UniversidadComplutensedeMadrid

FacultaddeCienciasQuímicas

DepartamentodeIngenieríaQuímica

*530986438XUNIVERSIDAD COMPLUTENSE

¼5 1

DesarrollodeModelosCinéticospara

Bioprocesos:Aplicacióna la Producción

deXantano

MEMORIAqueparaoptaral

GRADO deDOCTORpresenta:

AlmudenaLeónMartín

Madrid, 19994

A la memoriademi padre,siempreconmigoA mi madre

La Tesis doctoral que presentaDfla. Alniudena Alcón Martín,titulada: “Desarrollo de Modelos Cinéticos para Bioprocesos:Aplicación a la Producción de Xantano”,es un completoestudio delos diferentes modelos cinéticos que pueden ser aplicados a unprocesode interésindustrial, como es la producciónde xantanoy, ennuestraopinión, reune los requisitos necesariosde originalidad yseriedadcientífica para ser defmidacomo TesisDoctoral. El trabajoha sido realizado en los laboratorios de Ingeniería Química de laFsacultad de C.C. Químicas, bajo nuestra dirección y ha sidosubvencionadopordiversasinstitucionespúblicas.

ProfesorDr. Félix García-OchoaSoria

Dra. Victoria E. SantosMazorra

El presentetrabajo de Investigaciónha sido realizado en elDepartamentode IngenieríaQuímicade la Facultadde CienciasQuímicasde la UniversidadComplutensede Madrid, bajo laDirección del Profesor Dr. D. FELIX GARCIA-OCHOASORIA y de laDra. Dita. VICTORIA E. SANTOS MAZORRA,a los que quieroexpresarmi agradecimientopor su enseñanza,confianzay apoyodurantetodo el tiempo que me ha llevado larealizacióndel trabajoplasmadoen estaMemoria.

AGRADECIMIENTOS

Deseoagradecerla ayuda directa o indirecta en el desarrollo de esta TesisDoctoral a una serie de personas cuya inestimableayuda me ha hechomásfácil ygrat~ficantemi trabajo duranteestosaños:

En primer lugar, mi agradecimientoespecial al Prof Felix García-Ochoa,tanto por la aportación cientWcacomopor su estímulo,y enormepaciencia. Deseoagradecerleel gran esfuerzorealizado, especialmenteen la última etapa de estetrabajoy por todo lo quehe aprendidode él en estosúltimos meses.

A Vickv,por su enseñanzay amistad,por los buenosy malosmomentos.

Al Centro de Citometría de Flujo de la Facultadde Farmacia, especialmenteaAlberto Alvarez, quien siempreestuvo dispuestoa echarmeuna mano y a darmeconsejoen lo que necesité.

Al Centro de MicroscopiaElectrónicaLuis Bru, de la UniversidadComplutensede Madrid, especialmentea Agustín,por su ayuda buenosconsejospara observaryfotografiar a “mis bichitos

Al Departamentode Bioquímicay BiologíaMolecular, especialmentea la Dra.Pilar Castillón y a la Dra. CarmenAcebalpor poner a mi alcancela utilización delespectrofluorímetro,necesariopara la realización de estetrabajo.

Al ProfesorD. Pedro Luísy Luis, por su categoríacient{flea y humana,por susbuenosconsejosy ánimosdesdeel princz~iode estaTesisDoctoral.

A la Dra. Aurora Santosy al Dr. Jose Antonio Casaspor estar siempredispuestosa echarmeunamanoyfacilitar mi trabajo.

A José Timón, siempredispuestoa arreglar lo que dábamospor perdido ysuponíaperdero retrasarel trabajo.

A Inma,porsu amabilidady ayudaprestadaen todo momento

Quiero agradecer el apoyo, y siempreprácticos consejos, de mi compañeroMiguelLadero, con quien he compartidodurante los añosde realización de esta Tesistrabajoy amistad

A mi compañeroEmilio Gómez,por su inestimableayudaprofesionaly apoyopersonal durantela realizaciónde estetrabajo.

A JoseCarlosy a David, con quieneshe compartido estosdos últimos añosdetesis,graciaspor su sinceraamistady la ayuda que me han brindado. Graciaspor elbuenhumory las risas de cadadía.

Al resto de compañerosde laboratorio Virginia, David, Alexy Pedropor suinterésy aportacióndirecta o indirecta en estetrabajo.

A misamigas “del otro lado delAtlántico “, Liliana, Verónicay Miriam, con lasque compartítrabajo, consejos,y sin duda, amistad.

Quiero agradecer también a mis alumnos de la Academia,especialmenteaKhjad¿¡a, Besmay Monia, quienesmehan dadograndesánimosparaterminar.

Por supuestono puedoolvidarme de mis amigoscon quieneshe compartidomomentosfelicesy otros no tan felices. Gracias a todos por los ánimos, por lasllamadas,por las visitasy por elgran apoyoque mehabéisdado, especialmenteen losúltimosmeses.Mi máscariñosoagradecimientoa Sangeey a NPJosé,y por supuestoaEva,Samaria,Bea,Raví,Gisella,JuanMa, Pepe,Alberto, Raquel,...

A migranamigoFernandode la Paz,porsusinceraamistady su apoyo.

A Rodrigo,por su amistad, fuerzay cariño para la redacciónde la mayorpartede estaMemoria.

Quiero reservar las últimas líneaspara agradecer a mi familia su cariño ygrandesdosisde paciencia.A mis hermanospor su ayuday buen humor, por estarsiempreahí cuandoha sido necesario.Tambiéna Maria, Gema,Aurora yAlbertoporsusánimosconstantesy gran apoyo.

A mi madrepor susmimos, pacienciay gran impulso,para continuargraciaspor todo.

Y, por supuesto,a mi padre, quefue el que más meanimó para empezarconestaTesis, casi con más ilusión queyo. Gracias por tu sacr¼cio,por tu enseñanzaypor tu cariño.

INDICEPágina

1.- INTRODUCCIÓN 1

1.1.-OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO 10

1.2.-MODELOS CINETICOS 12

1.2.1.-ModelosCinéticos No Estructurados, No Segregados 12

1.2.1.1.-ModelosNo Estructurados del Crecimiento 13

1.2.1.2.-Modelosde Consumo de Sustratosy Formación de 18

Productos.

t.2.1.3.-Influencia de las Variables en los Parámetros /9

1.2.2.- Modelos Metabólicos 24

1.2.3.-Modelos Estructurados o de Célula 30

1.2.3.1.-ModelosCompartimentados 30

1.2.3.2.-Modelosde Célula 35

1.2.4.-Modelos QuímicamenteEstructurados 38

1.2.5.-Modelos Segregados 39

1.2.6.-In2eniería Metabólica 43

1.3.- GOMA DE XANTANO 47

1.3.1.-Xanthomonas campestris 56

1.3.2.-ProduccióndeXantano 59

1.3.3.-Transporte de Oxígeno 67

1.3.4.-Aislamiento y Purificación 74

1.3.5.-Propiedadesdel Xantano 78

2.-PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 85

2.1.-EQUIPOS 85

2.2.-MATERIALES EMPLEADOS 101

2.2.1.-Microorganismo 101

2.2.2.-ReactivosUtilizados 103

2.2.3.-Composiciónde los Medios Empleados /06

2.2.4.-Composiciónde las DisolucionesTampón y Preparacionespara

análisis /07

i

Página

2.3.-REALIZACIÓN DE UN EXPERIMENTO /08

2.4.-MEDIDA DE COMPONENTES EXTRACELULARES 110

2.4.1.-Análisisde Biomasa líO

2.4.2.-Medida de la Concentraciónde Sustrato Carbonado /1/

2.4.3.-Medida de la Concentarciónde Sustrato Nitrogenado /13

2.4.4.-Análisis de Xantano 114

2.5~ ANÁLISIS DE COMPONENTES INTRACELULARES lId

2.5.1.-Análisis de ComponentesIntracelulares por

Espectrofotometría de Absorción /18

2.5.1.1.-Análisis de Proteínas /18

2.5.1.2.-Análisis de ÁcidosNucleicos /21

2.5.2.-Técnicasdc Fluorescencia /25

2.6.-MÉTODOS MATEMÁTICOS 135

2.6.1.-Técnicasde Estimación de Parámetros 135

2.6.2.-Simulación con los Modelos Cinéticos 137

3.- RESULTADOS EXPERIMENTALES 141

4.- MODELO CINETICO NO ESTRUCTURADO 153

4.1.- FORMULACIÓN DEL MODELO 159

4.2.-AJUSTE DE LOS DATOS EXPERIMENTALES 161

4.3.- DISCUSIÓN 181

4.3.1.-Estudio de la Variación del Valor de los Parámetroscon las

Variables 181

4.3.1.1.-Influencia de la Temperatura 181

4.3.1.2.-Influencia dc la Cocentraciónde Amonio Inicial 189

4.3.2.-Simulación con el Modelo Cinético No Estructurado 191

4.3.2.1.-Influenciade la Biomasa Inicial 193

4.3.2.2.-Influencia de la Concentraciónde Azúcar Inicial /97

4.3.2.3.-Influencia de la Agitación 199

4.3.3.-Validez del Modelo Cinético No Estructurado 201

Páizina

5.- MODELO CINÉTICO METABÓLICO 203

5.1.-FORMULACIÓN DEL MODELO 2/2

5.2.-AJUSTE DE LOS DATOS EXPERIMENTALES 2/6

5.3.-DISCUSIÓN 231

5.3.1.- Variación del Valor de los Parámetros con las Variables 231

5.3.1.1.-Influencia de la Temperatura 231

5.3.1.2.-Influencia del Amonio Inicial 237

5.3.2.-Simulacióncon elModelo Cinético Metabólico 239

5.3.2.1.-Influenciade la BiomasaInicial 241

5.3.2.2.-Influencia de la Concentración de Azúcar Inic¡al 244

5.3.2.3.-Influencia de la Agitación y el Caudal del Aire 246

5.3.3.-Validez del Modelo Cinético Metabólico 249

6.-MODELO CINÉTICO DE CÉLULA 251

6.1.-ETAPAS EN EL PLANTEAMIENTO DEL MODELO 254

6.2.-MODELO CINETICO DEL CRECIMIENTO DE Xanthomonas

campestris 261

6.2.1.-Determinación de las EspeciesQuímicasy Formulación del

Esquemade Reacción 261

6.2.2.-Propuestade las EcuacionesCinéticas 281

6.2.3.-Obtención de Parámetrospor Ajuste en Múltiple Respuesta 306

6.2.4.-Discriminación de Modelos Cinéticos 350

6.2.4.1.-Criterios Estadísticos 350

6.2.4.2.-Discriminación por Criterios Físicos: Variación de los

Parámetroscon las Variables 353

6.2.5.-Mejora de las Deficienciasdel Modelo Cinético de Célula 366

7.-MODELO CINÉTICO QUÍMICAMENTE ESTRUCTURADO 377

7.1.-PLANTEAMIENTO DEL MODELO 381

7.2.-APLICACIÓN DEL MODELO CON DATOS

EXPERIMENTALES 383

7.2.1.- Mejora del Modelo QuímicamenteEstructurado 393

iii

Pá2ina

7.3.-SIMULACIÓN CON EL MODELO CINÉTICO QUÍMICAMENTE

ESTRUCTURADO

8.- RESUMEN Y CONCLUSIONES

8.1.- RESUMEN

8.2.-CONCLUSIONES

9.- NOMENCLATURA

10.- BIBLIOGRAFÍA

404

41/

4/1

419

431

437

iv

1.- INTRODUCCIÓN

Introducción

1.- INTRODUCCIÓN

Los procesosllevadosa cabo con microorganismoshan llegado a ser una fuente

importante de numerosos productos comerciales, principalmente en la industria

farmacéuticay alimentaria,pero tambiénen otras industrias,tales como la cosmética,el

análisisclínicoy químico,en la biorremediacióncon fines ambientales,etc.

Desdeque hacevariasdécadasseempezarona producir antibióticos,el cambio de

escalade los procesosdesarrolladosen laboratorioha sido consideradoun problemade gran

complejidad,dondela metodologíaempleadaen los procesosquímicospuedeseraplicada.

Los modelos fenomenológicos,basadosen fenómenos de transponeacopladosa las

reaccionesquímicas,puedenserdesarrolladosy aplicadosparael diseñodel biorreactor.La

dificultad que seplanteaen el estudiode estetipo de sistemassedebea sunaturaleza:son

sistemastrifásicosgas-líquido-sólido.La peculiaridadde estossistemasradicaen que en la

fasesólidaserealizanlas transformacionesque llevan tanto al desarrollodel propio sólido o

cultivo microbiano (crecimiento)como a la síntesisde los productosde interés. Dichas

transformacionesnecesitanla presenciade gran cantidadde nutrientesque se encuentran

principalmenteen la fase líquida, siendo de especialimportancia la llegadadel oxígeno,

desdeel aire, en sistemasaerobios.

1

Jntroduccwn

En el cambio de escalade este tipo de procesos,la importancia relativa de los

diferentes fenómenos involucrados va cambiando. Así, se deben considerar varios

fenómenosque hay que estudiarde formaaisladapara,una vezque el conocimientode los

mismoses suficiente,seracopladoscon vistas a la descripcióndel procesoglobal. Durante

el procesode cambiode escalalo que va variandoesla velocidadrelativade los diferentes

fenómenosy, quizás,la etapacontrolantede la velocidadglobal del proceso.Debido a la

complejidadde estossistemasmicrobianos,el cambiode escala no se realizaen un solo

pasodesdela escalade laboratorioa la escalade producción.En el laboratoriogeneralmente

se opera con Erlenmeyers,donde se buscannuevosproductos, mecanismosde control,

mediosde produccióny se mejoranlas cepas.Despuésse pasaa un biorreactor, de 1 a 2

litros de volumen, donde el contacto gas-líquido es muy distinto de la etapa anterior,

despuésa un tamañomayor, entre 10 y 20 litros. A estaescala,que de forma generalse

llama PlantaPiloto, seestudian o secompruebanlos efectosde diferentesvariables,tales

como la velocidadde agitación,el caudal de aire, la temperatura,el control del pH, etc.,

buscándosela simplificaciónde los problemas.En la primeraetapa,a escalade laboratorio,

tambiénseabordael estudiode los diferentesfenómenosy variablesde forma aislada,para

facilitar tanto el estudio como la comprensión.Cuando todos estos fenómenossean

suficientementeconocidosdeben ser acoplados,y el conjunto debedescribir el proceso

global. Así, se puedeprocederal diseñodel biorreactordondellevar a cabola producción,

para Jo que se deben conjugartodos los factoresde modo que la productividadsea la

máximaalcanzable.Por tanto, esnecesariorealizarun cambiode escalateniendoen cuenta

que el comportamientodel microorganismo,en cadanivel de producción,puedeno serel

mismo; las diferencias pueden ser debidas a que las cantidadesde energía y materia

involucradasson distintasparaproducir la transformación.La complejidadde los sistemas

que usanmicroorganismoslleva, en la práctica,a utilizar varias etapasde comprobaciónen

el cambiode escala,y no solo una -de plantapiloto- como ya es habitual en la Industria

Química.

Entre los fenómenosbásicos a teneren cuenta en el caso de transformaciones

microbianasson destacablesla transferenciade materia entre las fasesdel sistema, la

descripciónde la compleja red de reaccionesque tiene lugar en el interior de las células y

el posibledañoo “stress” que sufren las células debido a las condicioneshidrodinámicas

necesariasen el sistemaparaque el primerode los fenómenoscomentadosno seala etapa

limitante del proceso.

2

Introducción

• Transferencia de materia entre fases

El mecanismoglobal de transportede nutrientesa las células,su utilización y la

produccióny eliminaciónde metabolitos, se puedendividir en una serie de etapas

(Figura 1.1), cadauna de las cualesofreceuna resistencia.Estasetapassepueden

resumir de la formasiguiente(Quintero, 1981; Moo-Youngy Blanch,1987):

- Transportede nutrienteso productosdesdeel senodel gas hastala interfasegas-

líquido.

- Intercambioen la interfasegas-líquido.

- Transportedesdela interfaseal senode la fase líquida.

- Transponea travésde la faselíquida.

- Transportea travésde la películade líquido querodeala célula.

- Transporteatravésde la membranao paredcelular.

- Transporteen el interior de la célula,hastael lugardonde se producela reacción

bioquímica.

Estesistemapuedegeneralizarsea otros donde la fase continuano sea un líquido

sino un gas,e incluso,en casosespeciales,puedeserun sólido (fermentacionesen

estadosólido, de compostaje,por ejemplo) y la fase dispersauna o más de las

siguientes:

- Sólidos,talescomo células,partículascon enzimassoportadasy sustratossólidos.

- Líquidos,talescomosustanciasinsolubles.

- Gases,como aire,dióxido de carbonoy metano.

En la mayoríade los biorreactores,la resistenciaen la faselíquida suponeel control

global de la transferenciade materia, siendo una de las siguientes la etapa

controlantedelproceso(Moo-Youngy Blanch, 1987):

- La combinaciónde la resistenciaen la películadel líquido y la interfasegas-

liquido. Estas resistencias son frecuentementela etapa controlante en la

transferenciade oxigeno,debidoa labajasolubilidadde estecompuestoen agua.

3

Introducción

- Resistenciaen la faselíquida en la separacióndel medio acuosocontinuoy la fase

dispersa.Suimportanciapuedeserminimizadamedianteunabuenamezcla.

- Resistenciade la faselíquida en laproximidadde la interfasesólido-liquido. Esta

resistenciapuedesersignificativa debido a la pocadiferenciade densidadentreel

medio acuosocontinuo y la fase dispersa(microorganismos,células vegetalesy

animales).

- Resistenciade la faseliquida en la carade la fasesólidadispersa.Estaresistencia

puedesersignificativaen procesoscon célulasfloculadasy enzimasinmovilizadas.

Comoya se ha comentado,los sistemasmicrobianossonheterogéneos,normalmente

gas-líquido-sólido.Es por tanto imprescindibleprestaratenciónal transportede los

nutrientesen el sistema,ya que su disponibilidadpor partedel microorganismoes

totalmente necesariapara el conecto desarrollodel proceso de producción. De

especialimportanciaesel transportegas-líquidoen los sistemasaerobios,ya que el

oxígenoesnecesarioparaun grannúmerode reacciones.

La máxima productividady concentracióndel productoalcanzableen un proceso

microbiológicoaerobio,en la obtenciónde biomasao producto,puedeestarlimitada

por la velocidadde transportede oxigeno, la cual a suvez estádeterminadapor el

valor del coeficientevolumétricode transferenciade materia,kLav. El valor de este

coeficiente dependede muchasvariables,como el tipo de biorreactorempleado,el

sistema de aireación y mezcla y de las propiedadesfisicas del fluido (Yagi y

Yoshida, 1975; Gómez, 1995). Dentro de las propiedadesfisicas, la viscosidades

una de las propiedadesmás significativas en los procesosde producción de

polisacáridosmicrobianos,ya que la reología del cultivo esuno de los factoresque

determinala capacidadcte transportede materiay calor en los biorreactores(Pacey

Righelato, 1980: Gómez, 1995).Un descensode la concentración de oxigeno por

debajodel valor critico puedeprovocarun descensoacusadoen la produccióndel

metabolito (Yang y Wang, 1992; Santos 1993), la producciónde otro metabolito

distinto al deseado(Moesy col,, 1985;Galindoy Herrera,1989; Zhou y col., 1992)

e inclusodañosirreversiblesen las células(Meijer, 1989;Meijer y col., 1994).

4

Introducción

El mantenimientode las condicioneshidrodinámicasnecesariaspara el correcto

aporte de nutrientes a los microorganismospuede resultar perjudicial para el

proceso,sometiendoa los microorganismosal denominadostresshidrodinámicoo

daño celular. Este efecto lo puedensufrir las células cuandose sometena unas

condicionesque favorecenel transportede oxigeno —o de nutrientesen general-,

pero que sus estructuras,tanto internascomo externas,no son capacesde soportar,

afectandoa sumetabolismo,y por tanto a sucomportamientogeneral.Sin embargo,

estefenómenono ha sido todavíasistemáticamenteestudiadoni descritoparapoder

ser incorporadoen la descripciónglobal de un sistemamicrobiano(Meijer. 1989;

Merchuk, 1991).

Resistenciasenel TransponedeMateria

Figura 1.1.-Esquemade las resistenciasen el transportede oxígenodesdeel gashastaelmicroorganismo,o la fasesólidacon enzimao célulasinmovilizadas.

