Proteínas: miogIobina y hemoglobina

Víctor W. Rodweii, PhD

Como ejemplo de la relación estructura-función pro- teinica, este capitulo estudia la rnioglobina y la hemo- globina, proteinas importantes por derecho propio y porque en ellas puede apreciarse cómo las estructuras de las proteinas conforman o determinan sus funciones bioldgicas.

IMPORTANCIA BIOMÉDICA

Las proteínas hemicas intervienen en el transporte y fijacibn de oxígeno, en el transporte de electrones y en la fotosintesis. El estudio detallado de la hemorrlobina - y la mioglobina ejemplifica aspectos estructuraIes comunes a muchas proteinas. En un sentido, su mayor significado médico consiste en que su conocimiento muestra, de manera elocuente, las relaciones estructura- funcibn de las proteínas. Ademiis, este conocimiento permite reconocer la base rnolecular de enfermedades genéticas como la enfermedad de cklulas falciformes (que resulta de la alteracibn de las propiedades de superficie de la cubunidad beta de la hemoglobina) y tas talasemias (enfermedades hemoiiticas familiares crbnicas, caracterizadas por defectos en la síntesis de la hemoglobina). El cianuro y el mon6xido de carbono son tbxicos debido a que interrumpen la función fisio- lbgica de las proteinas hdrnicas, citocromo oxidasa y hemoglobina, respectivamente. Por último, la estabiliza- cEbn de la eshuctura cuatemaria de la desoxihemoglobina por el 2,3-bisfosfoglicerato (BPG, del inglés, 2,3- bisphosphoglicerafe) es esencial para comprender los mecanismos del mal de montafía y de la adaptacihn a las grandes altitudes.

EL HEM Y EL HIERRO FERROSO CONFIEREN LA PROPIEDAD DE ALMACENAR Y TRANSPORTAR OX~GENO

La mioglobina y la hemoglobina poseen coma grupo prostdtico un tetrapirrol cicIico, el hem. La extensa red de enlaces dobles conjugados del hem absorbe luz en el extremo bajo del espectro visible, por lo que su color es rojo intenso. Los tetrapimoles constan de cuaao mol~culas de girrol (figura 7-1) enlazadas en un anillo planar por cuatro puentes al fa-metileno. Los susti- tuyentes beta deteminan si un tetrapirrol es hem o un compuesto analogo. En el hern, los grupos son metilo (M), vinilo (V) y propionato (Pr) y siguen el orden M, V, M, V, M, Pr, Pr, M (figura 7-2). En el centro de este anillo planar, hay un titorno de hierro ferroso ( ~ e ~ ' ) . Otras proteinas con grupos prostt5ticos tetrapi- rrdlicos (y sus iones methlicos relacionados) incluyen los citocromos (Fe2' y Fe3'), las enzima catalasa y triptófano pirrolasa y la clorofila (Mg2*). En los ci- tocromos, la oxidación y la reducción del htorno de hierro son esenciales para su funci6n bioldgica. Por el contrario, la oxidación del Fe2'de mioglobina y hemo- globina destruye su actividad biológica.

Figura 7-1. Pirrol. Los carbonos alfa estdn unidos por puen- tes metileno en un tetrapirrol. Los carbonos beta sostienen a los sustituyentes característicos de un tetrapirrol específico, como el hern

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66 Rioquímica de Harper (Capitulo 7)

Figura 7-2. Hem Los carbonos de los anillos pirrolicos y de los puentes de metileno son coplanares y el átomo de hierro (Fez+) esta casi en el misma plano. La quinta y la sexta posiciones de coordinacbn del Fe2+ con perpendiculares y directamente arriba y abajo del plano del anillo hemico. Obsérvese la naturaleza de los grupos sustitvyentes en los carbonos beta de los anillos pirrblicos, el Btorno central de hierro y la ubicación del lado polar del anlllo hemica (casi a las siete horas del reloj) que se enfrenta a la superficie de la molécula de mioglabina.

La oxirnioglobina almacena oxígeno

La mioglobina del tejido muscular rojo almacena oxlgeno. Bajo condiciones de escasez (por ejemplo, en el ejercicio extenuante), el oxigeno almacenado se libera para usarse en las mitocondrias musculares para la síntesis de ATP dependiente de oxígeno.

Con dos excepciones, los residuos polares están en la superficie de la rnioglobina

La mioglobina, cadena polipeptfdica sencilla con peso moIecular de 17 000, no es excepcional respecto a sus 153 residuos aminoacídicos. Sin embargo, en su dis- tribución espacial hay diferencias evidentes. La superficie es polar y el interior no polar, patrón típico de las proreinas globulares. Los residuos con regiones po- lares y no polares (por ejemplo, Tre, Tri y Tir) orientan sus partes no polares hacia el interior. Sin contar los dos residuos histidilos que funcionan en lafijacion del oxlgeno, el interior de la mioglobina s61o contiene residuos no polares (por e,jemplo, Leu, Val, Fen y Met).

