3' conicyt

3' CONICYT COMISIÓN NACIONAL DE INVESTIGACIÓN • CIENTÍFICA Y TECNOLÓGICA

GOBIERNO DE CHILE

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(OMISIUN NACIONAL DE INVESTTGACTON CIENCTA Y TECNOLOGIA

VERSION OFICIAL

FECHA: 31/10/2010

PROYECTO INICIACION N°11070067

INVESTIGADOR RESPONSABLE: VIOLETA MARILYN MORIN MUOZ

FONDO NACIONAL DE DESARROLLO CIENTIFICO Y TECNOLOGICO (FONDECYT) Bernarda Morín 551, Providencia - casilla 297-y, Santiago 21

Telefono: 435 43 50 FAX 365 4435

Email: infornies.fondecytconicyt.c1

'CONICYT COMISIÓN NACIONAC DE INVESTIGACIÓN

CIENTÍFICA Y TECNOLÓGICA

GOBIERNO DE CHILE

COMPROBANTE DE RECEPCIÓN DE INFORME FINAL

N° PROYECTO: 11070067

INVESTIGADOR(A) RESPONSABLE : VIOLETA MARILYN MORIN MUÑOZ RUT: 8.721.305-6 TÍTULO PROYECTO: CARACTERIZACION Y LOCALIZACION SUBCELULAR DE UNA CISTEIN PROTEASA,

VARIANTE DE CATEPSINA L, PRESENTE EN CELULAS DE CANCER. COLORRECTAL.

DISCIPLINA PRINCIPAL: BIOQUIMICA CÓDIGO DE TRANSACCIÓN: CF592A4D8FEE15F74E2BFB904FFB2898

FECHA DE RECEPCIÓN: 31/10/2010

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INFORME FINAL

PROYECTO FONDECYT INICIACION

N° PROYECTO: 11070067 DURACIÓN: 3 años AÑO ETAPA: 2009

TÍTULO PROYECTO: CARACTERIZACION Y LOCALTZACTON SUBCELULAR DE UNA CISTEIN PROTEASA,

VARIANTE DE CATEPSJNA L, PRESENTE EN CELULAS DE CANCER COLORRECTAL,

DISCIPLINA PRINCIPAL: BIOQUIMICA

GRUPO DE ESTUDIO: BIOLOGIA 3

INVESTIGADOR(A) RESPONSABLE: VIOLETA MARILYN MORIN MUÑOZ

DIRECCIÓN : Avenida Collao Las Palmeras Juana Ross 634

COMUNA: Concepción

CIUDAD: Concepción

REGIÓN: VIII REGION

FONO: 41-204428

EMAIL: [email protected]

INFORME

OBJETIVOS

Cumplimiento de los Objetivos planteados en el Proyecto. Recuerde que los objetivos del proyecto no se refieren a listar actividades

desarrolladas sino a los obietivos desarrollados

N° OBJETIVOS CUMPLIMIENTO FUNDAMENTO

1 1.- Investigar la localización intracelular de la TOTAL

variante de catepsina L durante el ciclo celular de

células

Caco-2 en cultivo.

2 2.- Purificación y caracterización una variante de TOTAL

catepsina L de 60 kDa desde extractos nucleares

de

células Caco-2 en cultivo.

Otro(s) aspecto(s) que Ud. considere importante(s) en la evaluación del cumplimiento de objetivos planteados en la propuesta

original o en las modificaciones autorizadas por los Consejos.

Los objetivos generales planteados para el proyecto fueron cumplidos a cabalidad. Cada uno de los objetivos generales presenta

varios objetivos espccíficos, cada uno de los cuales es detallado en la sección resultados. Para una mejor comprensión de los

resultados obtenido se incluyen en el informe final figuras previamente informadas en los informes de avance 2008 y 2009. Los

objetivos específicos correspondientes al tercer y ultimo año de proyecto son detallados en la sección resultados.

Es importante destacar que parte de los objetivos cumplidos para el primer objetivo general se utilizaron en la publicación titulada:

"A NEW NUCLEAR PROTEASE WITH CATHEPSTN L PROPERTIES IS PRESENT IN HELA AND CACO-2 CELLS. El

investigador responsable del proyecto que se informa va como correspondig author.

Parte de los resultados obtenidos para los objetivos específicos del proyecto se presentaron en dos Congresos Internacionales y

cuatro Congresos Nacionales descritos en la sección congresos.

RESULTADOS OBTENIDOS: Para cada uno de los objetivos específicos, describa o resuma los resultados. Relacione las publicaciones y ¡o manuscritos enviados a publicación con los objetivos específicos. En la sección Anexos incluya información adicional que considere pertinente para efectos de la evaluación. La extensión máxima de esta sección es de 5 páginas (letra tamaño 10, Anal o Verdana).

El presente proyecto se centro en determinar la existencia de una nueva variante de catepsina L en células Caco-2 en cultivo y determinar si esta proteasa se relaciona a proliferación celular como previamente se describió en células embrionarias de erizo de mar. Para ello, se planteó como primer objetivo general: definir la localización intracelular de la variante de catepsina L, homóloga a SpH-proteasa, durante el ciclo celular de células Caco-2. Para desarrollar este objetivo se plantearon varios objetivos específicos los cuales se desarrollaron durante el primer y segundo año de presente proyecto. Los resultados obtenidos para los objetivos específicos de indican a continuación:

1.1- Sincronizar cultivos proliferativos de células Caco-2 en las distintas etapas del ciclo celular y determinar el porcentaje de sincronización mediante análisis por citometría de flujo. Células sincronizadas con nocodazol alcanzaron un 69,4 % de sincronía en etapa de mitosis. La sincronización de células en fase S se realizó por un doble bloque con timidina, observando un 83.4 % de células en fase S. La sincronización de células en etapa Gi se realizó con L-mimosina alcanzando un porcentaje de sincronización de 56.55%. El análisis de citometría de flujo se informo en el informe 2008 correspondiente al primer año de proyecto.

