fermentador, anaerobios facultativos, catalasa

positivos, oxidasa negativos, la mayoría son móviles, reducen los nitratos a nitritos, y no

presentan condiciones nutritivas exigentes, crecen muy bien en agar Mac Conkey.

La familia Enterobacteriaceae tiene como nicho ecológico el tracto intestinal de gran

variedad de seres vivos, incluyendo al hombre, lo cual facilita su presencia prácticamente en todo

lugar. La mayoría de las enterobacterias son parte importante de la microbiota intestinal,

comportándose como patógenos solo en el caso de pacientes inmunocomprometidos (patógenos

oportunistas).

Con el objeto de facilitar la caracterización de esta familia se ha dividido con base a la

capacidad de fermentar lactosa en dos grupos: lactosa positivos, los que la fermentan y los lactosa

negativos los que no poseen el sistema enzimático que les permite llevar a cabo el proceso.

También es necesario el empleo de pruebas bioquímicas y fisiológicas para establecer el grupo

bacteriano.

La fermentación bacteriana de la lactosa es más compleja que la de la glucosa. La lactosa

es un disacárido compuesto por glucosa y galactosa, unidas entre si por un enlace glucosídico.

Para que una bacteria pueda metabolizar a la lactosa debe tener a la enzima beta-galactósido





22

permeasa, que transporta a la lactosa al interior de la bacteria y la beta-galactosidasa, necesaria

para hidrolizar el enlace glucosídico y liberar a la glucosa y galactosa, finalmente la glucosa entra

a la ruta de Embden-Meyerhof para la formación de ácidos mixtos los cuales pueden ser

detectados en un medio de cultivo con un indicador de pH (ver tabla 4).

Objetivo

Determinar por medio de ensayos de laboratorio las características bioquímicas que definen a la

familia Enterobacteriaceae y a las enterobacterias lactosa positivas.

Material

Equipos de tinción de Gram Placas de agar Mac Conkey

Sensidiscos de oxidasa Placas con agar EMB

Reactivo para catalasa Benzal

Portaobjetos

Algodón

Cepas de Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter.

Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CITRATO Y UREA para pruebas bioquímicas.

Metodología

1. Sembrar por estría cruzada placas de Mac Conkey y EMB.

2. Inocular pruebas bioquímicas.

3. Inocular galerías.

4. Incubar.

5. Leer morfología colonial, pruebas bioquímicas, realizar tinción de Gram, catalasa,

oxidasa.

6. Comparar resultados en la tabla 4 y establecer género y especie.

23

Tabla 4. Diferenciación de enterobacterias mediante pruebas bioquímicas

Fuente: Sección Entérica y Rama de Entrenamiento Bacteriológico. CDC

24

Cuestionario:

1. ¿Cuál es la importancia médica de esta familia?

2. Las enterobacterias se han clasificado en dos grupos: lactosas (+) y lactosas (-), ¿qué

géneros de importancia médica se encuentran en cada uno de estos grupos?

3. De las bacterias lactosa positivas menciona a las inmóviles y a las que son capaces de

producir H2S?

4. ¿Cuáles son las pruebas bioquímicas que permiten identificar a las enterobacterias y

menciona el fundamento bioquímico de cada una de ellas?


a) Morfología colonial.

b) Tinción de Gram.

c) Pruebas de catalasa y oxidasa.

d) Pruebas bioquímicas.

e) Establecer género y especie de la cepa problema.

25

PRÁCTICA No. 8

CARACTERIZACIÓN DE ENTEROBACTERIAS: LACTOSA

NEGATIVAS

Introducción

Dentro de las bacterias lactosa negativas se encuentran los patógenos primarios como es el caso

de Salmonella spp, Shigella spp y Yersinia spp.

La tribu Salmonelleae contiene un único género Salmonella y reciben el nombre del

biólogo estadounidense Salmon. Esta tribu está relacionada con la salmonelosis que es una causa

importante de enfermedad entérica bacteriana en seres humanos y animales. Se estima que

ocurren 1.4 millones de casos anuales de salmonelosis en seres humanos en los Estados Unidos.