La mioglobina es rica en hélices alfa

La mioglobina es una molecula compacta, toscamente esférica, que mide 4.5 x 3.5 x 2.5 nm (figura 7-3). Sin

embargo, su conformación es atipica. Para facilitar la referencia a regiones particulares de estructura secun- daria o terciaria de un polipéptido, a cada hélice alfa, hoja beta o asa se le asigna un nhmero o letra a partir de la terminal amino del polipeptido. Aproximada- mente 75% de sus residuos se distribuyen en ocho hhlices alfa (giro a la derecha) de 7 a 20 aminohcidos de longitud. Comenzando por la terminal amino, se denominan hklíces de la A a la H. Las regiones inter- Relicales se identifican con las letras de las dos hhlices que conectan. Los residuos individuales se designan por la letra de la hdlice en la que residen y un nrjmero que indica su distancia desde [a terminal amino de esa hélice. Por ejemplo, "His FX" se refiere al m v o residuo en la hClíce F e identifica a un residuo histidilo. Los residuos que en la esttuctum primaria se encuentran bastante alejados (por ejemplo, en hélices diferentes) pueden, no obstante, estar en sentido espacial muy juntos, por ejempIo, los residuos histidilo Fg (proxi- mal) y E7 (dista]) (figura 7-3).

La estructura secundaria y terciaria de la rnioglo- bina en solución es muy semejante a la de larnioglobi- na cristalizada. Exhiben virtualmente el mismo espectro de absorción; la cristalina fija oxígeno y la cantidad de hélice alfa en una solucibn (calculada por la dispersión óptica rotatoria y dicroísmo circular) se aproxima bastante a la mostrada por el análisis crista- lográfico con rayos X.

Figura 7 3 . Modelo de mioglobina de baja resolucibn S610 se muestran los Btomos de carbono alfa. Las regiones donde se localizan las hklices alfa se designan con las letras que van de la A hasta la H. (Basada en Dickerson RE en: The Proteins, 2nd ed vol. 2 Neurath H [Editor]. Academic Press, 1964 Reproducida con autorización )

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Proteínw: miog/obinu y hemoglobina 67

En presencia del hem, la estructura primaria de la apomiogiobína determina un plegamiento proteínico correcto

Cuando la apomioglobina (mioglobina sin el grupo hem) es preparada reduciendo el pH a 3.5, su contenido de h&lice alfa decrece de manera notable. La adicibn subsecuente de urea elimina todo el contenido de hklices atfa. Si se retira la urea por diálisis y se agrega hem. el contenido completo de hélice alfa se recupera y la adiciirn de Fe2' restablece su actividad biolbgica (fijaci6n de oxigeno) integra. Por tanto, la infomacidn estnictural primaria contenida en la apomioglobina puede. en presencia del hern, especificar el ple- gamiento de la proteina a su conformacibn nativa con actividad biológica. Como se explic6 en el capítulo 6. este importante concepto se extiende a otras proteinas: la estructura primaria de una proteina dirige su conformacibn secundaria y terciaria.

Las histidinas F8 y E7 llevan a cabo funciones únicas en la fijación de oxígeno

El hern de la mioglobina, que se encuentra en un surco entre las hélices E y F (figura 7-3), se orienta con sus propionatos polares en la superficie. El resto se proyecta hacia el interior de la rnolkcula de mioglobina en donde, con excepcidn de His E7 y de His FS, los residuos circundantes son no polares. La quinta posi- ci6n de coordinacion del átomo de hierro se une al nitrógeno de un anillo de la histidina proximal, His F8 (figura 7 4 ) . Aunque no estit enlazada a la sexta posicion de coordinacidn del hierro, la histidina dis- tal (His E7) permanece en el lado del aniilo hdrnico al otro lado de His F8 (figura 7-4).

El hierro se mueve hacia el plano del hern cuando se fija el oxígeno

En la rnioglobina no oxigenada, el hierro del hern se encuentra aproximadamente a 0.03 nm (0.3 A) fuera del plano del anillo en direccidn a His F8. En la mioglobina oxigenada, un htorno de oxigeno ocupa la sexta posicion de coordinaci6n del iitorno de hierro y entonces &te se desplaza a 0.01 nm (0.1 A) fuera del plano del hem. Por tanto, la oxigenacibn de la rnioglobina va acornpaflada por el movimiento del átomo de hierro, y el consecuente desplazamiento de His FB y los residuos aminoacldicos enlazados por covalencia a CI , hacia el plano del anillo. Este movimiento produce una nueva conformacibn de cier- tas porciones de la proteina.

His proximal (Fa)

P,

4' HIS dista1 (ET)

Figura 7 4 . Adicidn del oxlgeno al hierro hemico en la oxigenacibn Tambien se muestran las cadenas imidazólicas laterales de los dos resrduos importantes de histidina de la globina que se adhieren al hierro del hem (Reproducida con autoruacion de Harper HA y colaboradores Phys~ologische ChemEe. Springer-Verlag, 1975 )

La apomioglobina proporciona un ambiente adverso para el hierro hernico

Cuando el oxigeno se une a la rnioglobina, el enlace entre este y Fe2' es perpendicular al plano del anillo hemico. Un segundo átomo de oxigeno se une en un dngulo de 121" con respecto al plano del hern y orientado alejándose de la h istidina dista1 (figura 7-51,

Figura 7-6. Anguios pceferidos para el enlace del oxfgeno y el rnonbxido de carbono al átomo de hierro del hern libre [línea gruesa)

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El mon6xido de carbono (CO) se une al hem aislado con una afinidad aproximadamente de 25 000 veces mayor que la del oxigeno. Si la amibsfera con- tiene restos de CO y el catabolismo normal del propio hern produce cantidades pequefias de este gas, ¿por qué entonces no es el CO (en lugar del Oz) e[ que ocupa la sexta posicidn de coordinacibn del hierro hémico de la mioglobina? La respuesta se encuentra en el ambiente adverso del hem en la mioglobina. La orientacihn preferida del CO para enlazarse al hierro hkmico es con los tres átomos (Fe, C, O) en posición perpendicular respecto al anillo hémico (figura 7-5). Aunque esta orientacion es posible para el hem ais- lado. en la mioglobina la histidina dista! obstaculiza esttricamente a los enlaces de CO en este Angulo (figura 76 ) . Esto obliga al CO a unirse en una con- figuracibn menos favorabte y reduce la fuerza de la unión hem-CO en más de dos órdenes de magnitud, aproximadamente 200 veces la fuerza del enlace hem- 02. NO obstante, por lo común, una pequeila cantidad (m8s o menos 1%) de la mioglobina está presente en forma de mioglobina-CO.