1.2- Determinar mediante inmunocitoquimica la localización intracelular de la variante de catepsina L en células Caco-2 en cultivo, sincronizadas en cada una de las etapas del ciclo celular. A este respecto, la inmunolocalización de la variante de catepsina L, se realizó utilizando el anticuerpo dirigido a la región N-terminal de la SpH-proteasa de erizo de mar. Los resultados muestran que en células sincronizadas en etapa Gi y S, la localización de la variante de catepsina L es preferentemente nuclear (Figura 1). En células Caco-2 en etapa de mitosis la variante de catepsina L se localiza en el huso mitótico y colocaliza con a-tubulina principalmente a nivel de los aster del huso, según se confirmó por microscopía confocal (Figura 1) y por ensayos de coimnunoprecipitación. Los ensayos de coimmunoprecipitación fueron realizados durante el segundo año de proyecto. A partir de estos resultados se pudo concluir que la variante de catepsina L se localiza en el núcleo de células en estado proliferativo durante la etapa Gil S y se asocia al huso mitótico en células en etapa de mitosis. En su conjunto, estos resultados concuerdan con los descritos previamente para la localización subcelular de SpH-proteasa en embriones de erizos de mar. Los resultados correspondientes a este objetivo se describen en el informe de avance 2008.

1.3.- Detección inmunobioquímica de la variante de catepsina L en células Caco-2 sincronizadas en cada una de las etapas del ciclo celular.

Durante el año 2008 se logro avanzar en la caracterización bioquímica de una variante de catepsina L en células Caco-2 en el marco de la tesis de pregrado de la Srta. Estefanie Dufey (tesista del proyecto), quien optó al título de Bioingeriiero. La tesis se titulo: Identificación de una variante de SpH proteasa en células de carcinoma colorrectal humano. Durante este período se logró identificar por Western blot tres especies moleculares de 60 kDa, 34 kDa y de 100 kDa en extractos de proteínas totales obtenidos por lisis de células Caco-2 derivadas de cultivos sincronizados tanto en etapa G2/M y G1/S (Figura 2, Línea i y 2). Con el objetivo de corroborar la identidad de esta proteasa como un miembro de la familia de catepsina L, se analizaron estas formas moleculares detectadas por Western blots con un anticuerpo anti-catepsina L humano (Figura 2, línea 3). Los resultados obtenidos indican que el anticuerpo anti—catepsina L da señal positiva con las mismas formas moleculares de 60, 34 y 100 kDa en extractos de proteínas totales de células Caco-2, aunque la forma molecular mayoritaria detectada por este anticuerpo es la de 34 kDa a diferencia del anticuerpo anti SpH-proteasa que reconoce principalmente a la forma molecular de 60 kDa. Estos resultados indican que la variante de catepsina L de 60 kDa presente en células Caco-2 poseen homología con la proteasa previamente descrita en erizos de mar y también con catepsina L humana. Estas tres formas moleculares también se encontraron presente en la fracción de proteínas asociadas a la cromatina de células Caco-2 sincronizadas en fase S. Paralelamente se investigó la actividad proteolítica de proteínas totales y de proteínas provenientes del fraccionamiento subcelular (núcleo y citoplasma) de células Caco-2 en cultivo. Para ello, proteínas provenientes de células Caco-2 sincronizados en distintas etapas del ciclo celular (M, S y GI) se incubaron en presencia del sustrato fluorogénico para catepsina L (Z-Phe-Arg-MCA). Los resultados muestran que las proteínas nucleares obtenidas por fraccionamiento subcelular, hidrolizan en forma significativa el sustrato fluorogénico (Figura 3). Mientras que proteínas citoplasmáticas presentan una actividad proteolítica sobre el sustrato fluorogénico inferior a la detectada en las proteínas nucleares. La actividad proteolítica detectada en las proteínas citoplasmáticas se puede atribuir a la presencia de una o varias catepsinas con especificidad para el sustrato Z-Phe-Arg-MCA y cuya localización es probablemente lisosomal. En extracto de proteínas provenientes de células

sincronizadas en etapa G1 no se detecta una actividad proteolítica significativa para el sustrato utilizado, lo que indica que en esta etapa del ciclo celular la variante de catepsina L, quien presenta una localización nuclear, no se encuentra activa (Figura 3). En su conjunto, estos resultados nos permiten concluir que la variante de catepsina L se encuentra asociada con la fracción nuclear en células Caco-2 y es activa en células en etapa de mitosis y de síntesis. Para analizar la selectividad de sustrato, se investigó la actividad proteolítica de proteínas obtenidas por lisis y por fraccionamiento subcelular utilizando el sustrato [14C]-SpH1. Este sustrato corresponde a la histona Hl de espermatozoide de erizo de mar y es específico para la SpH-proteasa descrita en erizo de mar. Se observó que la mayor actividad proteolítica para el sustrato [14C]-SpH1 se asoció con la fracción de proteínas nucleares. La actividad proteolítica de la fracción de proteínas citoplasmáticas es significativamente menor a la observada para proteínas nucleares (Figura 4). Estos resultados permiten concluir que la variante de catepsina L se encuentra presente en la fracción de proteínas nucleares y presenta especificidad proteolítica tanto para el sustrato de catepsina L como para el sustrato específico de SpH-proteasa de erizo de mar. Esto último nos permiten concluir que la variante de catepsina L presente en células Caco-2 tiene homología de sustrato con SpH-proteasa.

1.4. - Sincronizar los cultivos de células Caco-2 en presencia de inhibidores de catepsina L. 1.4.1.- Sincronización de cultivos de células Caco-2 según lo descrito en la sección 1.1 en presencia de inhibidores de catepsina L. Como nuestra proteasa pertenece a la familia de catepsina L, en otra serie de experimentos se adicionaron inhibidores de cisteino proteasa a cultivos de células Caco-2 previamente sincronizados y se monitoreó el progreso del ciclo celular. Como inhibidores se utilizaron: el inhibidor 1 catepsina L (Z-Phe-Phe-CH2F) y el inhibidor general de cisteino proteasas, E64-d. El inhibidor 1 de catepsina L se utilizó a una concentración efectiva de 100 pM. Los resultados obtenidos en células sincronizadas en etapa de mitosis indican que el inhibidor 1 de catepsina L generó una desorganización parcial del huso mitótico (Figura 5). De estos resultados se deduce que la variante de catepsina L ejerce una función directa en la organización del huso mitótico y su inhibición genera un retardo de la salida de mitosis de las células, afectando la continuidad del ciclo celular. La acción del inhibidor E64d a una concentración efectiva de 300 uM, generó un efecto similar al que se observó en células tratadas con el inhibidor 1 de catepsina L. Por otro lado, en células Caco-2 sincronizadas en la etapa GIIS los inhibidores de cisteino proteasas alteraron la localización que la variante de catepsina L, la cual se localizó principalmente en el citoplasma de la célula, a diferencia de células controles donde su localización es principalmente nuclear (Figura 6). Estos resultados son concordantes con los obtenidos en cigotos de erizo de mar tratados con los mismos inhibidores. Los resultados nos permiten concluir preliminarmente que la actividad de una variante de catepsina L nuclear es esencial durante el ciclo celular no solo para completar la mitosis exitosamente sino también para permitir la fase S.

