pract bacter i unidad2

8/17/2019 Pract Bacter i Unidad2

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IBQ Ma. de Jesús Robles Ortega 1

S.E.P. S.E.M.S.

CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLOGICO industrial y de servicios Nº 107

IDENTIFICA MICROORGANISMOS CON BASE EN TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS

PRACTICA Nº 1

I. INTRODUCCION:

En bacteriología, esterilización implica la eliminación o destrucción de todo organismo vivo.Por lo tanto un objeto estéril está libre de todo organismo viable (vivo). Se dice que un

microorganismo está vivo cuando es capaz de reproducirse. Algo que con mucha frecuencia seolvida es que destrucción no es lo mismo que eliminación, especialmente cuando se esterilizanlíquidos debemos tener en cuenta que algunos métodos de esterilización dejan organismosmuertos u otros productos después del procedimiento. Aunque el líquido puede ser estéril,estos productos remanentes con frecuencia interfieren con la finalidad a la que se destina ellíquido. Los microorganismos pueden ser eliminados, inhibidos o muertos por agentes físicos,procesos físicos o agentes químicos. Se dispone de una gran variedad de técnicas yagentes que actúan de maneras diferentes y cada uno tiene sus propios límites de aplicaciónpráctica.

Un agente químico es una sustancia (sólido, líquido o gas) que se caracteriza por unacomposición molecular definida y que causa una reacción por ejemplo; los compuestos

fenólicos, los alcoholes, el cloro y el óxido de etileno. Ningún agente químico antimicrobiano esel mejor para todas las finalidades. Esto no es sorprendente a la vista de la variedad decondiciones bajo las que los agentes pueden ser utilizados, las diferencias en su modo deacción y los muchos tipos de células microbianas que hay que destruir. Nunca será posibleencontrar un solo compuesto que reúna todas las propiedades.

Un agente físico es una condición física o propiedad física que causa un cambio, latemperatura, la presión, la radiación y los filtros son ejemplo de esto.

Un proceso físico es un procedimiento que causa un cambio, por ejemplo la esterilización, laincineración y la higienización.

II. FUNDAMENTACIÓN:

El calor en forma de vapor saturado, a presión, es el agente físico más práctico y eficaz deesterilización. El vapor a presión proporciona temperaturas considerablemente por encima delas que se pueden obtener al hervir; además tiene la ventaja de un calentamiento rápido,penetración y abundante humedad, todo cual facilita la coagulación de las proteínas de lascélulas microbianas.El aparato para esterilizar que utiliza vapor de agua a presión regulada se denomina autoclavey es el que utilizamos en bacteriología, consta esencialmente de una cámara de doble paredque se llena de vapor saturado libre de aire y se mantiene a la temperatura indicada y a lapresión establecida, durante un período de tiempo determinado. El vapor se introduce

directamente en forma de vapor o es producida por medio de agua hirviendo en el fondo de la

ESTERILIZACION DEL MATERIAL


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Cámara, desalojando previamente el aire para que la cámara se llene de vapor de agua a bajapresión. Si queda algo de aire presente reducirá substancialmente la temperatura de la cámara,manteniéndola por debajo de la que alcanzaría el vapor saturado puro, a la misma temperaturano es la presión la que mata a los microorganismos, sino la elevada temperatura delvapor de agua. Una vez terminado el tiempo que se requiere en determinado material aesterilizar hay que tener precaución después de usar autoclave, de ir reduciendo la presión porla apertura de la válvula hasta que salga todo el vapor, antes de abrir la tapa de la cámara, si

no se hace así, los tapones de algodón pueden saltar. Los objetos que se van a esterilizar seenvuelven en papel o se protegen de otra forma para evitar posterior contaminación.

III. OBJETIVO:

Practicar la esterilización de material utilizado en bacteriología, sin error.

IV. DESARROLLO:

1. Envuelve en papel estraza cajas petri de la manera como le indique el profesor ymarque por fuera con su número de equipo. Recuerde la posición en que debe ir la caja

de acuerdo a lo que tenga que esterilizar. Por ejemplo: material, cajas petri limpias,cajas petri con medio de cultivo con desarrollo bacteriano a desechar.

2. Para esterilizar las pipetas se deben envolver en papel de estraza de modo que noquede ninguna entrada de aire y se debe marcar el lado por donde esté la boquilla ymarque con un número de equipo.

3. A los tubos de ensaye se les hace su tapón (torunda) de algodón recubierto conpañalina, apretado y no muy largo. se debe hacer a cada uno, un gorro de papelestraza, el cual debe quedar ajustado de tal manera que sea fácil quitarlo y ponerlo, porla parte de enfrente se marca con su número de equipo.

4. A los matraces Erlenmeyer se les hace un tapón (torunda) de algodón y su gorro deigual manera que a los tubos de ensaye, marcando con su número de equipo.

5. Para usar el autoclave, primero asegúrese de que el nivel del agua esté correcto, sí esnecesario agregar más hágalo. Después introduzca el material y cierre bien la tapa.espere hasta que empiece a salir vapor por la válvula entonces ciérrela así se debedejar hasta que el manómetro marque 15 lbs. /pulg2 entonces cambie el botón a bajo(low) para que se mantenga 15 minutos en 15 lbs. /pulg2. Una vez pasado este tiempose coloca la autoclave en apagado (0ff) y se abre poco a poco la válvula para que seescape el vapor. la presión irá bajando, cuando llegue a cero y ya no salga vapor por laválvula, se puede abrir la autoclave y el material estará estéril.