Po2‘¡tG

lA8

Gr

oGfl

InterfaseGas-Líquido

Membrana

Co2

0

4

ni

ni o:o’— ¡

o’:4

4

4:

u— ¡4’

o:

4

4:

o‘o

Gr

5

Introducción

• Transformación dentro del Microorganismo

Se trata siempre de una transformación compleja, es una red de reacciones

enzimáticas de varios tipos, de óxido-reducción, oxidativas, de síntesis, de

producción de energía, etc. El microorganismodurante su crecimiento produce

numerosasmacromoléculascomplejasa partir de 100 unidadesde monómeros.En

las rutas bioquímicas, para llevar a cabo estas transformaciones, intervienen

alrededorde 1000enzimasdiferentes.El metabolismobioquímicoes dividido en dos

rutas generales:rutas anabólicas,para la síntesis de moléculascomplejas y los

precursoresde los intermedios,y rutascatabólicas,que aportanla energianecesaria

paralos procesosanabólicos.Estasdosactividadesdivergentesestánestrechamente

ligadas,tal como se muestraen la Figura 1.2, la cual esun esquemadel entramado

de red de reaccionesque ocurrenduranteuna transformaciónmicrobiana.En esta

figura se muestran solo las principales rutas de biosíntesisy sus principales

conexionescon las rutascatabólicas,de unaforma muy simplificada.

Esta enormecomplejidadse podría solventarsi se consideraseal microorganismo

como un catalizador,que por un complejo mecanismoproduce un servicio o un

producto. Peroesteplanteamientono resultaválido, puesestasreaccionestienenun

cierto carácterautocatalítico,debido al crecimientodel microorganismo,y paraello

seutiliza reactantes(nutrientes),con lo que el procesose complicanotablemente,no

siendoevidenteslas relacionesestequiométricas,o en otraspalabras,el “catalizador”

intervieneen laestequiometríade la(s) reacción(es).

Esto implica medir un mayornúmerode componentesparadescribir el sistema,lo

que a su vez lleva implícito un número elevadode parámetrosen las ecuaciones

cinéticas,que hay que determinar,y que no esfácil llegar a valorespor ajustede

datosexperimentales.Portanto, el abordajedelproblemaesenormementecomplejo,

comoya seha indicado,ya queocurrencientosde transformacionesen el interior de

cada microorganismo.El metabolismo incluye sustratos -frente de carbono y

nitrógeno-y otros nutrientes(fósforo, azufre,metales,etc) y, dependiendodel caso,

la producción de energía, síntesis de proteínas,ácidos nucleicos, enzimas que

conllevanel crecimientodcl microorganismo,etc,

6

Introducción

ANABOLISMO CA TABOLISMO ANABOLISMO

MXNADA

DNAA TPRNA

ANudeátidosDesoxinucleñtidos

Acido Fólico

p-aminobenwatop-hidroxibenzoato

hexosa

41Pentosa

Nucleátidos Glicósidos

Triosa Glicerol

Tetrosa P-Gticerato

Fosfoenolpiruvate

¿Piruvato

Quit,J respiratoria

Aspartato

}sI!Porjirinas

Acetil-CeA

4

Serbia fr01¿cina

$Cisteina

Glutamina

Ácidos grasos, Lípidos,Poliquétidos

Meya/en ato, Esteroides,Carotenoides, Terpenos

Oxalacetato —.—~. Citrato

ArgininaPretina

Succinato < 2-Oxoglutarato

Figura 1.2.-Esquemageneralde las rutasanabólicasy del catabolismocentral

Histidina

TirosinaTripto’fano

TriglicéridosU,iidos membrana

PurinasPirbnidinas

+Porfirinas,etc.

Purinas

Treonina¡so/encina1’!etioninaLisina

¡ Giutamato

—1——fr GlutaminaTransferenciaNH

4t

-7

Introducción

Esta red de reaccioneses complicadade describir, por un lado se cuenta con el

apoyo de los métodosmatemáticospara la resolucióndel problemade cálculo de

parámetros~no obstante,con el actualdesarrolloy facilidaddel cálculonumérico, la

principal dificultad sigue siendo la medida de un elevado número de especies

químicas, cuyo análisis permitiráconocerla evolución de las concentracionesque

podránser descritasa través de un modelo cinético de mayor o menor grado de

dificultad.

Níelsen y Villadsen (1994) dan como definición de modelo cinético para la

descripción de un proceso microbiano la siguiente: ‘.. la correlación verbal o

matemáticaentre velocidadesy concentraciónde reactantes/productos,los cuales

son insertados en balances de materia y permiten la predicción del grado de

conversión de sustratos y el rendimiento de productos individuales en otras

condicionesde operacion

La complejidadde los modeloscinéticosparadescribirel cambioproducidodentro

de la célula duranteuna transformaciónmicrobianapuedeser muy amplia. Se han

propuestonumerososmodeloscinéticos, los cualesse puedenclasificar segúnse

recogeen la Tabla 1.1 (García-Ochoay col., 1999a).

Los modeloscinéticosmássimplesson los modeloscinéticosno estructurados-no

segregadosque consideran al microorganismo como un único componenteque, de

formagenérica,denominanbiomasa(expresadacomo masade microorganismoseco

porvolumen de sistema,pero esto solo por la forma habitualde realizarla medida).

Los modelosdenominadosmetabólicosconsideranrutas metabólicassimplificadas

dentro del microorganismoen las que únicamenteestá involucrado el sustrato

carbonado.En un modelo estructuradoo de célula se considerael metabolismodel

sustratonitrogenado,describiendoel crecimientomedianteesquemassimplificados

de reacción.Cuandose unen los esquemassimplificadosde reacciónprocedentesde

modelosmetabólicosy de modelosde célula seobtienenlos modelosquímicamente

estructurados,en los que sedescribeel metabolismomicrobiano global de forma

simplificada,considerandoal microorganismoformadopormultitud de componentes

internosque reaccionanentresí. Un modelo segregadoesaquelque consideraque

8

Introducción

una población está formada por microorganismosdiferentes. En el caso de los

microorganismospresentesen un cultivo puro, en el que se presentandistribuciones

de algunapropiedadcomo edad,tamaño,etc. Se puedendenominartambiéncomo

modelos morfológicamente estructurados. En el caso de los cultivos mixtos, la

segregaciónpuedereferirseúnicamentea la consideraciónde diferentes“biomasas”

empleandoparala descripciónde cadauna de ellas modelosno estructurados-no

segregados(García-Ochoay col., 1999b).

Los modelosmás sencillos o no estructuradosno-segregadosson empleadospara

numerosasaplicacionesen la solución de problemasde ingeniería,pero para una

mejor descripcióndel sistemaes necesarioutilizar modelosque tenganen cuenta

esquemasde reaccióncomplejos, es decir que tenganen cuenta las rutas del

metabolismode cadamicroorganismo.

Tabla 1.1.- Clasificaciónde ModelosCinéticos.

Modelo Cinético Concepto

NO ESTRUCTURADO--NO SEGREGADO

La biomasaseconsideracomoun único componenteSeconsiderauna célula media comorepresentativadelcultivo.

METABÓLICONormalmenteno estructurado-nosegregado.Se describenlas rutas metabólicascomo una red dereacciones empleando un esquema simplWcado dereacción,con relacionesestenimétricasde midas.

ESTRUCTURADO(o de CÉLULA)

La descripciónde la biomasase realiza considerándolaformada por varias especies.Se tienen en cuenta loscomponentesintracelulares.

QUÍMICAMENTEESTRUCTURADO

Se consideraa la biomasaformadapor varias especiesytambién un metabolismo simplWcado (una red dereacciones).

SEGREGADOEn la descripcióndel microorganismose considera ladistribución de alguna propiedadNo se considera unmicroor anismomedio.

9

Introducción

1.1.-OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO

El presentetrabajo de investigación trata de conseguirla aplicación de diferentes

modelos cinéticos de diferente grado de complejidad a un proceso microbiano,

comprobandola mejora en la descripcióndel sistema. Es decir, pretenderealizar una

aplicación de la metodología de la Ingenieria Química en un sistema de producción

llevado a cabopor un microorganismo,el cualsintetiza un productode interésindustrial.

El sistemaa modelizares la producciónde xantano,un sistemabien conocido.

Esteprocesoya ha sido estudiadoy desarrolladoen un trabajoprevio (Santos, 1 993) y se

tiene el conocimientosuficientede las variablesque influyen en el procesode producción,

concretamentela temperatura,la composicióndel medio y la velocidadde transportede

oxigenojueganun papelrelevanteen el procesode producción.

Los modeloscinéticosque se plantearántratan de conseguirla descripciónde la

influencia de ciertas variables en dicho proceso de producción, considerando

posteriormentetodos los diferentesfenómenos involucrados, de forma que el conjunto

sirva como modelopredictivo de la evolucióndel sistemay surespuestaa perturbacionesen

el medio,variablesde operación,etc.

Los modelosque se van a proponera lo largo de estaTesisDoctoralsonde diferente

gradode complejidad.El primerpasoescomenzarpor un modelo sencillo,de los conocidos

como no estructurados, puesdesde un punto de vista técnico tiene sentido iniciar un

estudiode estetipo con los modeloscinéticosmás sencillos.Además,el abordaje,tanto

experimentalcomo matemático,es relativamenteasequible, lo que hace que el primer

planteamientoal comenzara modelizar un sistema sea con modelos de este tipo. Se

determinarási estemodelo es suficientepara la descripcióndel sistema,para lo cual se

estudiarála influencia de dos variables sobrela evoluciónde los parámetrosdel modelo

(temperaturay concentraciónde nitrógenoinicial). En casode queno existaunarelaciónde

parámetroscon las variablesa estudiar, semodificaráel modeloplanteado de modo que

sea capazde teneren cuenta la evoluciónde los parámetroscon la variable,y así poder

obteneruna relación en función de la variableestudiada.En casode no sersuficienteeste

modelo se irá complicandohasta [legar a modelos estructurados,que, si bien más

complejos,se acercanmás a la realidad,es decirtienenmássentidofisiológico.

10

Introducción

La progresivacomplicaciónen el planteamientode modelosparala descripcióndel

sistemamicrobianodebellevar consigounamejoraen la consideraciónde algún aspectoen

la propia descripcióndel sistema, es decir, debe de ser capaz de subsanardeficiencias

encontradas en los modelos más simples desarrolladosy aplicados a los datos

experimentalesenlas primerasetapasdcl presentetrabajo.

En definitiva, el objetivo final de estaTesisDoctorales llegar a aplicar un modelo

cinético de los denominadosquímicamenteestructurados,puesprobablementesean los

únicoscapacesde teneren cuentalos cambiosen la composicióndel medio, especialmente

en lo referenteal sustratonitrogenado,tan ligado al crecimientodel microorganismo.Para

llevar a cabo la aplicación de estetipo de modelosseráprecisoun conocimientoprofundo,

tanto bioquímico y microbiológico,de la bacteria Xanthomonascampestris.Además,se

hace necesariorealizarun estudioexhaustivoy puestaa puntode métodosrápidosy fiables

para el análisisde compuestosintracelulares de forma cuantitativa.Para ello, se van a

comparardiferentestipos de técnicasde análisisde estoscomponentes,desdelas técnicas

bioquímicasconvencionales,pasandopor técnicasespectrofluorimétricas.hastallegara una

técnicacadavezmásutilizadaen microbiologíacomoesla citometriade flujo.

Finalmenteseránecesariodesarrollaruna metodologíapara hacerfrentea la dificil

tarea de proponery aplicarmodeloscinéticosestructurados.Hay que teneren cuentaque

apenashayantecedentesen la literaturaen cuantoa la propuestade estetipo de modelos,y

no seencuentraajustede datos experimentales,y el consiguientecálculo del valor de los

parámetros,ni, desdeluego, la relación de los valores de los parámetrosen diferentes

experimentosrealizadosen condicionesdiversas.

11

introduccion

1.2.-MODELOS CINÉTICOS

A continuación se realiza una breve revisión sobre los diferentestipos de modelos

cinéticosplanteadosen la literaturade acuerdoa la clasificacióncomentadaen la Tabla1.1.

1.2.1.-ModelosCinéticosNo Estructurados- No Segregados

Los modelos más sencillos del crecimiento -modelos no estructurados-están

expresadosen términosde unidadesabstractasde vida, generalmentese empleael término

poblaciónmicrobianao “biomasa”, ignorandocompletamentela estructurainterna de las

célulasque componendicha biomasa,ya que considerana la población como una unidad

homogéneamentedistribuida. Aunque los modelos no estructuradosson una gran

simplificación del problema real, suelen ser útiles para ser empleados con fines

tecnológicos,ya queproporcionanecuacionessencillascon sentidofisico, en las que setrata

al microorganismocomo una especiereactantesencilla.El esquemamáscomplicadoal que

podría responderestetipo de modeloses el que se representaen la Figura 1.3, donde

apareceel consumode sustratospor las células,tanto paracrecer como paraproducir, así

como los conceptosde respiración endógenay energía de mantenimiento, que serán

comentadosmásadelante.

Los modelos no estructuradosrecogidos en la literatura incorporan parte del

esquemarepresentadoen la Figura 1.3. Parapoderrealizaruna revisión de este tipo de

modelossehan dividido en dosgrupos:modelosde crecimientoy modelosde consumode

sustratosy formaciónde productos.

12

Introducción

Energia deMantenimiento

Lisis celular

CELULAS NOVIABLES

PRODUCTOS

Figura 1.3.- Esquemade reacciónsimplificadode los ModelosNoEstructurados

1.2.1.1.-Modelos No Estructurados de Crecimiento

Dentro de este tipo se encuentran modelos que relacionan el crecimiento del

microorganismo únicamente con la propia concentración de biomasa y otros que hacen

dependerel crecimiento de la concentraciónde un sustrato, que suelendenominar “sustrato

limitante”.

En el primer grupo de estaclasificaciónseencuentrala Ley de Malthus, que está

planteada para describir el crecimiento “balanceado”,es decir, las actividadesde síntesis

celular estáncoordinadasde manera que la composicióncelular media no seve afectadapor

la proliferación de la población. Por ello, escapaz de representar la fase exponencial de

crecimiento en fermentacionesen discontinuo o “batch” y las fermentacionesen continuo,

ya que al mantenerseel valor de las variablesen estadoestacionario,se obtiene un valor

constantede la velocidad de crecimiento (ji), lo que se aproxima mucho a lo que se

consideraun crecimientobalanceado.

RespiraciónEndógena

/3

Introduccwn

La Ley de Maithus seempleade forma ampliaen estudiosmicrobiológicossobreel

crecimiento,debido a la gran simplicidad del modelo, puessolo es necesarioconocerla

evoluciónexperimentaJde la biomasacon el tiempo. La citadaexpresiónde Malthus viene

dadapor la siguienteecuación:

dC~ [1.1]

dt

Este modelo es incapaz de predecir la concentraciónde biomasa en la fase

estacionaria,ya que su tendenciaes al crecimiento infinito. Esto es debido a que, en

realidad,la velocidadespecíficade crecimientono esconstantedurantetodo el procesodel

crecimientoen discontinuoy, por tanto, no escapazde predecirtodaslas fasesdel ciclo de

crecimiento.En consecuencia,cuandoseplanteala representaciónde un sistemamicrobiano

en discontinuo, teniendoen cuentano solo su crecimiento, sino también el consumode

sustratosy la formación de productos,la ecuación[1.1] no se puedeempleardentrodel

conjunto de ecuacionesnecesarias,ya que llevaríaal absurdodel crecimientoinfinito. Sin

embargo,puedeproporcionarresultadosaceptablesen sistemasen continuo, aunquenunca

con sentidofisico.

La segundaexpresiónempleadapararepresentarel crecimiento,y que esúnicamente

dependientede la concentraciónde biomasa,es la conocidacomo ecuaciónlogística, que

resultade la integraciónde la siguienteecuacion:

____ cxdC~ = ¡¡C~. 1 [1.2]

di’ C~.

La ecuación[1.2] presenta,parauna concentracióninicial de biomasadeterminada,

dos parámetros:ji y C~,,. La ecuaciónlogísticaescapazde proporcionaruna curva con las

tres fasesde crecimientodel microorganismo:latencia, exponencialy estacionaria.Esta

ecuaciónfue propuestade formaempírica,como modeloparael estudiodel crecimientode

microorganismos,debidoaque la formade la funciónmatemáticaerasimilar a la observada

para el crecimientode microorganismosen discontinuo,posteriormentefue deducidade

formamecanística(Santos,1993).

14

Introducción

Las expresionesque hacendependerel crecimientode microorganismos,tantode la

concentraciónde biomasa como del “sustratolimitante”, hacenque estadependenciade la

concentracióndel citado sustrato esté incluida dentro de la velocidad específica de

crecimiento(ji), siendola ecuacióngeneral:

dC~ _

dt y(C5).Q~ [1.3]

La primeraexpresiónde estetipo fue la propuestaporBlackman(1905):

4Cs)11m.iCs>It,nB[1.4]

Cs

B

dondeB es unaconstante.Estemodelo planteaque hastaque la concentraciónde sustrato

no haya llegado a cierto valor no influye en el crecimientoy se puedeaplicar la ley de

Malthus.

Posteriormente,M’Kendrick y Pai (1910) eliminaron la primera parte de la

expresiónde Blackman (1905), planteandopara todo el intervalo de concentraciónde

sustratola siguienteexpresión:

di’ —

proponiendo,porprimeravez, una relaciónestequiométricaentre la velocidadde consumo

del sustratoy la de producciónde biomasa:

dÉ?5 _ 1 dC~ [1.6]dt Y~ ch’

A partir de estasexpresiones(ecuaciones[1.5] y [1.6J), se deducela ecuación

logística:

— Cx0 expQu.t) [1.7]c~i~A~- — exp[u .41

15

fu trod;tccwjj

siendo:

= ~t,,, c~ = . (ci. -4-C8j [1.8]Y tI’

AS \YS 1

C~ =C~ ±Y~ C8 [1.9]

Otra ecuación que relaciona la velocidad específica de crecimiento con la

concentraciónde un sustratolimitante esla propuestaporTiesser(1942):

dC1 Líex~KE±)j.c [1.10]

Posteriormente,NIonod (1949 y 1950) propuso otra expresión del tipo de [a

ecuación[1.3], de forma empírica, y similar a la ecuaciónya propuestapor Michaelis-

Mentenparalas reaccionesenzimáticas.El planteamientose basabaen que, en realidad,las

reaccionesquetienenlugaren el interior del microorganismosonenzimáticas:

dC~ [1.11]

di’

El modelopropuestoporMonodestáformadopor las ecuaciones[1.7] y [1.11]. Este

modelosesimplifica en las siguientescondicionesparticulares:

dC~ _K5 «C5 ~. ____ — p 45 [1.12]

di’

K ~ d~i% — Mm c .cj’ [1.13]

La simplificación que lleva a la ecuación[1.12] correspondea la Ley de Malthus,

mientrasque cuando K5 es mucho mayor que la concentraciónde sustrato,la ecuación

[1.13] se simplifica a la expresiónpropuestapor M’Kendrick y Pai (1910). Estasmismas

condicionesparticularessecorrespondencon el modelo propuesto por Blackman(1905)

(ecuación[1.4]).

16

Introducción

A partir de los diferentesmodeloscomentadoshastael momento,se observaque la

expresiónfundamentalde la cinéticamicrobianaes el modelopropuestopor Monod (1949 y

1950)(ecuaciones[1.7] y [1.11]), ya queexceptolapropuestaporTiesser(1942) -que no

parece tener explicación mecanística-el resto de las expresionescomentadaspueden

entendersecomo simplificacionesdel citado modelo, segúnla concentraciónde “riutriente

limitante” presenteen el medio; ya que la concentracióndel citadonutrientevariadurantela

fermentación,el modelo propuestopor Monod se puede simplificar a unas u otras

expresionesduranteel transcursode la misma. Estehechoes corroboradode forma patente

en el trabajode Esenery col. (1982)sobremodelosno estructurados,en el que se ajustanlos

mismos datos experimentalescon diferentesmodelos,no siendo capacesde discriminar

entreellos.

Un concepto importante,que fue tenido en cuentaposteriormenteen los modelos

cinéticosno estructurados,es la respiraciónendógena,introducido por Herbert (1958),

que planteaque partede la propiamasacelularseempleaen mantenerlas célulasen estado

viable, dándoseesteprocesoa velocidad constante,independientementedel valor de la

velocidadespecíficadel crecimiento:

dC~ = (p(q)—,ue).É?x [1.14]

dr

Esto conlíevaun descensoen la cantidadde biomasa,unavez agotadoel nutrienteo

sustratoque aportaenergía.

Tambiénsehanpropuestoexpresionesparael crecimientobajo la suposiciónde que

el microorganismose ve inhibido por la presenciade alguna sustancia-que puede ser

sustratoo producto-en ciertacantidad.Las expresionesmáscomunesson:

• Inhibición por sustrato,fue propuestopor Waymany Tseng(1976);estosautores

consideranque existeuna concentracióncríticade sustrato,pordebajode la cual no

se produce inhibición del crecimiento.

• Inhibición por producto, propuesto por Hinshelwood (1946) plantea que la

inhibición del crecimiento,porpartedel producto,dependede la concentracióndel

mismo.

‘7

introducción

1.2.1.2.- Modelos dc Consumo de Sustratosy Formación de Productos

La primera relación propuestapara el consumo de sustratoses la comentada

anteriormente, que relaciona la velocidad de crecimiento de la población con la de consumo

del sustrato mediante un “rendimiento macroscópico” (Y5j, representado en la ecuación

[1.4].