LAS CURVAS DE DISOCIACIÓN DEL OX~GENO PARA LA MIOGLOBINA Y LA HEMOGLOBINA EXPLICAN SUS FUNCIONES FISIOLQGSCAS

¿Por que la mioglobina es inadecuada como proteina transportadora de oxígeno, pero eficaz para almace- narlo? La cantidad de oxigeno unido a la rnioglobina (expresada como "porcentaje de saturacibn ") de- pende de la concentracibn de oxigeno (expresada

como PO2 o presión parcial de oxigeno) en et entorno inmediato del hierro h&rtico. Ea relacion entre PO? y la cantidad de oxlgeno unido puede graficarse como una curva de saturacibn de oxigeno (disociacidn del oxígeno). Para la mioglobina, la forma de la isotenna de absorción de oxígeno es hiperbblica (figura 7-7). Dado que la PO2 en el lecho capilar pulmonar es de 100 mm Hg, la miaglobina podria retener oxigeno de manera eficaz en los pulmones. Sin embargo, la POz de la sangre venosa es de 40 mm Hg y la del músculo activo aproximadamente de 20 mm Hg. Puesto que la mioglobina no puede liberar una fracción grande de su oxigeno unido aún a 20 rnm Hg, no sirve como un vehículo eficaz para el transporte del oxigeno de los pulmones a los tejidos perifkricos. No obstante, en la privacibn de oxigeno que acompaflñ al ejercicio físico extenuante, la PO2 del tejido muscular puede dis- minuir hasta 5 mrn Hg. A esta presión, la mioglobina cede con facilidad su oxigeno pare la síntesis oxida- tiva de ATP por las rnitocondrias musculares.

LA HEMOGLOBINA TRANSPORTA 0 2 , COZ Y PROTONES

La hemoglobina de los eritrocitos de los vertebrados llevan a cabo dos funciones biolbgicas principales: 1) transportar el 0 2 del aparato respiratorio a los tejidos perifericos y 2) transportar el C01 y los protones, desde los tejidos perifericos hasta los pulmones para ser excretados. Aunque la bioquímica comparativa de las hemaglobinas de los vertebrados constituye un campo fascinante, aqui sólo se describirkn las hemo- globina~ humanas.

Figura 7 4 . Anguios para el enlace del oxigeno y e l Flgura 7-7. Curva de fijecibn de oxlgeno para la mioglobina rnonbxido de carbono al hierro hérnico de la mioglobina La Obsérvese la relacibn entre el porcentaje de saturacidn y las histidina distal E7 obstaculiza el enlace del CO en su Angulo presiones pardaks representativas en pulmones(lO0 mm Hg), preferido (1 80 O) respecto al plano del anillo hbmico. tejidos (20 mm Hg) y el músculo en trabajo activo (5 mm Hg).

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LAS PROPIEDADES ALOSTÉRICAS DE LAS HEMOGLOBINAS SON CONSECUENCIA DE SUS ESTRUCTURAS CUATERNARIAS

Las propiedades de cada hemoglobina son consecuen- cia inherente de su estructura cuaternaria, así como de la secundaria y la terciaria. La estructura cuaternaria Ze da a la hemoglobina propiedades adicionaIes sor- prendentes (no existentes en la mioglobina) que la adaptan a su función biologica única y le permiten una regulacibn precisa de sus actividades. Ademas las propiedades alostéricas (del griego, allos: otros, steros: espacio} de la hemoglobina proporcionan un modelo para comprender otras proteínas alostericas.

A diferencia de la mioglobina, Za hemoglobina es una proteína tetramérica

Las hemoglobinas son protcinas tetramdricas, com- puestas de pares de polipbptidos diferentes (denomi- nados alfa, beta, garnrna, delta, S, etcétera). Aunque semejantes en longitud global, los polipdptidos alfa (14 1 residuos) y beta (146 residuos) de la hemoglo- bina A (HbA) son codificados por genes diferentes y tienen estructuras primarias distintas. No asi, las estructuras primarias de las cadenas beta, delta y g a m a de las hemoglobinas humanas tienen estructuras pri- marias altamente conservadas. Las estructuras tekarnéricas de 1a.s hemoglobinas comunes son: H1iA @e- moglobina normal del adulto) = alfazbeta2, HbF memoglobina fetal) = alfaz, gammaz (a2,&), HbS perno- globina de c&lulas falciformes) = alfa2S2, y HbAz (una hemoglobina menor del adulto) = alfaz, deltaz (azSz.).

La mioglobina y las su bunidades beta de hemoglobina comparten estructuras secundarias y terciarias casi idénticas

A pesar de las diferencias en el tipo y niimero de ami- noácidos presentes en la mioglobina y en el polipép- tido beta de HbA, exhiben estructuras secundarias y terciarias casi idrlnticas. Esta semejanza que se extiende a la ubicacibn del hem y de las ocho regiones helicoi- dales, es consecuencia en parte de la presencia de aminohcidos de propiedades análogas en puntos equivalentes en las estructuras primarias de ambos. Ademh, el polipéptido beta es muy semejante a la rnioglobina a pesar de la presencia de siete hélices en lugar de ocho. Igual que en la rnioglobina, los residuos hidrofobos son internos y (de nuevo con excepci6n de los dos residuos His por subunidad), tos residuos hidrbfílos son características de la superficie en las subunidades alfa y beta de la HbA.