En caso de utilizar ollas de presión:

1. Coloque la olla sobre la estufa cuidando que la indicación de cerrado ↔ abierto quedehacia enfrente, debe colocar la parrilla dentro de esta y sin tapa.

2. Agregue agua hasta la señal que indique la olla. Encienda la llama para que se vayacalentando el agua.

3. Introduzca el material bien acomodado y aproveche al máximo el espacio.

4. Coloque la tapa cuidando que la flecha indicadora quede hacia el frente coincidiendo

con la base de la olla, cerrado ↔ abierto la flecha debe quedar en cerrado,perfectamente embonada sin colocarle la válvula de seguridad metálica e indicador depresión, hasta que el aire sea desplazado en el interior de la olla se coloca ésta.


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5. Con la fuente de calor alta se deja hasta que el manómetro marque 15 lbs. /pulg2,entonces reduzca la fuente de calor para que se mantenga 15 min., en 15 lbs. /pulg2.

6. Después de 15 minutos retire o apague la fuente de calor y espere a que la presióndescienda hasta cero, moviendo poco a poco la válvula de seguridad metálica para quese escape el vapor.

7. Cuando ya no salga vapor y el manómetro marque cero, se puede abrir la olla, cuidandoque los vapores no le quemen.

NOTA: Todo el material debe estar bien limpio antes de envolverse.

MATERIAL Y REACTIVOS:

V. CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es el tiempo aproximado de la muerte por calor para las células vegetativas de lamayoría de las bacterias?

2. ¿Por qué el calor húmedo es más efectivo que el calor seco para la esterilizaciónrápida?

3. ¿Qué es una autoclave?

4. ¿Qué clase de materiales se esterilizan usualmente en autoclave?

5. ¿Cuál es la respuesta de los microorganismos a las temperaturas bajo cero?

VI. CONCLUSIONES:

VII. GLOSARIO:

1. Defina los siguientes términos: Sepsis. Séptico, Asepsia o Aséptico, Antiséptico,Desinfectante, Agente Bacteriostático y Agente Bactericida.

VIII. BIBLIOGRAFÍA:

Autoclave Cajas petri Tubos de ensaye Pipetas Pañalina Papel estraza Cinta maskintape


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IDENTIFICA MICROORGANISMOS CON BASE EN TÉCNICAS BACTERIOLÓGICASPRACTICA Nº 2

I. INTRODUCCION:

Cualquier sustancia que pueda ser usada para el cultivo de microorganismos, puede serllamada un medio (en latín medium, cuyo plural es media) o, dicho con mayor precisión, unmedio de cultivo; es un substrato o solución de nutrientes en que se cultivan los

microorganismos en el laboratorio. el desarrollo o cosecha de microorganismos obtenidos ental medio se designa como cultivo.

Los medios sirven para uno de dos propósitos principales:

1. Fomentar el crecimiento microbiano en forma que puedan comprobarse lascaracterísticas de cultivo.

2. Facilitar algunas reacciones bioquímicas, que luego pueden ser demostradas porobservación directa, o bien indirectamente por subsecuente reacción en presencia dealgunos reactivos adicionales.

Como es natural, todas estas reacciones de cultivo así como las bioquímicas, dependen de lacomposición del medio y de la naturaleza del cultivo que se estudie.

Los medios de cultivo pueden ser sólidos, semisólidos y líquidos en base a su estadofísico; esto se debe a la presencia o ausencia de agar (agente solidificante extraído dealgunas especies de algas marinas rojas).

II. OBJETIVO:

El alumno preparará y diferenciará los diferentes tipos de medios de cultivo para aislamiento debacterias, sin error.

III. DESARROLLO:

Los medios sólidos, semisólidos o líquidos se preparan rehidratando el medio de acuerdo a lafórmula del fabricante. Se debe utilizar agua destilada.

1. Realizar cálculos (utilizando regla de tres) de acuerdo al medio que se le asigne,verificando cantidad a preparar y leyendo el método de preparación en la etiqueta delmedio.

2. Pesar en la balanza granataria el matraz Erlenmeyer (vacío, limpio y seco).

3. Al peso del matraz vacío, súmele la cantidad de medio deshidratado (polvo) resultadodel punto 1. El resultado de esta suma márquelo en la balanza.

PREPARACION Y USOS DE MEDIOS DE CULTIVOS


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4. Con ayuda de una espátula adicione poco a poco el medio hasta que la balanza seencuentre en el peso indicado, cuidando de que no caiga medio fuera del matraz.

5. En una probeta limpia mida la cantidad de agua destilada que se necesita pararehidratar el medio.

6. Adicione el agua arrastrando el polvo que este adherido a las paredes del matraz,cuidando que este se humedezca antes de adicionar toda la cantidad de agua medida.