Estas infecciones son causadas por ingesta de alimentos, agua o leche contaminados con

excremento de animales o humanos. Las salmonelas son patógenos primarios de los animales

inferiores como vacas, cerdos, mascotas, etc. que constituyen la fuente principal de salmonelosis

no tifoidea en los humanos. Mientras que Salmonella typhi es específico del humano y causa

fiebre tifoidea.

La shigelosis es la más contagiosa de las diarreas causada por Shigella, la enfermedad es

transmitida por vía fecal-oral y se requieren tan solo 200 bacterias viables para producir la

enfermedad.





26

Se conocen 3 especies del género Yersinia: Y. pestis, Y, pseudotuberculosis y Y.

enterocolitica. La peste bubónica es causada por Y. pestis, es una enfermedad de la antigüedad

que persiste en los tiempos modernos, es una enfermedad zoonótica, transmitida por un roedor a

otro o del roedor al hombre a través de las pulgas (ver tabla 4).

Objetivo

Determinar por medio de ensayos de laboratorio las características bioquímicas que definen a la

familia Enterobacteriaceae y a las enterobacterias lactosa negativas.

Material


Sensidiscos de oxidasa Placas con agar Salmonella-Shigellla (SS)


Portaobjetos Cepas de Salmonella sp, Shigella sp, Proteus sp

Algodón

Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CITRATO Y UREA para pruebas bioquímicas

Metodología

1. Sembrar por estría cruzada placas de Mac Conkey y SS.

2. Inocular pruebas bioquímicas.

3. Inocular galerías.


5. Leer morfología colonial, pruebas bioquímicas, realizar tinción de Gram, catalasa,

oxidasa.

6. Comparar resultados con ayuda de la tabla 4 y establecer género y especie.

Cuestionario:

1. ¿Qué géneros son lactosa negativa?

2. ¿Cuál es la importancia de las enterobacterias lactosa negativas?

3. De las lactosas negativas, menciona a las enterobacterias inmóviles y a las que son

capaces de producir H2S?

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4. ¿Cuál es una característica importante de la tribu Proteae y porqué?



b) Tinción de Gram



e) Establecer género y especie de la cepa problema

28

PRÁCTICA No. 9

CARACTERIZACIÓN DEL GÉNERO Vibrio

Introducción

Este género se define como bacilos gramnegativos, fermentadores, móviles, catalasa y oxidasa

positivas. Algunas especies se caracterizan por ser halofílicas. Todos los géneros se consideran

patógenos, resaltando en particular Vibrio cholerae por ser el agente causal del cólera,

enfermedad que se presenta comúnmente en forma epidémica, sobre todo en países en vías de

desarrollo (ver tabla 5).

Tabla 5. Diferenciación entre biotipos de Vibrio cholerae

Prueba Clásica El Tor

Prueba del filamento + +

-hemólisis en agar sangre de carnero - +

Prueba de CAMP - +

Prueba de Voges-Poskauer - +

Aglutinación de eritrocitos de pollo - +

Sensibilidad a 50 U de polimixina B S R

Susceptibilidad al fago IV S R

Objetivo

Determinar con base a las pruebas de laboratorio correspondientes, las características

bioquímicas más relevantes de este género.

Material






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Sensidiscos de oxidasa Placas de agar TCBS


Portaobjetos Cepas de Vibrio cholerae y V. parahaemolyticus.

Algodón

Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CITRATO Y UREA para pruebas bioquímicas

Metodología

1.- Sembrar por estría cruzada los medios en placa.

2.- Sembrar las pruebas bioquímicas convencionales.

3.- Incubar 24 horas a 37° C.

4.- Leer morfología colonial.

5.- Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tinción de Gram.

6.- Leer pruebas bioquímicas.

Cuestionario:

1. ¿Qué géneros conforman a la familia Vibrionaceae?

2. ¿Cuál es la importancia clínica del género Vibrio?

3. Indique el mecanismo de patogenicidad de Vibrio cholerae.

4. ¿Qué pruebas permiten diferenciar entre las especies de Vibrio?



b) Tinción de Gram



e) Establecer género y especie de la cepa problema

30

PRÁCTICA No.10

CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS DE LOS GÉNEROS Streptococcus y

Enterococcus

Introducción

Estos géneros se caracterizan por ser cocos Grampositivos agrupados en pares o cadenas,

generalmente inmóviles, catalasa negativos en general, no esporulados, aerobios y anaerobios

facultativos con metabolismo fermentativo en el que producen ácido láctico, fórmico, etanol y

CO2, crecen óptimamente a 37° C.

