Universidad de San Carlos de Guatemala Centro de Estudios del Mar y Acuicultura

Prctica Profesional II

INFORME FINAL

VALIDACIN DEL MTODO DE SHOCK TRMICO PARA LA PRODUCCIN DE TILAPIAS TRIPLOIDES

Presentado por: T.A. Mario Abraham Hernndez Sagastume

Guatemala, enero de 2011

Universidad de San Carlos de Guatemala Centro de Estudios del Mar y Acuicultura

Prctica Profesional II

INFORME FINAL

VALIDACIN DEL MTODO DE SHOCK TRMICO PARA LA PRODUCCIN DE TILAPIAS TRIPLOIDES

Presentado por: T.A. Mario Abraham Hernndez Sagastume Carn: 20042053. Asesorado por: Ms. C. Leonel Carrillo

Guatemala, enero de 2011

DEDICATORIA

A Dios por ser mi creador y permitirme crecer espiritual e intelectualmente, por bendecirme y guiarme en mi vida.

A mis padres por ser ejemplo, al ensearme conducirme y a sembrar principios morales y ticos, que se reflejan en mi conducta y actitud profesional.

A mis hermanos por su apoyo que me han demostrado permitindome seguir adelante ante cualquier adversidad.

A mi abuela mam Tila por ser pilar en mi vida, y brindarme sabidura.

A mis primos, tos, sobrinos y padrinos por estar incentivndome a superarme cada da.

A mis amigos con los cuales nos hemos redo, aprendido y apoyado, por brindarme su amistad sabiendo que puedo contar con ellos siempre. Especialmente a Manuel Reyes y Pedro Rodrguez por incentivarme y ayudarme a destacarme.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad de San Carlos de Guatemala, por ser la casa de estudios superiores que me permite alcanzar mis metas profesionales y poderme desarrollar intelectualmente.

Al Centro de Estudios del Mar y Acuicultura, por brindarme el conocimiento necesario para contribuir y servir a mi querida Guatemala.

A mis catedrticos que me instruyeron con sus conocimientos en la materia de estudio.

Al Laboratorio de Investigacin Aplicada, por permitirme usar las instalaciones y brindarme equipo para la realizacin de la investigacin.

Al M. Sc. Leonel Carrillo Ovalle por su apoyo incondicional, consejos, por su confianza y asesora durante la investigacin.

A Dr. Lenin Arias, de la Universidad de Jurez Autnoma de Tabasco, por brindarme su colaboracin en reactivos.

Al personal de la Estacin las Ninfas en Amatitln especialmente a la Licda. Silvia Guerra por brindarme los peces que fueron utilizados en la investigacin.

Al Ing. Gustavo Elas Ogaldez por su apoyo durante la investigacin.

RESUMEN Desde principios del siglo pasado, y tras el redescubrimiento de las leyes de Mendel, se comenz a aplicar la mejora gentica de los organismos, entre los mtodos mas prometedores estn los mtodos de manipulacin cromosmica como es la triploida.

Daz et al. (2005) dice que la aplicacin de choques trmicos calientes para la produccin de peces triploides tanto en la trucha, el salmn, la carpa, peces planos y hasta en la ostra japonesa, reportan excelentes resultados tanto en lo que concierne a la eficacia del tratamiento como a la supervivencia de los descendientes.

Este estudio tuvo como objetivo evaluar la eficacia del empleo de choque trmico post fecundacin para la produccin de tilapias triploides, determinar la intensidad de temperatura que genere mas triploida y cuantificar la sobrevivencia del choque trmico. Adicionalmente, se evalu el crecimiento entre las tilapias diploides y triploides durante tres meses haciendo muestreos de crecimiento cada quince das.

Los gametos fueron obtenidos a travs de masaje abdominal de reproductores maduros, se mezclaron en seco y se activaron con agua para su fecundacin. Despus de la fecundacin, el nmero total de huevos fue dividido en 4 tratamientos segn la

intensidad de temperatura del choque trmico: T1 el control (24C), T2 35C, T3 38C y T4 40C. El efecto del choque trmico, consiste en que si se aplica a un cigoto recin fecundado impide la extrusin del segundo cuerpo polar, producindose una descendencia triploide.

Al finalizar 3 meses de cultivo, los peces fueron sacrificados para la determinacin de ploida utilizando el mtodo de citogentica de tejido branquial y de rion. Se contabilizaron campos cromosmicos para determinar el nmero modal diploide y triploide.

Se obtuvo la supervivencia final en el T2 35C de 22.26%, para el T3 38C, la supervivencia fue de 10.9%, para el T4 40C de 0% y para el control 38%, lo que sugiere i

que la mortandad no fue ocasionada solamente por el estrs del choque trmico, sino tambin por el mecanismo de incubacin y fecundacin in vitro.

En el caso del nivel de ploida el numero modal diploide para tilapia es 2n = 44 cromosomas y 3n = 66 cromosomas, el T3 38C presento 100% de triploides mientras el de T2 35C present un 70% de eficacia en la produccin de tilapias triploides. Los alevines triploides al principio mostraron un crecimiento mas rezagado que los diploides, pero al final de los tres meses de cultivo en la prueba de hiptesis con un 95% de significancia, se revelo que los triploides tienen un mejor crecimiento.

Se puede deducir, que dese el punto de vista de la mejora, la importancia de las tcnicas de manipulacin cromosmica destinadas a la induccin de peces triploides radica en el control que la triploida ejerce sobre la maduracin sexual, ya que estos no la presentan, mostrando as un mejor crecimiento y un cultivo mas controlado.

En conclusin, los organismos triploides manifestaron mejor crecimiento, aunque su supervivencia es baja, por lo que se recomienda continuar con la estandarizacin del mtodo con la finalidad de aumentar el nmero de organismos vivos.

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NDICE DE CONTENIDO Pgina 1. INTRODUCCIN. 2. MARCO TEORICO. 2.1. Biotecnologa aplicada a la acuicultura. 2.2. Poliploidia 2.3. Procedimientos para la manipulacin cromosmica. 2.4. Principios bsicos de la preparacin de cromosomas en peces. 2.5. Determinacin de ploida. 2.6. Choque con temperatura para producir tilapias triploides. 2.7. Crecimiento en peces triploides. 2.8. Ventajas de los peces triploides. 2.9. Biologa de la especie. 3. HIPOTESIS 4. OBJETIVOS 4.1.Objetivo general. 4.2. Objetivos especficos. 5. METODOLOGA 5.1. Ubicacin geogrfica. 5.2. Procedimiento. 5.3. Anlisis estadstico. 5.4. Variables. 5.5. Anlisis de resultados. 5.6. Recursos. 6. RESULTADOS Y DISCUSIN 7. CONCLUSIONES 8. RECOMENDACIONES 9. BIBLIOGRAFA 10. ANEXOS 1 3 3 4 5 6 7 7 8 8 9 13 14 14 14 15 15 16 21 21 22 22 23 32 33 34 37