1.4.2.- Monitorear la replicación de las células de Caco-2 en cultivo sincronizadas en fase 5 en presencia y ausencia de Inhibidores de catepsina L. Con el objeto de analizar la proliferación de células Caco-2 se realizaron experimentos de incorporación con Bromodesoxiuridina (BrdU) en presencia de inhibidores de cisteino proteasas. Los cultivos de células Caco-2 sincronizados en etapa G1IS, se trataron con el inhibidor 1 de catepsina L o con el inhibidor E64d. Posteriormente al tratamiento de inhibición los cultivos celulares se lavaron y se les adicionó medio de cultivo nuevo que contenía 50 pM de BrdU, luego de lo cual las células se analizaron por inmunofluorescencia. Los resultados muestran que el inhibidor 1 de catepsina L produjo una inhibición significativa en la incorporación de BrdU, similar a los resultados obtenidos en presencia del E64d. La inhibición de una variante de catepsina L por lo tanto produjo una disminución en la capacidad de replicación de ADN (Figura 7). El efecto de la inhibición en células asincrónicas fue similar al observado para células sincrónicas, es decir, se produjo una disminución de la incorporación de BrdU y por lo tanto de la capacidad de síntesis de ADN. En base a los resultados obtenidos se puede concluir que la variante de catepsina L esta involucrada en proliferación celular, ya que, su inhibición genera una disminución de la progresión de la fase S.

Los resultados anteriores son parte de la tesis de Magíster de la Srta. Estefanie Dufey, titulada: Expresión de una variante de SpH-proteasa en células de carcinoma colorrectal humano. Tesis finalizada y defendida el 27 de Octubre de 2010.

1.43- Investigar si la variante de catepsina L colocaliza con a-tubulina durante la organización del uso mitótico en presencia y ausencia de inhibidores de catepsina L. Con el objetivo de investigar si existía colocalización entre la variante de catepsina L y x-tubulina durante la etapa de mitosis se realizó una coinmunoprecipitación de la variante de catepsina L (SpH-proteasa) con a-tubulina, a partir de células sincronizadas en esta etapa del ciclo celular. Los resultados de estos experimentos se presentaron en el informa de avance 2009. Los resultados obtenidos muestran que SpH-proteasa coprecipita con a-tubulina durante la fase M del ciclo celular (Figura 8), concordante a lo obtenido previamente en erizo de mar. La inmunoprecipitacián con el anticuerpo anti a-tubulina muestran resultados similares al descrito en el párrafo anterior. Por otro lado, al realizar la inmunoprecipitación de lisados de proteínas totales provenientes de células sincronizadas con Nocodazole e incubadas en presencia del inhibidor 1 de catepsina L,

muestran que la coinmunoprecipitación de la variante de catepsina L con c-tubulina no se ve afectada. Estos resultados son concordantes con los observados mediante microscopia confocal, donde se observa que la variante de catepsina L colocaliza con a-tubulina durante la etapa de mitosis y su localización no se ve alterada en presencia del inhibidor 1 de catepsina L (Figura 9). Sin embargo, se observa que células incubadas es presencia de este inhibidor, muestran un retraso en la salida de la etapa de mitosis, lo que podría estar indicando que esta variante de catepsina L, podría estar cumpliendo durante esta etapa del ciclo celular, una función relevante, la cual a la fecha no ha sido definida.

1.5.- Detectar y caracterizar por métodos inmunocitoquímicos e inmunobioquímicos la variante de catepsina L desde células Caco-2 en cultivo no proliferativos (Go). Con el objeto de obtener cultivos de células Caco-2 en estado no proliferativo, las células se sincronizaron mediante deprivación de suero durante 24 horas. De los cultivos sincronizados en etapa Go, se realizó un fraccionamiento subcelular obteniendo la fracción nuclear y citoplasmática. Los resultados obtenidos muestran que en las células es estado no proliferativo la variante de catepsina L se localiza principalmente a nivel citoplasmático a diferencia de lo observado en células en etapa proliferativa, donde la proteasa se observa principalmente en el núcleo. Mediante análisis por western blot utilizando el anticuerpo anti SpH-proteasa se determiná la presencia de la variante de catepsina L de 60 kDa tanto en lisados totales como en la fracción de proteínas nuclear y citoplasmática (Figura 10). Se observan además bandas de un tamaño molecular de 100 kDa y 34 kDa, principalmente en el extracto de proteínas nucleares. La presencia de una mayor proporción de la proteína de 60 kDa en los extractos de proteínas citoplasmática concuerda con lo observado mediante microscopía confocal, donde se observa la localización de la variante de catepsina L principalmente en el citoplasma de la célula (Figura 11). La detección con el anticuerpo anti catepsina L, reveló bandas de tamaño molecular similar a las detectadas con el anticuerpo para SpH-proteasa (Figura 10). En los análisis de inmunolocalización utilizando microscopia confocal, se determinó que la localización de la variante de catepsina L en células en etapa no proliferativa es principalmente citoplasmática con una presencia a nivel nuclear en menos proporción. El efecto del inhibidor 1 de catepsina L no altero la localización de la variante de catepsina L en comparación a cultivos controles. Estos resultados, son concordantes con los obtenidos al medir la actividad proteolítica de la variante de catepsina L utilizando el sustrato fluorogénico Z-Phe-Arg-MCA (carbobenzoxy-phenyl-argi nyl-4-methyl coumary1-7-amide) donde se observa que los extractos de proteínas citoplasmáticas presentan una mayor actividad proteolítica que la observada en los extractos de proteínas nucleares, a diferencia de lo descrito previamente en células en estado proliferativo (Figura 12). Sin embargo, la acción de los inhibidores sobre la actividad de la variante de catepsina L, afecto significativamente su actividad proteolítica, tanto en extractos citoplasmáticos como nucleares. Además, los resultados de selectividad proteolítica nos confirman que estamos frente a una variante de catepsina L ortóloga a SpH-proteasa descrita en erizo de mar, ya que es capaz de degradar el sustrato SpHI, al igual que la proteasa descrita en erizo de mar (Figura en Informe avance 2009).

En resumen los resultados de los objetivos específicos puntos 1.1 al 1.5 en su conjunto fueron presentados el año 2009 en tres reuniones científicas.

-Un congreso Internacional:

Experimental Biology 2009. Trabajo titulado; 'SpH-proteasa exists in Caco-2 cell. Morin V, Dufey E, Jaña C, Solis C, Rivas C, Puchi M, lmschenetzky M. New orleans, Estados Unidos, 18-22 de Abril de 2009.