7. Mezcle perfectamente y caliente para disolver las partículas restantes del medio.

8. Tape el matraz con una torunda de algodón y su gorro de papel; etiquetándolo con elnombre del medio respectivo y el número del equipo.

9. Si el medio lo indica, esterilizar en autoclave a 15 lbs. /pulg2 de presión durante 15minutos, o bien como lo requiera el medio.

10. Se saca el medio del esterilizador, se enfría a 50°c aproximadamente a chorro de aguade la llave, cuidando de no mojar la torunda.

11. Se vacía el medio en:

Si es sólido en cajas petri o tubos de ensaye (agar inclinado). Si es semisólido o líquido en tubos de ensaye (posición vertical).

NOTA: Se trabajará con medios comerciales deshidratados.

EXPLICACIÓN DEL PROCEDIMIENTO:

a) Vertido en cajas petri: se van a vaciar aproximadamente de 15 a 20 mls. del mediosuficiente para cubrir el fondo de la caja, al vaciar el medio, se debe tomar la caja conuna mano y abrirla con los dedos pulgar e índice no coloque la tapa en la mesa, con laotra mano se deberá quitar la torunda de algodón del matraz Erlenmeyer (usando losdedos meñique y anular, sosteniendo todo el tiempo la torunda), vaciar el mediotomando el matraz por la parte media, una sola persona debe realizar el procedimiento.debe trabajarse en una zona estéril, (esto puede conseguirse trabajando cerca de laflama del mechero), libre de corriente de aire y desinfectar con fenol al 5%, cloro u otrodesinfectante la mesa de trabajo. se vierte el medio a cajas petri, se dejan en la mesade trabajo y no se mueven hasta que haya solidificado el medio (aproximadamente 15minutos).

b) En tubo inclinado: con los dedos meñique y anular de la mano izquierda quite el tapónde algodón de su tubo estéril, y después tome el tubo con los dedos pulgar o índice; elmatraz que contiene el medio de cultivo (agar) debe estar en la mesa, entonces con losdedos meñique y anular de la mano derecha quítele el tapón de algodón y con losdedos pulgar e índice tome el matraz por la parte media, acérquelo a la boca del tubo,vacié 5 mls, flamee la boca del tubo y tápelo con la torunda inmediatamente, coloque sutubo en una posición inclinada y déjelo así hasta que solidifique (15 min.) cuidando quese tengan fondos de 2 cm. de profundidad.

REPITA EL PASO “B” USANDO EL CALDO: Como es medio líquido no hay necesidad de

inclinar el tubo se coloca en posición vertical sobre la gradilla.


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MATERIAL Y REACTIVOS

IV. CUESTIONARIO:

1. Nombre y explique brevemente 5 tipos de medios de cultivo en base a su aplicación.2. ¿Cómo se pueden impedir las desviaciones fuertes de pH de un medio de cultivo

3. ¿Quién establece la diferencia entre un medio sólido, líquido y semisólido?

Cajas Petri Tubos de ensaye estériles 15 x 100mm Matraces Erlenmeyer de 250 mls.

Mechero Fischer Balanza granataria Autoclave Espátula Medios sólidos Medios semisólidos Medios en caldo


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I. INTRODUCCION:

Los microorganismos se encuentran en casi toda la naturaleza. Las corrientes de aire los llevandesde la superficie de la tierra a las capas superiores de la atmósfera. El suelo esta rebosantede ellos. Los rayos y los ríos arrastran microorganismos a los lagos y los grandes embalses, ycuando en aquellas corrientes descargan enfermedades de un lugar a otro. Se presentan en

más abundancia cuando encuentran materias nutritivas, humedad y temperaturas favorablespara su desarrollo y multiplicación. Las condiciones que favorecen la supervivencia y elcrecimiento de muchos microorganismos, son los que rodean normalmente al hombre. Estánen el aire que respiramos, en el alimento que ingerimos, se encuentran en la superficie denuestro cuerpo, en los intestinos, en la boca, en la nariz y en otras cavidades abiertas delorganismo. Por fortuna la mayor parte de los microorganismos son inocuos para nosotros ydisponemos de medios para resistir la invasión de las que puedan dañarnos.

II. OBJETIVO: Obtener un cultivo de microorganismos a partir de una muestraproblema.

III. METODOLOGIA:

1. A partir de una muestra problema de bacterias, se procede a inocularla en cajas petripreviamente esterilizadas, que contienen medio de Eosina azul de metileno (EMB),Estafilococos 110 (S-1 10) agar sangre con azida (ASA).

2. Etiquete la caja petri con su nombre, fecha, no. de práctica y muestra inoculada.

3. Se incuban a 37°c durante 24 horas.

4. Una vez obtenido el cultivo, observe las diferentes colonias que hayan crecido en elmedio, anotando las pruebas de cultivo y pruebas morfológicas (observaciones

macroscópicas y observaciones microscópicas respectivamente).5. Si nuestro cultivo resultará mixto, se escogerá una colonia aislada de cada bacteria

identificada, para inocularla en un medio de cultivo nuevo y así obtener un cultivo puro.

6. Si nuestro cultivo resultara puro, sólo trabajaremos una resiembra para tener unamejor apreciación de nuestra bacteria(s) en estudio.