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NDICE DE CUADROS Pgina Cuadro No. 1. Tasa de supervivencia final y porcentaje de triploides inducido en cada uno de los niveles trmicos ensayados en tilapia O. niloticus. Cuadro No. 2. Cuadro No. 3. Supervivencia durante el tiempo de incubacin. Moda de los tratamientos indicando el nmero de cromosomas. Cuadro No. 4. Cuadro No. 5 A. Cuadro No. 6 A. Cuadro No. 7 A. Datos de crecimiento al inicio y al final del experimento. Sobrevivencia de huevos ensayo 4. Sobrevivencia de huevos ensayo 5. Resumen de las medias por muestreo de la evaluacin de crecimiento. Cuadro No. 8 A. Materiales, equipo, recursos financieros y recursos humanos. 28 23 23 27

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NDICE DE FIGURAS Pgina Figura No. 1. Figura No. 2. Ejemplar de tilapia O. niloticus. (A) Extraccin de semen con la ayuda de una pipeta pasteur; (B) masaje abdominal a una hembra de tilapia para la obtencin de ovocitos, tambin se puede apreciar la papila urogenital de color rojo intenso; (C) mezcla en seco del semen y los huevos; (D) activacin de los gametos con agua. Figura No. 3. Figura No. 4. Figura No. 5. Figura No. 6. Figura No. 7. Incubadora de huevos. Hidratacin de tejido branquial en citrato de sodio al 1%. Tubos eppendorf con tejido fijado. Larva de tilapia recin eclosionada. Comparacin de las tasas de supervivencia y porcentajes de triploides inducidos en tilapia segn distintos niveles trmicos aplicados. Figura No. 8. (A) Huevos que presentan forma de gemelos; (B) diferencia de tamao de los huevos que presentaron anomalas. Figura No. 9. (A) Campo cromosmico triploide 3n=66 cromosomas de tilapia; (B) Campo cromosmico diploide 2n=44 28 29 29 26 25 16 17 19 20 24 10

cromosomas de tilapia. Figura No. 10. Figura No. 11. Figura No. 12 A. Figura No. 13 A. Crecimiento de las tilapias diploides y triploides. Muestreo rutinario de peces triploides. Sacrificio de los organismos post inhibidor mittico. Tincin de laminillas en solucin giemsa.

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1. INTRODUCCIN. La demanda constante de protena animal para consumo humano a partir de cultivos en estanques, y no por extraccin directa del medio natural, se abre paso como alternativa en pases en desarrollo como forma de aliviar la presin por alimentacin de una creciente poblacin mundial. Esta oportunidad de suplir la gran demanda global, deja abierta la posibilidad de un mercado de carne de pescado muy prometedor para nuestro pas, si se consigue aumentar la produccin de esta especie por medios biotecnolgicos.

La tilapia es una especie africana de alto valor nutricional que se cultiva alrededor de todo el mundo. En Guatemala el cultivo de tilapia se lleva a cabo a nivel extensivo y semiintensivo llegando a la talla comercial de 0.45 kg en seis a ocho meses dependiendo del manejo, alimentacin y la gentica utilizada.

En Guatemala, el cultivo de tilapia aunque con poca tecnologa, se ha alcanzado una importante produccin anual que satisface las demandas internas de forma conveniente, un mejoramiento de los actuales procedimientos aumentara las posibilidades econmicas de sus productores con miras a un mercado externo ms competitivo.

El mejoramiento gentico de las especies es importante para optimizar los cultivos acucolas. En Guatemala se ha mejorado el cultivo de tilapia a travs de hormonas masculinizantes, tambin mejoramiento gentico a travs de programas de seleccin y actualmente con peces GMT (Tilapia Genticamente Macho) utilizando supermachos como reproductores. Sin embargo existen tcnicas ms baratas y rpidas para el mejoramiento gentico de las especies para su cultivo como es la triploida a travs de shock trmico. Los peces triploides segn la literatura tienen un mejor crecimiento al no presentar desarrollo gonadal.

La posibilidad de producir tilapias triploides es viable en nuestro pas, los beneficios de generar individuos triploides con la ayuda de la biotecnologa son mucho ms evidentes en los aspectos productivos y econmicos, ya que se obtendra un aumento de la produccin a un menor costo. Los peces triploides al ser estriles optimizan el cultivo 1

evitando peces precoces y gasto de energa en produccin de gnadas, que en peces triploides es aprovechada para el crecimiento, por lo que la utilizacin de tilapias triploides reducen los costos de produccin al evitarnos la compra de la hormona masculinizadora. Sin embargo, el mtodo de shock trmico tiene grandes tasas de mortalidad de alevines. La meta es diferenciar cuantitativamente el porcentaje de supervivencia, el porcentaje de peces triploides y las variables zoomorfomtricas atribuidas a la respuesta fisiolgica de las tilapias triploides.

A ciencia cierta no se sabe el porcentaje estndar de peces triploides que se obtienen utilizando el shock trmico, adicionalmente no se sabe el nivel de mortalidad que se tiene con este mtodo. Por lo que la presente investigacin aunque no se pudo validar el mtodo, sirve como referencia y gua respecto a esas dudas que se tienen de acuerdo a la triploida en tilapia.

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2. MARCO TEORICO. 2.1. Biotecnologa aplicada a la acuicultura. Daz y Neira (2005), afirman que en la actualidad existe una beneficiosa interaccin entre biotecnologa, concebida como un conjunto de tcnicas que utilizan o se aplican a organismos vivos para modificar o fabricar un producto de consumo o uso, y acuicultura, concebida como la produccin de organismos acuticos en sistemas controlados y con aplicaciones tecnolgicas que permiten manejar densidades poblacionales mayores que las naturales, optimizando su manejo en los cultivos, lo que habla de una acuicultura intensiva.

En la reproduccin de especies acucolas cultivadas, existen biotecnologas, fisiolgicas y genticas, cuya aplicacin puede producir efectos favorables para incrementar la capacidad productiva de especies econmicamente importantes. La factibilidad de aplicacin de estas tcnicas se ha demostrado en una amplia gama de especies.

Hermes et al,. (2004), asegura que para mejorar la produccin, la biotecnologa, proporciona las mejores ventajas en crecimiento y manejo debido al efecto de esterilidad producido por la poliploida, a travs de la manipulacin cromosmica mediante choque trmico para obtener individuos triploides.