Dos congresos Nacionales; XXXII Reunión Anual Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile. Trabajo titulado; "Una variante de catepsina L colocaliza con c-tubulina durante la mitosis de células de cáncer de colón. Dufey E, Aguilar R, Arrey V, Hermosilla V, Perez y, Puchi M, Morin V. Termas de Chillan, 22-25 de Septiembre de 2009

XXIII Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile. Trabajo titulado "Variante de Catepsina L nuclear involucrada en el ciclo celular en células de cáncer". Dufey E, Aguilar R, Puchi M, lmschenetzky M, Morin V. Pucón, Chile, 1-5 de Noviembre de 2009.

Parte de los resultados obtenidos en los objetivos anteriores fueron publicados en la revista Journal of cellular Biochemistry: Puchi M, García-Huidobro J, Córdova C, Aguilar R, Dufey E, lmschenetzky M, Bustos P, Mann V. 2010. A new nuclear protease with cathepsin L properties is present in HeLa and Caco-2 cells. 001 10.10021jcb.22712. En dicha publicación el investigador principal del proyecto a informar va como corresponding author.

2.- El segundo objetivo general del proyecto fue la purificación y caracterización de una variante de catepsina L desde extractos nucleares de células Caco-2 en cultivo. Parte de los objetivos específico se desarrollaron por la Srta. Viviana Pérez, como parte de una Unidad de Investigación de Bioquímica el año 2009, titulada: Caracterización bioquímica, purificación y actividad proteolítica de una variante de catepsina L presente en células Caco-2" y como parte de su tesis de pregrado 2010. Actualmente la señorita Pérez se encuentra como tesista del proyecto a informar. Su tesis se titula: "Implicancia de una variante de catepsina L homóloga a SpH-proteasa presente en células Caco-2 durante la fase S mitótica del ciclo celular". Esta tesis será finalizara durante enero del 2010.

Para el cumplimiento de este objetivo se plantearon los siguientes objetivos específicos.

2.1.- Obtención de extractos nucleares de células Caco-2 en cultivo. En primer lugar, se realizó la sincronización de cultivos de células Caco-2 en la fase S del ciclo celular mediante doble bloqueo con timidina. Posteriormente las células fueron sometidas a fraccionamiento subcelular obteniéndose con ello tanto la fracción de proteínas nucleares, como citoplasmáticas.

2.2.- Detección inmunobioquímica de la variante de catepsina L nuclear con anticuerpos dirigidos contra la secuencia N-terminal de la proteasa de erizos de mar. Los resultados obtenidos de estos experimentos son concordantes a los informados en el informe de avance 2008 y 2009.

2.3.- Purificación de la variante de catepsina L homóloga a la proteasa obtenida de erizo de mar desde extracto nuclear de células Caco-2. De los cultivos sincronizados en fase S, se obtuvieron lisados de proteínas totales las cuales posteriormente se sometieron a fraccionamiento subcelular mediante centrifugación diferencial. Con el fraccionamiento subcelular se obtuvieron extractos de proteínas nucleares asociadas a la cromatina. A partir del extracto nuclear, se obtuvieron proteínas solubles a KCI 400 mM. Dentro de estas proteínas KCI solubles, se identificó por western blot a la variante del catepsina L utilizando el anticuerpo anti SpH-proteasa y el anticuerpo anti catepsina L. Ambos anticuerpos detectan una proteína mayoritaria de 60 kDa y dos especies moleculares menos representadas de 34 y 100 kDa (Figura 13). 5 mg de proteínas solubles a KCI 400 mM, se separaron mediante cromatografía de exclusión Sephadex G-1 00. Las fracciones eluídas de la columna se analizaron por Western blot utilizando el anticuerpo anti SpH-proteasa, confirmando con ello, la presencia de una proteína de 60 kDa y 100 kDa que eluyen entre los 10 ml a los 14 ml del volumen de elución de la columna. La proteína de 34 kDa eluye a un volumen de 16 ml. La actividad proteolítica frente al sustrato fluorogenico Z-Phe-Arg-MCA, confirma la presencia de la variante de catepsina L en las fracciones eluídas a los volúmenes indicados, mostrando una actividad proteolítica mayoritaria para las fracciones que contiene a la proteína de 60 kDa y una menor actividad para la proteína de 34 kDa (Figura 14). Los resultados de este objetivo se informaron en el informe de avance 2009.

2.4; 2.5.- Determinación de la actividad ¡n vitro de la variante de catepsina L purificada utilizando histona Hl y variantes de histonas CS como sustrato. Las fracciones eluídas de la columna Sephadex G-100 que contenían la proteína de 60 kDa, se juntaron y se determinó su selectividad proteolítica utilizando como sustrato histonas de erizo de mar (previamente marcadas con formaldehído carbono 14): histonas espermatozoide específicas de erizo de mar ([ 14C]-SpH) y las variantes de histonas CS o de estado de clivaje de origen materno, las cuales se encuentra poliADP-ribosiladas ([ 14C]-CS-poliADP-ribosiladas) (Figura 15). Los resultados obtenidos indican que la variante de catepsina L presente en núcleo de células Caco-2, presenta una selectividad proteolítica específica para la histona Hl y no así para las variantes de histona CS, lo que concuerda con los resultados descritos en erizo de mar donde la selectividad proteolítica entre ambas especies moleculares esta dada por la presencia de la Poli-ADP(ribosilación), que protegería a las variantes de histonas CS de la degradación proteolítica por parte de la SpH-proteasa. Estos resultados nos permiten confirmar que la variante de catepsina L nuclear de células Caco-2 en células en estado proliferativo se comporta de una forma similar a la SpH-proteasa nuclear descrita de erizo de mar en términos de la selectividad de sustrato.

Los resultados obtenidos de los objetivos 1.43, 1.5 y 2 (2.1-2.5), fueron informados en el informe de avance 2009 y parte de estos resultados presentados a tres congresos científicos durante el año 2010:

The EMBO meeting. Trabajo titulado: A new protease with cathepsine L properties is present in cancer celi. Morin V, García-Huidobro, Aguilar R, Dufey E, Perez y, Cordova C, Puchi M. Barcelona 4-7 Septiembre de 2010. Destaco en este punto que el panel fue elegido uno de los mejores paneles del día por los jurados de la EMBO. (Anexo Presentaciones a congreso).