NOTA: Para la incubación las cajas petri se colocan en posición invertida, para que el vapor deagua que se forme no caiga sobre el cultivo y evitar así una posible contaminación.

OBTENCION DE UN CULTIVO DE MICROORGANISMOS


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MATERIAL Y REACTIVOS:

Matraz ErlenmeyerCajas petri Asa bacteriológicaPinzas

Mechero FischerPapel estraza AlgodónFenol 5% Agar Soya TripticaseinaMedio SIM Agar NutritivoCaldo Nutritivo Agar eosina azul de metileno (EMB

IV. CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es la definición del término crecimiento en bacteriología, y en qué se diferenciasu significado cuando se aplica a los vegetales y animales superiores?

2. Define cultivo y medio de cultivo.

3. ¿Qué características deben tomarse en cuenta para describir las colonias bacterianasen placa de agar?

4. ¿Cómo se toman las características de un crecimiento de bacterias en caldo nutritivo?

V. CONCLUSIONES:


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TÉRMINOS USADOS PARA DESCRIBIR LA MORFOLOGIA BACTERIANA

1.- FORMA:

2.- ELEVACIÓN:

3.- MARGEN:

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PRACTICA Nº 4

I. INTRODUCCION:

La mayor parte de las bacterias cuando están sin teñir son cuerpos homogéneos o granulosos,incoloros, transparentes de índice de refracción baja, aproximadamente igual a la del agua. Elproceso de coloración de las bacterias ha sido objeto de muchas controversias sobre todo para

saber si se trata de un proceso físico o químico.

II. FUNDAMENTACIÒN:

Se admite en general que es de índole química y que el mecanismo es un intercambio iónicoentre el colorante básico y las proporciones ácidas del protoplasma (ácidos nucleicos y suscompuestos), con formación de compuestos nucleótido-colorantes insolubles. La coloración delas bacterias o de otros organismos por aplicación de una solución de un colorante a unapelícula fijada o frotis, se denomina tinción simple. Esta tinción nos muestra la forma,tamaño y ordenamiento de las células.

III. OBJETIVO:

Preparar frotis y teñirlos para observar las diferentes estructuras bacterianas.

IV. METODOLOGIA:

PREPARACION DE FROTIS:

1) Lavar con agua y jabón perfectamente los portaobjetos necesarios. si estos quedangrasosos pasarlos por una corriente de alcohol.

2) Secar perfectamente

3) Marcar con lápiz graso obscuro cada portaobjetos haciendo cuadros de 1.5 x 1.5 cm.aproximadamente de acuerdo al número de frotis bacteriano que tenga que realizar,aprovechando al máximo el portaobjetos.

4) Sobre el portaobjetos (primer cuadro) coloque una gota pequeña de agua de la llavecon el asa. En esta gota emulsifique una pequeña cantidad del cultivo de bacteriasprocedente de un medio sólido. si procede de un medio líquido se suprime la gota deagua de la llave. El frotis debe ser delgado.

5) Se procede a secar al aire de preferencia.

6) Se repite el procedimiento en cuadros 2. 3, y 4, excepto esta vez, emulsifique materialbacteriano procedente de otra muestra.

FROTIS


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7) Después de haber secado los frotis, se fijan al calor, esto se hace tomando elportaobjetos y pasándolo lentamente a través de la flama del mechero una y otra vez,aproximadamente tres veces. No debe permitirse que el vidrio se sobrecaliente tantoque resulte doloroso al tacto.

MATERIAL Y REACTIVOS

*Portaobjetos*Mechero Fischer*Microscopio*Aceite de inmersión*Cultivo de bacterias en placa y caldo*Asa bacteriológica

PRÁCTICAS Y ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS

1. Explique qué es un colorante.

2. ¿Qué característica presentan las bacterias antes de un proceso de tinción?

3. ¿Cuál es la finalidad de que se hayan desarrollado procedimientos de tinción?


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I. INTRODUCCION:

La coloración de Gram, descubierta hace algo más de 100 años por Hans Christian Gram, seusa principalmente para el examen microscópico directo de muestras y subcultivos.

El cristal violeta (violeta de genciana) sirve como colorante primario, el propósito de este

primer paso es impartir color a todos los microorganismos en el frotis. El segundo reactivo de la serie es una solución diluida de yodo que generalmente se

conoce como Yodo Gram o bien Lugol Gram. esta solución actúa como mordentesustancia que aumenta o refuerza la unión entre un colorante y su substrato.

El tercer reactivo se conoce como decolorante porque disuelve y arrastra fuera de lascélulas el colorante primario. se emplea una mezcla de Alcohol acetona. esta mezclaefectivamente disuelve el cristal violeta muchos organismos retienen el cristal violeta congran tenacidad a pesar del decolorante. las bacterias que retienen el colorante se ven negroazuladas cuando se observan al microscopio, y se denominan entonces Grampositivos.

El cuarto reactivo en la serie Gram es una colorante rojo llamado Safranina, el cual seaplica como contra tinción. Aquellos organismos que se decoloraron con el alcohol-cetonase han tornado invisibles (incoloros), como estaban originalmente por eso es que, paratornar visibles estos organismos se emplean una contra tinción de diferente color que elcolorante primario. Así, se designan Gramnegativas a cualquier organismo que tome lacoloración roja de la safranina. A los organismos que retienen el colorante primario a lolargo de todo el proceso, estos organismos se denominan Grampositivos, no toman el rojode la safranina simplemente porque ya han reaccionado completamente, con el cristalvioleta.

