2.8 estudio microscópico de los...
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2.8 Estudio microscópicode los microorganismos.
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Preparaciones Microbiológicas
•Preparaciones en fresco (microorganismos vivos)•Preparaciones fijas y teñidas (microorganismos muertos)
FrotisUna capa delgada de muestra extendida sobre un portaobjetos que permite el paso de la luz a través de ella.
•Impronta •Gota de cultivo líquido
•Cultivo sólido resuspendido
•Frotis sanguíneo •Cinta adhesiva transparente
•Hisopo
Tinciones
•Positivas
Se observa teñida la célula sobre un fondo claro.
•Negativas
El fondo se tiñe de oscuro para observar células o estructuras refringentes.
Frotis Sanguíneo Cryptococcus neoformans
Tinciones
•SimplesSe utiliza un solo colorante (básicos).- Azul de metileno- Safranina- Cristal violeta
•CompuestasSe utilizan dos ó más colorantes. Pueden usar mordentes y decolorantes- Giemsa- Wrigth- May Grünwald(Eosina-Azul de metileno)
Bacillus megaterium. Tinción simple con cristal violeta.
Frotis sanguíneo con Yersinia pestis. Tinción de Wrigth.
Médula ósea. Tinción de May Grünwald-Giemsa.
Trypanosoma spen sangre. Tinción de Wrigth.
Tinciones
•Tinción negativa de Cápsula
•Selectivas
Son utilizadas para dar color y aislar partes específicas de los microorganismos
- Endosporas- Flagelo- Núcleo
Tinción negativa de cápsula.Streptococcuspneumoniae.
Tinción de endosporas. Bacillus subtilis.
Tinción de flagelos.Proteus sp
Tinciones
•Diferenciales
Reaccionan de manera diferente entre las distintas clases de bacterias.
- Ziehl-Neelsen
- Gram
Tinción de Ziehl-Neelsen.
Tinción de Gram.
Tinción de Gram.
ColorantesCompuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les imparten color; están formados por un grupo cromóforo que es la parte responsable del color, y un grupo auxócromo que al formar sales le permite disociarse y combinarse. Mordente : compuesto químico intensificador de color.
•Ácidos.
El cromóforo es el anión de la molécula.
•Básicos.
El cromóforo es el catión de la molécula.
Br
NaO
Br
O
Br
O
Br
COO- Na+
Eosina
N
S(CH3)2N N(CH3)2+
Cl-
Azul de metileno
Técnicas de tinción
•Tinción simpleColorante básico (1 minuto)
Enjuagar con agua
Frotis
Bacillus anthracisTinción simple con cristal violeta.
Staphylococcus aureus.Tinción simple con azul de metileno.
Neisseriagonorrhoeae. Tinción simple con safranina.
Pseudomonas aeruginosa. Tinción simple con safranina.
Técnicas de tinción
•Tinción de cápsula
Extendido
Muestra + tinta china o nigrosina
Safranina de Gram o Cristal Violeta (1 minuto)
Secar al aire
Streptococcus pneumoniae
Acinetobacter calcoaceticus
Técnicas de tinción
Verde de malaquita 5% con emisiones de vapor de agua (10 minutos)
Lavar con agua
Safranina 0.5% (1minuto)
•Tinción de endosporas
Bacillus subtilis
Clostridium tetani
Técnicas de tinción
•Tinción de flagelo
Colorante primario. Para-rosa anilina
Mordente. Acido tánico
Colorante de contraste. Azul de metileno
Proteus vulgaris
Vibrio cholerae
Colorante primario. Cristal violeta 1% en solución de oxalato de amonio al 0.85% (1 minuto)
Colorante de contraste. Safranina 0.25% (1 minuto)
Mordente. Lugol Iº/KI 1g/2g en 300 mL de agua (1 minuto)
Decoloración. Alcohol-Acetona 70:30. Hasta eliminar el exceso de colorante
•Tinción de Gram
Técnicas de tinción
Streptococcus pyogenes
Bacilos Gram negativos y levaduras
Técnicas de tinción
Colorante primario. Fucsina fenicada con emisiones de vapor de agua (10 minutos)
Colorante de contraste. Azul de metileno de Loeffler (1 minuto)
Decoloración. Alcohol-Acido (etanol-HCl) 97:3. Hasta eliminar el exceso de colorante
•Tinción de Ziehl-Neelsen(BAAR)
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
BaciloÁcidoAlcoholResistente
Fijar carbol- fucsina calentar
Mantener humedo calentar lavar con agua
Decolorar con ETOH-HCl Contrastar con azul Observar 1000X
de metileno
Tinción de
Ziehl-
Neelsen
Nocardia sp.
Bacterias filamentosas,
Acido-Alcohol-Resistentes
Microscopía
Microscopía
http://twistedbacteria.blogspot.com/
Comparación de tamaño entre varios átomos, moléculas y microorganismos. No está dibujado a escala. Tomado de Alcamo´s Fundamentals of Microbiology.
Microscopía
Las bacterias y las célulasde arqueastienenaprox. 1–5 micrómetros(µm) largo.
Microscopía óptica y electrónica
Tipos de microscopías•Óptica de campo claro •Óptica de campo oscuro
•Contraste de fases •De contraste de interferencia diferencial (DIC).
Tipos de microscopías•Confocal •De fluorescencia
•Electrónica de barrido •Electrónica de transmisión
En la microscopía de fluorescencia, el especímen es cubierto con un colorantefluorescente y se ilumina con luz ultravioleta.
Microscopía de fluorescencia de células esporulantes de B. subtitlusCourtesy of Dr. Peter Lewis; School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle
La microscopía electrónica provee imágenesdetalladas de células, partes celulares, y virus.
Los electrones son absorbidos, reflejados o transmitidos dependidendo de la densidad de las estructuras en la muestra.El límite de resolución es aprox. de 2nm.
Microscopía electrónica de Transmisión (TEM)
Con la Microscopía Electrónica de Transmisión se visualizan estructuras en cortes ultrafinos de células.
Pseudomonas whole cells TEM
© CNRI/Photo Researchers, Inc.
La microscopía electrónica de barrido (scanning electron microscope (SEM)) Se utiliza para visualizarsuperficies de objetos no seccionados.
© Dr. Dennis Kunkel/Visuals Unlimited
Pseudomonas whole cells SEM
http://www.microscopyu.com/staticgallery/featuredmicroscopist/deerinck/images/deerinckimage8large.jpg
Confocal image of some dividing cells that are triple labeled for Golgi apparatus (green), microtubules (red), and DNA (blue).
Microscopía
http://endospore.freeblog.hu/files/early_microscope.jpg