XXIV Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile. Inhibition of a nuclear cathepsin L activity impairs progression of ceil cycle at S-phase and Mitosis in HeLa and Caco-2 cells. Viviana Pérez, Rodrigo Aguilar, Viviana Hermosilla, Estefanie Dufey, Paula Bustos, Marcía Puchi, Violeta Morin. Pucón, Chile, 1-5 de Noviembre de 2010.

XXIV Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile. Identification of cathepsin L nuclear variants in colon cancer cells (Caco-2). Estefanie Dufey, Vivian Arrey, Viviana Pérez, Viviana Hermosilla, Claudio Iribarren, Marcia Puchi, Violeta Morin. Pucón, Chile, 1-5 de Noviembre de 2010.

Informe de avance 2010: Los objetivos para el tercer año y final de proyecto incluyen los objetivos específicos 2.6 al 2.8, cuyos resultados se indican a continuación.

2.6.- Determinar la actividad de la variante de catepsina L purificada utilizando el sustrato fluorogénico, Z-Phe-Arg-MCA, específico de catepsina L. la actividad proteolítica de la proteasa de 60 kDa eluida de la columna de sephadex G-100, se evaluó midiendo fluorométricamente la hidrólisis del péptido sintético Z-Phe-Arg-MCA. Antecedentes preliminares describen que la variante de catepsina L nuclear exhibe un máximo de actividad a pH 7.5 y catepsina L lo hace a pH S.S. Figura 16, muestra los resultados obtenidos al medir la actividad de la variante de catepsina L de 60 kDa eluida de la columna de Sephadex G-100 a pH 5.5 y pH 7.5. Los resultados expresados como intensidad de fluorescencia muestran que la proteasa parcialmente purificada hidroliza el sustrato fluorogénico a pH 7.5. Cuando la medición de actividad se realiza a pH pH 5.5, se observa que la hidrólisis del sustrato fluorogénico es significativamente menor al observada a pH 7.5. Estos resultados son concordantes a los previamente descritos para la SpH-proteasa de erizo de mar, e indican que una nueva variante de catepsina Lnuclear es activa a un pH mayor al descrito frecuentemente para las catepsinas localizadas a nivel lisosomal cuyo pH óptimo es de 5.5.

2.7- Confirmar la actividad de la variante de catepsina L de la fracciones purificada mediante análisis por Zimograma, utilizando gelatina como sustrato. El extracto nuclear purificado se analizó por zimograma. Para la preparación del zimograma, un gel de poliacrilamida 12% (PN)/SDS se polimerizó en presencia de 0.1 % de gelatina. En la Figura 17, se observa que tanto el extracto de proteínas nucleares como la proteasa de 60 kDa eluída de la columna de Sephadex hidrolizan la gelatina, observándose como una banda clara en un fondo azul. La diferencia en la intensidad de digestión se puede deber a un aumento de la actividad específica de la proteasa eluida de la columna. Por otro lado, en el extracto de proteínas citoplasmáticas analizada no se observa digestión de gelatina, lo que nos indica que la variante de catepsina L de 60 RDa no se encuentra presente en dicha fracción durante esta etapa del ciclo celular (fase S). La Figura 18, muestra el zimograma obtenido al tratar la proteína purificada con el inhibidor 1 de catepsina L. Se observa que el inhibidor causa una pérdida de la actividad de la proteasa, ya que se observa una pobre digestión de gelatina en comparación al control no inhibido.

2.8.- Medición de la actividad enzimática de la variante de catepsina L purificada en presencia de inhibidores de cisteino proteasas. Con el objeto de determinar si la variante de catepsina L corresponde a un cisteino proteasa, se procedió a medir la actividad enzimática, en presencia de distintos inhibidores. Para ello se tomarron alícuotas de la fracción nuclear purificada previamente y se midió su actividad en presencia del inhibidor de cisteino proteasas (E64d), y del inhibidor específico de catepsina L (Inhibidor 1 de catepsina L). Para la determinación de la actividad proteolítica se utilizó como sustrato proteínas marcadas [14C]-metil]-SpHI y el sustrato fluorogénico Z-Phe-Arg-MCA. La Figura 19, muestra los resultados obtenidos al medir la actividad proteólitica de la variante de catepsina L purificada sobre el sustrato fluorogénico Z-Phe-Arg- MCA, en presencia y ausencia de los inhibidores; Inhibidor 1 de catepsina L y E64d. Los resultados muestran que la variante de catepsina L purificada presenta una actividad proteolítica frente al sustrato fluorogénico. Esta actividad proteolítica se ve significativamente afectada en presencia del inhibidor 1 de catepsina L. La acción del inhibidor E-64d sobre la actividad de la proteasa también causa una disminución, aunque levemente menor a la observada para el inhibidor específico de catepsina L. Estos resultados nuevamente confirman que estamos frente a una proteasa tipo catepsina L de localización nuclear ya que es capaz de hidrolizar un sustrato específicos de catepsina L y ser inhibida frente a inhibidores de catepsina L. La Figura 20, muestra que la variante de catepsina L de 60 kDa es capaz de hidrolizar la histona Hl obtenida de erizo de mar, [14C] SpH. Esta actividad proteolítica se ve s ig nifi cativam ente inhibida frente a la acción del inhibidor 1 de catepsina L, y en menor proporción frente al inhibidor E64d. Estos resultados confirman nuevamente que estamos frente a nueva variante de catepsina L nuclear que correspondería a un ortólogo de SpH-proteasa descrita en erizo de mar.

DESTAQUE OTROS LOGROS DEL PROYECTO TALES COMO: - Estadías de investigación. - Actividades de difusión y/o extensión en la temática del proyecto. - Cualquier otro logro no contemplado en los ítem anteriores y que Ud. quiera destacar.

La extensión máxima de esta sección es de 1 página (letra tamaño 10, Anal o Verdana).

1,111 proyecto que se informa nos ha permitido avanzar en el conocimiento de una nueva variante de catepsina L de localización nuclear y su efecto durante el ciclo celular. Parte de los resultados obtenidos se publicaron en el articulo titulado: "A NEW NUCLEAR PROTEASE WITH CATHEPSIN L PROPERTIES IS PRESENT IN HELA AND CACO-2 CELLS". Puchi M, García-Huidobro J, Aguilar R; Dufey E, Córdova C, Bustos P, lmschenetzky M, Morin M. Journal of Cellular Biochemistry. 2010 (Articulo se anexa en la sección Publicaciones).