Segn Hermes et al (2004), gran parte de Latinoamrica ha permanecido al margen de muchas de las .aplicaciones biotecnolgicas en peces como manipulacin cromosmica (ginognesis, andrognesis y poliploides), la tecnologa de la expresin proteica, los anlisis de caracterizacin gentica poblacional, el mapeo gnico, las vacunas de DNA, y los organismos modificados genticamente (OMG). Muchos pases, con amplia tradicin pesquera en Asia, Europa y Norteamrica, reconocen la utilidad de estas metodologas en la acuicultura como una estrategia para el desarrollo de una mayor fuente de protena animal para alimentar grandes grupos humanos, y crear otros derivados nutritivos para la dieta en animales. Por lo tanto, la biotecnologa, como metodologa de trabajo, abre la posibilidad de aumentar la produccin bajo los parmetros de seguridad alimentaria y produccin primaria a pequeos cultivadores en 3

la regin, proporcionando peces con mejores ventajas como mayor tamao y peso corporal mediante la manipulacin gentica, y especficamente, la produccin de individuos triploides.

Hermes et al. (2004), asegura que la biotecnologa ha hecho grandes contribuciones en todas las disciplinas de las ciencias biomdicas, la agricultura y las industrias farmacuticas en las ltimas dcadas, lo que posibilita su aplicacin en la acuicultura. Dentro de la manipulacin cromosmica en peces, se destacan los avances realizados en ginognesis, andrognesis y poliploidas en muchas especies de peces.

2.2. Poliploida. Daz y Neira (2005), indica que la poliploida es una variacin cuantitativa del genoma que afecta al conjunto de los cromosomas de las clulas, aumentando el nmero de juegos cromosmicos. En peces, la induccin experimental de poliploidas se realiza, evitando que se complete la meiosis II en la hembra, una vez que el ovocito es fecundado. De este modo se impide la reduccin del nmero de cromosomas a la mitad (n). Por lo tanto, el embrin presentar una constitucin cromosmica triploide (3n), formada por dos juegos cromosmicos maternos y uno paterno. Esta es una metodologa econmica, muy eficiente, con baja mortalidad, cuya nica desventaja es la pobre respuesta por parte de los machos. No obstante, es muy til cuando se manejan poblaciones constituidas slo por hembras.

Los mtodos experimentales utilizados para la obtencin de poliploides corresponden a. 1. Mtodos fsicos, ej. Choques trmicos de calor o fro, choques de presin o termoelctricos, 2. Mtodos qumicos, ej. Aplicaciones de citocalasina B, colchicina o 6dimetilaminopurina, y 3. Mtodos genticos, ej. Cruzamientos de hembras diploides con machos tetraploides.

Hermes et al (2004), indica que la produccin de poliploides mediante el tratamiento fsico de los gametos se ha convertido en una importante herramienta comercial para la industria de la acuicultura mundial, centrada principalmente en la produccin de 4

individuos triploides en varias especies de peces. El perfeccionamiento de las tcnicas desarrolladas para la manipulacin de la ploida en peces ha venido acompaado de un aumento en el inters por la viabilidad y el rendimiento de los individuos triploides.

Daz y Neira (2005), dice que la produccin de individuos poliploides tiene varias aplicaciones posibles. En el caso de los triploides, siendo stos total o parcialmente estriles, tienen utilidad para aumentar la eficiencia de produccin de carne al reducir el gasto de energa en el proceso de maduracin sexual, incrementando el crecimiento, evitando el deterioro en la calidad de la carne y previniendo cambios en la coloracin de la piel. Con la utilizacin de peces estriles se puede adems retrasar las cosechas, logrando peces de mayor peso y edad. Tambin se evita la aparicin de machos precoces entre los peces destinados a cosecha.

2.3. Procedimientos para la manipulacin cromosmica. Hermes et al (2004), expresa que aunque la poliploidia es un fenmeno de baja probabilidad en peces del medio natural, su frecuencia aumenta en la acuicultura donde los mtodos selectivos para su induccin como choques trmicos, por presin o agentes qumicos son de uso habitual. En este texto, slo considerar el mtodo de choque trmico por alta temperatura por ser el ms fcil para cualquier acuicultor, ya que es posible disponer de los recursos logsticos para alcanzar un alto porcentaje de triploides, y particularmente ventajosos debido al gran nmero de ovas que pueden ser tratadas. El procedimiento para el choque trmico en caliente de forma experimental en tilapia (O. niloticus) requiere de agua a temperatura graduada con termostato y un reloj con marcacin de segundos. Por el contrario, los choques por presin requieren de equipos hidrulicos especializados y los choques por agentes qumicos de sustancias de alto costo y en algunos casos de obligada importacin.

La induccin de poliploidas se ha aplicado a numerosas especies de peces donde se ha trabajado con las familias como Salmonidae, Characidae, Cyprinidae, Centrarchidae, Ciclilidae, Pleuronectidae. Tambin se ha analizado la utilizacin de choques trmicos fros en la induccin comercial de triploides, investigando los efectos de la duracin del 5

choque trmico fro en la supervivencia y en los porcentajes de tripliodas. Daz y Neira (2005), refiere que el objetivo de estas investigaciones ha sido obtener un 100 % de triploides, con la mejor supervivencia de larvas posible y comparar la supervivencia temprana y el crecimiento de triploides relacin con diploides.

Los efectos de la induccin de triploida en el metabolismo, la fisiologa, los parmetros citogenticos, la estructura de rganos y tejidos, el comportamiento y la calidad y conservacin de la canal han sido investigados en varias especies de telesteos.

Hermes et, al. (2004), seala que cuando consideramos que la produccin de peces triploides mediante choque trmico en caliente es una posibilidad biotecnolgica viable para implementar porque requiere de un bajo presupuesto, y los conocimientos fundamentales de un personal capacitado.

2.4. Principios bsicos de la preparacin de cromosomas en peces. Arias (1998), dice que antes de iniciar la aplicacin de la tcnica citogentica es necesario, conocer y discutir algunos aspectos bsicos y generales del procedimiento a seguir ya que este permitir, dependiendo del manejo que se haga la experiencia que se logre al respecto, obtener una buena cantidad de clulas detenidas en metafase con la calidad requerida para ser apropiadamente identificadas. Estas requerirn de una hidratacin, fijacin, tincin dispersiones cromosmicas. montaje adecuado, lo que nos facilitara observar

Kirpichinikov (1981), puntualiza que los cromosomas de peces son vistos al microscopio con ms facilidad durante la metafase de la mitosis, cuando ellos estn solamente condensados y definidos, segn Thorard y Disney (1990) y mejor an cuando han sido sometidos a una tcnica de tincin especfica.

Thorard y Disney (1990), indican que las preparaciones cromosmicas de clulas mitticas en divisin, se pueden obtener a partir de una variedad de tejidos durante

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diferentes fases de la vida del pez, tambin pueden ser obtenidas clulas meiticas a partir de las gnadas indican.

Un procedimiento ampliamente extendido entre los citogenetistas para la determinacin de pares cromosmicos es el desarrollado por Levan et al. (1964) en l se describe un sistema de clasificacin de los cromosomas basado en la posicin del centrmero por lo que se clasifican en varias categoras con base en la posicin de esta estructura y el tamao que guardan los brazos cromosmicos atendiendo a la posicin de este.