La oxigenación de la hemoglobina se acompaña por cambios en la conformación de la apoproteína

La hemoglobina fija cuatro rnol~culas de oxlgeno por tetrhmero (uno por cada subunidad hdmica), y sus curvas de saturacibn de oxigeno son sigmoideas (figura 7-8). Por tanto, la facilidad con la que el Oz se une a la hemoglobina depende de la presencia de otras moléculas de 0 2 en el mismo tetrámero. Si ya existe oxigeno unido, la fijacibn de subsiguientes moltculas del mismo tiene lugar con mayor facilidad. Por tanto, la hemoglobina muestra una cinética cooperativa de fijacibn, propiedad que le permite retener una cantidad máxima de oxígeno en los pulmones y ceder una cantidad, también rnkirna, con la POz baja que pre- valece en los tejidos perifdrjcos. Por ejemplo, com- pdrense estas cantidades a la PO2 de los pulmones humanos (100 mrn Hg) y de tos tejidos (20 mm Hg) con las de la rnioglobina (figura 7-8).

La P50 compara las afinidades relativas de diferentes hemoglobinas para el oxigeno

La PW es la presibn parcial de oxfgeno que satura la mitad de una moltcula de hemoglobina. Dependiendo del organismo, la Pso puede variar ampliamente, aun-

100

c 90 'O .g so 5 70 - 2 60 a, P

,50 p 40

30

20 'lo

' 0 20 40 00 80 100 120 140

Presidn gaseosa del oxígeno (mrn Hg)

Flgura 7-8. Curvas defijacibn del oxígeno de la hemoglobina y la mioglobina. La tensión artenal de oxigeno es aproximada- mente de 100 mm Hg, la tensión de oxígeno de la sangre venosa mezdada es de más o menos 40 rnm Hg, la tensibn caprlar (músculo activo) del oxígeno es de 20 mm Hg y la tensibn de oxígeno minirna requerida por las enzimac ci- tocrómicas es de 5 mm Hg. La agrupacibn de cadenas en una estructura tetramkrica (hemoglobina) permite una cesibn mayor de oxígeno que la que sería posible mn cadenas sencillas. (Modificada con autorizacidn de Stanbury JB, Wyn- gaarden JB, Fredrrckson DS [editors]: The Metabolic Basis of lnhented Disease, 4th ed McGraw-Hill, f 978 )

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70 Bioquimica de Harper (Capiau/o 7)

que en todos los casos es superior a la PO? en !os tejidos periféricos del organismo en cuestihn. La hemoglobina fetal humana (H bl: del inglés, human~iaI hemoglohin) proporciona un ejemplo representativo. Para H bA, Pro = 26 mm Hg; para HbF, Pru = 20 mm Hg. Esta diferencia permite a la HbF extraer oxígeno de la HbA de la sange placentaria, Sin embargo, dcspuks del parto la HbF es inadecuada, ya que su elevada afinidad por el oxígeno la obliga a ceder menos O2 a los tejidos.

Al principio, el feto humano no sintetiza cadenas alfa ni beta sino reta y epsilon. Al final del primer trimestre, alfa ha reemplazado a las subunidades zeta y a 10s pCptidos Cpsílon. Asi, la hemoglobina F, que es la hemoglobina de Ia vida fetal tardía, tiene la camposici6n alFa: gammaz. Las cadenas beta, cuya sintcsis comienza en el tercer trimestre, no reemplala en su totalidad a gamrna hasta algunas semanas despues del nacimiento.

Grandes cambios de conformación acompañan la oxigenación de la hemoglobina

La unión del oxígeno ocasiona la rotura de los enlaces salinos entre carboxilo de las cuatro subunidades (figura 7-9). La fijación subsecuente de O2 se facilita ya que se requiere la rotura de un número menor de enlaces salinos. Estos cambios alteran lambidn de manera profunda las estructuras secundaria, terciaria y cuater- nariade la hemoglobina. Un par de unidades alfdheta gira con respecto al otro par alfabeta, haciendo com- pacto al tetramero e incrementando Ia afinidad de los hemes por el O: (figuras 7-1 0 y 7-1 1 ).

L a estructura cuaternaria de la hemoglobina par- cialmente oxigenada se describe como el estado T (tenso) y el de la hemoglobina oxigenada (HbOz)

His 94

COO 4 / n= ASP NH,' I I ,

Figura 1-9. Enlaces salinos entre las diferentes subunidades de la desoxihemoglobina Estas interacciones electrastáticas no covalentec son interrumprdas por la oxigenación (Ligera- mente modtficada y reproducida con autorización de Stryer L. Brachemistry, 2nd ed Freernan, 1981 .)

1 Forma T

wi Forma R

Figura 7-10. Durante la trancicibn de la forma T a la R de la hemoglobina se produce Fa rotacibn da un par de subuni- dades rigidas (alfaZlbeta2) de 15 grados en relación con el otro par de subunidades rígidas (alfallbetal) El eje de rotacibn es excéntrico y además, el par alfa2lbeta2 derjva un poca hacia el eje. En el diagrama, el par aifallbetal no ect6 sombreado y se conserva f ~ o , en tantu que el par sombreado alfa2lbeta2 gira y se desplaza.