2.- Gracias a los recursos aportados por el proyecto FONDECYT 11070067, durante el primer año fue posible financiar la tesis de pregrado de la Srta. Estefanie Dufey Oyarce, la cual finalizó con éxito en Marzo de 2009. Durante el segundo y tercer año de proyecto se financio la tesis de Magíster de la Srta. Dufey la cual finalizó con un concepto de sobresaliente el 27 de Octubre de 2010. Parte de los resultados obtenido por la Señorita Dufey han sido recientemente publicados (2010) y presentados en 6 congresos; dos internacionales y cuatro nacionales. Presentaciones a congresos se anexan en el ítem Congresos.

3.- Durante el último año de proyecto, se financio la tesis de pregrado de la Srta. Viviana Pérez F., Quien 0pta al título de Bioquímico. La tesis actualmente en ejecución se finalizará a fines de enero de 2010. Parte de los resultados obtenidos por la Señorita Pérez, se presentaron a tres congresos; uno internacional (EMBO Meeting 2010) y dos nacional (XXIV Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile, 2010).

4.- Gracias a los recursos aportados por el proyecto FONDECYT a informar, se ha podido aceptar alumnos de la carrera de Bioquímica para la realización de unidades de investigación. Estas actividades han apoyado algunos de los objetivos planteados en el proyecto. Los alumnos de Bioquímica que han realizado Unidades de Investigación son: Srta. Viviana Pérez F (2009), Sr. David Flaig (2010).

5.- El investigador responsable de proyecto FONDECYT realizó una estadía de Investigación dentro del Programa de Cooperación Científica Internacional ECOS/CON ICYT C07 B05: "Rol de la estructura de la cromatina durante la iniciación de la replicación post-fecundación en erizo de ma(, en colaboración con el Laboratorio de la Dra. Anne Marie Geneviére, Laboratorio Aragó-UMR, Francia. Investigador Responsable (Chile): M Puchi. Desarrollada entre el 6 de Mayo al 5 de Junio de 2008. Este aspecto no esta relacionado directamente con el proyecto que se informa, pero es un aspecto importante a considerar por el gran apoyo en aspectos metodológicos que el grupo Frances nos ha aportado. (Anexo: Carta de Invitación)

RESUMEN: Describa en forma precisa y breve el tópico general del proyecto, sus metas y objetivos y los resultados alcanzados. Utilice un lenguaje apropiado para la comprensión del público no especialista en el tema. Esta información podrá ser difundida. La extensión máxima de esta sección es de 1 página (letra tamaño 10, Anal o Verdana).

El presente proyecto se centró en una cistein-proteasa tipo catepsina L descrita previamente en erizo de mar, que participa en la remodelación de la cromatina espermática post-fecundación, degradando selectivamente las histonas espermatozoide específicas (SpH). Esta proteasa, persiste en el núcleo del cigoto durante la fase S del primer ciclo celular y colocaliza con a-tubulina durante la mitosis. Resultados adicionales demuestran que esta proteasa está involucrada en la proliferación celular embrionaria, puesto que su inhibición bloquea la replicación de ADN y perturba la mitosis. Esta proteasa ha sido purificada parcialmente desde erizo de mar y se ha logrado donar el gen que la codifica. La secuencia aminoacídica parcial y el gen donado de la proteasa nuclear, muestran una homología significativa con catepsina L de otros orígenes entre ellos el humano. Esto, nos abrió la interrogante sobre la potencial existencia de una variante de catepsina L en células humanas similar a la proteasa de descrita en erizo de mar. Catepsina L es una proteasa de alrededor de 24-30 kDa de localización y función lisosomal, que manifiesta un máximo de actividad a pH acídico (pH 5.5). Se ha correlacionado la falta de regulación de la actividad de catepsina L con la capacidad invasiva de células cancerosas. Muchos estudios reportan actualmente un aumento en la expresión, actividad y perdida de la localización en distintos cánceres humanos entre los cuales se encuentra el cáncer colorrectal. Sin embargo la correlación entre cáncer y catepsina L aún es ambigua. Esto nos permitió inicialmente plantear como hipótesis de trabajo para el presente proyecto, la existencia de una nueva variante de catepsina L se asocia a la proliferación en células humanas en cultivo Caco-2. Esta hipótesis se apoyo en la rol en proliferación que cumple la variante de catepsina L descrita previamente en erizo de mar. Resultados preliminares avalan la presencia en el núcleo de células Caco-2 en cultivo de una variante de catepsina L de 60 kDa que es reconocida por el anticuerpo anti SpH-proteasa de erizo de mar, obtenido previamente en nuestro laboratorio. Dado estos antecedentes, se propuso como primer objetivo general del proyecto, definir la localización intracelular de la variante de catepsina L homóloga a SpH-proteasa. Para el cumplimiento de este objetivo, las células se sincronizaron en las distintas etapas del ciclo celular y se determinó mediante inmunocitoquímica la localización subcelular de la proteasa. Los resultados obtenidos, muestran que células en etapa Gi y S, la variante de catepsina L se localiza preferentemente en el núcleo. En células sincronizadas en etapa de mitosis la localización de esta proteasa se observa asociada al huso mitótico colocalizando con a-tubulina. En células sincronizadas en etapa no proliferativa la variante de catepsina L se localiza principalmente en el citoplasma de la célula. Paralelamente, se determinó por Western blot tres especies moleculares de 60, 34 y 100 kDa presentes en lisados de proteínas provenientes de células sincronizadas tanto en etapa GIIS como G2/M. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en presencia de anticuerpos anti catepsina L comerciales. Los resultados obtenidos muestran que células en etapa proliferativa, la forma molecular de 60 kDa se encuentra principalmente a nivel nuclear y es capaz de hidrolizar tanto el sustrato fluorogénico Z-Phe-Arg-MCA como el sustrato SpH1, sustrato específico para la proteasa descrita en erizo de mar. Adicionalmente, se determinó el efecto de inhibidores específicos para catepsina L, observando que células en fase de mitosis muestran una desorganización parcial de huso mitótico con el subsecuente retrazó en la salida de esta etapa del ciclo celular. En células sincronizadas en etapa G1IS, la inhibición produjo una alteración en la localización de la proteasa desde el núcleo al citoplasma y una inhibición significativa de su actividad. Adiciorialmente se observó que la inhibición de la proteasa afecta significativamente la incorporación de Bromodesoxiuridina (BrdU) durante la fase S. Esto nos permite concluir que la variante de catepsina L podría estar involucrada en proliferacián celular dado que su inhibición genera una disminución significativa de la progresión del ciclo celular. Estos resultados en su conjunto permiten concluir preliminarmente que la actividad de la variante de catepsina L nuclear es esencial durante el ciclo celular. El segundo objetivo del proyecto se centro en la purificación y caracterización bioquímica de la variante de catepsina L presente en la fracción de proteínas nucleares de células Caco-2 sincronizadas en la fase S del ciclo celular. Mediante fraccionamiento subcelular y posterior purificación por cromatografía en Sephadex G-100 de las proteínas asociada a la cromatina, se logró la purificación parcial de la proteasa de 60 kDa, que presentó selectividad proteolítica frente sustratos específicos. A este respecto, la variante de catepsina L de 60 kDa es capaz de hidrolizar histonas espermatozoide especificas, no así variantes de histonas de origen materno. Estos resultados son concordantes con los obtenidos para la SpH-proteasa nuclear descrita en erizo de mar. Por otro lado, la actividad proteolítica de la variante de catepsina L purificada frente al sustrato fluorogénico se ve significativamente disminuida en presencia de inhibidores específicos para catepsina L. La inhibición de la actividad de la proteasa en presencia de un inhibidor específico de catepsina L, se corroboro adicionalmente por análisis en zimograma. Estos resultados nos permiten concluir que estamos frente a una nueva variante de catepsina L de localización nuclear en células Caco-2 en etapa proliferativa, que estaría cumpliendo una importante función durante la fase S del ciclo celular. También se puede atribuir en base a los resultados obtenidos que esta proteasa estaría cumpliendo una función durante la fase de mitosis. Sin embargo, aun queda por definir los sustratos específicos sobre los cuales actúa esta variante de catepsina L durante estas etapas del ciclo celular.