Posteriormente, Pirt (1965) obsevóque el citado rendimiento macroscópicono

presentaba valores constantes a lo largo de la transformación, por lo que consideró que el

sustrato se emplea para funciones asociadas y no asociadas al crecimiento, proponiendo la

siguienterelación:

1 — 1 .4-21- [1.15]

r~ ‘ir

Introdujo así el coeficientede mantenimiento (ms), el cual trata de explicar el

consumo de sustratopara el mantenimientode la biomasaen estado viable. Esto es

normalmenteaplicable sólo al sustratoempleadocomo frente energética(generalmente

azúcares).Sustituyendola expresión[1.15] en la [1.7), seobtienela siguienteecuacion:

dÉ?8 _ ( 1 dÉ?7 _ m8 dC~j [1.16]

di’ Y~ dt y di)

Estaexpresiónproporcionael consumode sustrato,cuandoseempleatanto parael

crecimientocomoparael mantenimientocelulardel microorganismo.

Cuandoel sustratoenergéticose empleatambiénpara la producción,se define un

nuevo “rendimiento macroscópico” de sustrato en producto (Ypsmt, incorporándoseel

término de consumodel sustratopara la producción en la ecuación[1.16), de la siguiente

forma:

dÉ?5 — (__1 dC7 ¡ dc,. m5 [1.17]

di di J$7 di’ y 4

18

Introducción

En cualquiercaso,sehacenecesariodisponerde una expresiónde la evolucióndel

producto con el tiempo que se pudiera sustituir en la ecuaciónanterior.El planteamientode

las ecuaciones de la velocidad de formación de productos depende del tipo de producto de

que se trate. Así, según RÉleis y Kossen (1978), basándose en la terminología propuesta por

Gaden (1959), clasifica los productos en las siguientes categorías:

• Productos no asociados al crecimiento

• Productos asociados al crecimiento

• Productos parcialmente asociados al crecimiento

La velocidad de producción del producto en cuestión puede expresarse de acuerdo a

la ecuación denominada de Luedeking-Piret (1959):

___ dÉ?~

di’ di

El primer término de esta expresión representa la producción no asociada al

crecimiento y el segundo la producción asociada al crecimiento, por lo que para los

primeros tipos de productos, se debe emplear únicamente uno de los términos de esta

ecuacion.

1.2.1.3.- Influencia de las Variables en los Parámetros

Las variablesmás estudiadasque influyen en la velocidadde cambiode los sistemas

microbianos son: temperatura, pH y, en sistemas aerobios, la concentración de oxigeno

disuelto.

Debido a la existencia de una temperatura óptima de crecimiento, la variable más

estudiada en este tipo de sistemas ha sido la temperatura (Esenery col., 1983;Ratkowskyy

col., 1983; Bailey y Ollis, 1986); en panicular, su influencia en la velocidadespecífica

máxima de crecimiento. Así, Esenery col. (1983)y Bailey y Ollis (1986)expresanla citada

variación de la siguienteforma:

19

lníroducc tau

iHík0, exp(— RT

AH2 [1.19]¡ + . exp(—----)

RT

mientras que Sinclair (1987) y Shu y Yang (1991) plantean:

E2= k~ exp(——)—k1>,•exp(—RT~ [1.20]

y, por último Ratkowskyy col. (1983)empleanla expresión:

,aJT) / C1 (7’- 7’,»,») /1 - exp(’c2 . (7’ Trnat))j}2 [1.21]

La influencia de la temperatura en el resto de parámetros ha sido menos estudiada:

Esener y col. (1983) plantean la variación del rendimiento macroscópicodel sustrato

carbonado en biomasa (Yxs) y del coeficiente de mantenimiento (ms), mientras Shu y Yang

(1991) lo hacen para los parámetros de [aecuación de Luedekíng-Piret (m y n). Apenas hay

datos en la literatura sobre estos aspectos.

La influencia del pH en los parámetros cinéticos de este tipo de modelos,apenasha

sido estudiada, únicamente Sinclair (1987) propone una expresión de su influencia en la

velocidad específica máxima de crecimiento, como la siguiente:

P,n(PH) = [1.22]

El máximo proporcionadopor estafunción estarámás o menos desplazadoen la

escalade PH dependiendodel tipo demicroorganismode que setrate(basófilo, acidófilo o

neutrófilo).

En los procesosaerobios, se le está dando gran importancia al estudio de la

evolución de oxígeno disuelto en el sistema (Cho y Wang, 1990; Hoojimans y col., 1991).

En un proceso fermentativo, la evolución de oxigeno disuelto respondea la siguiente

ecuación(Moo-Youngy Blanch, 1987):

20

Introducción

dC0

di’ — k~a~ (C0 — É?<> ) — É?~ [1.23]

El segundo sumando del segundo miembro indica la velocidad total de consumo de

oxígenodebidaal microorganismo,que se correspondecon la sumadel oxígenonecesario

para mantenimientocelular y para el crecimiento(Pinches y Pallent, 1986; Cho y Wang,

1990):

1q<> É?~ =m<> ~É?~<+ .dc~ [1.24]%‘~ di’

sustituyendola ecuación[1.3] en la [1.24],seobtiene:

+ 1’ [1.25]

que en ocasiones puede ser reducida a (Cho y Wang, 1990):

qQ — [1.26]

En el caso de que sea el oxigeno el nutriente limitante del crecimiento,se pueden

emplearlas ecuacionescinéticastipo Monod,tanto parala velocidadespecíficade crecimiento,

como parael consumode oxigeno(Cho y Wang, 1990),de acuerdo,respectivamente,a las

siguientes expresiones:

[1.27]/1=

K ±É?0, 02

q¿7X

.

= K-i-É? [1.28]OQ Q

Parapoder plantearun modelo cinéticono estructurado,dondese tengaen cuentano

sólo el crecimiento,sino tambiénel consumode sustratos y la formaciónde productos,es

imprescindible tener datos experimentales en los que se analicen los sustratos, productos y

biomasaa lo largodeltiempo. En definitiva, setratade observarsilos sustratos influyen en el

crecimiento y en la producciónpara incluir o no los términos correspondientesen las

2/

Introducción

velocidadesde producción de cadauno de los compuestosque intervienen.En el casode que

la expresiónde velocidadde produccióndel sustratolimitante del crecimientosevea afectada

por la producción,se tendránque repasarlas suposicionesrealizadasparael planteamientode

la expresiónparadescribirel crecimiento.Esto esparticularmenteimportanteen el casode

adoptarla ecuaciónlogística,ya queestaecuaciónpartede la suposiciónde queel crecimiento

y el consumodel sustrato limitante están relacionadosúnicamentepor un “rendimiento

macroscópico”o coeficienteestequiométricoconstantea lo largode la transformacion.

En definitiva, para el planteamientode un modelo cinético no estructuradono

segregado,que sea capaz de describir el crecimiento, el consumo de los sustratosy la

producción, se deben de obtener datos experimentales a partir de los cuales se pueda saber, en

principio, quétérminossedebenincluir en las expresionesde las velocidadesde producciónde

los diferentescompuestos.Es decir,hay queplantearel esquemade reacciónsimplificadoentre

los compuestoscomentados,a partir de los datosobtenidos.De otraforma, siemprese pueden

ajustar los datos experimentalescon diferentesexpresionesque tomen en cuenta distintas

posibilidades,y elegir el mejor ajuste,esdecir, un ajusterazonablecon el menornúmerode

parámetrosposible.Seriaentoncesaplicable,en amboscasos,la metodologíaestablecidapara

la discriminaciónentremodeloscinéticosde reaccionesmúltiples (Kittrell, 1970; Froment,

1975:García-Ochoay Romero,1993).

Los modelosdescritoshastaahora, esto es, los modelosno estructuradosserán

buenos cuando los microorganismos posean una composición celular que esté

aproximadamenteen estadoestacionario.No obstante,cuandotienenlugar cambiosen la

composicióncelular, los modelosno estructuradosproporcionan,en la mayoríade los casos,

una pobre aproximacióna la realidad. Es también lógico pensarque los modelosno

estructurados no sean capaces de reflejar la influencia de ciertas variables,

fundamentalmentela composicióndel medio. Para estoscasossehan propuestoun tipo de

modelosque tienenen cuentacambiosen la estructurainterna del microorganismoy, en

casos muy complejos, únicamentemodelos de este tipo serán capacesde explicar la

evolucióndel cultivo.

Estetipo de modelos,máscomplejos,se correspondencon la clasificación que fue

mostradaen laTabla 1.1 y puedenresumirsede la siguienteforma:

22

Introducción

• Modelos metabólicos,son modelos que podrían englobarsedentro de tos no

estructurados,pero empleanun esquemasimplificado de reacciónpara describir las

rutasmetabólicasde consumode sustratoy formaciónde productoscomo unared de

reacciones.Describenel crecimientocomoen los modelosno estructurados.

• Modelos de célula, describenla biomasaconsiderándolaformadapor varias

especies, teniendoen cuentalos componentesintracelularesy proponiendoparasu

descripción un esquema de reacción simplificado.

• Modelos químicamenteestructurados, sepueden considerar como la suma de los

dostipos de modelosanteriores,

• Modelos segregados,en la descripción del microorganismose considera la

distribución de algunapropiedad.Estos modelosno consideranun microorganismo

medio, como en tos casos anteriores.

El problema de plantear este tipo de modelos es relativamente parecido al abordado

en estudios de ciertos sistemasquímicos reaccionantesextraordinariamentecomplejos,

aunquemenos que la mayoría de las transformacionesbiológicas, es decir, del uso de

microorganismospara obtenerproductos de interés. Así como para la descripciónde

procesosquímicos complejos,tales como el craqueode hidrocarburoso la oxidación de

hidrocarburosse ha desarrolladoy aplicado una metodologíaque ha cubierto distintas

etapas,o al menoshaconsideradodistintasposibilidades;el caminoy posibilidadestomados

en cuenta han sido, conceptualmente,bastanteparecidosa lo hecho,en las tres últimas

décadas, en el análisis de sistemas microbianos. Por ejemplo, en el craqueo y oxidación de

hidrocarburos, primero se describió el sistema como si se tratara de una reacciónsimple,

añadiendo una distribución de productos,en función de ciertas variables, normalmente

condiciones de operación (García-Ochoa y col., 1990a); se intentó también describir el

sistema con toda su complejidad, analizando cientos de reacciones con decenasde especies

químicas, incorporando los valores de los coeficientescinéticos calculadosde forma

individualporotrosautores,o suponiendovaloressimilaresa los calculadosparareacciones

o etapasparecidas(Sundaramy Froment,1978; Milhail y col., 1983; Navarro, 1986).Estos

dosextremostienensu correspondenciaen el estudiode las transformacionesmicrobianas,

en la simple reproducciónde la biomasacon el tiempo, de acuerdoa ecuacionessimples,sin23

Introducción

justificación mecanística(ecuaciónde Malthus,por ejemplo), y en la recientepropuestade

modelosde célula concientosde reaccionesy decenasde especiesquímicasparticipando

en el esquema(simplificado) del metabolismocelular (Jeongy col., 1990). El camino

adecuado parece ser intermedio, con la utilización de esquemasde reacciónsimplificados,

pero realistas, utilizando iumping o una asociación de especies químicas para simplificarlo,

y una metodologíaparala discriminaciónentremodelosposiblespasandopor el cálculo de

parámetros (Sundaram y Froment, 1977; García-Ochoa y col., 1990b). En los sistemas

biológicos,estametodologíase correspondecon la propuestade modelos estructuradosen

Compartimentos,capacesde describir las transformacionesde forma simplificada, pero

mucho más cercanaa la realidadque los modelossencillos, siempreque su grado de

complejidadno seaexagerado.SegúnShuler(1985),en surevisiónsobremodeloscinéticos

estructurados,paraqueun modelo cumplaesasituaciónde compromiso ... debepresentar

un mínimo deparámetrosajustabíes, la mayoríade los parámetros debenser determinados

a partir de experimentos independienteso estimadospor una serie objetivade reglas. Debe

ser tratable matemáticamente y debe tener alta fidelidad en los procesos biológicos,

teniendoque ser posiblela verWcaciónexperimentaldelmodelo

1.2.2.-ModelosMetabólicos

Estetipo de modelosplanteaestructurasólo parael metabolismodel o de los sustratos

carbonados,sin diferenciarpanesen la biomasa,ya que la siguen considerandocomo en los

modelos no estructurados;es por ello que se pueden considerar como modelos no

estructurados-nosegregados.Dentro de este tipo, existenmodelosmuy diferentes,muchas

veces propuestos para problemas muy específicos de forma teórica (Van Dedem y Moo-

Young, 1973; Geraatsy col., 1990; Bibila y Flickinger, 1991), realizandouna simulacióna

partir de unosparámetrosestimadosde unamaneraqueno siemprequedaclara.

Otrosautoresplanteanestudiosmetabólicosmásgenerales,comoesel casode Kogay

col. (1969)y de Barford y col. (Barford, 1990; Hall y Barford, 1981; Barford y Hall, 1981;

Barford y col. 1 992ay 1 992b; Montes y col., 1998),aunqueen todoslos casosseplanteapara

ej casoespecíficode la levadurafermentativaSaccharomycescerevisiae.

24

introducción

Los modelos metabólicosplanteadosen la literatura, están todos realizados con la

levadura Saccharomycescerevisie.Estos modelos responden, de forma general, al esquema

planteadoen la Figura 1.4, dondeel sustratocarbonadoes introducidoen la célulamedianteun

sistemade transporte.La célula puedeutilizar estesustratocomo “esqueleto”para sintetizar

nuevascélulas(crecimiento),o bien transformarestesustratocarbonadoen un intermediario

reducido (IR), el cual puede ser fermentado a etanol o bien ser introducido en la mitocondria

para, a través del ciclo TCAy la respiración obtener energía en forma de ATP.

s

Figura 1.4.- Esquemageneralde los modelosmetabólicosparala levaduraSacchoromycescerevisie, existentes en la literatura.

25

Introducción

El modelo de Koga y col. (1969)planteaseis reaccionesdentrodel metabolismode la

levaduraSaccharomyces cerevisi,y queresponderíanal esquemaplanteadoen la Figura 1 .4.:

- Glicolisis (rj:

5’ + YÁTPO . ADP -e~YÁTP.G ATP + Y/RO . IR [1.29]

- Metabolismoanabólico(rA):

[1.30]¡N.A N+yÁT,.Á A TP —* YATP.Á ADP + X

- Metabolismocatabólico(rc)

ATP —* ADP + Pi [1.31]

-Ciclo TCA(r1’):

IR + NADH ~ Ysúrnx . NAD [1.32]

Respiración(rR):

YYID.R NADH + YITPR ADP+ ~2 >YVADR. NAD4 +r~i~,.>~ . ATP±r.up. M [1.33]

Fermentación (rF):

IR—> YP,F P [1.341

Los autoresproponenecuacionescinéticasglobales—tipo Monod-paracadaunadedichas

reacciones:

- Glicolisis:

csr¡rcma

• ~ • Cx

KATP + CATP

- Metabolismoanabólico:

[1.35]

r2rA~.,~ Kv +É?\;Cx CÁTPCX [1.36]

26

Introducción

- Metabolismocatabólico:

r§k0C ÁTP C [1.37]

- Ciclo TCA:

C PvCx [1.38]

KNAD+CrvAn Ka +Cp

- Respiración~

rsrp~; CNADHCX [1.39]

- Fermentación:

u6 ‘k FC ~ ,~. [1.40]

El conjunto de las velocidadesde producciónsepuedeescribiren función de una matriz

de coeficientesestequiométricos(yij), como en el tratamientocinético clásico de reacciones

múltiples(García-Ochoay Romero,1993):

dé’ 6 [1.41]

‘It ‘4/

Koga y col. (1969), no estiman los parámetrosdel modelo por ajuste de datos

experimentales sino que toman estos parámetros de la bibliografia, realizando de esta forma

simulaciones con el modelo.

El equipo de Barford propone un modelo algo sencillo. Comienza su planteamiento en

1981 (Barford y Hall, 1981) y se completa en 1990 (Barford, 1990), siendo ampliado al caso de

múltiplessustratosen 1992 (Barford y col., 1992ay 1992b).

El esquema de reacción que plantean viene dado por el siguiente grupo de ecuaciones:

- Paraeltransponedel sustratocarbonadoatravésde la membranaplasmática,(ri):

[1.42]

- Transformacióndel sustratoen el IR (r2):

S*~~>7p IR+y~ ATP [1.43]

27

Intro¿l,.¡cc¡on -

Formaciónde etanolpor fermentaciónde IR (r3):

IR —~ P + (‘O.

Ciclo de TCA (r4):

IR + 30,—>JCO,+SH,0+(473+!)ATP

-Parael crecimiento(r5):

Y + • 5’ + . íR+ YA J4TP - 2X

Las ecuaciones cinéticas que proponen estos autores también son tipo Monod:

Cr~k ~

¡ !K»+C/ x

rskj <yKw + Cm

r4ÑC4 Cii

?

CxKm + Cii?

rs kv C»i Cx

r2, la obtienena partir de la suposiciónde estadopseudoestacionariopara

dC5~—

0—rl-r2-vs

Por lo tanto el

¿Itrs r¡ri-v~rs [1.51]

modelo final viene dado por el siguiente grupo de ecuaciones

diferenciales(velocidadesde producción):

- Sustratocarbonado:

dC5___ :t-I,I

dt

Biomasa:

dC~dt

[1.53]5

((.44]

[1.45]

[1.46]

[1.47]

[1.48]

[1.49]

[1.50]

La velocidad

[1.52]

28

Introducción

- ffitermediarioreducido:

dC15 =r~ .r, —r3 —r4 —~y, r5 [1.54]

di’

- Oxígeno disuelto:

dC<, =—3r, [1.55]

¿It

- ParaelATP:

dCÁTP =(~>~ +1)r4 +y~ .y~, ~~YÁ •r5 [1.56]

dt

Como puedeobservarseel planteamientodel modeloesmuy similar al de Kogay col.

(1969),peroestemodeloes mássencillopuesel númerode componentesclaveseha reducido

a cinco , en lugarde teneroncecomoen el casoanterior.

Los parámetrosdelmodelo de Barford se estiman,en todoslos casos,apartir dedatosen

bibliografíao tomandoen consideracióndatosexperimentales,pero por métodosparticulares,

no por regresion.

Un modelometabólicomásreciente,tambiénrealizadosobreSaccharomycescerevisieesel propuestopor Montesy col. (t998), basadoen el modelo de Bardford, el cual,a suvez,

estábasadoen el conceptode que el metabolismoaerobiode las levadurases determinado

mediante el transporte de azúcar al interior celular y la velocidad de transporte de piruvato

dentro de la mitocondria. Los parámetros de este modelo son obtenidos de forma experimental,

por ajuste de datos con el modelo propuesto.

De los modelosmetabólicosplanteadosen la literaturase puedeconcluir queestetipo de

modelossonabordablestantodesdeel puntode vistamatemáticocomodesdeel puntode vista

experimental,pues,como seha visto, el númerode parámetrosquepresentanno es elevadoy

los productos o componentesclave quesonnecesariosanalizar no suelenprecisardemétodos

de análisiscomplicados.

29

Introduccion

1.2.3.-Modelos Estructurados o de Célula

Como seha comentadopreviamente, este tipo de modelos secaracteriza por que la

descripción de la denominada biomasa se realiza de forma estructurada,es decir, se

consideraque está formada por componentesque reaccionanentre sí. Los modelos

encontradosen la literaturaclasificablesdentro de estetipo se puedendividir a su vez en

dos:

- Modelos Compartimentados, en los que la consideraciónde los componentesinternos

de la biomasano serealizade forma explícita. Se divide la biomasaen subunidadeso

compartimentosa las que se le asigna una función, pero que no representana

compuestosintracelularesespecíficos.

- Modelos de Célula: estos modelos proponen esquemas simplificados de reacción en los

que los compuestosintracelulares aparecenexplícitamente.

1.2.3.1.-Modelos Compartimentados

Los modeloscompartimentadosagrupandetallesdel metabolismomicrobianoen

grupos. estandoel metabolismototal tratadoen términos de un númerode componentes-

bloques o compartimentos-más o menos limitados que, a veces,tienen una definición

bioquímicaaproximada.Estosmodelossuelenpresentarpocosparámetros(entre5 y 15). Es

un concepto parecido al lumping empleado en reaccionesmúltiples (García-Ochoay col.,

1 990b).

El modelocompartimentadomás sencillo es el formado por dos bloques; este tipo de

modelosse comenzóa desarrollara mediadosde los 60 y se siguen empleandoen la

actualidad.Dentrode estetipo de modelosde doscompartimentosse encuadranlos debidos

a : Deany Hinshelwood(1966); Williams (1967); Ramkrishnay col. (1967): Verhoffy col.

(1972);Bijkerk y Hall (1977); Esenery col. (1982); Bleecken(1984);Nielseny col. (1991a

y 1991b)y Nikolajseny col. (1991). Todos estosmodelos,exceptoel primero,identifican

los compartimentoscon partes de la biomasa(DNA, proteínas,etc.), denominandoa las

partesen que dividen a la biomasade diferentesformas, como por ejemplo: componente

sintético,genéticoo estructural.