DESOXI (forma T)

0x1 (forma R)

Asn G41102)

Figura 7-1 1. Cambios en el contado alfailbeta2 en la oxigen- acion Et contacto se cierra de un Area en forma de cola de paloma a otra, comprende el cambio de un puente de hidrbgeno a otro distinto Los dernac enlaces son no polares (Reproducida con autorización de Perutz MF: Molecular pa- thology of human hemoglobin Stereochernical interpretation of abnormal oxygen affinities Nature 1971.232,408 )

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como el estado R (relajado) (figura 7-12). La R y T bamato y liberando protones que contribuyen al efecto se utilizan tambikn para describir las estructuras cua- Bohr. ternarias de las enzirnas alostkricas, donde el estado T H tiene afinidad menor por el susírato. CO~+H~-NH;=ZH'+ ~ b 4 - C O O -

La oxigenación de la hemoglobina se acornpaiia de cambios de conformación en la vecindad del grupo hern

En la oxigenación, los Qtomos de hierro de la desoxi- hemoglobina (que se encuentran alrededor de 0.06 nm fuera del plano del anillo hérnico) se mueven hacia este plano (figura 7-13). Este movimiento se tsans- mite a la histidina proximal (Fg), que avanza hacia el plano del anillo y arrastra consigo a residuos adheri- dos a His F8.

Después de la liberación de oxígeno a los tejidos, la hemoglobina transporta COZ y protones a los pulmones

Además de llevar el oxigeno de los pulmones a los tejidos periféricos, la hemoglobina facilita el trans- porte del COz de los tejidos a los pulmones para ser exhalado. La hemoglobina puede un irse directamente al COI cuando cede su O? y aproximadamente 15% del CO1 acarreado por Ia sangre es transportado asi. El bióxido de carbono reacciona con los grupos amino terminales de la hemoglobina, formando un car-

La conversión del amino terminal de una carga posi- tiva a una negativa favorece la formacibn de un puente salino entre las cadenas alfa y beta, situación tipica del estado "desoxi". En los pulmones, la oxigenacibn de la hemoglobina se acompafía de la expulsi6n y la subsiguiente exhalación de COZ. Cuando la sangre recibe el Coa, laanhidrasa carbónica de Ios eritrocito5 cataliza Ia formación de ácido carbonico (figura 7-14). Este se disociacon rapidez en bicarbonato y un protón. Para evitar que se aumente la acidez en la sangre, debe existir un sistema amortiguador que absorba el exceso de protones. La hemoglobina retiene dos prorones por cada cuatro rnoltculas de oxigeno que pierde y de este modo aumenta la capacidad amortiguadora de la sangre (figura 7-15), En los pulmones, el proceso se invierte, es decir, conforme el oxígeno se une a la desoxihemo- globina, los protones se liberan y se unen al bicar- bonato formando hcido carbónico. Con ayuda de la anhidma carbbnica, el hcido carb6nico forma Coz, que es exhalado. Por tanto, la fijacibn de! oxigeno obliga la expulsibn del COz. Este fenbmeno reversible se llama efecto Bohr: este efecto se acompafía por una des- viacibn de la curva de oxigenacibn hacia la derecha, es decir, la hemoglobina se encuentra menos saturada a una presión parclal de oxígeno dada. El efecto Bohr es una propiedad de la hemoglobina tetramérica y de- pende de la interaccibn hem-hem o de efectos coo- perativos. La mioglobina no muestra tal efecto.

m Estructura T

Estructura R

Figura 7-12. La Iransicibn de la estructura T a la estructura R es mfis probable conforme se oxigena cada 1 d e los 4 grupos hem de una hemoglobina tetrhmera En este modelo, los puentes salinos (lineas delgadas) que enlazan las sribunidades en la estructura T, se rompen progresivamente al unirse al oxigeno y aún aquellos enlaces salinos que no se han roto se debilitan cada vez mis (lineas onduladas) La transicibn de T a R no tiene lugar sino decpu6s de que se han filado cierto numero de rnolewlas de oxigeno, pero se vuelve rnhs probable con cada oxígeno sucesivo que se une. La transición entre las dos estructuras es modificada por varios factores, incluyendo protones, bióxido de carbono, cloro y BPG. Mientras mayor sea su mncentracion, más oxígeno debe unirse para desencadenar la transiudn Aquí no se muestran mol&culac totalmente oxigenadas en la estructura T ni totalmente desoxigenadas en su forma R, debido a que son demasiado inestables para existir en cantidad significativa. (Modificada y redibujada Con autorizacidn de Perutz MF Hemoglobin structure and respiratory transport Sci Am [Dec] 1978:239,92 )

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(Capítulo 7)

Histidina Fa

Repulsibn

Plano de la porñrina

Figura 7-13. El Btomo de hierro se mueve en el plano del hem durante la oxigenacibn La histidina F8 y sus residuos relacionados son arrastrados con el fitomo de hierro. (Ligera- mente modificada y reproducida con autorizacibn de Stryer L Biochemistry. 2nd ed Freeman 1981.

Los protones que causan el efecto Bohr se generan por rotura de enlaces salinos durante la fijación del oxígeno

Los protones que ocasionan el efecto Bohr, son gene- rados por la rotura de puentes salinos durante la fijacibn del oxigeno a la estructura T. Estos protones, liberados de los itomos de nitrógeno de los residuos HC3 (His 146) de la cadena beta, conducen al bicar- bonato hacia el acido carbbnico, el cual es liberado como C 0 2 en la sangre alveolar (figura 7-1 5). Por otro lado, en la cesibn del oxigeno Ea estructura T y los puentes salinos se regeneran, y tos protones se unen a los residuos HC3 de la cadena k t a . Por tanto, la presen~ia de protones en los tejidos periféricos fa- vorece la formación de puentes salinos en la residuo His terminales de las subunidades beta. La regene-

Figura 7-14. Formacibn de á d o carbónico, mtatizada por Fa anhidrasa carbbnica eritroutaria y disociacibn del áudo carbbnico a ion bicarbonato y un protbn.