2.5. Determinacin de ploida. Para conocer el porcentaje de poliploides en los lotes donde se hayan realizado los tratamientos trmicos, se han descrito una de las metodologas como es la citogentica la cual se describe a continuacin.

2.5.1. Citogentica. Hermes et al. (2004), indica que la citogentica determina el nmero de cromosomas de una especie, el cual tiene un significado adaptativo y evolutivo. En el caso de la tilapia O. niloticus se ha determinado que su nmero diploide es 2n= 44 cromosomas. En citogentica, la determinacin se realiza contando el nmero de cromosomas en la metafase de las clulas, lo que significa que para esta especie un organismo haploide tendra un nmero n= 22, triploide 3n= 66 y tetraploide 4n= 88 cromosomas.

2.6. Choque con alta temperatura para la produccin de tilapias triploides. Brmick et al. (1995), revela que los procedimientos de choque trmico en caliente para la produccin de triploides, teniendo en cuenta la temperatura y la duracin del choque trmico, as como tiempo despus de la fertilizacin, han sido descritos por varios autores con diferentes porcentajes de xito. El procedimiento consiste en tomar los oocitos fecundados y colocarlos en un bao mara con temperatura alta constante (40C) por un intervalo de tiempo apropiado (3 min.) para no permitir la migracin de los cromosomas por dao del huso nuclear y alcanzar un alto porcentaje de triploides.

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Brmick et al. (1995), exterioriza que se pueden obtener tanto triploides (s el choque trmico se hace al poco tiempo despus de la fertilizacin de tal forma que se retenga el segundo cuerpo polar - choque trmico meitico o temprano), como tetraploides (si el choque trmico se hace una vez se han iniciado las divisiones mitticas, de tal forma que se duplique el nmero cromosmico - choque trmico mittico o tardo).

Brmick et al. (1995), dice que ciertamente, un efecto drstico del cambio de temperatura en el proceso de desarrollo embrionario ocasiona una mortalidad de un 50% en promedio, lo que es susceptible de reducir en cada una de las diferentes incubadoras, mediante pruebas de ensayo y error de pequeas cantidades de ovas bajo distintos tratamientos trmicos. Sin duda, cada cultivador debe estandarizar su procedimiento de produccin de triploides segn las condiciones reproductivas y de agua.

2.7 Crecimiento en peces triploides. Vzquez et al. (2002), menciona que el crecimiento de los peces triploides de diversas especies ha sido objetivo de mltiples trabajos cuyos resultados no indican una pauta sostenida de comportamiento en cuanto a esta variable, obtenindose a menudo resultados contradictorios, incluso entre individuos de la misma especie.

Las comparaciones indican que las similitudes son mayores entre cada grupo triploide y su control correspondiente que las existentes entre los grupos con el mismo nivel de ploida, lo que parece sugerir un mayor peso de los factores ambientales y genticos en el crecimiento que del factor ploida. Estos resultados son coincidentes con los encontrados por diferentes autores para distintas especies, como tilapia O. niloticus.

2.8. Ventajas de los peces triploides. Los individuos triploides tienen como caracterstica fundamental su esterilidad, lo que les confiere utilidad en campos diversos.

Vzquez et al. (2002), asegura que los organismos triploides difieren de los diploides tanto en el nmero de clulas como en el tamao de las mismas, lo que, a menudo, da 8

como resultado diferencias en el crecimiento y en el comportamiento cuando se comparan diploides y triploides mantenidos en las mismas condiciones.

Galbreath et al. (1994), menciona que en algunos casos se logran mejores conversiones de alimento con reduccin de costos, y se obtienen peces con buena calidad de carne para su procesamiento y comercializacin.

2.9. Biologa de la especie. 2.9.1. Distribucin geogrfica. De acuerdo a Pillay (1993), las tilapias son peces de la familia Cichlidae nativos de frica que han sido introducidos a un gran nmero de pases con climas tropicales y subtropicales en todo el mundo. 2.9.2 Taxonoma. Reyno: Phylum: Subphylum: Superclase: Serie: Clase: Orden: Suborden: Familia: Gnero: Especie: Nombre Cientfico: Nombre Comn: Cantor, (2007). Animal Chordata Vertebrata Gnathostomata Pisces Actinopterygii Perciformes Percoidei Cichlidae Oreochromis niloticus Oreochromis niloticus Tilapia.

2.9.3 Caractersticas biolgicas. Mair G, y Little D, (1991); Maclntosh D, y Little D, (1995), aseguran en cuanto a su apariencia general, O. niloticus presenta una coloracin normal gris plateada con franjas 9

de tono gris oscuro a negras.

Los ejemplares presentan usualmente un grado

significativo de dimorfismo sexual, que incluye diferente patrn de coloracin, siendo generalmente lo machos ms grandes que las hembras a la misma edad y con mayor coloracin en la temporada de desove. Las formas rojas corresponden a individuos originados en un inicio de lneas puras en Egipto; o bien el hbrido rojo proveniente del entrecruzamiento entre Oreochromis niloticus y Oreochromis mossambicus que a su vez ha sido hibridizado con otras especies, proporcionando una amplia gama de mezcla de color. Estas caractersticas particulares y en conjunto con su rpido crecimiento hacen a la especie atractiva para el cultivo.

Figura No. 1 Ejemplar de tilapia O. niloticus. Fuente: Elaboracin Propia. 2.9.4. Hbitat. Iturbide (2004), dice que las tilapias o mojarras, como se les conoce comnmente en Guatemala son especies aptas para el cultivo en zonas tropicales y subtropicales del pas.

Segn Gmez (2005), se les encuentra habitando en aguas lnticas (lentas), principalmente someras o turbias (estancadas o inactivas) como lagos, lagunas, litorales, bordos, estanques, charcos as como tambin en loticas (aguas corrientes) a orillas de ros entre piedras y plantas acuticas e inclusive en aguas marinas.

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Cantor (2007), exterioriza que el hbitat que prefieren es de fondo lodoso, toleran altas salinidades, son peces eurihalinos, o sea que pueden vivir en aguas dulces, salobres y marinas, el rango de tolerancia es de 0/00 a 40/00(partes por mil) y en algunos casos, se ha presentado por arriba de esta salinidad.

2.9.5. Hbitos alimenticios. Teich-Coddington et al. (1997), afirma que los cclidos son considerados como omnvoros que hasta su etapa de cra de 5 cm. presenta preferencias fitoplanctofagas, puesto que su alimentacin se basa en el consumo de zooplancton, insectos y vegetales acuticos, y de alimentos artificiales como harinas y granos. Es considerado un pez filtrador por lo que tiene la capacidad de capturar eficientemente organismos planctnicos de la columna de agua. Asimismo, digiere con gran xito la mayora de los componentes de las dietas, en particular resulta interesante la alta digestibilidad que presentan algunos compuestos que no son aprovechables por otras especies de peces como los carbohidratos complejos y alimentos ricos en fibra. La digestin y asimilacin del material es buena ya que realiza en su intestino largo, que puede llegar a medir 6 veces la longitud total del pez.