30

Introducción

El modelo planteadopor Ramkrisnay col. (1967), divide el citoplasmaen dos

componentesestructurales,cuya interacción entre sí y con el ambiente que les rodea,

produceel crecimiento.DenominanmasaO al gnipo formadoporácidosnucleicos(DNA y

RNA) y masaD a las proteínas;proponiendoel esquemasimplificado formadopor cuatro

reaccionesen el que la formaciónde un inhibidor del crecimientopuededar lugar a formas

muertasde las masasG y D (N0 y ND).

C+75,<S —*2G [1.57]

O + y> 5’—> 0+ D±y,,. T [1.58]

0+ T —* + (1±7,,)T [1.59]

D±T-4 ND [1.60]

El citado modelo proporcionacurvasde crecimientocon todaslas fasesobservadas

experimentalmente,incluyendo la fase de latencia. La concentracióntotal de protoplasma

viable es la suma de las concentracionesde los dos compartimentos.El modelo predice

fenómenosobservadosen el crecimiento en discontinuo, ya que las curvas obtenidas

dependen de las siguientes variables (Tsuchiya y col., 1966):

i) La proporción relativa entre O y D en el inóculo, lo queinfluye en la longitud de la

fase de latencía.

u) El tamaño del inóculo, cuyo aumentoproporcionauna disminución de la fase de

latencía.

Como planteamiento teórico, parece coherente, el problema está en determinar la

sustancia inhibidora del crecimiento y en analizar la cantidad de la misma presente en las

células; para poder obtener los parámetros del modelo por regresión de datos

experimentales.

De los modelos de dos compartimentos citados, el que ha tenido mayor repercusión

posterior ha sido el modelo de W¡ll¡ams (1967). En este modelo se distinguen dos

compartimentos: la sección sintética (K) y la seccióngenético-estructural(O). Se supone

que las células sedividen tan pronto como el compartimentoO seha dobladoen tamano.

Williams sugirió que el compartimento O está formado por DNA y proteínas, y el K por

RNAy moléculas pequeñas. El esquema de reacción planteado es el siguiente:

31

Introducción

S—*K +G [1.61]

Con las siguientes ecuaciones cinéticas:

(C~ + C0)

= k,, C5 C~ .

[1.62]

[1.63]

Sin embargo,R6els y Kossen (1978) modifican el modelo incluyendo diferentes

cambios:

a) Se dan dostipos de reacciones:

i) Reaccionesgobernadaspor las concentracionespor unidadde biomasa(fase

biótica).

u) Reaccionesen las que son de importancia las concentracionesreferidasa

unidadde cultivo (faseabiótica).

b) Incluyencoeficientesestequiométricosenel esquemade reacción.

c) Proponenecuacionescinéticaspotenciales,deltipo:

[1.64]1sI( flCJCY= fI 4-1

donde i está referido al cultivo y el indice j a la biomasa.Por lo tanto, al

aumentar la velocidad r~ aumentalabiomasaen la mismaproporción.

Estos autores calculan los parámetros del modelo por regresión no lineal y

reproducendatosexperimentales.

Las últimas modificacionesdel modelo de Williams (1967)son las realizadaspor

Nielseny col. (1991a y 1991b);Nikolajseny col. (1991). En estosmodelosse incluyen los

doscompartimentos,aunquecambiala nomenclaturaempleada,denominancompartimento

A o parteactiva de la célula(proteínasy RNA) y compartimentoG o parteinactiva(DNA e

hidratosde carbono).El modelo desarrolladopor el equipo de Villadsen (Nielseny col.,

1990a y 1991b; Nikolajsen y col., 1991) incluye dos tipos de sustratos(carbonadoy

nitrogenado)y la formación de productos,suponiendoque el sustratonitrogenadosólo

32

Introducción

interviene en la formación de biomasa,mientrasque el sustratocarbonadose empleatanto

parael crecimientocomo parala producción.El esquemageneralse da en la Figura 1.5.

Este modelo debido a que incluye la formación de dos productos , podría ser clasificado

dentro de los modelosQuímicamenteEstructurados,en el que el metabolismose considera

de forma compartimentada.

Estosautores(Nielseny col., 199 la y 199lb) calculanlos valoresde los parámetros

a partir de los experimentos realizados, pero no por regresión, y comprueban la

reproducción de datos experimentales (Nielsen y col., 1991) donde aumentan el número de

sustratos carbonados a tres reproduciendo posteriormente a datos experimentales.

s

N

P

Figura 1.5.-Esquemageneraldel Modelo de Nielseny col. (1991a y 199 Ib).

33

Introducción

Dentro de los modelos compartimentadoshay modelos con más de dos

compartimentos, como el propuesto por Harder y Rdels (1982), que está formado por tres

compartimentossegúnel esquemade la Figura 1.6. El compartimentoK representael RNA,

el compartimentoU las proteínasy el compartimentoR la biomasarestante,principalmente

hidratosde carbonoy precursores.talescomo ácidosnucleicosy aminoácidos.Se supone

que los tres compartimentosse sintetizana partir de un sustrato interno y hay sólo una

frentede carbonoque seempleatanto parala síntesisde ATP como paraprecursores.Se

supone que el sustrato limitante entra en la poblacióncelular y se incorporadirectamenteal

compartimentoR; los compartimentosK y G se forman a partir de precursoresque hay en

R; K y U se puedendegradardando lugar de nuevo a precursores,que retornanal

compartimento R; esto último se puede identificar con el mantenimiento. Las expresiones

cinéticas sugeridas por Harder y Róels (1982) están basadas en la suposición del estado

pseudoestacionario para el ATP y los precursores. La justificación de esta hipótesis es que

los tiempos de relajación para la adaptación del ATP y los precursores son mucho menores

que para los otros componentes (R, G y K). Shuler (1985)criticó la aplicaciónque hicieron

los autores del modelo a un lodo activado, partiendo de parámetros obtenidos para E.coli,

sin tener en cuenta las posibles iteraccionesentrelas diferentesespeciespresentes.

¡

R

4

Figura 1.6.-Esquemadelmodelo de Hardery Róels(1982).

34

Introducción

1.2.3.2-Modelos de Célula

Como ya se ha comentadoanteriormente,la principal característicade estetipo de

modelosesqueconsiderala biomasaformadapor componentesintracelulares,identificandoa

estoscompuestosno comoun compartimento,como sucedeen los modeloscompartimentados,

sino teniendoen cuentaal compuestoen sí en un entramadode reaccionesquepuedesermáso

menoscomplejo.Paradesarrollarun modelode célulase debetenerun conocimientodetallado

del microorganismo,por lo que los modelosencontradosen la literatura estándesarrollados

para microorganismos muy conocidos, como Escherichia coli, Bacillus subtilis o

Sacharomvcescerevisiae. Este tipo de modelosse caracterizapor un elevadonúmerode

parámetros(entre74 y 200) quelos autoresgeneralmenteestimanapartir de datosqueexisten

en bibliografia.Estosmodelosestándesarrolladosúnicamentedeforma teóricay explicansólo

el crecimientodel microorganismo.

Dentro de estosmodeloscomplejosde crecimiento,se incluye el trabajopionerodel

grupode Shuler, en el que sedesarrollael modelo de ComelíparaE. coil. Un esquemadel

modelo inicial (Shuler, 1985)se representaen la Figura 1.7. En estemodelo se consideraa la

célulacomo un reactorqueeslibreparacambiarde forma y volumeny respondera cambiosen

las concentracionesde glucosay amonio, que se incorporana la célula paradar lugar a las

reaccionesen suinterior. Se emplealumpingen el planteamientodel esquemade reacción—es

decir, seagrupan,por ejemplo las proteinascitoplasmáticasy de pareden un solo compuesto,

se agrupantodoslos aminoácidosen otro, se agrupanribonucleótidosy deoxirribonucleótidos,

etc-, en total, consideran 18 componentes, para los que plantean sus velocidadesde

producción, con expresionescinéticasgeneralmentetipo Monod. El modelo presenta88

parámetrosque estimande forma independienterealizandoexperimentosespecíficos,en los

quepareceaislarseciertaspartesdel modelo paraobtenerlos valoresdeseados.El modelo lo

planteancomouna buenaherramientaparatestarcuantitativamentelos mecanismosde control

celular.

El modelo de Cornell, propuestopor el grupo de Shuler, fue evolucionandocon el

tiempo, siendoconsideradosdiferentesaspectos:en 1984(Domachy col., 1984),se aplicó a

35

Introducción

poblaciones:en 1985, fue ampliado(Shuler, 1985)paraincluir situacionesde anaerobiosis,

alterandolos mecanismosde generaciónde energíaen la célula; en 1986 fue modificadopor

Perettiy Bailey (1986)examinandolas interaccioneshuesped-plásmido.

Otro ejemplode estetipo de modeJosesel propuestopor Jeongy col. (1990).Estos

autores desarrollan un modelo muy complejo para la descripción del crecimiento y la

esporulaciónde Bacillus subtilis. El esquemade reacciónconsideradose recogeen la Figura

1.8. Este modelo tiene en cuenta 35 componentesintracelulares,en los que se incluyen

intermediosmetabólicosde la glicolisis, gluconeogénesis,ciclo TCA, y una representación

detalladadel metabolismode los nucleótidos.En total estáformado por 39 ecuacIones

diferencialesquecontienen200 parámetros.

El modelose empleaparasimularel crecimientoen un bioreactortanqueoperandoen

discontinuo,empleandovaloresde los parámetrosobtenidosde bibliografía, con los que los

autoresobtienen una buena reproducciónde los datos que observanexperimentalmente.

Simulan la evoluciónde los 35 componentes,pero no analizanlos citadoscomponentes,de

hecho,en el trabajopublicado, no aparecendatosexperimentales.

En ninguno de los modelosde célula encontradosen la literatura se obtienenlos

valoresde los parámetrosdel modelomedianteajustede datosexperimentales,debidoaqueel

análisisde muchosde esoscomponentesno serealiza, dadala complejidadde dichosanálisis.

Por lo tanto, y como se ha indicadoanteriormente,estosmodelostan complicadosno parecen

los más adecuados,al menosdesdeel punto de vista técnico(Esenery col., 1983).De hecho,

parala simulaciónde una transformaciónmicrobiana,y la eleccióny diseñodel reactormás

conveniente,no esnecesarioir al nivel de complejidadqueexigenestosmodelos.Sin embargo,

puedeque en el futuro hayaque emplearlos,ya que, en la actualidad,los modeloscinéticos

más sencillos, ajustadosa datos experimentalesconseguidosen diferentesexperimentos,

proporcionanunos parámetros,en general, no relacionables.Es decir, no se consiguen

ecuacionescinéticascon los parámetrosen funciónde las variablesde operación(temperatura,

pH, composicióndel medio empleado,velocidad de transportede oxigeno, etc.) que sean

capacesde predecirlos resultadosen experimentosllevadosa caboen variedadde las citadas

condicionesde operación.Esto debeser el gran logro de los modeloscinéticosestructurados,

36

Introducción

frentea la simplicidadde los modelosno estructurados.En cualquiercaso,aunquelos modelos

de célula seannecesarios,esde suponerque seránmodelosmássencillosque los propuestos

hasta ahora, con menos componentesclave, y, por tanto, con necesidadde medir menos

compuestos,de tal forma que el cálculo de parámetrospor regresiónsea abordable.Esto

implica hablarde modeloscon no másde 7 a 10 componentesclave, el mismo númerode

etapasen el esquemade reacción,y no másde 20 parámetros.

Figura 1.7- Esquemadel modelode Domachy col. (1984),siendo:

A1= amonioA2= glucosa(componentesasociadosen lacélula)W= productosresiduales(CO2, H20)P1= aminoácidosP2~ribonucleótidosP3=desoxiribonucleótidosP4=precursoresenvueltacelularM1= proteína(citoplasmáticay de envueltacelular)M2R-¡1 RNA inmaduroestableM2RTM= RNA maduroestableM2~ RNA mensajeroM3= DNAM4= porciónno proteicade la envolturacelularM5 glicogenoPG= ppUppE2,E3=moléculasimplicadasdirectamenteenla formaciónde la paredcelularGLN= glutaminaE1= glutaminasintetasa* - materialpresenteenel medioexterno

37

Introducción

Figura 1.8.-Esquemadel modelode Jeongy col. (1990)

1.2.4.-ModelosQuímicamenteEstructurados

Ya se ha comentadoque estetipo de modelosconsiderala biomasaformadapor

variasespecies,de la mismaformaque en los modelosde célulapero, además,los modelos

químicamenteestructuradosdescriben el metabolismo como una red de reacciones

empleando esquemassimplificadosde reacción,como en los modelosmetabólicosya

descritos.En definitiva, un modeloquímicamenteestructuradose formulapor la unión de

un modelometabólico-en el que sedescribela produccióndel productode interésteniendoen

cuentael sustratocarbonadodentrode la red simplificadade rutasmetabólicas-,junto con el

modelode célula— quedescribeel crecimientodelmicroorganismoproductor-.

Los modelosmáscomplejosempleadoshastaahorahansido los modelosde célulacon

los cualesera posible realizaruna buenadescripcióndel crecimientoteniendoen cuentala

38

co; NH

Introducción

evolución de componentesintracelularesduranteel mismo. Estos modeloseran realizados

sobresistemasde sobraconocidoscomo Ecolí o Bacillus subtilis y no con microorganismos

empleados con un interés industrial. En consecuencia no es posible observar la aplicación de

tales modelos desde este punto de vista, ni poder predecir el comportamiento del

microorganismocuandose realizaun cambiode escala.

Porestarazón,esnecesariala propuestade los modelosquímicamenteestructurados,es

decir, los que tienenen cuentalos principios del modelo de célula pero ademásdel modelo

metabólicocon lo que,en principio seráposiblemodelizarunaproducciónde interésindustrial,

permitiendorealizarsimulacionesen el cambiode escaladel proceso.Ademáspodríapermitir

la relación de parámetrosdel modelo en función de las variables del proceso, como

temperatura,oxígenodisuelto,composicióndel medio,etc.

Aunque teóricamenteestos modelos presentangrandes ventajas respecto a los

comentadosanteriormente,no existe en la literatura ningún modelo de este tipo. La

modelizaciónmáscomplejavistahastaahora seha quedadoen el nivel de modelosde célula,

donde se realiza un estimaciónde parámetrossin ajuste de datos experimentalesy sin

aplicaciónen un sistemadeproducciónde interésindustrial.

1.2.5.-ModelosSegre2ados

El desarrollo de modelos segregadosse comenzó en la décadade los años 60,

planteándosemodelosde escasaaplicaciónpráctica(Tsuchiyay col., 1966; Matsumuray col.,

1973; Kobasyashi,1966), debidoa que estos primerosmodelossegregadospertenecena la

clasede modelosde balancede población,que se basaen la defmición de una función de

distribución de propiedadque expresala probabilidadde que la citadapropiedadpresente

cierto valor y, en el casode los modelosdesarrolladosen la décadacomentada,la propiedad

elegidaera la edadcelular, siendo difícil de medir e incluso de definir la edadcelular en un

cultivo microbiano:esdificil enlazarel conceptode edadcon la teoríabioquímicaexistentey

no essatisfactoriosuponerquelo quetieneinfluenciaenel procesoseala edaden sí mismaen

lugarde los cambiosen la composición.

39

Introducción

En la literatura inicial sobremodelossegregadosse encuentraun grupode modelosque

usael tamaño o masacelular como propiedada consideraren la función de distribución

(Eakmany col., 1966).Estetipo de modelosbasadosen el tamañoo la masacelularhansido

los precursoresde los modelossegregadosque sedesarrollany empleanen la actualidaden la

descripciónde sistemasmicrobianos,en los que el microorganismoes de tipo filamentoso

(hongos,principalmente).Los hongosfilamentososforman partede un subgrupode hongos

muy importantea nivel industrial, ya que se empleanen la síntesisde metabolitos, tanto

primarioscomosecundarios.

El metabolismoprimariode los hongosfilamentososes muy similaral de las levaduras.

El mecanismode crecimientode los hongos filamentososes, sin embargo,completamente

diferentedel de los microorganismosunicelulares.Los modelosdescritoshastaestepunto son

válidos únicamenteparamicroorganismosunicelulares,ya que en ellos secombinael modelo

celular con un modelo de poblaciónno segregadoque consideraa todaslas célulasidénticas.

En el casode microorganismosfilamentosos,el modelo quedescribala evolucióndel sistema

debe tener en cuentalos cambiosmorfológicosque allí se producen,es decir, debe ser un

modelo segregado.Estetipo de modelosesdenominadopor algunosautorescomo modelos

morfológicamenteestructuradosfNielseny Villadsen,1992;Nielsen,1993).

Los modelosparamicroorganismosfilamentososse puedende nuevo dividir en dos

grandesgrupos:

- Modelosde crecimiento

- Modelosde crecimientoy producción

Modelosdecrecimientodehongosfilamentosos

Las célulasde los hongosfilamentososestánunidasen estructurasdenominadashifas,

estos elementoshifales crecen sólo en las células situadasen los extremosde las hifas,

denominadaspuntaso yemas,produciéndosenuevasyemasen célulasintermediasde la hifa

por un mecanismodenominadoramificacion.

40

Introducción

El crecimientode las yemaso puntasseproducegeneralmentea cierta velocidadde

extensiónconstante,queestácondicionadapor la composiciónintracelulary el entornoque la

rodea;por lo tanto, el crecimientoexponencialde un cultivo de hongosfilamentosossedeberá

sólo a la existenciade una frecuencia de ramificación de la hifa. Así, mientras que el

crecimientode un microorganismounicelularse caracterizapor una velocidadespecíficade

crecimiento,para caracterizarel crecimientode hongos filamentososse necesitantanto la

frecuenciade ramificación como la velocidadde extensiónde la yema(Nielsen y Villadsen,

1992). Sin embargo,estasvariablesson dificiles de evaluary, debido a la falta de mejores

medidas, la velocidad específicade crecimiento se emplea también para caracterizarel

crecimientode hongosfilamentosos.

Nielseny col. (Nielsen, 1992; Nielseny Villadsen, 1992; Nielsen 1993) refieren el

índicede crecimientode la hifa que se empleageneralmentees la unidadde crecimientohifal,

a la masade la hifa (miigi3:

lbgu [1.56]

= [1.57]n

Mb [1.58]

Nielsen (1993)plantea la relación entre ellos:

~ [1.59]4

Esteautor (Nielsen, 1992)comprobóque la unidadde crecimientohifal referidaa la

masade la hifa es aproximadamenteconstanteen diferentescondicionesy para diferentes

especiesde hongosfilamentosos;sin embargo,el diámetrode la hifa varía, lo queimplica que

launidadde crecimientohifal referidaa la longitud de lahifa tambiénserávariable.

41

Introducción

Según Nielsen y Villadsen (1992), si la citadaunidad de crecimientohifal (ecuación

[1.65]) es constante,tanto la velocidadde extensiónde las yemascomo la frecuenciade

ramificaciónson proporcionalesa la velocidadespecíficade crecimientode la biomasa,y para

ambasvariablesla constantede proporcionalidades la unidadde crecimientohifal.

Segúnel valorde estaconstantese obtieneun tipo u otrode estructuramacroscópica:

- Si m~g¡¡ presentaun valor elevado:hifas Largascon pocospuntosde ramificación.

- Si mí,gu presentaun valor bajo: densaestructurahifal con muchos puntosde ramifícacion.

Estasestructurassedenominan pdllets’.

Esta estructuramacroscópicapresentagran importancia, ya que en el caso de un

tamañode pellet elevadose puedenpresentarproblemasrespectoa la difusión del sustrato

hastala zonainternade la hifa.

Los modelos empleadosen la literatura para describir el crecimiento de hongos

filamentosos son generalmentemodelos no estructurados,ya que siguen expresandola

cantidadde microorganismopresenteen el cultivo en términosde biomasa(Yangy col., 1992;

Nielsen, 1993; Viniegra-Gonzálezy col., 1993; Patankar y col., 1993>, empleando,

generalmente,expresionescomo la ecuaciónlogística o la ecuaciónde Monod, para su

descripción.

Entre los modelospropuestospara el crecimientode microorganismosfilamentosos

existeunoespecialmentecurioso,el propuestopor Aynsleyy col. (1990)en el queseidentifica

a la hifa con un reactortubularautoextensibleparasimular su crecimiento.

Modelosdecrecimientoy producciónen hon2osfilamentosos

Nielsen y Villadsen (1992) incluyen en su revisión tres modelos sobre hongos

filamentosos(Matsumuray col., 1981) tambiénsegregados,ya que consideranreaccionesde

metamorfosiso diferentesformasmorfológicas,pero con la particularidadde serestructurados

de tipo metabólico, ya que, debido a que prestanespecial atencióna la producción (de

42

Introducción

antibióticos, enzimas, etc.) desarrollan ligeramente el metabolismo del sustrato en el interior

del hongo. En el modelo de Matsumuray col. (1981), seconsiderantres tipos de reacciones:

toma de sustratos,reaccionesde metamorfosisy reaccionesde los sustratosen el interior del

microorganismo,enfocadasa la producción.Los citadosautoresplanteanecuacionescinéticas

para los dos últimos tipos de reacciones,siendo, generalmente,expresionestipo Monod o

potenciales.