ZCO, + 2HzO

11 lz3 2HXOs

41 TEJIDOS FERIFERICOS Il

2HCO3- + 2H + x;;:>-03- 4%

(Amortiguador) 2HzCOa

PULMONES

Generado por el /'

dcb de Krebs

Figura 7-15. Efecto Bohr El bibxido de carbono generado en los tejtdos periféricos se combina con el agua para formar Audo carbbnico el cual se disocia en iones bicarbonato y protones. La hemoglobina desoxigenada actúa como un amortiguador al fijar protones y liberarlos en los pulmones Aqui, la unibn del oxígeno a la hemoclobina desaloja a los protones; estos se combinan con el ion bicarbonato y rege- neran al ácido mrbbnico el cual, cuando es dechidratado por la anhtdrasa carbbnica, produce bibxido de carbono, que es exhalado desde los pulmones.

ración de los enlaces salinos propicia la liberacibn del O2 de la hemoglobina oxigenada (forma R). En re- sumen, un incremento en los protones estimula la liberacibn de oxígeno, en tanto que un incremento en el oxlgeno provoca la liberacibn de protones. El primer fenbmeno puede representarse en una curva de disociacibn del oxigeno por un desplazamiento a la derecha al aumentar la concentración de iones hidrbgeno (protones).

El 2,3-bicfosfoglicerato (BPG) estabiliza la estructura T de la hemoglobina

En los tejidos perifericos, una escasez de oxigeno acumula el 2,3-difosfoglicerato (BPG) (figura 7-1 6). Este compuesto se forma a partir del intermediario de la vla glucolitica, 1,3-bisfosfoglicerato. Una molécula de BPG se une a cada tetrámero de la hemoglobina en una cavidad formada por residuos de las cuatro subunidades. La cavidad central es de tamaño sufi- ciente para el BPG sblo cuando el espacio entre las hélices H de las cadenas beta es de una anchura adecuada, es decir cuando la molécula de hemoglo-

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Proteinas: miogioblna y hemoglobina 73

Figura 7-16. Estructura del 2,3-bisfosfoglicerato (BPG).

bina esta en la forma T. El BPG es unido mediante puentes salinos entre sus Sitornos de oxigeno y las dos cadenas beta a travks de sus grupos m i n o arnino-ter- mina1 (Val NAl ), Lis EF6 y His H21 (figura 7-17). Por tanto, el BPG estabiliza la forma T o desoxigenada de la hemoglobina por medio de enlaces cruzados con las cadenas beta y por contribuir con puentes salinos adicionales, que deben romperse antes de que se pro- duzca la f o m a R.

El BPG se une de manera más dtsbil a la hemo- globina fetal que a la hemoglobina del adulto debido a que el residuo H21 de las cadenas gamma de la hemoglobina fetal es Ser en lugar de His y no puede formar un puente salino con BPG. Por lo anterior el

Figura 7-17. Modo de enlace del 2-3-bisfosfoglieerato a la deaoxihemoglobina humana. El BPG interactba con tres grupos de carga positiva en cada cadena k t a (Basada en Arnone A: X-ray diffraction study of binding of 2,341phospho- glycerate to human deoxyhemoglobin Nature 1972;237.146. Reproducida con autorizacibn.)

BPG tiene un efecto menos profundo en la estabili- zación de la HbF y es causa de que esta parezca tener una mayor afinidad por el oxigeno que la hemoglo- bina del adulto.

El desencadenante de la transicibn entre R y T de la hemoglobina es el movimiento del hierro dentro y fuera del plano del anillo de porfirina. Tanto los factores espaciales como los electrostáticos median ese desencadenamiento. Asi, un cambio minimo en la posición de Fe2' en relacibn al anillo de porfirina induce variaciones significativas de las confonnacio- nes de la hemoglobina y afecta de manera decisiva su función biolbgica en respuesta a una sena1 ambiental.

SE HAN IDENTIFICADO VARIOS CIENTOS DE HEMOGLOBINAS HUMANAS MUTANTES

Las mutaciones en los genes que codifican las cadenas alfa y beta tienen potencial para afectar la functdn bioldgica de la hemoglobina. De los varios cientos de hemoglobinas humanas mutantes conocidas (lamayo- ría son muy raras y benignas), en seguida se descriixn algunas, cuya función biológica esti alterada. Cuando la alteracibn de la funcibn biolbgica se debe a una rnutacidn en la hemoglobina, el trastorno se conoce como una hemoglobinopatia.

En la hemoglobina M, Tir reemplaza a His F8

El hierro hdmico se estabiliza en el estado Fe", ya que forma un complejo i6nico firme con el anión fenola- to de Tir, Larnetahemoglobinemia, donde el ion hierro del hem está en estado férrico en lugar de ferroso, puede ser adquirida (por ejemplo, con la oxidacirin de Fe2' a Fe3+ por compuestos tales como las sulfonamidas), hereditaria (debido a la presencia de HbM) o causada por la disminuci6n de Ia actividad de la rnetahemoglo- bina reductasa, enzima que reduce el Fe" de MetHb a Fe2+. Puesto que la metahemoglobina no fija 01, no puede participar en el transporte de oxlgeno. En las variantes de la cadena alfa de la hemoglobina M, el equilibrio R-T favorece a la forma T. La afinidad por el oxigeno esta disminuida y no hay efecto Bohr. La cadena beta de estas variantes presenta cambio R-T y, por tanto, se produce el efecto Boht.