Enterococcus se encuentran de manera natural en muchos organismos, incluidos los

humanos, como parte de su flora intestinal. Son microorganismos muy resistentes, capaces de

tolerar concentraciones relativamente altas de sales y ácidos.

El género de mayor interés médico son los Streptococcus. Algunas especies forman parte

de la flora normal del hombre y otras están relacionadas con cuadros clínicos de amigdalitis,

celulitis, erisipela, faringitis, rinitis, fiebre escarlatina, sepsis puerperal, neumonía, endocarditis

bacteriana, caries, meningitis, infecciones en vías urinarias y heridas, fiebre reumática, glomérulo

nefritis y conjuntivitis purulenta.

Objetivo

Caracterizar bioquímicamente a las especies más importantes de ambos géneros.

Material

Equipos de tinción de Gram Placas con agar sangre de carnero





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Sensidiscos de oxidasa Caldos BHI con Streptococcus pyogenes

Reactivo para catalasa Caldos BHI con Streptococcus agalactiae

Portaobjetos Caldos con Staphylococcus aureus

Algodón Caldos BHI con Enterococcus sp

Benzal Caldos con BHI con 6.5 % de NaCl

Placas con agar bilis-esculina Sensidiscos con bacitracina (0.04 UI)

Sensidiscos con optoquina

Metodología

HEMÓLISIS

ALFA BETA NO HEMÓLISIS

(GAMA)

Crece en 6.5% NaCl

Soluble en bilis Sensible a bacitracina: S. pyogenes Ennegrece la bilis

Sensible a optoquina esculina

CAMP +

Hidrólisis del hipurato +: S. agalactiae

S. pneumoniae Enterococcus

1. Sembrar por estría cruzada una placa de agar sangre carnero.

2. Realizar pruebas de CAMP.

3. Realizar pruebas de sensibilidad a bacitracina.

4. Realizar pruebas de sensibilidad a optoquina.

5. Realizar tinción de Gram y observar al microscopio.

6. Incubar 24 horas a 37° C.

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8. Interpretar resultados.

Cuestionario

1. ¿Cuál es la definición del género Streptococcus?

2. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de CAMP?

3. ¿Para qué se utiliza la prueba de sensibilidad a bacitracina y optoquina?



b) Tinción de Gram


d) Otras pruebas

e) Establecer si la cepa en estudio pertenece al género de Streptococcus, de ser positiva la

respuesta, menciona la especie.

5. Menciona las especies más importantes de Streptococcus y qué enfermedad producen.

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PRÁCTICA No.11

CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS DEL GÉNERO Staphylococcus

Introducción

Este género está constituido por cocos grampositivos, agrupados en racimos, catalasa positiva

con metabolismo fermentativo. Son responsables principalmente de infecciones supurativas de la

piel y tejidos blandos. Así como de infecciones oportunistas. Se reconocen 3 especies de

importancia médica: Sta. aureus, Sta. epidermidis, Sta. saprophyticus (ver tabla 6).

Tabla 6. Diferenciación de las especies de Staphylococcus

Objetivo

PRUEBAS DE

LABORATORIO

S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus

Color de las colonias Amarillo-

blanco

Blanco Blanco

Hemólisis en agar sangre + +/- -

Crecimiento anaerobio + + +/-

Coagulasa y DNasa + - -

Fermentación de la glucosa + + +

Fermentación del manitol + - -/+

Novobiocina Sensible Sensible Resistente





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Observar las características más relevantes del género, resaltando aquellas que permiten su

diferenciación con otros cocos grampositivos de cercana filiación.