1.2.6.-La In2enieriaMetabólica

Diversosautores(Esenery col., 1983; Nielseny Nikolajsen, 1992; García-Ochoay

Romero, 1993) coincidenen la idea de que los modeloscinéticospara transformaciones

microbianas,que van a desarrollarsey aplicarseen la(s) próxima(s)década(s),son modelos

estructurados,pero simplificados, con un número reducidode componentesintracelulares

(dos,tres o cuatro),que sepuedanmedir, y, por lo tanto,obtenerlos parámetrospor regresión

de datosexperimentales.Perodichosmodelostienenunatareapendiente,debensercapacesde

explicar o de relacionarvariables,observacioneso fenómenos,que no sean capacesde

explicarlos modelosno estructurados,mássencillos.

La grandificultad de desarrollary aplicarmodelosestructuradoses,fundamentalmente,

de análisis. La metodologíaes en todo similar a la desarrolladapara determinarmodelos

cinéticos de redes de reacciones(García-Ochoay Romero, 1993), siendo las principales

herramientasmatemáticasa utilizar la regresión múltiple no lineal (Marquardt, 1963),

aplicandounasoluciónde multirrespuestaaun problemade dichanaturaleza.Perocomo seha

indicado,el modelotienequesersimplificado, con un númerode componentesclavereducido,

de cuatro a ocho parece un número razonable,que hay que medir. Algunos de estos

compuestosson intracelulares:DNA, RNA, proteínas,ATP, etc, son los más frecuentesa

determinar.Porello, es necesariomedir éstos y otros componentes,calcularparámetrospor

ajustede datosexperimentales,y reproducirdichosdatos.

Los modelossegregadosestánespecialmenteindicadosy quizássólo en esoscasos,

para describir el crecimiento de microorganismosfilamentosos de los que se obtienen

productosde graninterés.

43

lutroduccion

La necesidad de aumentar la complejidad de los modelos cinéticos para describir

la evolución de procesos microbianos es clara, sin embargo el propósito de los modelos

metabólicosy, especialmentede los modelosquímicamenteestructurados,entradentro

del desarrollode la denominadaIngenieríaMetabólica(Bailey, 1991: Stephanopoulos,

1991). La utilización de microorganismoscomo fábricas de productos sumamente

específicas ha llevado al desarrollo de herramientaspara conseguir mejorar el

rendimientodel compuestodeseado.Durantebastantetiempo, la citada mejora se ha

realizadopor mutagénesisal azarde cepasmicrobianaso por cambioen las condiciones

del cultivo. Estetipo de trabajo se llevaba a caboporquemuchoscambiosgenéticosdel

microorganismopotencialmentebeneficiososno eran evidentes,Incluso, los sistemas

enzimáticosque gobiernanlos “cuellos de botella” del metabolismocelularpuedenestar

situadoslejos del sistemaenzimáticoque finalmente sintetizael compuestobioquimico

deseado.En muchoscasos,las reaccionesenergéticasdel metabolismoprimario deben

serreconducidasparaaumentarlaproductividad(Vallino y Stephanopoulos,1993).

Durante las dosúltimas décadas,seha ido desarrollandouna técnicamás racional

paraconseguirla producciónóptima del productodeseado(Bailey , 1991), tratandopor un

lado de identificar la reaccióncríticao cueiio de botella del metabolismoen la producción

del compuestodeseadoy porotro, minimizaresfuerzosen la optimizacióndel proceso.Esta

técnicaesladenominadaIngenieríaMetabólica.

En los años70 (Heinrichy Rapoport,1974),comenzóel estudiode la identificación

de los citadoscuellosde botella,a partir de la definiciónde ciertoscoeficientes(de control

y ciertas relacionesentre ellos (teoremas).En realidad, se trataba de un análisis de

sensibilidaddel sistema que proporcionauna base cuantitativa para el estudio de la

regulación de sistemas metabólicos. El desarrollo de estos estudios se realizó,

principalmente,durantela segundamitad de la décadade los años 80 (Felí y Sauro. 1985;

Kell y Westerhoff, 1986; Reder, 1988; Westerhoffy Kell, 1989). Para su aplicación,es

precisoel análisisde compuestosintracelulares,dificilmente analizables-seha propuesto

realizarsuseguimientomedianteisótoposde C (Zupke y Stephanopoulos,1994),por lo que

se ha llegado a intentarla simulaciónde estas rutasmetabólicasin vitro (Delgadoy col.,

1993).

44

Introducción

A principios de los años 90 ya se encuentranrevisionescompletassobre estos

estudios (Felí, 1992; Liao y Delgado, 1993); sin embargo,su aplicación prácticano se

encuentraextendida.

La identificación del sistema metabólico, y su influencia en la produccióndel

metabolitode interés,se ha abordadodesdeel punto de vista estequiométrico(Hamer,

1989; Noormany col., 1991; Goel y col., 1993; Vallino y Stephanopoulos,1993); la razón

principal de estecambiode estrategiaesel granerror que conlíevala determinaciónde los

coeficientesde control y elasticidadnecesarios,así como la necesidadde conocer en

profundidadla cinética enzimáticade la red de reaccionesque forman la ruta metabólica

estudiada(Pons y col., 1996). En los antecedentescitados, se emplea un método que

denominande “balancede materia”, suponiendoparalos metabolitosintermediosun estado

pseudoestacionario,aproximaciónque evita la necesidadde sumedida.Cabendestacartres

gruposde investigaciónen la aplicación de estaherramientade la lingeniería Química a

procesosde producciónmicrobianos:el grupo de Delft (Holanda)(Noorman y col.,

1991;Deiong-Gubblesy col., 1995; Gulik y Heijnen, 1995; Vanrolleghemy col., 1996),el

grupo de Michigan (E.E.U.U.) (Varma y col., 1993; Varma y Palsson,1994a y 1994b;

Varmay Palsson,1995),y, por último, el grupode Lyngby (Dinamarca),que ya en sulibro

sobreIngenieríade la Biorreación(Nielseny Villadsen,1994) incorporanesteestudioen el

capitulo de análisis estequiométricode reacciones,como pasoprevio al desarrollo de

modeloscinéticosde estetipo de procesos(Nielsen y Villadsen, 1992; Jorgenseny col.,

1995; NoronhaPissaray col., 1996).

La utilidad potencial que Varma y Palsson(1994) asignanen su revisión a esta

técnicaesamplísima: la interpretaciónde datosexperimentales,el diseñode métodospara

trabajar con técnicas de Ingeniería Genética, la formulación de medios óptimos, la

optimizaciónde las condicionesde operacióny el diseñode bioreactoresparabioprocesos.

Todo ello alcanzablecon ciertasencillez,aunquesigue siendonecesarioel análisisde los

“componentesclave” obtenidosa partir del estudioestequiométrico,ya que además,el

númerode compuestosintracelularesque es necesarioanalizar está en función de las

simplificaciones empleadasen el citado estudio (lumping o agrupación de moléculas

similares, hipótesisde estadopseudoestacionario,etc.).

45

fY?tYOd¿ ¿celán

Bailey (1995)destacaLa aportaciónde la metodologíaque la IngenieríaQuímicaha

desarrolladoenel estudiode reaccionesquímicascomplejas,en el desarrolloy optimización

de procesosde producciónmicrobianos.Por tanto, hoy díapareceque se puedetrasladarla

metodologíadesarrolladaen el estudiode redescomplejasde reacción (García-Ochoay

Romero, 1993) al planteamientode modelos cinéticos para este tipo de procesos.No

obstante,hay que tenerpresenteque es necesariotener en cuentaotros fenómenosparael

cambiode escalade estosprocesos,como ya seindicó al comienzode estecapitulo, estos

son los relacionadoscon la transferenciade oxigeno y el daño celular o stress

hidrodinámico que se puedecausaral microorganismo por el propio fenómeno de la

energíainvolucradaparaaumentarla transferenciade oxígeno.

-/6

introducción

1.3.- GOMAde XANTANO

El xantanoes un biopolimero de origen microbiano. En el término biopolímerose

mcluyen un gran número de moléculasde elevado peso molecular, tales como ácidos

nucleicos,polisacáridosy lípidos, producidospor unaamplia variedadde sistemasbiológicos

(Higgins y col., 1985). Desde un punto de vista industrial han tenido importancia los

biopolímerosdenominados“gomas”. En términos prácticoso funcionales,las gomas son

compuestosde pesomolecularelevado, con propiedadescoloidalesque, en un disolvente

adecuadoo agentesuspendedor,producengeleso suspensionesde elevadaviscosidad. En la

industria, técnicamente,se empleael término “goma” referido a polisacáridosobtenidosde

plantaso animales,asícomoa susderivados,que sondispersablesen aguafría o calientepara

producirgeleso disolucionesviscosas.

La importancia industrial de las gomas se fundamenta en dos características

importantes:

• La capacidadparaalterarlas propiedadesde flujo de agua.

• La posibilidad de formar geles capacesde actuar como emulsificantes, adhesivos,

floculantes,formadoresde película,lubricantes,reductoresde fricción y enlazadores.

Segúnla fuente de obtención, las gomas se puedenclasificar en gomas naturales

modificadaso semisintéticasy sintéticas.Las gomasnaturalesson las obtenidasa partir de

plantas(semillas,algas,cereales,tubérculos),microorganismos(bacterias,hongos)o animales

(leche, huesos). Las gomas semisintéticas se pueden obtener también de plantas y

microorganismospero la moléculaobtenidaesmodificadaquímicamentey, por último, están

las gomasobtenidaspor sintesisquímicao gomassintéticas.

Los biopolimerosobtenidosmedianteprocesosmicrobianospresentanciertasventajas

respectoa las queseextraende plantas(Sutherland,1983;Pace,1987; Galindo,1988):

• Su producción no dependede las condiciones climáticas, contaminaciónmarina o

limitacionesde la cosecha.

• La variabilidad en la calidad y cantidaddel producto es menor, ya que las gomas

producidaspor plantasvarian su composiciónsegúnlas necesidadesmetabólicasde las

mismas.

47

IfltlO(hiCCiOfl

• Finalmente,a nivel microbianosepuede realizarunamanipulacióngenéticaque permita

obtenergomascon propiedadesreológicasfijadas,lo cualestálejos de conseguirsecon las

especiesvegetales.

Entre los biopolímeros que están teniendomayor potencial de comercializaciónse

encuentranlos polisacáridosde origen microbiano.Desdefinales de los 50 se han venido

publicandonumerosostrabajossobrela producciónde polisacáridosde origen microbiano,la

mayor parte no explotadoscomercialmente.Las investigacionesque han proporcionado

mejoresresultadosfueron las realizadaspor los laboratoriosN.R.R.L. del Departamentode

Agricultura de Estados Unidos, que a fmales de los 50 comenzaronuna investigación

exhaustivasobrelas aplicacionesindustrialesde biopolimerosmicrobiológicos.El dextrano,

sintetizadopor la bacteriaLeuconostocmesenteroides,fue el primerpolisacáridomicrobiano

producidoy utilizado en la obtenciónde sustituyentesdel plasmasanguíneo.A éstele siguió

el xantano,que luegocobrómuchamayorimportancia.

Los polisáridosde origen microbianoson macromoléculasorgánicasformadaspor

cadenasde monosacáridos,unidos entre si medianteenlacesglucosídicos.Son uno de los

tipos de moléculas naturales más comunesen los seres vivos, siendo frecuentemente

producidaspor bacterias,levaduras,hongosy algas.Susíntesisestárelacionadacon distintas

funciones biológicas, tales como conseguir una reservaenergética,formar parte de las

membranascelulares,actuarcomo barreraprotectoracontrael ataquede virus y anticuerposy

protegeral microorganismode la desecación(Petitt, 1979; Aspinalí, 1982;Pace,1987).

Los polisacáridos,dependiendode la constituciónde la cadena,puedenclasificarseen

honiopolisacáridos,cuandocontienenun único tipo de azúcar,tal como glucosa,fructosao

manosa-como por ejemploel dextrano,el levanoy el escleroglucano-y heteropolisacáridos,

cuandocontienendos o másazúcares,como glucomananoso arábigo-xilanos-como la goma

xantano-.Desdeotro punto de vista, los polisacáridosmicrobianospuedenclasificarse,según

su origen, en tres grandesgrupos (Margaritis y Zajic, 1978): polisacáridosintracelulares,

polisacáridos estructuralesy polisacáridosextracelulares.Estos últimos tienen distintas

funcionesbiológicas;unosson producidospor bacterias,dandolugar a cápsulasmicrobianas

querodeansupared;otros forman unapelículaviscosa,en la parteexteriorde la paredcelular,

quetiene lacapacidadde difundirseal medio líquido dondeseencuentrael microorganismo.

48

Introducción

La ‘goma de xantano”fue descubiertaa fmalesde los 50, como ya se ha indicado, por

los NothemRegional ResearchLaboratories(N.R.R.L.) del Departamentode Agricultura de

los EstadosUnidos,duranteunostrabajosde investigaciónsobrelas aplicacionesindustriales

de polisacáridos microbiológicos y la utilización de excedentesagrícolas. Los estudios

realizadosmostraronque el polisacárido,producidopor la bacteriaXanthomonascampestris

NRRL B-1459, poseíapropiedadesmuy interesantes.Propiedadesquehicieronpensarque el

polisacáridopodríasuplir, por susmejorescaracterísticasreológicas,a otrasgomasnaturalesy

sintéticassolublesenagua(Kennedyy Bradshaw,1984; Kangy Pettit, 1993).

Su importancia industrial se basa en su capacidadde controlar la reologia de los

sistemasde baseacuosa.incluso a bajas concentraciones,las solucionesde gomade xantano

presentanun alto gradode viscosidad,en comparacióncondisolucionesde otrospolisacáridos,

como carboximetilcelulosa,gomade guary de garrofin (Rocks,1971; Cottrell y Kang, 1978;

Pettit, 1979;Casas,1989).

Las solucionesde xantanotienengranestabilidady compatibilidadcon sales,excepto

con ionespolivalentesa valoreselevadosdel PH (Margaritis y Zajic, 1978). Las soluciones,

especialmenteen presenciade electrolito, tienen una estabilidadtérmica excelente,y su

viscosidad,en presenciade cantidadesmoderadasde electrolito (0,1%NaCí),esindependiente

del pH enel intervalode 5 a 9 (Margaritisy Zajic, 1978).

El xantanopresentauna gran cantidadde aplicacionesindustriales,debidoa la alta

viscosidad que proporciona en disolución, incluso a bajas concentraciones,siendo la

consistenciade dichasdisoluciones muy estableen amplios intervalosde temperatura,pH y

pK (Margaritis y Zajie, 1978).Por ello, presentaun amplio abanicode aplicacionesen gran

cantidadde industrias.En la Tabla 1.2 serecogenlas aplicacionesmásimportantesde la goma

xantano.

En general, las casas comercialesestablecendos calidades del producto: grado

alimentarioy gradotécnico. Supresentaciónes generalmenteen forma de sólido, aunqueen

aplicacionesespecíficasen el campo de la recuperacióndel petróleo utilizan caldos de

fermentaciónclarificados.De cualquierforma, el xantanodebecumplir una seriede requisitos

referentesa suscaracterísticasfisicasy químicas.

49

Introducción

TABLA 1.2.- Aplicacionesdel xantanoen los diferentestipos de industrias.

INDUSTRIA APLICACION GONG~TRAC[ON PUNCIONES

ALIMENTARIA

Aderezos para ensaladas 0,1 - 0.5 adherencia; mantiene en suspensión lasProductos de pasteleria y panadería 0,1 - 0,4 Retiene el agua, mejora la textura

Bebidas 0,05-0,2 Mejora la palatabilídad, estabíliza

Productos instantáneos 0,05 - 0,2 ~ea dar cuernosolubijidad enfrío yen ca ente

Alinsentos enlatados 0,1 -0,3 Control de viscosidad durante elprocesado

Sopas, salsas yjugos 0,05- 0,5 Mejora la textura, contribuye a darcuerno

Helados ~ alimentos congelados 0.05 -0,2 Controla la formación de cristales;contribuye a la textura crenlosa

Confitería 0,1 -0,4 estabilidad térmica, facilitaProporciona el procesado

Productos lácteos 0,05 - 0,2Inhibe la sinéresis; estabiliza la

emulsión

Productos dietéticos 0.3 - 0,5 Mejora la textura, estabiliza. bajocontenido calórico

Productos cárnicos 0,2- 0,5 Estabiliza; retiene el agila; inhibe lasinéresis

COSMETICA

Pastas dentífricas 0.7-1,0 Proporciona fácil extracción de lostitos y buena permanencia en eí cepilloCremas y lociones 0,2 -0,5 Estabilíza las emulsiones, proporciona

consistencia cremosa

Champúes 0,2- 0,5 Controla la reologia

FARMACEUTIGA

Suspensiones y emulsiones 0,1- 0,5Estabiliza las emulsiones y proporciona

estabilidad frente a las fluctuacionestérmicas

Tabletas- o,s- ~o ingredientes activosProlos~a•efliempo decontactodelos

ALINIENTACIONANIMAL.

Sucedáneos de leche 0,05-0,2 Estabíliza la suspensión de losingredientes insolubles

Alimentos enlatados para animalesdomesticos

0.1 -0,4 Evita la sinéresis, contnbuye a darcuerpo a los jugos

VARIOS

Productos agroquimícos 0,1 -0,3 Suspende los ingredientes activos;controla la adherencia del escurrido

Limpiadores y pulimentos 0,2-0,7Proporciona estabilidad frente a valoresextremos de pH, prolonga el tiempo de

contacto

Pinturas 0,1-0,3 Controla lareologia

Estampado de textiles y alfombras 0.2 -0,5

Controla la migración el color; mejora

el procesadoAdhesivos 0,1 -0,3 Controla la penetración

Industria papelera 0,1 -0,2 Conírola las propiedades de flujo

Mineria 0,1-0,3Controla la sedimentación en procesosde separación, mejora la estabilidad de

la espuma

Tintas 0,05-0,1 Controla la reologia

Esmaltes cerámicos 0,3 - 0,5 Proporciona buena estabilidad desólidos en stispensión

EXTRACCIONDEL

PETROLEO

Perforación 0,1-0,4 Proporciona buena estabilidad frente ala sal, temperatura y cizallado

Recuperación forzada del petróleo 0,05-0,2 Confiere estabilidad, buena movilidad yelasticidad en la inyección de polimeros

.50

Introducción

En cuanto al proceso de producción y purificación, el xantano se obtiene

industrialmentemedianteun procesode fermentaciónsumergidadesarrolladoen los años

sesenta. En la Figura 1.9 se muestra esquemáticamente, el diagramade producciónpara la

obtención del polímero. El desarrollo del proceso se puede resumir en las siguientes fases:

• Produccióndel polisacárido

• Aislamientoy purificación

• Producción del polisacárido: para llevar a cabo el proceso, son necesariasunas

etapasprevias,como la conservación,mantenimientoy crecimientode la bacteriacon

el fin de prepararel inóculo que se emplearáposteriormenteen la citadaproduccion.