PRODUCTOS

ARTÍCULOS Para trabajos en Prensa! Aceptados/Enviados adjunte copia de carta de aceptación o de recepción.

N°:

Autor (a)(es/as) : Puchi, M.; Garcia-Huidobro, J.; Cordova, C.; Aguilar, R.; Dufey, E., lmschenetzky, M.;

Bustos, P.; Morin, V.

Nombre Completo de la Revista: Journal of Cellular Biochemistry

Título (Idioma original): A NEW NUCLEAR PROTEASE WITH CATHEPSTN L PROPERTIES IS PRESENT IN

HELA AND CACO-2 CELLS.

Indexación : ¡SI

ISSN: DO!: 10.1002/jcb.227

Año:

Vol.:

N°:

Páginas:

Estado de la publicación a la fecha : En Prensa

Otras Fuentes de financiamiento, si las hay

Proyecto de la Dirección de Investigación de la Universidad de Concepción(DIUC)208.037.08-1 .0

Envía documento en papel : si Archivo Asociado al artículo: Manuscrito_2010_V_MORTN.pdf

305/11 070067/200919647/

OTRAS PUBLICACIONES

N°:

Autor (a)(es/as)

Título (Idioma original) cefl cycles of sea urchin embryos.

Tipo de publicación o producto

Morin, y.; Sanchez, A.; Quiñones, K.; Huidobro, J.G.;lribarren, C.; Bustos, P.; Puchi,

M.: Geneviére, AM.; Imschenetzky, M.

Cathepsin L inhibitor 1 blocks mitotic chromosomes decondensation during cleavage

Otros Especificar: Articulo Científico

ISBN:

Editor (es) (Libro o Capitulo de libros) :Wilcy-Liss, Inc.

Nombre de la editorial /Organización : Journal of Cellular Physiology

País: ESTADOS UNIDOS DE AMERICA

Ciudad:

Fecha: Febrero - 2008

Año: 2008

Vol.: 216

3

Páginas : 790-795

Otras Fuentes de financiamiento, si las hay

FONCECYT 1050100,

Proyecto de la Dirección de Investigación de la Universidad de Concepción8 (DIUC) 204.037.001-10.; PTCS-CNRS

France/CONICYT-Chile.

Envía documento en papel: si

Archivo Asociado al artículo : Morin,_2008.pdf

http://evaIcyt.conicyt.cl/informc_acadcmico/inde . php/investigador/f4_otras_publicaciones/dcscargaJ872l 305/11070067/2009/2642/

N°:

Autor (a)(es/as)

Título (Idioma original)

Male Pronucleus Formation

Tipo de publicación o producto

2

Iribarren, c.; Morin, y.; Puchi, M.; Imschenetzky, M.

Sperm Nucleosomes Disassembly is a Requirement for Histones Proteolysis During

Otros Especificar: Artículo Científico

ISBN: Editor (es) (Libro o Capitulo de libros) :Wiley-Liss

Nombre de la editorial /Organización : Journal of Cellular Biochemistry

País: ESTADOS UNTDOS DE AMERTCA

Ciudad:

Fecha: Febrero - 2008

Año: 2008

Vol.: 103

N° : 447

Páginas: 455

Otras Fuentes de financiamiento, sitas hay

FONDECYT 1050100; DIUC 204.037.001-1.0,


Archivo Asociado al artículo : Iribarren,_2008.pdf 305/11070067/2009/2683/

N°: 3

Autor (a)(es/as) : Leonardi, M.; Vera, j.; Tarifeño, E.; Puchi, M.; Morin, V.

Título (Idioma original) : Vitcllogenin of thc Chilcan floundcr Paralichthys adspersus as a biomarkcr of

endocrine disruption along the marine coast of thc South Pacific. Part 1: induction, purification, and identifícation

Tipo de publicación o producto : Otros Especificar: Artículo Científico

ISBN: DOl 10.1007/s10695-0

Editor (es) (Libro o Capitulo de libros) Springer Science+Business Media B.V. 2009

Nombre de la editorial ¡Organización : Fish Physiol Biochem


Ciudad:

Fecha : Agosto - 2009

Año:

Vol.:

N°:

Páginas:

Otras Fuentes de financiamiento, si las hay:

PIMEX-ARAUCO Program for funding (2006-2009).