Material


Sensidiscos de oxidasa Cepas de Staphylococcus aureus

Reactivo para catalasa Cepas de Staphylococcus epidermidis

Portaobjetos Cepas de Staphylococcus saprophyticus

Algodón Placas con agar DNasa

Benzal Plasma de conejo

Sensidiscos con novobiocina

Placas con agar sal y manitol

Metodología

1. Sembrar por estría cruzada una placa de agar sangre y una de agar sal y manitol.


3. Leer morfología colonial y microscópica.

4. Realizar pruebas de identificación de especie.


Cuestionario:

1. ¿Cuál es la definición e importancia del género Staphylococcus?

2. ¿Qué prueba permite diferenciar entre el género Streptococcus y Staphylococcus?

3. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de coagulasa y cómo se realiza en el laboratorio?

4. ¿Cuáles son los ingredientes del agar de sal y manitol y por qué es importante utilizarlo

para la identificación de este género y no de otros?


6. Morfología colonial

7. Tinción de Gram

8. Pruebas de catalasa y oxidasa.

9. Otras pruebas

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10. Establecer si la cepa en estudio pertenece al género de Staphylococcus, de ser positiva la

respuesta, menciona la especie.

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PRÁCTICA 12

CARACTERIZACIÓN DE BACILOS GRAMPOSITIVOS: Bacillus

Introducción

Los microorganismos del género Bacillus son bacilos Grampositivos, formadores de endosporas,

catalasa positivos, son móviles excepto B. anthracis y β-hemolíticos excepto B. anthracis. Este

género es ubicuo en la naturaleza ya que posee endosporas y éstas pueden permanecer en campos

contaminados por periodos de 10 hasta 30 años. B. anthracis es el agente causal de ántrax en

animales, principalmente vacas y ovejas, así como en el humano (ver tabla 7).

Tabla 7. Caracteres mínimos para diferenciar Bacillus anthracis de Bacillus cereus

Bacillus anthracis Bacillus cereus

Lecitinasa + +

Colonias rugosas + +

Morfología Bacilar; extremos

rectangulares

bacilar; extremos

redondeados

Movilidad - +

Cápsula

+ -

Hemólisis

- +

Colonias lisas (capsulación en agar

bicarbonato de sodio 0.7%)

+ -

Sensibilidad a penicilina

+ -





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Objetivo

Identificar por pruebas de laboratorio al género Bacillus.

Material


Placas con agar nutritivo Equipo para tinción de Shaeffer-Fulton

Reactivo para catalasa Cepas de Bacillus sp

Portaobjetos Sensidiscos de oxidasa

Algodón Caldo nutritivo

Benzal Tubos con gelatina

Metodología

1. Inocular una placa de agar sangre carnero.

2. Inocular un tubo de caldo nutritivo e incubarlo a 42° C.

3. Inocular un tubo con gelatina e incubarlo a 4° C por 7 días.

4. Leer morfología colonial, buscar hemólisis, hacer tinción de Gram y Shaeffer-Fulton


Cuestionario

1. ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Shaeffer-Fulton y cómo se realiza en el

laboratorio?

2. Menciona otras pruebas para diferenciar especies de Bacillus.

3. Menciona medios de cultivo para el aislamiento de Bacillus.

4. Menciona las medidas de seguridad que debe tener el laboratorio para poder trabajar con

Bacillus anthracis.


a) Morfología colonial.

b) Tinción de Gram.

c) Pruebas de catalasa y oxidasa.

d) Otras pruebas.

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Bibliografía

1. Bailey and Scott. 2009. Diagnóstico Microbiológico. 12ª. edición. Ed Médica

Panamericana.

2. Bergey’s 1994. Manual. Determinative bacteriology. 9a. edición. Williams & Wilkins.

3. Cowan y Steel.1988. Manual para la identificación de bacterias de interés médico. Ed.

Panamericana.

4. Hernández–Méndez, J.T y cols. 2003. Bacteriología Médica Diagnóstica. Instituto

Politécnico Nacional. 2ª. edición. Ed. Cuéllar.

5. Jawetz, Melnick y Adelberg. 2001. Microbiología Médica. 25ª. edición. Ed. Mc Graw Hill

6. Koneman. 2003. Diagnóstico Microbiológico. 5ª. Edición. Ed. Médica Panamericana.

7. Mc Faddin 1998. Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Interés

Médico. Ed. Panamericana.

8. NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.

5. manual de bacter i

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