En cualquieretapa del proceso,es fundamentalmantenerla esterilidadpara evitar

posibles contaminaciones.Las etapasde conservación de la cepa, así como el

crecimiento del microorganismo,son criticas en el proceso,ya que el estadodel

microorganismoen el reactorinfluirá de formanotable,tantoen la duraciónde la fase

de latenciadurantela produccióncomo en la calidaddel xantanoque se obtenga.Las

condicionesde fermentaciónson muy importantes,ya que tanto el crecimientode la

bacteriacomo la biosíntesisdel xantano se encuentranafectadaspor numerosas

variables(Santos1993,García-Ochoay col., 1997): el inóculoprevio, la composición

del medio de cultivo, la aireacióny agitacióndel medio, el pH del mediode cultivo y

la temperaturade fermentación

• Aislamiento y Purificación: una vez obtenido el caldo resultante,es precisa la

eliminación de las bacteriasdel mismo paraposteriormenteobtenerel xantano.Es

necesanaunaetapade desactivacióny eliminaciónde lasbacterias-pasteurizacióny

posteriorclarificación-, seguidade la obtencióndel xantano,generalmentemediante

precipitacióncon disolventesorgánicos.La repercusióndel costede estaetapa,sobre

el coste final del proceso es muy importante,debido a que los caldos son muy

viscosos y el mezcladocon cualquierreactivonecesitaun aportede energíaelevado,

siendo necesariala dilución en algunasetapasdel proceso.El xantano se somete

posteriormentea tratamientosde lavado,secadoy molienda,siendonecesarioevitar

efectos como la degradación,la decoloracióno la pérdidade solubilidadque puedan

afectara la propiedadesfisico-quimicasdel polisacárido.

si

Introducción

BACTERIAXanlwmonas campestris

ESTERIL IZAC IÓN

r

rMEDIO de PRODUCCIÓNSustratos (C,N)Nutrientes:

MacroNIlero

r

CALDO DE FERMENTACIÓN

YPASTEURIZACIÓN

Física,Quimica y/o Enziinática

CLARIFICACIÓNFiltración, Centrifugación

PRECIPITACIÓNAlcoholes,Sales,Mezclas

FILTRACIÓN

LAVADO, SECADO, MOLIENDA

¡ XANTANO

—PROPIEDADES

Figura 1.9.-Esquemadel procesode produccióndel xantano

CONSERVACIÓNy

MANTENIMIENTO

CRECIMIENTO

MedioComposiciónTemperaturaTransporte de 0~

4INÓCULO

Volumen1 Fasesen la preparación

BIORREACTORTemperaturaPH, controlOxígenodisuelto

- Caudal- Agitación

1

HumedadCenizasNitrógenoAcetatoPiruvatoPesoMolecular

VISCOSIDAD

52

Introducción

La estructuraquímicade la moléculade xantanoesbásicamentesimilar a la molécula

de celulosa.La gomade xantanocontienemanosa,glucosay ácidoglucurónico.Cadabloque

repetidocontienecinco unidadesde azúcar-dos unidadesde glucosa,dos unidadesde manosa

y una unidadde ácidoglucurónico-queformanunacadenaprincipaly unacadenalateral (ver

Figura 1.10).La cadenaprincipalestá constituidasobreunidadesde B-D-glucosaenlazadasa

travésde las posiciones1 y 4, como sucedeen el casode la moléculade la celulosa.La cadena

lateral consisteen las dos unidadesde manosay la unidad de ácidoglucurónico.La unidad

terminal<3-D-manosaestáunida glicosidicamentea la posición4 del ácido glucurónico,que

vuelvea unirse glicosídicamentecon la posición2 de la ct-D-manosa(Janssony col., 1975;

Kennedyy Bradshaw.1984). Estacadenalateralde tres azúcaresse une a la posición 3 de

cualquierotro residuo de glucosa de la cadenaprincipal. La distribución de las cadenas

lateraleses desconocida.Alrededor de la mitad de los residuosde D-rnanosaterminales

contienenun residuode ácidopirúvico,unido vía grupocetoa las posiciones4 y 6 de la citada

moléculade azúcar. La distribución de estos grupospiruvato también es desconocida.La

unidadD-manosatenninalcontieneun grupo acetiloen la posición6 (Kennedyy Bradshaw,

1984). Debido a la presenciade las unidadesde ácido pirúvico y ácido glucurónico en la

molécula,el xantanoesun polisacáridoanioníco.

La distribuciónde pesosmoleculareses amplia, el pesomoleculardel polímero varía

entre 2.106 y 20.106 Daltons. En disolución acuosa,a baja temperatura,presentaun ficticio

mcrementoen el peso molecular, como consecuenciade la tendenciaque tienen estos

polimerosa formar estructurasordenadasde las moléculasen disolución (estructuraterciaria).

En el xantanose han detectadodos conformaciones-hélice y ovillo-, dependiendode la

temperaturade disolución(Hortony col., 1985; García-Ochoay Casas,1993).

El hecho de que se trate de un polisacárido ramificado explica, en parte, la

extraordinariacapacidadespesantey de estabilidadquepresentanlas disolucionesacuosasde

estagoma,lo quehahechoquesus aplicacionesindustrialesseanmuy amplias,incluyendola

industriaalimentaria,la recuperaciónforzadadel petróleo,la industriapapelera,etc, como ya

se ha indicado previamente.Existen diversosderivadosdel xantano tales como xantano

desacetilado,carboxymetil éter y el propilen-glicol éster. Sin embargo,hasta el momento,

ningunode ellos tienela importanciaindustrialdel biopolimero(Kangy Pettit, 1993).

53

Introducción

CH2 OHCH2 OH 1

:oo M o

cCH3

Figura 1.10.-Esquemade la moléculade xantano

Se han realizado muchos trabajospara estudiary optimizar las condiciones de

producciónindustrial del biopolímero(Moraine y Rogovin, 1966, 1971,1973;Cadmusy col.,

1978; Davidson, 1978; Kennedy, 1982; De Vuyst y col., 1987ay 1987b; Hasslery Doherty,

1990; Shu y Yang, 1991; Santos, 1993; García-Ochoay col., 1995a). Los procesosde

producciónpuedensermejoradoscon el conocimientode la rutade síntesisdel xantanopor la

bacteria Xanthonzonascampestris. Sin embargo, en la actualidad, es aún limitada la

informaciónexistentesobrela síntesisde xantano,ya que setratade un procesocomplejoen el

queintervieneun sistemamultienzimático(Santos,1993).

Sutherland(1977)generalizala síntesisde polisacáridosextracelularesindicandoque

se lleva a cabo en cuatro grandesprocesos:consumode sustrato,formación de intermedios

metabólicos,produccióny modificación del polisacárido.En la Figura 1.11 se muestrael

mecanismopropuestoparala biosíntesisdel xantano(Sutherland,1977; Pace,1980; Kennedy

.54

r

co~

OH

- Na, K~, 112 Ca2

Introducción

1.11.-Xantlwinonascampestris

Xanthomonasesun génerode la familia Pseudomonaceae.Sonbacilosrectosaislados,

quemiden de 0,4 a 0,7 ~mde anchoy de 0,7 a 1,8 vm de largo. No poseenvainani seconocen

estadosde reposo.SonbacteriasGram negativasmóviles, ya que poseenun flagelo polar.

Estosmicroorganismossonaerobiosobligadosy sumetabolismoesestrictamenterespiratorio,

nuncafermentativo. Son bacteriasno desnitrificantesy no reducenlos nitratos, son catalasa

positivasy oxidasanegativas(Bradbury, 1984), formancoloniasusualmenteamarillas,lisas y

viscosas.

La cápsulade estetipo de bacteriasno presentaunaestructuraespecial,por observación

microscópicacon técnicassimplesde tinción. Sin embargo,la tinción capsularcon tinta Indio

ha llevado a observarcápsulasen muchoscultivos de Xanthomonasy especialmentede X

campestris(Bradbury, 1984).La producciónde grancantidadde estospolisacáridoscapsulares

-o gomadexantano-se llevaacabocuandoseempleanmediosricos enhidratosde carbono.

En cuantoa la pared celular, es similar a otras células Gram negativas.Ya se ha

comentadoqueposeenun solo flagelo, observablepor tinción y en microscopioelectrónicoen

cultivosjóvenes.Su longitudsueleser de 1,79 j.tm, pero ocasionalmentevariaentre2 y 3 gm.

No se ha observadopiti enXanthomonas,peroestono indica la ausenciade estasestructuras.

En lo referentea pigmentos,la mayoríade las bacteriasdel géneroXanthomonaspresentan

pigmentosamarillos-denominadosxanthomonadinas-,que son polienosaril-bromados.En la

Figura 1.12. se puedeobservaruna fotografia deXanthomonascampestrisrealizadamediante

MicroscopiaElectrónicade Transmisión(MET) donde se apreciauna célula en la fase de

división, y se ve claramenteel flagelo polarasícomola morfologíade la bacteria.Las especies

de Xanthomonasson quimioorganotrofas,son aerobiasestrictasy empleanel oxígenocomo

aceptorde electrones.Sonbacteriasoxidasanegativas,capacesde creceren un medio sintético

puro, conteniendominerales,nitrógeno amónico y una fluente de carbono como glucosay

suplementode aminoácidos(Bradbury, 1994).

.56

Introducc,ón

y Bradshaw, 1984; Sutherland, 1985). Hay que destacar la importancia de los lípidos

intennediosde la síntesis,queparecenserlos quetransportanel monómerodexantanohastala

membranacelular y graciasa ellos,se unena diferentesmonosacáridosparala formacióndel

esqueleto carbonado(Sutherland, 1975 y 1977). El residuo de piruvato proviene del

fosfoenolpiruvato(P.E.P)- obtenidogeneralmentepor vía de Entner-Doudoroff,quees la ruta

por la que la bacterialleva a caboel metabolismode la glucosa(Bradbury, 1984: Ponsy col.,

1989)-uniéndose,finalmente,al esqueletocarbonadoya formado(lelpi y col., 1981ay 1981b).

SicGP —.-—*GIc—1P

LIPIDO—PUDP— SIc

¡ UMPSic LIPIDO—P-P-G(c

¡DF- ¡DF

UDP-Ac SIc LIPIDO-P-P-Gíc-GIc

Entier GP—*Man- GP—*ManLIPIDO-P-P-GIc-GIc-Man

Doudoroff 1 ¡

PEP

LIPIDO-P-P

UD PLíPIDO- P-P-GIc-Glc- Man

Ac- Sic

LIPIDO-P-P-GIc- Sic-Man

- Ac-Gk

Many,

1 r

LIPIDO-Glc- Sic- Man- Ac-GIc

PYR= Man

MONOMERO DE XANTANO

1— Sic- Sic—

Man

Ac Sic

Mcin= Pyr

Figura 1.11.- Esquemade reaccionesde la síntesisde xantano.

55

Introducción

Figura 1.12.-Fotografia de XanthomonascampestrisrealizadamedianteMET (12000aumentos).

En cuantoal metabolismode carbohidratos,oxidanla glucosa,siendola rutade Entner-

Doudoroff la predominanteen el catabolismode la glucosa,solo desvíande un 8 a un 16% de

la glucosaa la ruta de las pentosasfosfato. El ciclo de la hexosano se emplea de forma

significativa. Tantoel ciclo del ácidotricarboxilicocomoel ciclo del glioxilato estánpresentes

entodo el géneroXanthomonas(Bradbury,1984).

El xantano se produce por bacterias del género Xanthomonas; aunque es,

principalmente,la especieXanthomonascampestris, la másestudiaday empleadaparallevar a

cabola producción.Se ha observadola síntesisde polisacáridossimilaresal xantanoa partir de

otrasespeciesde Xant/zomonas(Slodki y Cadmus,1978). A partir deXi mannihotisseobtiene

un polisacáridoformadotambiénpor D-glucosa,D-manosa,ácidoglucurónicoy ácidosacético

y pirúvico, aunqueen diferentesrelacionesmolares,obteniéndoseun 2,2% del polisacáridoa

57

Introducción

partir del 4 al lOOo de azúcar.Si se empleaAl phaseolise puedeLlegar aobtenerhasta10 gIL

de una gomade característicassimilares, con una composiciónsimilar, al xantano.pero con

diferente relación molar entre los azúcares que lo forman. Otras especies, como Xi

ma!vacearurn,Xi heredae,Xi papavericolay Xi vesicatoria,producenpolisacáridosformados

por las mismasunidadesde azúcar(Margaritis y Zadic, 1978; Bradbury, 1984). Es la goma

sintetizadaporXsrewartii la quepresentaunaclaradiferenciacon el resto,ya que las unidades

de azúcarque la forman son D-glucosa,D-galactosay ácidoglucurónico(Slodki y Cadmus,

¡978). La mayoría de las bacteriasdel género Xanthomonasproducen una familia de

polisacáridosextracelulares,cuyo papel pareceser protegera las células de la desecacióny

otrascondicionesadversas,ya que es,en realidad,la cápsulabacteriana(Bradbury, 1984).En

la Tabla 1 .3 seresumen¡a composiciónde diversosbiopolímerossintetizadospor diferentes

especiesdel géneroXanthomonas.

Tabla 1.3.-Composiciónmedia(en porcentaje)de Los diferentespolisacáridossintetizadosporLas bacteriasdel géneroXanthomonas(Kennedyy Bradshaw,1984).

Especie O-Glucosa 0-Manosa Ac. D-Glucurónico Piruvato Acetato

36 campestrus 30.1 27,3 t4.9 7.1 6.5

36 olbilíneans/739” 30,2 27,5 13.9 53 5.8

36 a/ti lineans2257 25,2 26,1 14,2 5.8 5,1

X wconopodis 457 30,6 28,6 13,7 7,2 5,5

36 fregaría1469” 32,5 28,5 15,1 7.0 3,9

XIfragarza1822 24,6 26,1 14,0 4.9 5.5

36 gurnnñsucians 2182 34,8 30,7 16,5 4,7 10,0

Xjug/andis 411 33.2 30,2 16,8 6,9 6,4

36 inanihotis 4459 33,3 28,7 16,7 7.6 6,8

36 phaseoli 556 29,1 34,2 17,8 7,7 1,8

36 phaseoli1/28 30,9 28,6 15,3 1,8 6,4

36 vu.scuíomm 702 34.9 30,2 17.9 6,6 6,3

36 vascularum 796 22.2 26,2 15,3 5,4 8,8

acontiene O-Galactosa

58

Introducción

Como ya se ha comentado, la especiemásampliamenteutilizada para La producción

de xantanoes Xanthomonascampestris. Aunque estabacteriano es dificil de cultivar en

mediosestándarde laboratorio,se hanobservadovariacionesen las cepas,tanto en cultivo en

continuo(Silman y Rogovin, 1972),comoen discontinuo(Cadmusy col., 1976),queafectana

la calidady al rendimientodel xantanoproducido.

Se han descritotrestipos diferentesde cepasde estabacteria(Slodki y Cadmus,1978;

Cadmusy col., 1976 y 1978;Jeanesy col., 1976;Kidby y col., 1977):

• CepaL (Large):presentacoloniasmucoidesamarillasbrillantes,de 4 a 5 mm

de diámetro.Proporcionabuenrendimientoen xantanoy con un nivel alto de

piruvato(tambiéninfluye el mediodeproducciónempleado).

• CepaSm (Small): coloniasmucoidesde color amarillo más oscuroque la

cepa L y de unos 2 mm de diámetro. Proporcionamenor rendimiento en

xantanoque lacepaL y con menorcontenidoenpiruvato.

• CepaVs (Very Small): producecoloniasno mucoides,de color indefinido y

de un diámetromáximode 1 mm. No producexantanoapreciablementey no es

muyfrecuente.

Pareceque las cepasSmy Vs se producenpor degeneraciónde la cepaL; normalmente

debido a un envejecimientodel cultivo, que puede ser aceleradopor una conservación

deficiente. Por lo tanto, es necesariomantenerla bacteriacomo cepa L, para obtenerun

xantanocon buenaspropiedadesy con buenrendimiento.

1.3.2.-ProduccióndeXantano

Un factorimportanteateneren cuentaesel estadodel microorganismoempleadocomo

inóculo en la producción,puesafectaa la duracióndel procesoy a la composicióndel xantano

obtenido.Los diferentesautoreshan abordadoesteproblemacreandoun inóculo a partir de

variosciclosde crecimiento,esdecir, en etapas(Rogoviny col., 1961; Sumany Rogovin, 1970

y 1972; Morainey Rogovin, 1971; Cadmusy col., 1976 y 1978; De Vuyst y col., 1987ay b;

59

In/toducción

Petersy col.. 1989: Pons y col., 1989 y 1990; Santos, 1993). El tiempo necesariopara la

preparacióndel inóculo estáinfluido por la composicióndel medio empleadoparael desarrollo

del microorganismo-algunosautoresvarian la composiciónde una etapaa otra (Rogovin y

col., 1961; Cadmusy col, 1978; Petersy col., 1989; Ponsy col., 1989) - y por la temperatura

empleadaparael crecimientode Xi campestris,existiendoun intervalo óptimo de 25 a 30 0C,

parallevarloa cabo(Thonarty col., 1985; Shuy Yang, 1990).

En trabajosprevios (Santos, 1993), tras un cuidadosoestudio,se ha concluidoque el

móculo deberealizarseen dosetapas,paraque de estemodo el microorganismose aclimatea

las condicionesdel fermentador,tanto al medio como a la agitaciónmecánica.La primera

etapadel inóculo consisteen incubar el microorganismoen tubo de ensayocon medio YM,

durante12 horasa 280C y 210 r.p.m., para,acontinuación,pasarloa un Erlenmeyercon medio

YM-T e incubarlo durante6,5 h, a28 0C y 210 r.p.m..

El medio de producción empleadoen los primeros estudiosrealizados sobre la

producciónde xantano(Rogovin y col., 1961 y 1965) era de tipo complejo; se empleaban

sustanciasabundantesen EstadosUnidos para probar la síntesisdel polisacárido(azúcarde

maíz, CSL, etc.). El desarrollodel proceso de producciónha llevado a la propuestade

diferentestipos de medios,entrelos quetodavíaseencuentransustanciascomplejas,cornoson

lapeptona(Kennedyy col., 1982;Pinchesy Pallent,1986; Leey col., 1989; Ponsy col., 1989

y 1990), extracto de levadura(Pons y col., 1989 y 1990; Shu y Yang, 1990 y 1991), CSL

(Kennedyy col., 1982; De Vuyst y col., 1987ay b), extractode Pharmamedia(Pattony Dugar,

¡981) y DDS (Moraine y Rogovin, 1971; Silman y Rogovin, 1972; Cadmusy col., 1976;

Kennedy y col., 1982). Sin embargo,en general,paramejorarel sistemade producciónde

xantano,podercontrolar las concentracionesde los diferentesnutrientesque seincorporanal

medio y observar su influencia en el proceso, se suele trabajar con medios sintéticos

(Davidson, 1978;Cadmusy col., 1978; Souwy Demain, 1979 y 1980; Trilsbachy col., 1984;

Tait y col., 1986; Petersy col., 1989; Schweickarty Quinlan, 1989;Suhy col., 1992).

Las fuentesde carbonomásampliamenteutilizadassonglucosay sacarosa(Morainey

Rogovin, 1966y 1971; Silman y Rogovin, 1972; Cadmusy col., 1976 y 1978;Davidson,1978;

Souw y Dennin, 1979 y 1980; Kennedyy col., 1982; Trilsbachy col., 1984; Thonarty col.,

1985; Tait y col., 1986; Pinchesy Pallent, 1986; Funahashiy col., 1987; De Vuyst y col.,

1987ay b; Lee y col., l989; Petersy col., 1989; Qadeery Baig, 1989; Vashitzy Sheintuch,

60

Introducción

1991; Zaidi y col., 1991; Suh y col.. 1992). Sin embargo, parece que es la sacarosa,en

concentraciónentre20 y 40 gIL, la que proporcionamejoresresultados(Souw y Demain,

1979; Funahashiy col., 1987;De Vuyst y col., 1987a;Santos,1993).

Respectoa! nutriente nitrogenado a emplear en la producción, existe una gran

discrepanciaen la literatura;mientrasquehay autoresquedestacanel efecto beneficioso,sobre

la producción del polisacárido, de fuentes nitrogenadasorgánicaso complejas(Souw y

Demain,1979y 1980; Kennedyy col., 1982; Qadeery Baig, 1989), otros autores comentan

que es mejor, para el transporteen el caldo, cuantomenory más sencilla sea la molécula

empleada(Slodki y Cadmus, 1978). La idea general sobre el sustratonitrogenadoparece

indicar que se debe emplear un compuesto orgánico (urea, ácido glutámico) o sustancias

complejas (CSL, DDS).No obstante, Santos (1993) realizó una comparación de [aproducción

obtenida cuando el nitrógeno se añade al medio de fomia inorgánica, como amonio y cuando

la frente nitrogenada es de naturaleza orgánica, observando que, para la misma cantidad de

nitrógeno, la cantidad de xantano producida con amonio era mayor que cuando se incluía una

fuente nitrogenada de naturaleza orgánica.

En cuanto al resto de los nutrientes, su incorporación al medio se suele realizar de

forma sintética, con compuestos inorgánicos; excepto en los casos en los que la sustancia

compleja empleada como fuente nitrogenada (DDS) incorpore las cantidades necesarias de los

citados nutrientes.

En los medios de producción se suele incorporar ácido cítrico, ya que se ha

comprobado el efecto beneficioso en la producción de ciertos ácidos orgánicos añadidos en

pequeñas cantidades en el medio (Souw y Demain, 1980; Trilsbach y col., 1984).

La composición del medio fue optimada en trabajos previos (García-Ochoa y

col., 1992; Santos, 1993) mediante diseño factorial de experimentos. La composición de

este medio aparece detallada en el capitulo 2 de esta Memoria y ha sido el medio empleado

para la producción de xantano en el presente trabajo en todos los experimentos. La

concentración óptima de amonio es de 0,257 gIL, concentraciones superiores pueden

ocasionar un efecto tóxico en las células, pudiendo verse afectado tanto el crecimiento como

la producción de xantano. Sin embargo, por motivos que luego se explicarán, la

concentración de la fuente nitrogenada ha sido variada. En cuanto a la fuente de carbono se

61

Introduccían

ha empleadosacarosaen una concentraciónde 40 gIL, la cuales lo suficientementeelevada

para favorecer la síntesis del polisacárido, pero no para tener efecto negativo en la

producciónpor inhibición delcrecimiento(Souw y Demain,1979).

El resto de variables que influyen en el procesode producciónson: temperatura,

agitación, caudal de aire y pH. En la Tabla 1.4 se muestralas condicionesde operación

empleadaspor diferentesautoresen biorreactorestipo tanqueagitado.

Tabla 1.4.- Condicionesde operaciónempleadaspor diferentesautoresparallevar a cabolaproducciónde xantanoen un tanqueagitado.