MacIntosh y Little (1995), dicen que en el caso de las cras, son principalmente planctfagas, aunque pueden consumir una amplia variedad de alimentos particulados. En el cultivo, el crecimiento y supervivencia de las cras son mejorados notablemente cuando se alimentan con frecuencia; de esta manera se garantiza que siempre tenga alimento disponible.

2.9.6. Hbitos reproductivos. Segn Iturbide (2004), la madurez sexual ocurre como en la mayora de los organismos como una respuesta a ciertas condiciones ambientales como la temperatura, fotoperiodo, disponibilidad de alimento, la presencia del sexo opuesto y la densidad. La tilapia del Nilo, puede madurar sexualmente en los primeros 6 meses de vida, inclusive cuando es muy pequea con 40 g de peso. La madurez sexual depende del tamao y la edad de los organismos. 11

Mair y Little (1991); Macintosh y Little (1995); Teichert-Coddington et al. (1997), revelan que en condiciones silvestres en los lagos de frica de donde es originaria, Oreochromis niloticus madura a los 10 o 12 meses de edad con peso de 350 a 500 gr. Cuando es cultivada en estanques y con condiciones favorables para su crecimiento a los 4 a 6 meses con un peso de 150 gr; o bien, inclusive en un ambiente con escasez de alimento o limitaciones de espacio puede alcanzar la madurez a un peso tan bajo como de 20 gr. Esto se debe a que la especie como estrategia de supervivencia de sus poblaciones tienen la capacidad de desviar o sacrificar parte de su energa originalmente destinada al crecimiento y utilizarla en eventos reproductivos.

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3.

HIPOTESIS.

H1. Existen diferentes formas de produccin de peces triploides, por lo que el tratamiento de shock trmico producir al menos 90% de tilapias triploides, adicionalmente estas presentaran una mejor tasa de crecimiento y sobrevivencia en relacin al testigo.

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4. 4.1. Objetivo general.

OBJETIVOS.

4.1.1. Validar el mtodo de shock trmico para la produccin de tilapias triploides.

4.2. Objetivos especficos. 4.2.1. Determinar el porcentaje de tilapias triploides producidas por shock trmico.

4.2.2. Conocer la sobrevivencia de alevines de tilapia sometidos al tratamiento de shock trmico.

4.2.3. Evaluar el crecimiento entre tilapias diploides y triploides durante tres meses.

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5. 5.1. Ubicacin geogrfica.

METODOLOGA

La investigacin se llevo a cabo en tres lugares, la induccin a la ploida se llevo a cabo durante los meses de agosto a octubre del ao 2010 en la Estacin Experimental Las Ninfas Amatitln. La incubacin de los huevos en un laboratorio ubicado en la zona 7 de la Ciudad de Guatemala y la fase de crecimiento y evaluacin de ploida se llevo a cabo de octubre a diciembre del ao 2010, en el Laboratorio de Investigacin Aplicada LIA del Centro de Estudios del Mar y Acuicultura CEMA, ubicado en el edificio T14 de la Ciudad Universitaria, de la Universidad de San Carlos de Guatemala USAC, en la zona 12, de la ciudad de Guatemala.

5.2. Procedimiento. El experimento se baso en la produccin de tilapias triploides utilizando la tcnica de shock trmico, tambin se evalu el crecimiento de las tilapias triploides con el de tilapias diploides (normales) durante tres meses, as como la sobrevivencia y eficacia del tratamiento de shock trmico. La investigacin se dividi en 5 fases que a continuacin se explican:

5.2.1. Fase 1 Se prestaron reproductores de tilapia (4 hembras y 2 machos) de la Estacin

Experimental las Ninfas ubicada en Amatitln. Los especmenes fueron transportados a tanques (1,000 litros), donde se les dio las condiciones adecuadas en calidad de agua (oxigeno, temperatura y transparencia) hasta que maduraron y fueron empleados para dar cumplimiento a la reproduccin . En esta fase se realizo la induccin al desove de O. niloticus adultos despus de haber observado el estado gonadal de la hembra a travs de la observacin al estereoscopio de los vulos utilizando la solucin aclaradora (anexo 1), y la papila urogenital de la hembra la cual al estar de color rojiza intensa indica que los huevos estn maduros.

Luego los vulos y los espermatozoides fueron extrados a travs de masaje abdominal (Figura No. 2), seguidamente los huevos de las hembras se mezclaron en seco con la 15

ayuda de una pluma juntamente con el semen de los machos y seguidamente se activaron los gametos a travs de agua para la fertilizacin.

Figura No. 2. (A) Extraccin de semen con la ayuda de una pipeta pasteur; (B) masaje abdominal a una hembra de tilapia para la obtencin de ovocitos, tambin se puede apreciar la papila urogenital de color rojo intenso; (C) mezcla en seco del semen y los huevos; (D) activacin de los gametos con agua. Fuente: Elaboracin propia.

5.2.2. Fase 2 Despus de la fertilizacin, el nmero total de huevos fue dividida en cuatro tratamientos: T1 el control, T2 35C, a T3 38C y a T4 40C.. Se espero 4 minutos post fecundacin y se inicia el tratamiento de triploidizacin, el cual consiste en quitar los huevos de temperatura ambiente (24C) y colocarlos por un lapso de 4.5 minutos en bao mara con los tratamientos antes mencionados a T2 35C, a T3 38C y a T4 40C. 16

Luego los huevos son llevados a un diseo especial de incubadora la cual mantuvo un flujo constante de agua que mantiene los huevos suspendidos en el agua y oxigenados, con una gota de azul de metileno por galn as evitando que se adhirieran hongos a estos, se colocaron a temperatura ambiente 24C. Donde permanecieron un promedio de siete das hasta la eclosin de los huevos.

Figura No. 3. Incubadora de huevos. Fuente: Elaboracin propia.

5.2.3. Fase 3. Se evalu el crecimiento de las tilapias triploides versus las tilapias normales durante 3 meses, la evaluacin consisti en 3 tratamientos, 3 del de shock trmico de 35C y 38C (supuestas triploides) y el control (normales).

Los alevines de tilapia fueron trasladados a acuarios a una densidad de 25 organismos por m2, quedando as cada tratamiento de 8 individuos, los cuales fueron tomados cada uno como unidad experimental.

17

El crecimiento fue evaluado a travs de cuadros con los ndices zootcnicos aplicados a tilapia (edad en semanas, peso, longitud, FCA y la tasa de crecimiento), los muestreos fueron rutinarios cada 15 das.