II. FUNDAMENTACIÒN:

Durante años se han expuesto numerosas teorías al mecanismo de la reacción de Gram. Lasexplicaciones más plausibles de este fenómeno son las que se refieren a la estructura ycomposición de la pared celular. Las bacterias Gramnegativas contienen un porcentaje másalto de lípidos que las bacterias Grampositivos. Las paredes celulares de las bacteriasGramnegativos son también más delgadas que las de las Grampositivos. Hay pruebasexperimentales en el sentido de que el tratamiento con alcohol extrae lípidos con lo cual seaumenta la porosidad o permeabilidad de la pared celular Gramnegativos. Así el complejocristal violeta-yodo (CV-I) puede extraerse en los organismos Gramnegativos y de esta manerase decoloran.

Las paredes celulares de las bacterias Grampositivos, por su composición diferente (bajo

contenido de lípido) se deshidratan durante el tratamiento con alcohol, los poros disminuyen, lapermeabilidad se reduce y no se logra extraer el complejo CV-I.

TINCION DE GRAM


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Otra explicación, un tanto similar, se basa también en diferencias de permeabilidad entre losdos grupos de bacterias. En las bacterias Grampositivas, el complejo CV-I queda retenido en lapared después del tratamiento con etanol, lo cual según se supone causa una disminución enel diámetro de los poros del glucopéptido o peptidoglucano de la pared celular. Las paredes delas bacterias Gramnegativas tienen una cantidad mucho menos de peptidoglucano conligaduras cruzadas menos extensas que en las paredes de las bacterias Grampositivas. Losporos en el peptidoglucano de las bacterias Gramnegativas después del tratamiento con etanol

quedan lo suficientemente grandes para permitir que se extraiga el complejo CV-I. Estas dosexplicaciones no se excluyen mutuamente y es probable que ambas contribuyan a explicar elmecanismo de coloración de Gram.Es conveniente mencionar algunas observaciones relativas a los riegos posibles en laejecución de la tinción de Gram. La decoloración es el paso más crítico de esta técnica. Siusted decolora demasiado, todas las células dejarán escapar el colorante primario y porconsiguiente aparecerán como Gramnegativas por otro lado, si usted decolore demasiadodébilmente, incluso las células Gramnegativas retendrán el colorante primario y apareceránGrampositivas. La edad del cultivo usado también determina los resultados finales de la tinciónGram. Es sumamente importante recordar que la tinción de Gram únicamente da resultadosválidos cuando se aplican cultivos nuevos, de 24 horas o menos. Una vez que el cultivo seincube por más de 24 horas, muchas células Grampositivas empiezan a perder habilidad pararetener el colorante primario. Al envejecer, las células tienden a volverse Gramnegativasincluso las que eran Grampositivas originalmente.

III. OBJETIVO:

Practicar la aplicación de la tinción de Gram para diferenciar las bacterias Grampositivas yGramnegativas sin error.

IV. DESARROLLO:

1. Se hace un frotis delgado del material a estudiar y se deja secar al aire

2. Se fija el material en el portaobjeto pasándolo 3 ó 4 veces a través de la llama de unmechero de modo que el material no sea lavado durante el procedimiento de tinción.ahora algunos trabajadores recomiendan el uso de alcohol para fijar el material a serteñido con Gram (cubrir el extendido con metanol o etanol por unos pocos minutos).

3. Colocar el extendido en una bandeja para teñido, y cubrir el frotis bacteriano conSolución de cristal violeta (colorante primario) y déjelo actuar por una minuto.

4. Lavar con agua de la llave, procurando que no pegue de lleno el agua sobre la muestray escurrir.

5. Se cubre el frotis con solución yodo de Gram o Lugol Gram (mordente) por un minuto.repita paso No. 4.

6. Agregue Alcohol-Cetona (decolorante) cubriendo el frotis bacteriano durante 10segundos. repita el paso No. 4

7. Cubra el frotis bacteriano con safranina de Gram (colorante secundario o de contraste)durante 1minuto. Repita el paso No. 4.

8. Se coloca el frotis en una posición vertical dejando que drene el exceso de agua y elfrotis se seque.

9. Finalmente se examina el frotis teñido con aceite de inmersión con el objetivo de I00xdel microscopio. Dibuje lo que observa.


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TINCIÓN DE GRAM

REACCIÓN Y ASPECTO DE LAS BACTERIAS

SOLUCIÓN EN EL ORDEN DESU APLICACIÓN

GRAMPOSITIVAS GRAMNEGATIVAS

1. CRISTAL-VIOLETA (CV) Las células se tiñen de violeta Las células se tiñen de violeta

2. SOLUCIÓN DE YODO (I) Se forma un complejo CV-I dentrode las células. Las células continúanvioletas.

Se forma un complejo CV-I dentrode las células, las células continúanvioletas.