Las mutaciones (por ejemplo, la hemoglobina Chesapeake} que favorecen la f o m a R muestran una afinidad creciente por el oxigeno, por lo cual no lo ceden en suficiente cantidad a los tejidos periftricos. La hipoxia tisuIar que se produce lleva a policiternia (incremento en el número de eritrocitos).

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En ia hemoglobina S, un residuo valil reemplaza al glutamato beta-6

En la hemoglobina S, Val reemplaza a Glu A2 (6)P, es decir. el residuo 6 de la cadena beta localizado en la superficie de la hemoglobina, expuesta al agua. Esta sustitución reemplaza el residuo polar glutamato por uno no polar y da lugar a una "zona adherente" en la superficie de la cadena beta. Esta zona existe en las formas oxigenada y desoxigenada de la hemoglobina S pero no en la hemoglobina A. En la superficie de la hemoglobina S desoxigenada hay un complemento para la zona adherente, pero en la hemoglobina S oxigenada este sitio complementario esta enrnas- carado (figura 7-1 8).

La desoxihernoglobina S puede formar una estructura fibrosa que distorsiona los eritrocitoc

Cuando la hemoglobina S está desoxigenada, su zona adherente puede unirse a la zona complementaria de otra molécula S desoxigenada. Esta union hace que la hemogiobina S desoxigenada se polimerice, for- mando precipitados fibrosos largos que se extienden a través del eritrocito y lo distorsionan mecfinicamente causando lisis y mtiltiples efectos cllnicos secun- darios. Asl, si [a hemoglobina S pudiera conservarse en su estado oxigenado, o si la concentracidn de la Forma desoxigenada lograra mantenerse en un mínimo, no se formarían estos polímeros y se evitaria la aparición de "células falciformes". Es evidente que la forma T de la hemoglobina S es la que se polimeriza.

Aunque la desoxihemoglobina A contiene los sitios receptores para ia zona adherente que existe en las hemoglobinas S, oxigenada y desoxigenada (figura 7-1 S), la uni6n de la hemoglobina S adherente a la desoxihernoglobina A no puede extender el polimero, ya que esta iiltírna no tiene zona adherente para promover a su vez la unibn de otra molCcula de hemoglobina. Por tanto, la uni6n de la desoxihemo- globina A a la forma R o a la forma T de la hemoglobina S terminará la polimerizacibn.

EI polimero forma una fibra helicoidal torcida, cuya seccion cruzada contiene 14 moléculas de HbS (figura 7-1 9). Estas fibras tubulares distorsionan al eritrocito de modo que toma la forma de una hoz (figura 7-20) y son vulnerables a lisis cuando penetran a los intersticios de los sinusoides esplknicos.

1) Mioglohinuria: Despues de lesiones multiples, [a mioglobina liberada de las fibras muscuIares rotas aparece en la orina, colorehndola de rojo oscuro. Aunque después de un infarto del mimardio es Q O S ~ -

ble detectar la mioglobina en el plasma, el andlisis de las enzimas skricas (capitulo 8) proporciona un indice m& sensible del daflo miocárdico.

2) Anemias: Las anemias comunes (reducciones en la cantidad de eritrocitos o de hemoglobina en la sangre) se deben al deterioro de la slntesis de hemoglobina (por ejemplo, en deficiencia de hierro; capítulo 59) o a la produccibn alterada de eritroci- tos (es el caso de la deficiencia de ácido fólico o vitamina Biz; capitulo 52). El diagnbstico de las

0 x 1 A Desoxi A Oxi S Desoxi S

Desoxi A Desoxi S

Flgura 7-18. Representacidn de la zona adherente (A) en la hemoglobina S y su "receptor" ( A ) en las desoxihemoglobinas A y S Las superficies complementarias permiten que la desoxihernoglobina S po/irnerice en una estructura fibrosa, pero la presencia de la desoxihernoglobina A termina la polimerizacibn debido a que no posee zona adherente. (Modificada y reproducida con autorizaubn de Stryar L. Biochemrstry, 2nd ed Freernan, 1981 .)

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Proteínas: miog/ubina y hemoglobina 75

Figura 7-19. Reprecentacidn de la estructura helimidal propuesta de una fibra de desoxthamoglobina S agregada En este modelo, las esferas representan moléculas invi- duales de HbS (Reproducida con autorizacibn de Maught II: A new understanding of sickle cell emerges Scienoe 1981,211 265 Copyright Q 1981 by the Arnerican Associa- tion for tha Advancement of Science )

anemias comienza con la deteminacidn espectro- fotométrica de la concentración de hemoglobina sanguinea. Las talasemias y el uso de probadores de DNA para su diagnóstico se consideran en los capitulas 8 y 42.

3) Hemoglobinopatias: En tanto que la mutación de ciertos residuos crlticos de la hcmogIobina (como las histidinas E7 o F8) tiene consecuencias graves. es posible que la rnutacidn de muchos residuos superficiales, alejados del sitio de fijacion del hem, no se traduzca en anormalidades clinicas. Una excep- cE6n notable es la anemia de cklulas falciformes, en donde todos los signos y sintomas (por ejemplo, crisis de céluEas Fatciformes y trombosis) provienen de la mutación de un solo residuo polar por uno no polar.