Las tasas de crecimiento han sido calculadas mediante la frmula: TC = [ (PT pt) / (T t)]

Donde PT y pt representan los pesos medios en los tratamientos efectuados en los tiempos T y t, la diferencia (T-t) el nmero de das transcurridos.

5.2.4. Fase 4 La evaluacin de ploida se hizo a travs de tcnicas citogenticas. La cual se describe a continuacin:

Se seleccionaron 10 organismos al azar para cada tratamiento, es decir se evaluaron un total de 30 muestras.

Se hizo de acuerdo a la metodologa de Arias-Rodriguez et al., (2006), donde a los organismos vivos, se les inyecto colchicina disuelta en una solucin de citrato de sodio al 0.1% a una concentracin de 30 g/g de peso del ejemplar y exposicin de 6 horas.

Siguiendo la metodologa de Arias-Rodrguez et al. (2006), los peces tratados fueron sacrificados con shock trmico fro y se les extrajo los tejidos de las branquias y el rin para ser hidratados por 80 minutos en una solucin de citrato de sodio al 1.0% (Figura No. 4).

Los tejidos fueron fijados posteriormente con metanol (4) y cido actico en proporcin 4:1, respectivamente. Y estos fueron introducidos en tubos de reaccin eppendorf de 2.5 ml.

18

Figura No. 4. Hidratacin de tejido branquial en citrato de sodio al 1%. Fuente: Elaboracin propia.

El fijador se reemplazo cada 10 minutos despus de cada centrifugado a 4C con una centrifuga en fro (equipo disponible CEMA Laboratorio de Biologa molecular) a 5000 rpm por cuatro veces, a continuacin los tejidos se preservaron a -20C.

La solucin fijada de cada tejido, se utilizo para preparar las laminillas por la tcnica de goteo desde una altura aproximada de 1.70 m, dejando caer sobre laminillas esteriles y fras, seguido se uso la tcnica de secado a la flama con un mechero de alcohol; consecutivamente las laminillas se incubaron en una estufa por 24 hrs a 45C.

La tincin de las laminillas secas se realizo con una solucin de giemsa al 10%, que se preparo en fosfato buffer a pH=7.0, se sumergen las laminillas durante 15 minutos en el colorante, luego se lavan y ponen a secar por 2 horas.

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Figura No. 5. Tubos eppendorf con tejido fijado. Fuente: Elaboracin propia.

Se analizo 1 laminilla por cada tejido extrado, branquial y de rin,

es decir 2

laminillas por organismo y fueron 10 organismos por tratamiento que se seleccionaron, es decir 40 laminillas por tratamiento (control, 35C y 38C) para tener un total de 120 laminillas.

Se realizo el conteo cromosmico con la ayuda de un microscopio ptico donde se vieron las laminillas y se buscaron y se contabilizaron las 10 mejores dispersiones cromosmicas (menos encimadas y contradas) en mitosis, con los objetivos 10X, 40X y 100X y las mejores dispersiones pudieron foto digitalizarse con un microscopio ptico adaptado a una cmara digital para evidenciar el hecho.

El nmero cromosmico modal de ploidia, se determino por conteo de las mejores dispersiones cromosmicas bajo el microscopio y en foto impresos de alta resolucin de las figuras cromosmicas digitalizadas.

20

La variacin en el nmero de cromosomas fue evaluada por la frecuencia registrada en triploides y diploides, de ese modo se determinarn el nmero de organismos triploides obtenidos a travs del tratamiento de shock trmico.

5.2.5. Fase 5 La fase 5, consisti en la evaluacin estadstica y trabajo de gabinete donde se analizaron los resultados para la presente publicacin.

5.3. Anlisis estadstico. El anlisis estadstico del crecimiento se llevo a cabo por medio de una prueba de hiptesis comparando las medias de la tasa de crecimiento final entre los tratamientos de peces triploides 35C y 38C (1) y el peso promedio de las tilapias normales control (2), donde la hiptesis tendr un nivel de significancia del 95%, quedando la hiptesis planteada de la siguiente manera: H0: 1 = 2 H1: 1 > 2 La variacin en el nmero de cromosomas ser evaluada al final de la investigacin por la frecuencia registrada en triploides y diploides, de ese modo podr determinarse el nmero de organismos triploides obtenidos a travs del tratamiento de shock trmico realizando el respectivo histograma de la frecuencia del numero de cromosomas.

5.4 Variables. 5.4.1 Variables dependientes. Peso (g). Porcentaje de triploida (%) Porcentaje de sobrevivencia (%)

5.4.2. Variables independientes. Shock trmico a 35C, 38C y 40C

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5.5. Anlisis de resultados. La tabulacin de los datos se hizo a travs del programa Microsoft Excel 2007, el cual fue utilizado para el anlisis estadstico, correlacin de datos, y se diseo en l una hoja de clculo para cada tratamiento a manera de calcular las variables independientes y plasmar las dependientes, los resultados son presentados en forma de cuadros y grficos. 5.6. Recursos. Ver anexos cuadro No. 8 A.

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6.

RESULTADOS Y DISCUSIN.

Los resultados obtenidos con el choque trmico aplicado a tres diferentes temperaturas T2 35C, T3 38C y T4 40C por 4.5 minutos post fecundacin se muestran resumidos en el Cuadro No. 2. Junto con el nmero total de huevos que fueron sometidos a los tratamientos, y los valores de supervivencia hasta los 7 das de vida.

Cuadro No. 1. Tasa de supervivencia final y porcentaje de triploides inducido en cada uno de los niveles trmicos ensayados en tilapia O. niloticus. Total de Tratamiento huevos T1 24C 107 T2 35C 109 T3 38C 109 T4 40C 131 Fuente: Elaboracin propia. Sobrevivencia final% Triploides 38.08% 0.82% 0% 22.26% 3.88% 70% 10.90% 0.52% 100% 0.00% 0.00% 0%

El tratamiento T2 35C fue el que mostr la mayor supervivencia pero el menor porcentaje de triploides y el tratamiento de T4 40C presento mayor mortalidad con 0% de supervivencia. Cabe recalcar que se tiene igualmente un bajo porcentaje de sobrevivencia en el control.

Cuadro No. 2. Supervivencia media durante el tiempo de incubacin.Supervivencia No. de individuos Tratamiento Da 1 Da 2 Da 3 Da 4 Da 5 Da 6 Da 7

T1 24C T2 35C T3 38C

107 109 109

88 75 83

71 61 76

65 56 52 7

56 46 39 0

44 31 26 0

41 25 12 0

T4 40C 131 50 31 Fuente: Elaboracin propia.

Se observ una alta mortalidad de los embriones entre el momento de la fertilizacin y la primera semana de vida como se observa en el Cuadro No. 3. Este hecho tambin fue reportado por Hussain et al. (1993) y vila, (2004).