Envía documento en papel : si

Archivo Asociado al artículo: Vitellogenin_of_the_Chilean_flounder_Paralichthys_adspersusl .pdf

hup://evalcyt.conicytcI/informe_academico/inde. php/investigador/f4_otras_publicaciones/deseargal872 1305/1 ¡ 070067/20092705/

CONGRESOS

N°:

Autor (a)(es/as) : Dufey, E.; Aguilar, R.; Puchi, M.; Imschenetzky, M.; Morin, V.,

Título (Idioma original) : Variante de Catepsina L nuclear involucrada en el ciclo celular en células de cáncer

Nombre del Congreso : XXIII Reunión de la Sociedad de Biología Celular de Chile

País: CHILE

Ciudad: Pucón

Fecha Inicio : 01/11/2009

Fecha Término : 05/1 1/2009

Nombre Publicación

Año: Vol.:

N°:

Páginas:


Archivo Asociado : XXTII_SBC_2009.pdf hup://evalcytconicyt.cI/informe_acadeniico/index.php/investigadoríf4_congresos/descarga!872 131)5/1 1070067/200911458 II

Nu : 2

Autor (a)(es/as): Dufcy, E.; Aguilar, R.; Arrcy, V.; Hermosilla, V.; Perez, V.; Puchi, M.; Morin, V.,

Título (Idioma original) : Una variante de catepsina L colocaliza a-tubulina durante la mitosis de células de cancer de

colon

Nombre del Congreso : XXXII Reunión Anual Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile

País: CHILE

Ciudad: Termas de Chile

Fecha Inicio : 22/0912009

Fecha Término: 25/09/2009

Nombre Publicación

Año:

Vol.:

N°:

Páginas:


Archivo Asociado: XXXTI_SBM_2009 .pdf 1305/11 070()67/2(>09114832/

N°: 3

Autor (a)(es/as)

Título (Idioma original) : SpH- protease cxists in Caco-2 ccli

Nombre del Congreso : Experimental 2009 Biology


Ciudad: New Orleans

Fecha Inicio: 18/04/2009


Nombre Publicación:

Año:

Vol.:

N°:

Páginas:


Archivo Asociado: Exp_2009_Biology.pdf http//evalcyt.conicytcI!informe_academico/index.php/investigador/f4_conresos/descarga!872 1305/1 1 Q70067/2000/14g33!

N°: 4

Autor (a)(es/as) : Morin, V.; Garcia-Huidobro,j.; Aguilar, R.; Dufey, E.; Perez, V.; Cordova, C.; Puchi, M.

Título (Idioma original) : A new nuclear protease with cathepsina L properties is present in cancer cells

Nombre del Congreso: The EMBO meeting 2010

País: ESPANA

Ciudad: Barcelona

Fecha Inicio : 04/09/20 10

Fecha Término : 07/09/2010

Nombre Publicación

Año:

Vol.:

N°:

Páginas:


Archivo Asociado: THE_EM BO_MEETI NG_20 1 0.pdf 1305' 11070067/2009/14835/

5

Autor (a)(es/as) : Estefanie Dufey, Vivian Arrey, Viviana Pérez, Viviana Hermosilla, Claudio Iribarren,

Marcia Puchi, Violeta Morin.

Título (Idioma original) : Identification of cathepsin L nuclear variants in colon cancer cells (Caco-2).

Nombre del Congreso: XXIV Reunión Anual Sociedad de Biología Celular de Chile

País: CHILE

Ciudad: Pucón




Año:

Morin, V.; E, Dufey.; Jaña, C.; Solis, C.; Rivas, C.; Puchi, M.; lmschenetzky, M.

Vol.:

Páginas:


Archivo Asociado : XXIV2009_A.pdf 1305/11 07007/2009/14836/

N°: 6

Autor (a)(eslas) : Viviana Perez, Rodrigo Aguilar, Viviana Hermosilla, Estefanie Dufey, Paula Bustos, Marcia

Puchi, Violeta Morin.

Título (Idioma original) : Inhibition of a nuclear Cathcpsin L activity impairs progrcssion of ccli cycle at S-phasc and

Mitosis in HeLa and Caco-2 cells.

Nombre del Congreso: XXIV Reunión Anual Sociedad de Biología Celular de Chile

País: CHILE

Ciudad: Pucón

Fechalnicio: 01/11/2010



Año:

Vol.:

Páginas:


Archivo Asociado: XXTV_2009_B.pdf 305/1 1070067/2009/14837/

TESIS/MEMORIAS

N°:

Título de Tesis : Identificación de una variante de Sph-proteasa en células de carcinoma colorrectal Humano

Nombre y Apellidos del(de la) Alumno(a) : Estefanie Dufey Oyarce

Nombre y Apellidos del(de la) Tutor(a) : Violeta Morin Muñoz

Título Grado: Pregrado

Institución: Universidad de Concepción

País: CHILE

Ciudad: Concepción

Estado de Tesis: Terminada




Archivo Asociado: Tesis_Pregrado_E,_Dufey_2009.pdf 1305/11070067/200917502/

N°: 2

Título de Tesis : Implicancia de una variante de catcpsina L homóloga a SpH-proteasa presente en células Caco-2 durante la fase mitótica del ciclo celular.

Nombre y Apellidos del(de la) Alumno(a) : Viviana Perez Femandez

Nombre y Apellidos del(de la) Tutor(a): Violeta Morin Muñoz

Título Grado : Pregrado


País: CHILE

Ciudad: Concepción

Estado de Tesis : En Ejecución


Fecha Término:


Archivo Asociado: Tcsis_Prcgrado_V_PEREZ.pdf 1305/11070067/2009/7503/

3

Título de Tesis : Expresión de una variante de SpH-protcasa en células de carcinoma colorrectal humano

Nombre y Apellidos del(de la) Alumno(a) : Estefanie Dufey Oyarce

Nombre y Apellidos del(de la) Tutor(a) : Violeta Morin Muñoz

Título Grado : Magistcr


País: CHILE

Ciudad: Concepción

Estado de Tesis : Terminada




Archivo Asociado : Tesis_Magister_E._Dufey_20 1 0.pdf

http://evalcytconicyt.cl/iiiforme_academcn/iiide . php/investigador/f4_tesis_iiiernorias/descarga/872 1305/II 070067/2009/7504/

ANEXOS

Archivo Asociado: Figuras_informe_final_fondccyt.pdf 1305'! 1070067/2009/1 4478/

2

Archivo Asociado : Carta_de_Aceptacion_paper_20 1 0.pdf

http://evaIcyI.conieyt.cI!informe_acadernico/indexplip/investigador/f5_anexoS'deScarga/872 305/11 070067/20091l4537/

N°: 3

Archivo Asociado : estadia_francia_2008.pdf http:I/evalcytconicyt.cI/informe_acadeniico/iiidex.php/investigador!f5ailCXOS/dCSCarga/872l3O5/l 1070067/2009/14630/

A continuación se detallan los anexos fisicos/papel que no se incluyen en el informe en formato PDF.

Figuras: resultados informe final FONDECYT 11070067

2.- Carta de Aceptación de paper titulado: A NEW NUCLEAR PROTEASE WITH CATHEPSTN L PROPERTIES IS PRESENT

IN HELA AND CACO-2 CELLS, 2010.

3.- Carta de invitación. Estadía de Investigación.

3' conicyt

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