3. ALCOHOL- CETONA Las paredes celulares sedeshidratan, los poros merman, lapermeabilidad de la pared celular yde la membrana, disminuye el

complejo CV-I. No puede salir de lascélulas permanecen color violeta.

Se extraen lípidos de las paredescelulares. Los poros se agrandan yel complejo CV-I es eliminado de lacélula. Las células quedan incoloras.

4. SAFRANINA Las células no se afectanpermanecen de color violeta

Las células toman este colorante yse ponen de color rojo

RESULTADOS:

Las bacterias Grampositivas retienen el cristal violeta después de la decoloración y aparecen de color azul intenso.

Las bacterias Gramnegativas no son capaces de retener el cristal violeta después de la decoloración y son teñidas de rojo con el colorante de contraste safranina.

Bacterias teñidas de color azul intenso------ Grampositivas Bacterias teñidas de color rojo ----------------- Gramnegativas

PRÁCTICAS Y ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS

1. Explique lo que es un colorante2. ¿Cuál es la finalidad de que se hayan desarrollado procedimientos de tinción?

S.E.P


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PRACTICA Nº 6

I. INTRODUCCION:

Las Micobacterias están cubiertas por un material grueso, ceroso, (lípidos) que resiste latinción; no obstante, una vez que se tiñen las paredes celulares bacterianas resisten ladecoloración por solventes orgánicos fuertes, como el alcohol-ácido. Consecuentemente,

dichas bacterias son conocidas como resistentes al ácido, acidorresistentes un fenómenodescubierto en 1881 por Ziehl y Neelsen.

II. FUNDAMENTACIÓN:

Se requiere un tratamiento especial para que el colorante primario, la carbolfuscina, penetre enel material ceroso de los bacilos resistentes al ácido. En la técnica convencional de ZiehlNeelsen se utiliza calor. Una vez que la carbolfuscina se deposita en la superficie del frotis ateñir, se pasa por debajo del portaobjeto, hacia atrás y hacia delante, la llama de un mecherobunsen. El calentamiento del extendido prosigue hasta el desprendimiento de vapores, y sedetiene poco antes de la ebullición.

La modificación de Kinyoun a la técnica de alcohol-ácido se denomina método en frío, porqueutiliza un detergente tensioactivo de superficie, como tergitol, en lugar de tratamiento con calor.Con cualquiera de estas tinciones, los bacilos resistentes al ácido se ven rojos contra unfondo verde o azul, lo que depende del colorante de contraste. Si bien este método essatisfactorio para la mayoría de las Micobacterias, algunas cepas alcohol-ácido débiles deespecies de crecimiento rápido (complejo Mycobacterium fortuitum / chelona) se tiñen mejorcon el método de Ziehl Neelsen. Los ovoquistes de especies de Cryptosporidium, Isospora belli dos microorganismos coccídeos que se han incriminado como agentes etiológicos delsíndrome intestinal de homosexuales, son ácido-resistentes y pueden detectarse con facilidaden preparados con tinciones ácido-resistentes de muestras de materia fecal. Los ácidoscarbólicos existentes dentro de la pared celular cérea, rica en lípidos, de las Micobacterias

poseen la capacidad particular de unirse al colorante fucsina de una forma tal que no escontrarrestada por el alcohol-ácido. La tinción de Ziehl Neelsen se conoce comocoloración en caliente porque se utiliza calor para facilitar la penetración del colorante através de la pared celular. La tinción de Kinyoun se conoce como coloración en fríoporque la alta concentración de fenol presente en el reactivo sirve para disolver elmaterial lipídico de la pared celular, lo que permite la penetración del colorantecarbolfuscina sin utilizar calor. Una vez teñidas, las paredes celulares mantienen elcolorante en forma resistente dado el característico color rojo.

III. OBJETIVO:

Aplicar el método de tinción de Ziehl Neelsen para identificación de Bacilos Alcohol Ácido

Resistentes (BAAR).

TINCION ACIDORESISTENTE(MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN)


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IV. METODOLOGÍA:

(MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN)

1. Preparar un frotis del esputo autoclaveado de la manera que se le indique.

2. Séquelo al aire y fíjelo al calor.

3. Colocar una tira de papel filtro de 2 x 3 cm sobre el portaobjetos, para mantener elcolorante sobre éste y filtrar los cristales disueltos.

4. Cubrir la tira de papel con fucsina fenicada de Ziehl Neelsen.

5. Calentar lentamente el portaobjetos hasta emisión de vapores, sin llegar a la ebullición.

6. Teñir durante 5 minutos. si el colorante se seca, agregar más sin calentar.

7. Quitar con cuidado la tira de papel del portaobjetos con pinzas.

8. Lavar con agua en abundancia.

9. Cubrir el frotis con decolorante alcohol-ácido al 3% durante 2 minutos.

10. Lavar con agua y eliminar el exceso.

11. Cubrir el portaobjetos con la coloración de contraste de azul de metileno durante unminuto. no secar con papel.

12. Examinar el frotis con un objetivo de inmersión 100x.

MATERIAL Y REACTIVOS:CARBOLFUSCINACristales de fenol 2.5 mls. Alcohol 95% 5.0 mls.Fucsina básica 0.5 grs. Agua destilada 100 mls

ÁCIDO-ALCOHOL 3%HCL concentrado 3.0 mls. Alcohol 70% 100 mls.