23

El sistema de incubacin y el mtodo utilizados en la fecundacin in vitro, en este estudio pudieron haber contribuido a la baja tasa de supervivencia, como lo sugiere Shelton (2002), quien concluye que la tasa de supervivencia baja observada pueden atribuirse al hecho de que el mecanismo de manipulacin de la reproduccin y la incubacin artificial de tilapia (exclusin de los gametos, fecundacin in vitro y la incubacin artificial) puede afectar las tasas de mortalidad en comparacin con la cra y la eclosin natural. As mismo, Arai (2001), describe que las tcnicas para inhibir la 1 divisin de embriones generalmente resultan en bajas tasas de supervivencia.

Figura No. 6. Larva de tilapia recin eclosionada. Fuente: Elaboracin propia.

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100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Control (24C) 35C Nivel Trmico 38C 40C Triploides Sobrevivencia final% %

Figura No. 7. Comparacin de las tasas de supervivencia y porcentajes de triploides inducidos en tilapia segn distintos niveles trmicos aplicados. Fuente: Elaboracin propia.

Como puede observarse en la Figura No. 7, el porcentaje de triploides es directamente proporcional a la temperatura de choque trmico, e inversamente proporcional con la supervivencia.

Mair (1993), explica que las causas que determinan la induccin de triploidia con cambios bruscos de temperatura, es debido a la influencia de las altas temperaturas sobre la oognesis. Concretamente si se aplica el choque trmico a un cigoto recin fecundado, impide la extrusin del segundo cuerpo polar producindose una descendencia triploide.

La distincin de individuos poliploides en base a caractersticas morfolgicas es difcil en la mayora de las especies. Sin embargo, se pudo apreciar que los huevos diploides eclosionaron unas 8 horas antes que los sometidos a tratamiento, adems las larvas del control presentaron mayor motilidad y ms dinmicos que los sometidos al shock trmico. 25

Cabe sealar que algunos huevos de tilapia resultantes de los tratamientos, presentaron anomalas o deformidades, se encontr cambios muy visibles. Cambios encontrados que se encuentran en el estudio fueron que los huevos tenan un gran tamao, deformaciones en los huevos no parecan redondos ni ovoides, algunos eran gemelos y eran dbiles debido a esto se moran rpido. Los huevos que presentaron estas anomalas eran triploides, ya que slo estos tratamientos los presentaron en muy poco porcentaje (13% del total) pero era importante mencionarlos.

Figura No. 8. (A) Huevos que presentan forma de gemelos; (B) diferencia de tamao de los huevos que presentaron anomalas. Fuente: Elaboracin propia.

Se analizaron un total de 30 peces, 10 de cada tratamiento, para determinar el nivel de ploida, donde se contabilizaron un total de 100 campos cromosmicos por tratamiento, y as se estimo la moda de cada tratamiento.

Todos los otros tratamientos mostraron triploida a excepcin claro del control. El tratamiento T3 38C, present el 100% de los individuos triploides. Mientras el tratamiento de choque trmico T2 35C present un 70% de triploida (Cuadro No. 3).

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Cuadro No. 3. Moda de los tratamientos indicando el nmero de cromosomas.T1 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 100% moda T2 35 66 44 66 66 44 66 66 66 44 66 70% T3 38 66 66 66 66 66 66 66 66 66 66 100%

Fuente: Elaboracin propia.

La moda del nmero de los campos cromosmicos contados de los 10 organismos de cada tratamiento. El T2 35C muestra que no es uniforme debido a que el 30% son diploides, mientras que el T3 38C muestra 100% de triploida, los individuos sometidos a anlisis cromosmico en diferentes tratamientos mostr que el nmero modal de diploides normales de la especie, 2n = 44 cromosomas, y 3n = 66 (Figura No. 9), esta de acuerdo con la resultados obtenidos por Myers, (1986), El Gamal et al. (1999), Shelton, (2002), Herbst (2002) y vila, (2004). Los tratamientos de choque trmico se

consideran los ms adecuados para inducir poliploida, con base en porcentajes de los individuos poliploides viables producidos y la supervivencia concluyo Hussain et al. (1993).

Es importante tener en cuenta la dificultad de inducir a la tilapia al desove, ya que esta especie desova ovocitos en varias ocasiones en el curso de desove. Por esta razn, los ovarios de estos peces contienen los ovocitos en todas las etapas de desenvolvimiento, que van madurando en cuotas, que caracteriza asincronismo en el desove de los peces Carrillo y Rodriguez, (2001).

27

Figura No. 9. (A) Campo cromosmico triploide 3n=66 cromosomas de tilapia; (B) Campo cromosmico diploide 2n=44 cromosomas de tilapia. Fuente: Elaboracin propia.

El mtodo de citogentica para la evaluacin de ploida, es de los ms empleados debido a la exactitud del mismo. La determinacin del nmero cromosmico en metafase mittica es fcil en estados de crecimiento de los peces, debido al alto ndice de clulas que se encuentran en metafase, sin embargo es una tcnica destructiva.

Cuadro No. 4. Datos de crecimiento al inicio y al final del experimento. Tratamiento Peso inicial g. Peso Final g. T1 Control 2.83 0.932 29.84 2.495 T2 35 2.08 0.785 31.45 3.71 T3 38 1.58 0.650 33.78 3.352 Edad das 31 89 Fuente: Elaboracin propia No. De organismos 8 8 8 Tasa de crecimiento 0.47 g/da 0.51 g/da 0.55g/da

La Tasa de Crecimiento TC fue calculada con la siguiente formula: TC = [(PT pt)/(T t)] Donde PT y pt representan los pesos medios en los tratamientos efectuados en los tiempos T y t, la diferencia (T-t) el nmero de das transcurridos. En los primeros das los diploides tienen mayor peso. Sin embargo, se observa que T235C y T3 38C son muy parecidos y tienen ligero incremento de peso final superior al control. 28

40 35 30 25 Peso (g.) 20 15 10 5 0 19 31 48 Das 60 76 87 Control 35 38

Figura No. 10. Crecimiento de las tilapias diploides y triploides. Fuente: Elaboracin propia.

Figura No. 11. Muestreo rutinario de peces triploides. Fuente: Elaboracin propia. 29

Para la prueba de hiptesis se tomaran los datos finales en peso (g.) de los peces triploides y diploides.Diploide Triploides Media g. Desv. Est. 29.84 2.495 32.615 1.6475588

H0: 1 = 2 Diferencia se debe al azar H1: 1 > 2 Hay diferencia significativa

Donde se utilizo las desviaciones tpicas mustrales como estimaciones de 1 y 2.

Con un contraste de una cola al nivel de significacin 0.05, rechazamos la hiptesis nula ya que z es mayor que 1.645 el cual es el valor crtico de z para pruebas unilaterales.