Autores V(L) Q(L/L/min) N(r.p.m.) T(0C) pH1

Cadinus y col. (1978) lO 1.5 225-300 20-30 6.8(control)

Rogovinycol(1965) 2272268

0.5 90-29030-250

28 7

Moraine y Rogovin 0966) --- 1 1000 28 7

Moraine y Rogovin (1971) 8 1 500-1000 28 72.1(control)

Moraine y Rogovin (1973) --- --- --- 28 (

(control)Souw y Desnain (1980) --- 0.5 500 25 (

(control)

PinchesyPallent(1986) 102.5

0,4 6001000

30 ((control)

De Vuysty col. (1987) 6 1 250-700 28 7

Funahashly col. (1987) 6 1 350-1200 30 7

Peters y col (1989) --- 0.3 200-800 28 ((control)

ShuyYang(l990) --- 1.16 800 20-34 ((control)

¡ Pons y col. (1990) 3.6 0,3, 0.6 500-900 29 6.9(control)

Kennedyy col. (1982) 3.5 0.5 400-600 30 ((control)

SchweikartyQuinlan(1989) 1.2 1 300-1300 26 (

(control)

Santos(1993) 1,5 1 210-1300 28 7

Comopuedeapreciarseen la tabla, la temperaturaque se debeemplearparallevar a

cabola producciónse encuentraen el intervalo de 25 a 33 0C. La gran mayoríade los autores

empleanla misma temperaturaen la preparacióndel inóculo que en la producción(Rogovin y

col., 1961 y 1965; Moraine y Rogovin, 1966, 1971 y 1973; Sumany Rogovin, 1970 y 1972;

Davidson, 1978; Souwy Demain,1979 y 1980; Kennedyy col., 1982; Trilsbachy col., 1984;

62

Introducción

Pinches y Pallent, 1986; Tait y col., 1986; Funahashi y col., 1987, De Vuyst y col., 1987a y b;

Petersy col., 1989; Lee y col., 1989; Qadeery Baig, 1989; Ponsy col., 1989 y 1990; Zaidi y

col., 1991; Suh y col., 1992). Sin embargo,se ha propuestoel empleo de temperaturas

diferentesen ambasetapasdel proceso(Thonarty col., 1985; Shuy Yang, 1990 y 1991).

En trabajosprevios (Santos,1993 y García-Ochoay col., 1997)se determinóque la

temperaturaóptima para la producciónde xantanoes 28 0C, si bien no existe una gran

diferenciacon la temperaturade 310 C.

Debido a que Xanthomonascampestrises una bacteria estrictamenteaerobia, la

transferenciade oxígeno en la fermentación se convierte en una variable de gran

trascendencia.En cadatipo de reactorlas variablesde operaciónquepuedenafectara la citada

transferenciade oxígenosondiferentes.Como el reactormásempleadoparala producciónde

xantanoesel tipo tanqueagitado,las condicionesde operaciónquemásinfluyen sonel caudal

de aire y la agitación.

Aunquelos valoresdel caudaldeaíreempleadosson dispares(de 0,3 a 1,5 L/L/min),

todos los autoresmantienenconstantela citadavariable.Portanto, la transferenciadel oxígeno

en el caldo dependeúnicamentede la velocidadde agitación.Sobreesta última variable

citada,hay dos tendencias:por una partehay autoresque la mantienenconstantedurantetoda

la fermentación(Souwy Demain, 1980; Pinchesy Pallent, 1986; Shu y Yang, 1990 y 1991),

mientrasque otros la van aumentandoa medidaqueaumentala viscosidaddel caldo (Rogovin

y col., 1961 y 1965; Moraine y Rogovin, 1971; Cadmusy col., 1978; Kennedyy col., 1982;

Funahashiy col., 1987;De Vuyst y col., 1987ay b; Schweickarty Quinlan,1989; Ponsy col.,

1990).

Diversos autores (Santos, 1993) han propuesto que la velocidad de agitación

empleadadebe ir incrementándosea medida que aumentar la viscosidaddel caldo, para

mejorarla transferenciadel oxígeno,ya que los microorganismosseencuentranrecubiertosde

una capade polisacáridoque evita surotura por efectode la elevadavelocidadde agitación,

que es necesarioalcanzarpara mantenerla concentraciónde oxígeno disuelto a niveles

adecuados.Paraun caudalde aire constantede 1 L/L/min, la velocidadde agitacióninicial

debeserde 210 r.p.m. y tiene que ir aumentandoa medidaque crecela viscosidaddel caldo

enel biorreactor,hastaalcanzarun valorentre800 y 1000 r.p.m..

63

Introducción

Finalmente, respecto a la última de las variables citadas anteriormente,el pH,

únicamenteThonarty col. (1985)proponenrealizarla preparacióndel inóculo aun valor de 5,

el restode los autorescomienzanla fermentaciónpartiendode un inóculo crecido a pH cercano

al neutroy con el medio de producciónajustadotambiéna un valor cercanoa 7. La diferencia

entre unos trabajosy otros radicaen controlar o no estavariabledurantela fermentación,e

incluso se estudiala mejor basea emplearpara realizarel citado control. Hay autoresque

señalan,de forma especial,el beneficiodel control del pH durantela fermentación(Moraine y

Rogovin. 1971), mientrasque otros autoresúnicamentetrabajanempleandoel citado control,

pero sin comentarsi esta variable ha sido o no estudiada(Cadmusy col., 1978; Davidson,

1978; Souw y Demain,1980; Pattony Dugar, 1981; Pinchesy Pallent, 1986; Tait y col., 1986;

Robinsony Wang, 1988; Ponsy col., 1989; Lee y col., 1989; Petersy col., 1989; Schweickart

y Quinlan, 1989; Shu y Yang, 1990 y 1991; Suh y col., 1992). Moraine y Rogovin (1971)

señalanla mejoríaque suponeel empleo de hidróxido amónico como álcali para realizar el

controldel pH.

En la literatura,sin embargo,existetambiénun grannúmerode trabajosen los que

serealizala fermentaciónsin llevar a cabo el control del pH (Rogovin y col., 1961 y 1965;

fvloraine y Rogovin, 1966; Sumany Rogovin; 1970 y 1972; Souw y Demain,1979; De Vuyst

y col., 1987a y b; Funahashiy col., 1987). Santos(1993) y García-Ochoay col. (1997)

proponenrealizar la producciónsin control de pH pues no resultabeneficioso para la

producción.Durante el periodo de crecimiento,el pH del medio prácticamentesemantiene

constanteen estevalor, pero al llegar a la faseestacionariade crecimientoel pH disminuye,

si secontrolaestavariable la producciónsedetiene.

Finalmente,en la Tabla 1.5 semuestrala comparación entrela cantidadde xantano

producido,así como el rendimientoobtenido,en las condicionesempleadaspor Santos(1993)

en comparacióncon otrosautoresen tanqueagitadoy en discontinuo.Comopuedeobservarse,

Shuy Yang (1990) obtienenmejor rendimientoen xantanoqueel obtenidoen dicho trabajo,

pero la concentracióndel polisacáridoobtenidapor estosautoresesapenasla mitad que la

obtenidapor Santos(1993), siendo un factor más importantellegar a una concentraciónde

xantanoelevada. Sólo Funahashiy col. (1987) han obtenido la misma concentraciónde

xantano,perohannecesitadoun díamásdetiempode fermentación.

64

Introducción

Desdeque se comenzóa estudiar la síntesisdel xantano, su producciónse ha

llevado a cabo en reactorestipo tanqueagitado, realizándosela operación de forma

discontinua.Existen, desdeentonces,una gran cantidadde trabajosque, incluso en la

actualidad, siguen llevando a cabo la fermentación en las mismas condiciones de

operacióny tipo de reactor(Rogovin y col., 1961 y 1965;Moraine y Rogovin, 1966, 1971

y 1973; Cadmusy col., 1976 y 1978; Souwy Demain,1979y 1980; Kennedyy col., 1982;

Thonart y col., 1985; Dussapy Gros, 1985; Pinches y Pallent, 1986; De Vuyst y col.,

1987ay b; Funahashiy col., 1987; Petersy col., 1989; ShuyYang, 1990 y 1991; Ponsy

col., 1990).A partir de los años70 comenzarona realizarseestudiosparallevar a caboel

procesoen continuo (Silman y Rogovin, 1970 y 1972; Davidson, 1978; Pattony Dugar,

1981; Trilsbachy col., 1984; Tait y col., 1986; Leey col., 1989),aunquela produccióna

escalaindustrial se siguerealizandoen operacióndiscontinua,ya que elproblemaesevitar

la contaminacióndel cultivo con microorganismosindeseables(Kennedy y Bradshaw,

1984) y la degeneraciónde las cepas.En los últimos años,han comenzadoa realizarse

trabajosen reactoresdiferentes al tanqueagitado, como son columnasde burbujeoy

airlifts (Ponsy col., 1989 y 1990; Zaidi y col., 1991; Suh y col., 1992), los cuales,según

estosautores,presentanventajas en algunosaspectosrespectoa los de tanqueagitado

mecánicamente,como menor stress hidrodinámico, aumento en la velocidad de

transferenciade materiay calor,mejorescondicionesde mezclay menoreslimitacionesen

el cambiode escala.Inclusose han empleadoreactoresprototipo, como esel T.O.R.U.S.

(Krebser y col., 1988), llevándose a cabo el proceso, en todos los casos,de forma

discontinua.En trabajosprevios (Santos, 1993; García-Ochoay col. , 1997), se ha

empleadoun tanqueagitadoen operaciónen discontinuo.La Tabla 1.6. muestrade forma

comparativalos resultadosobtenidospordiferentesautoresquellevana caboel procesoen

diferentestipos de biorreactores,apareciendotanto la concentraciónde xantanoalcanzada,

como el rendimientodel procesoy el tiempo en que se alcanzala concentraciónque se

especifica.

65

!ntíoducc¡on

Tabla 1.5.- Producciónde xantano y rendimientosobtenidostrabajando en tanque agitado y aereado

por los diferentes autores

Autores t(h) P(g/L)

Cadmusy col. (1978) 46 72-96 14

Rogovinycol.(1966) 67 96 15

Morainey Rogovin(1966) 70 96 15

Morainey Rogovin(1966) 73 40 14.6

Morainey Rogovin(1966) 75 96 29

Souwy Demain(1980) 50 60 10.5

Pinchesy Pallent(1986) 76 45 ¡‘7

DeVuystycol.(1987) 75 144 27.9

Funahashiy col. (1987) 96 30

90 18.5

52 19

50 13

Kennedyy col. (1982)

Schweikarty Quinlan(1989)

Santos(1993)

Producción de xantano y rendimientos obtenidos en diferentes trabajosen operación discontinua y diferentes clase de biorreactores.

Autores X’p ~ t (h) Cp (g/L) Fermentador

Ponsycol., 1990=9 80 12 ColunnadeBurbujeo

65 50 ¡3 Tanqueagitado

Ponsycol..¡989 50 120 20 Columnadel3urbujeo

Zaidiy col, 1991 “Pluggingjet”

Suhycol.. 1992

Kesslery col.. 1993

Santos,1993

Fermentaciónen dos etapas,primeratiempoenlas 49 h de fermentación.

etapa 12 h en tanqueagitado,no siendoconsideradoeste

66

Tabla 1.6-

Introducción

1.3.3.- Transponede Oxí2eno

El estudiode la transferenciade oxigenoen la producciónde xantanoes de suma

importanciadebidoa dosaspectosfundamentales.Porun lado, la bacteriaque lleva a cabo

esteproceso,estoes,Xanthomonascampestrises estrictamenteaerobia,lo que quieredecir

que el microorganismonecesitapara crecery producir el biopolímero, el oxígeno; este

nutrientedebetomarlo de la fase líquida y debidoa que susolubilidad en aguaesmuy

pequeña,debe ser suministrado de forma continua al medio. Por otro parte, en la

producciónendiscontinuode xantano,la viscosidaddel cultivo aumentaconsiderablemente

como consecuenciade la acumulacióndel biopolímero, produciendo una significativa

disminuciónde la transferenciade materia.En estas circunstancias, la velocidad de

transportede oxígenocontrola,o influye notablemente,la velocidaddel procesoglobal; por

lo que el parámetrocaracterísticode este transporte,el coeficiente volumétrico de

transferenciade materia,kLav, debeserconocido.

Por otra parte, teniendo en cuenta que, para efectuar cambios de escala en

fermentacionesaerobias, uno de los criterios más ampliamenteutilizado es el de mantener

valoressimilaresde la concentraciónde oxígenodisueltoo su velocidadde transferencia, se

entiendequela determinaciónde esteparámetroseade graninterés.

La importanciade la transferenciade materiagas-líquido en las biotransforrnaciones

aerobias—donde la máximaconcentraciónde productoalcanzableestágeneralmentelimitada

por la velocidadde transponede oxigeno-haceque en los últimos añoshayasido objeto de

numerosostrabajos(Yagi y Yoshida,1975; Figuciredoy Calderbank,1979; Nishikaway col.,

1981ay b; Ogut y Hatch, 1988; Poizat y col., 1992; Nocentiol y col., 1993; Romany col.,

1993; Pederseny col., 1994; García-Ochoay Gómez, 1998). Sin embargo,es escasala

informaciónque existesobrela influenciade las variablesde operaciónen el coeficientede

transportey su predicción,en los cultivos de elevadaviscosidad(Margaritis y Zajie, 1978;

Vashitzy col., 1989; Suhy col., 1992; Ivlerbst y col., 1992; Gómez,1995).Sin duda,estafalta

de información en caldos con microorganismosse debe a que se suponeque los datos

obtenidoscon caldossimulados-dondelos trabajoshansido másextensos-son extrapolables

a la fermentaciónen presenciade los microorganismos,sin tener los inconvenientesdel

trabajocon microorganismos(Dussapy col., 1985; Vlaev y Valeva, 1990; Kawasey col.,

1992).

67

Introducción

Como ya se ha comentado,en los procesosde fermentaciónaerobioses necesario

proporcionaral microorganismola cantidadde oxigeno suficientepara que éste satisfaga

sus requerimientos metabólicos. La utilización de los nutrientes por parte de los

microorganismos,principalmentela oxidación de la fuente de carbono y su posterior

transformaciónen biomasa,productosy dióxido de carbonosólo esposiblecon el suficiente

aportede oxígenodesdela fasegas. Cuando,en un biorreactor,un componente poco soluble

como el oxígeno, debe ser transferido desde el gas —aire- al medio liquido, donde se

encuentranlos microorganismos,el balancede oxígenopuedeexpresarsecomo (Moo-Young

y Blanch, 1987):

¿¿CL =kLaV (C0 *Á30$

dt - q02 •C~ [1.60]

Siendo, el primer sumandoa la derechade la expresión,el término referidoal transportede

oxigeno y el segundo sumando, el referido al consumo del oxigeno por parte del

microorganismo.

Se han desarrolladoun gran número de técnicasexperimentalesde medida, con

distintasvariantes,todasellasaplicablesdentrode un intervalo restringidode condicionesde

operación y que se pueden clasificar en: técnicas de medida indirecta y técnicas de medida

directa.

Las técnicas de medida indirecta son aquellas que se llevan a cabo en sistemas donde

no se está produciendouna biotransformacion.Los valores de kLav obtenidos en medios

artificiales que simulan los caldosde fermentaciónse emplean,generalmente,para realizar

comparacionesentrediferentesbiorreactoresque operanen condicionessimilares o en la

obtenciónde correlacionesempíricasquepermitanestimarel coeficientede transportey poder

describirla transferenciade materiagas-líquido(Dussapy col., 1985; Vlaev y Valeva, 1990;

Yasukaway col., 1991a; Leckiey col., 1 991b; García-Ochoay Gómez,1988).

En estos casos, en ausencia de transformación microbiana, el término correspondiente

al consumo de oxigeno, q0, - C~, de la ecuación [1.60] es cero, resultando la siguiente

ecuación:

dC0, =kLaV.(CO —C0) [1.61]

dt

68

Introducción

Los datos experimentalespara la resoluciónde esta ecuación se pueden obtener

mediante diferentes técnicas o métodos,que puedenserclasificadosen químicosy fisicos. Los

métodosquímicos,se basanen la medidade la concentraciónde oxígenodisuelto a travésde

una reacciónquímicatal como la oxidacióndel sulfito (Yoshiday col., 1960; Dussapy col.,

1985; Yang y coL, 1992), la adsorciónde CO2 (Danckwertsy Gillham, 1966; Danckwerts,

1970) o la oxidación de la hidracina (Onken y col., 1985). Los métodosfisicos utilizan la

respuesta de un electrodo de oxígeno, a los cambios en la concentración de este gas en el

medio, en condicionesno estacionariaso dinámicas.Esteúltimo tipo de método esel más

ampliamente utilizado y se basa en la medida de la concentración del oxígeno disuelto durante

la absorcióno desorciónde oxígenode la disolución(Dussapy col., 1985; Costay col., 1982a

y 1982b; Merchuky col., 1994; Arranz, 1993; Gómez, 1995, García-Ochoay Gómez,1998).

Su aplicaciónpresentaciertasrestriccionesque esnecesarioteneren cuentaparala obtención

de valorescorrectos,como son la adecuadadisposiciónen el reactordel electrodode medida

del oxígenodisuelto, el tiempode respuestay la linealidaddel mismo(Nocentiniy col., 1993;

Merchucky col., 1994).

Las técnicasde medidadirectason aquellasen las que sedeterminala velocidadde

transferencia de materia en presencia de microorganismos, es decir, en la fermentación real por

lo que el valor obtenido es más representativodel sistema en estudio. La medida de la

variación de la concentraciónde oxígenoen el biorreactorpuederealizarseen condiciones

estacionadaso no estacionariaso dinámicas.

La técnicadirectamásutilizada por su sencillezy relativa exactitudes la técnica

dinámica(Dussapy Gros, 1985; Yang y col., 1988; Gaoy Lee, 1992; Raney Sims, 1994;

Gómez, 1995). Este método se basaen el balance de oxígeno disuelto en el biorreactor,

expresado en la ecuación [1.60], midiendo la evolución de la concentración del oxígeno

disuelto durante la interrupciónde la aireacióndel caldoy suposterioraireación.Si a su

vez, semide la concentracióncelulardel medio de cultivo se puededeterminarel consumo

específicode microorganismo,qo2.

En la Figura 1.13 serecoge,de forma esquemática,las distintas fasesde aplicación

de este método. En una primera fase, se suspendela aireacióndel medio de cultivo,

registrandoel decrecimientode la concentracióndel oxígenodisuelto con el tiempo, de

formaque la ecuación[1.60],en estascondiciones,sereducea:

69

Introducción

dc0,

dt — ~~“1o. C\

Co2*

Co2

e

[1.62]

Figura 1.13.-Esquemade la técnicadinámica(régimenno estacionario)parala medidadelcoeficientede transferenciade materia.

Antesde que la concentraciónde oxígenodisuelto alcanceun valor crítico, sereanuda

la aireacióndel medio de cultivo y seregistrala variaciónde la concentraciónde oxigeno

disuelto con el tiempo. En estascondiciones,la ecuación[1.601se puedeexpresarcomo:

de0, =k,a~ .<Q, * —9, )dt—q0 .9, dr

Teniendo en cuenta que, en el momento que se inicia la aireacióndel caldo de

fermentación,las condicionesiniciales son t t~ y C Cm, la ecuación [1.63] se puede

íntegrar,obteniéndosela siguienteexpresion:

[1.63]

C ~ _ ______02 02 — k,a,

AIRE‘ETENIDO

FASE 11

Ccrit 1 FASE 1

AIREACIÓN

* ~—c) — q0, ¿1-.dt

t

70

Introduccion

q0, C~ (t~lm)+(Co, ~Cm) kLaVIj (C0, *C02).dt [1.64]

ecuación,que unavez integrada, permite calcularel valor de kLav a partir de la variaciónde

la concentraciónde oxigeno con el tiempo, una vez conocidoel valor del consumo del

microorganismo,q0 C,<, de la pendientede la primerapartede la curva.

La transferenciade oxígeno en un biorreactor tipo tanque agitado -el más

ampliamenteutilizado en estetipo de procesos-es función de numerosasvariables, tales

como las propiedadesfisicas del líquido (viscosidad,tensiónsuperficial,etc.), la geometría

del tanquey del agitador,el tipo de difusorempleadoy las condicionesde operación.

Esteelevadonúmerode variableshacequeexistannumerosascorrelacionesempíricas

para predecir el valor de kLaV que podemosclasificaren dos categorías.Unas tienen una

formadimensional,correlacionandokLav con la velocidadde agitación(o potenciapor unidad

de volumen, la velocidadsuperficialdel gasy, en casode que el fluido seano-Newtoniano,

con la viscosidad.Segúnunaexpresióndel tipo:

o bien,si seutiliza la potenciasuministradaporel agitador:

Pi?kLaV =C,V~”(—-) -p~ 11.661

Los valoresde las constantes,C1 y C2, y de los exponentesen ambos tipos de

ecuacionescambian para los distintos autores, dependiendo, principalmente, de los

parámetrosgeométricosdel tanque. En la Tabla 1.7 se presentanlos valores de los

exponentesde cadauna de las variablesen algunasde las correlacionespropuestasen la

literatura.

La segundacategoría,tiene una forma adimensionaly expresan,generalmente,el

númerode Sherwoodcomounafuncióndel númerode Reynolds, Aireacióny Weber.