AZUL DE METILENO DE LÖEFFLER

Azul de metileno 0.5 grs. Ácido acético glacial 0.5 mls. Agua destilada 100 mls.

*Portaobjetos*Varillas de vidrio*Bandeja de tinción*Algodón *Asa de platino .*Mechero Fischer

MUESTRA BIOLÓGICA:

Esputo autoclaveado de un paciente con tuberculosis Orina


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RESULTADOS:

Las bacterias ácido-alcohol-resistentes (BAAR) se tiñen de rojo (retienen el colorantecarbolfuscina)

Las bacterias no ácido-alcohol-resistentes (NO BAAR) se tiñen de azul.

OBSERVACIÓN EN EL FROTIS INFORME

1 ó 2 cada 300 campos (3 barridos) Dudoso, repetir1-9 cada 100 campos Muy escasos, 1+ 1-9 por cada 10 campos Pocos, 2+ 1-9 por campo de inmersión Abundantes, 3+ 9 por campo 4+

ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS:

1. Realice los dibujos de sus frotis observados.

2. Haga su reporte de resultados.


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INTRODUCCION:

Las características de cultivo, también conocidas como características de crecimiento, obien características macroscópicas observadas en los diferentes medios es uno de losprincipales distintivos de las bacterias. Características tan triviales como el color, la abundanciade crecimiento, y el olor del cultivo, proporcionan todas ellas indicios para la identificación de

un cultivo desconocido.Las características de cultivo se observa en los diferentes tipos de cultivos:

a) Colonias en placa de agarb) Crecimiento en agar inclinadoc) Crecimiento del picado en medio semisólido o gelatina

Por lo común, la valoración de las características más notorias de las colonias se realizamediante la inspección visual del crecimiento en la superficie de las placas de agar. Lainspección se lleva a cabo sosteniendo la placa en una mano y observando la superficie delagar para detectar el crecimiento bacteriano. Por lo común no se utilizan medios primarios en

tubos para la evaluación de la morfología de colonias, sino que más bien se les usa paraenriquecer el crecimiento de las bacterias de modo que pueda recuperarse una cantidadsuficiente para su estudio.

OBJETIVO:Interpretar las características de cultivo, crecimiento o macroscópicas de las bacterias.

MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO:

2 Cajas petri con cultivo de bacterias de 24 hrs.2 Tubos de ensaye con cultivo de bacterias de 24 hrs. en caldo2 Tubos de ensaye con cultivo de 24 hrs. en agar inclinado

2 Tubos de ensaye con cultivo de bacterias de 24 hrs. en medio semisólido o gelatinaFenol 5%Mechero Fischer Asa bacteriológicaPortaobjetosPinza de disección

NOTA: Los responsables de esta asignatura deberán proporcionarles a los alumnos los cultivosinoculados (cajas petri, caldos y agar inclinado)

CARACTERISTICAS DE LOS CULTIVOS DE LAS BACTERIAS


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METODOLOGÍA:

1. La inspección de cultivos se lleva a cabo sosteniendo la placa en una mano yobservando la superficie del agar en busca de crecimiento bacteriano.

2. Cada placa debe estudiarse con cuidado porque las bacterias inicialmenterecuperadas de muestras a menudo están en un cultivo mixto y puede haber una

variedad de tipos de colonias. Colonias puntiformes de bacterias que crecenlentamente pueden pasarse por alto entre colonias más grandes en particular si elcrecimiento tiene tendencia a diseminarse sobre la superficie de la placa. durante elexamen, las placas deben inclinarse en diversas direcciones con una iluminacióndirecta brillante de modo que la luz se refleje desde varios ángulos.

3. Interprete las características macroscópicas del cultivo en placa que se le haproporcionado, haga sus anotaciones y observaciones con cuidado ya que lasbacterias aisladas inicialmente a partir de muestras diversas, constituyen a menudocultivos mixtos y puede haber una variedad de tipos de colonias. las características seapreciarán en la siguiente forma:

TAMAÑO: Diámetro de la colonia en mms. aproximadamente considerando que el diámetro dela caja petri es de 100 mms.

FORMA: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, fusiforme. (Ver esquema en la hojaanexa).

MARGEN O BORDE: Estos son de diferentes tipos según la especie de que se trate. Puedenformar un círculo perfecto como las orillas de una gota o mostrar gran variedad deirregularidades como entero, ondulado, lobulado, aserrado, filamentoso, rizado. (Ver esquemaen la hoja anexa).

ELEVACION: Las colonias pueden ser planas, elevadas, convexas, pulverizadas o embonadas(ver esquemas en la hoja anexa). Cromogénesis o pigmentación (color): las colonias puedenestar pigmentadas o no. Esta coloración está relacionada en base a la bacteria en estudio y elmedio de cultivo que se emplee.

CONSISTENCIA: Viscosa, membranosa, dura, butirosa. etc.

CARACTERISTICAS ÓPTICAS: Opacas, transparentes, transparentes en los bordes concentros opacos u opalescentes.

4. Interprete las características de crecimiento del cultivo que se le ha proporcionado, dela forma en que se indica a continuación y haga sus anotaciones.