4) Hemoglobina glucosilada (HbAlr): Cuando la glucosa sanguínea entra a los eritrocitos, la hemo- globina es glucosilada de manera no enzimatica y su hidroxilo anomérico deriva los grupos amino presentes en los residuos lisil y en las terminales amino. La HbAic, puede separarse de HbA por cromatografía de intercambio ionico o electrofore- sis. La fraccibn de hemoglobina glucosilada, nor- malmente alrededor de 5%, es proporcional a la concentracibn de glucosa en la sangre. Por tanto, la medicibn de HbAic proporciona Pnfomaci6n util para el manejo de la diabetes sacarina. Dado que la vida media de un eritrocito es de 60 dias, la concentración de HbA i c refleja la concentración sanguínea promedio de glucosa en el periodo de 6 a 8 semanas precedentes. Asi, una HbA ic elevada, que indica control deficiente de la glucosa san- guinea, puede guiar al mkdico en la seleccibn del tratamiento apropiado (por ejemplo, un control m i s riguroso de la alimentación o una dosificacibn mayor de insulina).

Figura 7-20. Micrografla electrdnica de barrido de un eritrocito normal (A) y uno falciforme {B). El cambio en la mol6cula de globina beta que causa esta alteracibn estructural, es consecuencia de la mutacibn de una sola base en el DNA Ttmina (T) por adenina (A), lo cual conduce a la sustitucidn de un residuo de valrna por uno de glutamina en la malécula de globina beta

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Las talasemias se originan de la síntesis reducida de cadenas alfa o beta

En las talasemias, la síntesis de las cadenas alfa (alfa- talasemias} o beta (beta-tarasemias) de la hemoglo- bina estA disminuida. La consecuencia es una anemia que puede ser muy grave (capítulo 42).

RESUMEN

Las proteínas globulares compactas, mioglobina (Mb) y hemoglobina (Hb), funcionan en el almacenaje y transporte de oxigeno. respectivamente. La ~b &S

monomerica; Hb es un tetrhmero de dos tipos de subunidades (alfazbetaz en la hemoglobina del adulto, H1iA). La Mb y la subunidad beca de Hb, rica en hélices aIfa, comparten una estructura secundaria y terciaria vimialmente idtnticas (no así la Los residuos de arninoAcidos de sus seis (A a H) regiones helicoidales se denominan (por ejemplo) "His P8" -la histidina que es el octavo residuo en la hClice F o sexta.

El grupo prostktico hem de Mb y I-Ib es un tetrapirrol ciclico, planar en esencia, un poco plegado, con un Fe" central. Cuando el grupo hem se agrega a una apomioglobina desnaturalizada (Mb sin hem), ésta se pliega de nuevo en su confomación nativa. Por tanto, la información estructural primaria impEicita en apoMb (y por extensidn, en otras proteínas) basta para definir la estructura secundaria y terciaria.

El Fe2' del hem se une a los cuatro átomos de nitrogeno del hem y a los dos ligandos adicionales localizados arriba y abajo del plano del hem. Un ligando es la histidina FX. En la oxiMb y oxiHb, el sexto ligando es 02. En una intoxicacibn con monhxido de carbono, el sexto ligando es CO el cual, a pesar del obsthculo espacial por la presencia de His F7, se une con más fuerza al hierro que el 02.

Las curvas de saturación muestran la captacibn y liberacirln del oxigeno. La curva de Mb es hiperbblica,

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en tanto que con Wb es sigmoidea. Esta ultima forma es critica para una mol6cula transportadora de Oz que debe saturarse con oxígeno en los pulmones y liberar- lo al m k i m o en los tejidos. Las afinidades relativas de las diferentes hemoglobinas se expresan como Pso, que es la presi6n parcial de O? a la cual se saturan la mitad de hemoglobinas con oxígeno. Las hernoglobi- nas se saturan a las presiones parciales de sus respec- tivos órganos respiratorios (por ejemplo, HbF se satura con la PO1 de la placenta). Los residuos His proximal (F8) y dista1 (E7) descansan en sitios opuestos del anillo hémico. Durante la oxigenacion, Fe2', His F8 y Pos residuos adyacentes se mueven hacia el anillo htmico. Por tanto, [a oxigenacidn de Hb se acompafía de cambies notorios en la conformación.

La adición de Oz a desoxiHb destruye los en taces salinos entre subunidades y dentro de ellas, volviendo laxa la estructura cuaternaria y facilitando la fijación de moliculas adicionales de oxigeno. En la cavidad central de la desoxiHb, el compuesto 2,3-bisfosfo- glicerato (RPG) forma enlaces salinos con las subuni- dades beta, que estabilizan aún m8s la desoxiHb. Durante la oxigenacirln, la cavidad central se conhe , el BPG es expulsado y la estructura cuaternaria de nuevo queda laxa.

La Hb tiene también la funcibn de transportar COI y protones desde los tejidos al pulmbn. La libe- ración de oxigeno de ra oxiHb (HbO2) a los tejidos se acornpaiía de captacibn de protones debido a la dis- minucirln del valor de pK. de un residuo His.

Entre los cientos de mutantes de Hb (en gran parte benignos) se destaca la hemoglobina de las células falciformes (HbS), en la cual Val reemplaza a Glu beta6 de HbA. Esto crea una "zona adherente" que tiene un complemento sobre la desoxiHb (pero no en oxi Hb). En concentraciones bajas de oxigeno, desoxiHbS polimeriza, forma fibras y distorsiona los eritrocitos dándoles formas de hoz. Las talasemias al fa y beta son anemias causadas por disminución en la produccibn de subunidades alfa y beta de HbA, res- pectivamente. . Everse J, Vandergriff Kü, Winslow RM: Hernoglobiiis:

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