Segn los datos, tambin al principio los triploides presentan bajo crecimiento debido al estrs sufrido en la etapa larvaria, sin embargo se espera que ese crecimiento se vea compensado en la formacin de las gnadas de los diploides. Ya que se observo que al finalizar los 3 meses hay diferencia significativa entre los peces triploides y diploides

Se puede deducir, que desde el punto de vista de la mejora, la importancia de las tcnicas de manipulacin cromosmica destinadas a la induccin de peces triploides, radica en el control que la triploida ejerce sobre la maduracin sexual, ya que en esta edad cuando los diploides empezaron a formar gnadas, mientras que los triploides siguieron creciendo.

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Segn Brmick (1995), a pesar de los beneficios de los triploides, en tilapia se presenta menor viabilidad cuando la especie cultivada se somete a un programa de triploidizacin artificial, este descenso de la viabilidad viene marcado principalmente por el menor nmero de huevos con respecto a los diploides.

31

7.

CONCLUSIONES.

7.1. No se pudo validar el mtodo de shock trmico para la produccin de tilapias triploides pues el sistema de incubacin, la manipulacin de la reproduccin y fecundacin in vitro pudieron ser mal manejados, ocasionando as baja tasa de supervivencia.

7.2. El porcentaje de tilapias triploides varia de acuerdo a la intensidad del choque trmico pues para este experimento a una intensidad de 35C se obtiene un 70% de tilapias triploides mientras que a 38C un total de 100%.

7.3. La aplicacin de choque trmico result en un ndice de muy alta mortalidad. Alcanzando una sobrevivencia de 11% y 22.26% para los tratamientos de 38C y 35C respectivamente, mientras que a una intensidad de 40C de choque trmico la sobrevivencia es 0%.

7.4. Al finalizar los tres meses de evaluacin de crecimiento se observa diferencia significativa entre las medias de los diploides y los triploides, presentando mejor crecimiento los triploides.

7.5. Para la aplicacin de la tcnica de shock trmico, se requiere de la experiencia previa en el manejo de los reproductores, la obtencin de los gametos y la fertilizacin artificial. As mismo, conocer el tiempo despus de la fertilizacin de los huevos en el que aplicar el tratamiento con el fin de manipular los juegos enteros de cromosomas.

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8. RECOMENDACIONES.

8.1. Realizar ms pruebas que corroboran la induccin de triploida a travs de cambios bruscos de temperatura, principalmente a 35C y 38C.

8.2. Evaluar el crecimiento de tilapias triploides por un ciclo completo.

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36

10. ANEXOS.

37

Anexo No. 1 Solucin YBAG/85 (Solucin aclaradora) La solucin aclaradora de ovulos se compone de lo siguiente:

Alcohol etlico absoluto 6 ml Formol Glicerol cido actico glacial 3 ml 2 ml 1 ml

Todos los componentes se mezclan y se conserva la solucin en un frasco mbar. Cuando los ovocitos estn disponibles, colocarlos en una caja Petri, mismos a los que se les agregar la solucin en una proporcin de 1:10. Siendo posible la observacin de los ovocitos aclarados en un estereoscopio despus de 4 minutos de expuestos a la solucin, alrededor de 25 minutos hasta que se degrade el ovocito. Fuente: Arias (1998).

Cuadro No.5 A. Sobrevivencia de huevos ensayo 4.

Ensayo 4Temperatura Shock Da 1 2 3 4 5 6 7 Porcentaje Control 24C 75 56 42 38 38 32 29 39% 35 68 50 41 39 32 23 17 25% 38 71 48 41 28 21 14 8 11%90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 Das Sobreviencia de huevos No.

Fecha: 1/10/2010

40 82 38 23 4 0 0 0 0%

Porcentaje de sobrevivencia50%Sobrevivencia 40% 30% 20% 10% 0% Series1 1 39% 2 25% 3 11% 4 0%

sobrevivencia

Control 24C 35 38 40 5 6 7

Fuente: Elaboracin propia

Cuadro No. 6 A. Sobrevivencia de huevos ensayo 5.

Ensayo 5Da 1 2 3 4 5 6 7 Porcentaje60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 Das 4 5 6 7 Control 35 38 40

Fecha: 19/10/2010

Control 32 32 29 27 18 12 12 38%

Temperatura Shock 35 38 41 38 25 35 20 35 17 24 14 18 8 12 8 4 20% 11%

40 49 12 8 3 0 0 0 0

Fuente: Elaboracin propia

Sobreviencia de huevos No.

Sobrevivencia

Cuadro No. 7 A. Resumen de las medias por muestreo de la evaluacin de crecimiento.

Tratamiento Talla cm Peso g 2n 3.73 19/10/2010 Muestreo 1 3n 35 3.38 3n 38 2.98 2n 5.18 2.83 02/11/2010 Muestreo 2 3n 35 4.93 2.08 3n 38 4.45 1.58 2n 6.05 8.44 19/11/2010 Muestreo 3 3n 35 5.92 8.32 3n 38 5.90 7.80 2n 9.61 12.45 01/12/2010 Muestreo 4 3n 35 7.4 11.93 3n 38 8.34 11.81 2n 11.5 17.98 17/12/2010 Muestreo 5 3n 35 10.65 18.45 3n 38 10.37 21.7 2n 14.96 29.84 28/12/2010 Muestreo 6 3n 35 13.85 31.45 3n 38 14.38 33.78 Fuente: Elaboracin propia.

fecha

FCA Sobrevivencia 100% 100% 100% 1.94 100% 2.45 100% 2.82 100% 1.82 100% 1.9 100% 2.3 100% 1.75 100% 1.47 100% 1.73 100% 1.7 100% 1.85 100% 1.82 100% 1.46 100% 1.89 100% 1.97 100%

Figura No. 12 A. Sacrificio de los organismos post inhibidor mittico. Fuente: Elaboracin propia.

Figura No. 13 A. Tincin de laminillas en solucin giemsa. Fuente: Elaboracin propia.

Cuadro No.8 A Materiales, equipo, recursos financieros y recursos humanos. Material Reproductores de tilapia Incubadoras de Huevos Pesceras Cajas de Petri Estuche de Diseccin Termostatos Colchicina Inyecciones para insulina Citrato de Sodio Giemsa Metanol Alimento de tilapias Tubos Eppendorf Porta Objetos Tinaco de Transporte Mangueras de aireacin Piedras difusoras Gasolina Cabezas de Poder Regletas de electricidad TOTAL Equipo Centrifuga en Fro Microscopio Mechero Transformador de energa Vehiculo Congelador Recurso financiero ------------Q300.00 ------------Q125.00 Q160.00 ------------------------Q25.00 ------------------------------------Q250.00 -----------Q75.00 ------------------------------------Q200.00 Q400.00 Q300.00 Q.2,260.00 -------------------------------------------------------------------------

Recursos Humanos T.A. Mario Abraham Hernndez Ms. C. Leonel Carrillo Ing. Gustavo Elas Ogaldez Dr. Lenn Arias Rodrguez Fuente: elaboracin propia.

Investigador Asesor de investigacin Responsable de curso Colaborador