VALOR DEL CRECIMIENTO: Escaso, moderado o abundante

DISTRIBUCION DEL CRECIMIENTO: Uniformemente distribuido (turbiedad uniforme).Desarrollo confinado a la superficie (ver la figura en hoja anexa). Desarrollo que se acumulacomo sedimento, el cual puede ser granular o viscoso.

OLOR: Pútrido, a frutas, aromático, imperceptible.


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5. Interprete la forma de crecimiento de la estría en agar inclinado del cultivo que se le haproporcionado, de la forma que se indica y haga sus anotaciones.

CANTIDAD: Escasa, moderada o abundante.

FORMA DEL DESARROLLO: Filiforme, equinulada, perlada, difusa, arborescente, rizoide (ver

la figura en hoja anexa).

CROMOCENESIS O PIGMENTACIÓN: Las colonias pueden estar pigmentadas o no. estacoloración está relacionada en base a la bacteria en estudio, y al medio de cultivo que seemplee.

CONSISTENCIA DE LA MASA DESARROLLADA: Mantecosa (butirosa), viscosa,membranosa, quebradiza, dura o filamentosa.

6. Interprete el crecimiento del cultivo que le ha proporcionado en medio semisólido degelatina, en la siguiente forma y haga sus anotaciones.

CRECIMIENTO (SIN LICUACIÓN): Limitado a la línea de inoculación (bacterias inmóviles) opuede presentar varios grados de propagación fuera de esta línea (bacterias con movimiento).

LICUACIÓN DE GELATINA: Puede avanzar por igual desde la superficie o presentar diversosaspectos infudibuformes (figura de embudo), ver figura hoja anexa.

PRÁCTICA Y ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS

1. ¿Cuál es la importancia de interpretar las características de cultivo?

2. ¿Con qué otros nombres se les conoce a las características de cultivo?

3. Tiene la misma aplicación trabajar con gelatina o con medio semisólido. Explique elporqué de su respuesta.


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INTRODUCCIÓN:

La población microbiana del ambiente circundante del hombre es muy amplia y compleja,muchas especies microbianas diferentes habitan en diversas partes de nuestro organismo ynuestro ambiente. Uno de los problemas más frecuentes en microbiología, es el aislamiento deun cultivo puro de una especie bacteriana dada idealmente. uno debería aislar una sola

bacteria individual y luego transferirla a un medio estéril hasta que se divide para generarmuchas bacterias todas derivadas de una sola célula original a pesar de que es muy difícilaislar una sola célula, existen técnicas capaces de aproximar este ideal. Aunque uno no puedetener la certeza absoluta de haberlo logrado. La técnica mas empleada para lograr un cultivopuro, es el método llamado sembrado en estrías. Se entiende por cultivo puro unapoblación de células donde todas proceden de una sola.

OBJETIVO: Obtener un cultivo puro a partir de un cultivo mixto con precisión.

MATERIALES Y REACTIVOS:

• Matraces erlenmeyer• Tubos de ensaye con caldo nutritivo • Cajas petri• Mechero Fischer • Asa bacteriológica• Algodón • Agar Soya Tripticaseína (en cajas petri y tubo de ensaye)• Agar EMB o Mc Conkey

METODOLOGIA:

1. Seleccione una de las colonias obtenidas en el cultivo mixto teniendo en cuenta las

siguientes precauciones. La colonia pura tiende a tener forma muy regular y nuncaestá en contacto con otras colonias. Cualquier colonia que está en contacto directo conotra colonia no es pura y debe descartarse.

2. Con un asa bacteriológica estéril, transfiera un poco de material de la coloniaseleccionada al medio correspondiente contenido (EMB, MC) y siempre en estría deacuerdo a las instrucciones del profesor.

3. Utilizando la misma colonia, transfiera con el asa una pequeña cantidad de muestra altubo de ensaye que contiene el caldo nutritivo, sigue las instrucciones del profesor.

4. Etiquete la caja petri y el tubo de ensaye.

5. Se incuban a 3 7°c, durante 24 hrs.

CULTIVO PURO


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IBQ M d J ú R bl O 22

6. Una vez obtenido el cultivo, para comprobar que es puro se toman las característicasde cultivo. Se realizan frotis y se tiñen por el método de Gram, para valorar lascaracterísticas microscópicas o morfológicas.

7. Para conservar el cultivo puro, se transfiere con el asa una pequeña muestra de lacolonia a un tubo que contiene Agar Soya Tripticaseína inclinado y se siembra porestría.

PRÁCTICA Y ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS:

1. ¿Cuál es el significado de los términos: cultivo mixto, cultivo puro y aislamiento de ungermen?

2. Mencionar y describir tres técnicas para aislamiento de microorganismos en un cultivopuro.

3. Suponiendo que se ha aislado un cultivo puro siguiendo una técnica aceptable ¿Cómose puede comprobar que el cultivo aislado es realmente puro?

4. Define: medio de cultivo y cultivo

5. ¿Qué características deben tomarse en cuenta para describir las colonias bacterianasen placa de agar?

6. ¿Cómo se toman las características de un crecimiento de bacterias en caldo nutritivo?

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