Sh C ReN). NaX2 WCÁ3 [1.67]

Ambos tipos de ecuaciones,son únicamenteaplicables,en un restringidointervalo de

las condicionesde operacióny sonespecíficasde cadarecipiente.

71

introducción

Tabla 1.7.- Valores de los exponentesencontrados por distintos autores en correlacionesdimensionales.

FLUIDO Autores N INI’ ½ T

NEWTONIANOS

Yagi y YosI,ida (¡975) 2,2 - 02 - -0.4 -

Ríguciredo ~‘Calderbank ¡1979) 0,6 0 8 ¡.0 -

Nishíkawaycol. (1981) - 0,8 0.3 - - -

Moo-Young y Blanch ([987) - 0,4 0.r - -

Oguí y F-latch <¡988) 0,9 - 0.7 0,5 - -

Poizal yco. (¡992) 2,7 - 0.6 - -

Nocent¡n¡ y col. (¡993) - 0,6 04 - -¡2 -

komai, y col. (1993) 0.5 0.4 0.5

L¡nek y col (19944 - 0,7 0.4 -

Pedersen y col. (1994) 2.0 - 0.5 -

NO NEWTONIANOS

N,shíkaway col. (1981) 2,4 0,8 0.3 -2.5 -0,5 -

Costa y col (¡982> 2,0 0.4 2,5 -0,4 -

Dtissap y col. <¡985) 1,5 - 0.5~ - -0,’ -

bock y Vacek (1988) - 0,9 0.4 - - -

Ogiit y Hatch (1988) 0,5 - 0.5 0,1 -0.4 -

- 0,02 0,9 - -0,6 -

Linek y col (1991) - 1,1 0.4 - -

Pedersen el al. (1994) 2,7 - 0.6 - - -

Garcia --Ochoay Gómez. (1998)

García-Ochoa y Gómez (¡998)

2,0 - 0.67 - -0,67 -1,0

- 0.6 0.67 - -0,67 -1,0

En un trabajoprevio, llevado a cabopor esteequipo de investigación,serealizó un

amplio estudiode la transferenciade oxígenoen esteproceso,determinándosekla tanto en

disolucionesde xantanocomo en caldosde fermentación,durantela biotransformación,en un

amplio intervalo de condicionesde operacióny geometríasde tanque(Gómez, 1995). En

amboscasos,seempleóunatécnicadinámica.

En el caso de disolucionesde xantanoy paraun biorreactorde 25 litros, cuandola

reología se describe mediante el modelo de Ostwald-deWaele, se obtuvo la siguiente

ecuacion:

72

Introducción

[1.68]

y parauno de 2 litros:

kLaI, =c, y’72 N1 u~E’3 [1.69]

El exponentede la viscosidadcambiacuandola viscosidadsedescribemedianteel

modelo reológico de Casson,tomandoun valorde—1.

Los valoresobtenidossonacordescon los propuestosen la bibliografia. En la Figura

1.14 secomparanlos valoresobtenidosa partir de la ecuación[1.69] con las correlaciones

propuestaspor otrosautoresparasistemasanálogosy en el mismo mtervalode condicionesde

operación.En la misma se observa,que los valores obtenidos por Ogut y Hatch(1988) son

significativamentesuperioresal resto de los trabajos, siendo las diferencias tanto más

significativascuantomenores la velocidadde agitación. La presenciade electrólitos y la

aplicación de una técnicapoco adecuada(el método químico del sulfito) que proporciona

valores muy superiores,no comparablesa los obtenidosmediantemétodosfisicos. Las

diferencias obtenidas por otros autores y las calculadas con la ecuación [1.69]se explican por

el efecto de los parámetros geométricos sobre el coeficiente de transporte en el biorreactor

usadoen el estudio(altura, tipo de agitador,tipo de difusor, etc.)y las propiedadesfisicasdel

fluido.

Asimismo, en presenciadel microorganismoXanthomonascampestris,la correlación

entrelas variablesde operaciónqueinfluyenen el sistemay el coeficientede transporte, en un

biorreactorde 2 litros es:

kLak. = 3,O8.1O~ . . N’75 p39 [1.70]

Como puede observarse, la influencia, sobre el coeficiente volumétrico de

transferenciade materia,de la velocidadsuperficial del gases similar; mientras que la

velocidad de agitaciónes mayor y la influencia de la viscosidadaparente,menor. Así

mismo, los resultadosexperimentalesobtenidosmuestranque los valoresdel coeficientede

transporte son superiores en presencia de microorganismo que cuando se realiza en

ausencia de transformación microbiana. Por ello, en el resto del trabajo se utilizará esta

última ecuaciónpara la determinacióndel coeficientede transporte,en su aplicacióna los

modeloscinéticos.

73

Introducción

2 4 6 8N (r.p.s.)

0,1

~iz 0.01

.2

0.001

10

Figura 1.14.- Predicciónde diferentescorrelacionesadimensionalespara valoresde kLavobtenidos por diferentes autores. VsO,002 mis; g~>-t~ 8.1 o3 a 30.10’Pas.

1.3.4.- Aislamiento y Purificación

Una vez obtenido el xantano, queda bastante diluido en el caldo de fermentación, y

se encuentramezcladocon unagranvariedaddeotros compuestos—componentesdel medio

utilizado que no ha empleadoel microorganismo(salesy nutrientes), las propias células,

etc.-. La composiciónmedia de un caldo resultantede una fermentaciónpararealizar la

producción de xantano es, aproximadamente, la siguientede: 1 a 4% de xantano,de 0,2 a

O,50o de células y de 0,1 a 1% de sales y azúcares no consumidos. Además, debido a la

presencia de xantano, el medio es muy viscoso, unos 100 Kg/ms. Por todo ello, la

recuperacióndel xantano del caldo de fermentaciónno es sencilla, ya que se debede

74

0,000 1

Introducción

eliminarcercadel 95%del caldo.Paraconseguirestefin sepuedenemplear tantométodos

fisicos como químicos (Kennedy y Bradshaw, 1984), dentro de los que se encuentran:

• Tratamientospreliminares,enfocadosa la degradacióny eliminación de las

células.

• Precipitacióndelpolisacárido.

• Etapasfinales,como sonlavado,secado,molienday empaquetado.

En la literatura se han propuesto y empleado diferentes técnicas para llevar a cabo

este proceso. Así, los tratamientospreliminaresempleadosson de naturalezatérmica

(Smith, 1983; lnkson y Wilkinson, 1981), química (Jnksony Wilkinson, 1981; Patton y

Holman, 1968) y/o fisica (Pattony Holman, 1968; Bouniot, 1976; Towle, 1977; Inkson y

Wilkinson, 1981).

En cuantoa la etapade precipitación,éstase puedellevar a cabodisminuyendola

solubilidadde la gomapor adición de alcoholeso cetonasde bajo peso molecular,tales

como metanol (Smith, 1983), etanol e isopropanol(Smith, 1983; Inkson,1979;Bouinot,

1976), t-butanol (Bouinot, 1976), acetona (Smith, 1983), etc. En la mayoríade los trabajos,

el disolventeempleadoes isopropanol(Smith, 1983; Inkson y Wilkinson, 1981; Bouinot,

1976),en cantidadesreferidasa volumende caldoentre 1,8:1 y 2,5:1 (y IPA/v caldo).

Otros autores (Patton y Holman., 1968; Pace y Righelato, 1981; Albretch y col,

1964; Kenedy y col., 1981) han propuesto la adición de cationes polivalentesa las

soluciones de xantano, realizándose la precipitación del xantano debido al carácter

políelectroliticodel polisacárido.Se puederealizarla precipitaciónpor la adición de sales

de calcio(Pattony Holman,1968; Macneelyy O’Conell, 1966) a pH básico(entre8,5 y 12)

o por salesde aluminio (Albretch y col., 1962 a pH ácido(entre4 y 4,5). De este modo se

obtiene una sal de xantano insoluble, que debe de ser transformado en un compuesto

soluble,en formade sal sádicao potásica,parasuempleocomercial.

75

Introducción

Otra posibilidades el empleocombinadode ambosefectos(debido al disolventey a

la presenciade cationesen la disolución). Smith (1983)señalóla posibilidadde añadiral

caldo sales —de calcio, magnesioy cinc- así como isopropanol,disminuyendoen gran

manera la cantidad de disolvente necesaria para llevar a cabo la precipitación. El empleo de

salespolivalentessedebea que, cuantomayores la cargadel catión empleado,menores el

volumen necesario de disolvente para conseguir la precipitación de la misma cantidad de

xantano(ver Figura 1.15).

Las etapasfinales empleadasdependende las propiedadescomercialesy los usos a

los que sevayaadedicarel xantanopurificado.

Fernández(1992)propusoun métodopararealizarel citadoprocesode aislamientoy

purificacióndel xantano,dentrode las especificacionesexigidasparasu comercialización.

Esteprocedimientoconsisteen diluir el caldo de fermentacióncon alcohol. La adición del

alcohol cumple una doble misión, por un lado la dilución de los caldos,provocandouna

notabledisminuciónen su viscosidad,y por otro actuar como un biocida, destruyendola

actividadbacteriana,así como, en muchoscasos,su paredcelular. Una vez diluidos, los

caldos se filtran, separando así las células del medio.

El xantano se separadel medio por precipitación al adicionar más cantidad de

alcohol o alcohol y sales, siendo el alcohol isopropílico el más adecuado ya que generaba un

menorcosteen disolventes,puesaunquecantidadessimilaresde acetonaproducela misma

separación, tanto por la cantidad requerida como, sobre todo, por su menor toxicidad, es

preferible el empleode IPA, como puedeapreciarseen la Figura 1.15. Además, este

comportamientoesbastanteparecidoa distintasconcentracionesde xantanoen disolución.

La adición de sales al medio hace reducir notablemente la cantidad de alcohol

necesaria para la precipitación del xantano, aunque hay una gran diferencia entre utilizar

salesmonovalentes,divalenteso trivalentes,cuantomayor es la cargadel catión, menor es

la cantidadde alcohol necesariaparaobtenerLa precipitacióndel xantano(Figura 1 .1 5>. El

aumentode la concentraciónde salesen el medio reduce,también,la cantidadde alcohol

necesariaparala precipitación(García-Ochoay col., 1993).En la Figura 1.16 se observala

influenciade la concentraciónde salesempleadasobreel volumende PA necesario para la

precipitacióndel xantano.Las salesde cationesmonovalentespuedenser las elegidaspara

76

Introducción

realizar el proceso,ya que evitan la etapa posteriorde conseguirque la sal de xantano

insoluble,obtenidaen el casode emplearsalesde cationespolivalentesseatransformadaen

solubleporcambiodelcatión.

Cuando el xantano es separado del caldo se le somete a sucesivoslavados con

alcohol o con diversasmezclasalcohol-agua.De estaformase eliminan las salesque haya

podido arrastraren el proceso,tratandode evitar la redisoluciónde partedelxantano.

6

2

o

Figura 1.15.-Utilización de diferentesagentesparala precipitacióndel xantano.

77

Introd¿¡cc¡ón

a>—y

Figura 1.16.- Influenciade la adición de salessobreun volumende WA parala precipitacióntotal de xantano

1.3.5.-Proniedadesdel Xantano

Las propiedadesy caracteristicasexigidas al xantano, que deben cumplir las

especificacionescomercialesson las siguientes:

- Contenidoen cenizasy humedad.

- Contenidoen nitrógeno,acetatoy piruvato.

- Viscosidad (como indicación del peso molecular) y comportamiento reológico.

Debido a que la propiedad más característica del xantano es la elevada viscosidad

en disolucionesacuosasse hanrealizadodiversosestudiosde estapropiedad.En un trabajo

previo(Casas,1991),seestudióel comportamientoreológicoempleandoun viscosímetrode

cilindros concéntricos, marca Brookfield, modelo LVT-Sinchrolectric, ampliamente

empleado en la industria y en la literatura para determinar la viscosidad de los caldosde

78

(~0 o’ a6 1,0

Introducción

fermentación. La naturaleza polielectrolitica del xantano obliga a estabilizar su

conformación en disolución, por adición de pequeñascantidadesde sal (generalmente

NaCí), siendoestala únicaforma de obtenerresultadosreproduciblesy evitar así posibles

comportamientostixotrópicoso de agregaciónde moléculas.

Las disoluciones de xantano presentan un comportamiento claramente

pseudoplástico,aumentandoextraordinariamentela viscosidadal aumentarla concentración

en disolución,como se apreciaen la Figura 1.17. La viscosidadseve poco afectada,pero

disminuyealgo, al aumentarla temperaturade medida,como ponede manifiesto la Figura

1.18, y varia de una forma poco habitualcon el cambio de la tertiperaturade disolución,

segúnseapreciaen la Figura 1.19. Estaextrañainfluenciade la temperaturade disolución

en la viscosidadse debea un cambioen la conformaciónde la moléculade xantanoen

disolución, lo que se denominaestructuraterciaria. La conformación que adquiere el

xantanodependede la temperaturaa la que se realizala solubilización,pudiendoadquirir

unaconformaciónordenada(doble hélice,a temperaturasde disolución comprendidasentre

25 y 4fl0 C) o una conformacióndesordenada(de ovillo, paratemperaturasde disolución

más elevadas,60~80O C). El cambio conformacionalse observó por medidastanto de

rotación óptica como de dicroismo circular. Este cambio en la moléculade xantanoen

disolución no fue relacionadoclaramentecon la variación de la viscosidad,y seestableció

claramentela diferenciaentrela variaciónde la temperaturade disolución y la de medida,

aunqueen otros trabajosno se indica si el cambio conformacionalse produce con una

variaciónde la temperaturade medida—o a la que seutiliza-, siendo independientede la

temperaturaa la que la moléculaseha disuelto.

En el trabajoprevio citado se determinóla viscosidadde las disolucionesde xantano,

en distintas condiciones de concentración de xantano, temperatura de disolución y

temperaturade medida,y sehacorrelacionandoutilizando distintosmodelos,como los que

aparecen en la Tabla 1.10. Los citados modelos reproducían de forma satisfactorialos

resultadosexperimentalesque obtuvieronlos autores.Aunquetodos ajustabanbien los datos

experimentalespareceobservarseuna menor dispersiónen la reproducciónde datos al

utilizar el modelo de Casson; esta diferencia es más notoriacuantomayoresseanlos valores

de viscosidad.En el ajustecon el modelode Horschel-Bulkleyseobtienenvaloresparate

(esfuerzocortanteaparente)muy próximosa cero, lo quehaceque estemodelo se reduzca

al de Ostwald-de Waele.

79

Introducción

Tabla 1.10.- Modelos reológicos para disoluciones acuosas de xantano.

MODELO FUNCION

Ostwald-de Waele y = k ytYp

0 = 1< yfl~I)

Casson 2 «~ +k0 .~‘<2Horschel-Bulkley ~- = +

E

2

11

lo-;

—2lo

roo

—1lo

-2lo

Figura 1.16.-Comportamientopseudoplásticode lasdisolucionesde xantano.Influenciade la concentracióndel polisacárido.

80

io~ 102—4-y ls-’)

102

Introducción

u’

o’s

—3‘o

— TMUC)20 ¿26080

e TM(C)

F¡gura 1.17.- Influencia de la temperatura de medida en la viscosidad de disoluciones dexantano.

¡ 1 1 ¡

Key C,(><ao 15o

<AEo’

—2lo

—3‘o

T0 60’CY 7.92r’

1 1 ¡

¡ ¡ ¡ ¡

250C

‘y’ 792s’ -

¡ r20 ~C 60 80

8]

Jniroduccz<vn

¡

Figura 1.18.- Cambio conformacional en la molécula de xantano. Variación de laviscosidad, ángulo de rotación óptica y dicroismo circular con latemperaturade disolución

La reologíadel xantanocambiacon la naturalezadel polímero,esdecir, dependede

supesomoleculary del nivel de acetilaciónde la molécula(Tako y Nakamura,1984)y del

gradode piruvatización(Petersy col., 1993; Kangy Pettit, 1993).Estos niveles en el

contenido de acetato y piruvato varían con las condiciones en las que crece la bacteria

(Souw y Demain, 1979; Cadmus y col., 1978; De Vuyst y col., 1987), con las condiciones82

(Kg/ms>

SO

— 1, rc

Introducción

de operación (Trilsbach y col., 1984; Peters y col., 1993) y con la especie de Xanthonionas

spempleada(Cadmusy col., 1976; Kennedy y Bradshaw, 1984; Tait y col., 1986).

Un xantanocon un nivel alto de acetatoy, especialmente,de piruvato, aumentala

viscosidadde las disolucionesacuosasal favorecerlas asociacionesintermoleculares(Tako

y Nakamura,1984).

Existennumerosostrabajosque abordanel estudiode las condicionesde operación

en la estructuray pesomolecular. La variable más estudiada,es la influencia de las

propiedadessobreel grado de piruvatización,debidoa que estavariableesindicativa de la

calidaddel polisacárido(Cadmusy col., 1978).

En cuanto a la influencia de la temperatura, algunos autores (Cadmus y col.,

1978; Shu y Yang, 1990) han observadola influencia de estavariable en el grado de

piruvatización,llegandoa obtenerel máximo contenidoen piruvatocuandoel proceso se

realizabaa 270C. En el trabajo realizadopor Casasy col. (1999), se observóque el

contenidoen piruvatono variabacon la temperaturade producción,pero el contenidoen

acetatodel xantanoobtenido,a bajastemperaturas25 y 280 C eramayorque el contenidoa

temperaturasmásaltas.En cuantoal pesomoleculardel xantano,estees mayor a medida

que disminuye la temperatura.Concluyeronque la concentraciónde productoobtenidaera

mayorcuandola temperaturade operaciónera de 280 C. Paraun intervalo de temperatura

entre 25 y 34 0C, la viscosidadde las disolucionesde xantanoesmayorcuantomenores la

temperaturade producción. Los parámetrosde los modelosde Ostwald-de Waele y de

Casson-indice de consistencia(K) y esfuerzocortanteaparente(to)- aumentana medida

quedisminuye la temperaturadelprocesode fermentación.

La composición del medio de producción también influye en la estructura

moleculardel xantano.Esteaspectoha sido estudiadoteniendoen cuentavarios nutrientes,

pero la mayoría de los trabajos se centranen el estudiode la fuente de nitrógeno. Hay

autoresque encuentranun mayor grado de piruvatización cuandola fuentede nitrógeno

empleadaes de naturalezaorgánica(Qadeery Baig, 1989; Kennedyy col., 1982), pero

Cadmusy col (1978)concluyenque la mejor frentede nitrógenoparaconseguirun xantano

con alto contenido en piruvato es (NH~)2HPO4. Sin embargo,De Vuyst y col., (1987)

observaronuna influencia inversadel ión (PO3)3~ y el grado de piruvatización.Kennedyy

83

Introducción

col. (1982) encontraronun incrementoen el contenido en piruvato cuando la concentración

de nitrógeno en el medio se aumentaba, pero Davidson y col. (1978) obtuvieron mayor

piruvatización y menor contenido en acetato cuando la fuente nitrogenada era el nutriente

limitante. Trilsbach y col. (1984) no encontraron relación entre el contenido en piruvato de

la moléculay la composicióndel medio. Posteriormente,Casasy col. (1999), también

estudiaron la influencia de esta variable sobre las propiedades de la molécula. Así, en el

trabajo realizadose muestraque la concentraciónde nitrógenono afectaal contenidoen

piruvato y acetato ni al peso molecular del polímero. Además en su estudio se observó LLfl

máximo de producción de xantano, coincidente con la concentraciónde amonio optimizada

por Santos(1993),por debajoo porencimade estaconcentración(0,257 g/L de amonio)la

concentraciónde xantanoesmenor. En lo referentea la viscosidadde las disolucionesde

xantano.seobservóque esmayorcuantomenores la concentraciónde sustratonitrogenado

empleadoen el mediode producción.

La influencia de la concentración de oxígeno disuelto ha sido estudiada, sobre

todo en el contenido en piruvato (Cadmus y col., 1978) y en el peso molecular (Suh y col.,

1987; Peters y col., 1989). Cadmus y col (1978) estudiaron el grado de piruvatización

cuando el proceso se llevaba a cabo con diferentes caudales, no encontrando diferencias

significativas entre caudales de 0,75 hasta 1,5 L/L/min. Peters y col. (1989) estudiaron la

influencia del oxigeno disuelto sobre el peso molecular (cambiando la velocidad de

agitación y empleando aire enriquecido), observaron que el peso molecular del xantano

aumentaba cuando no existían limitaciones del oxígeno durante el proceso. Esta influencia

tambiénha sido observadapor Casasy col (1999) que han llevado a cabo el estudiode la

influencia del oxígeno disuelto, variando la velocidad de agitación en el biorreactor,

observando que la influencia de esta variable se ve reflejada en la mayor producción

obtenida con el aumento de la concentración de oxígeno disuelto en el biorreactor. Cuanto

mayor es la concentración de oxígeno disuelto, mayor es la viscosidad de los caldos de

fermentación. El contenido en piruvato es independiente de la cantidad de oxígeno disuelto

en el medio, sin embargo, se obtiene un mayor grado de acetilación cuando la producción se

realiza con una agitación elevada (500 r.p.m.); por otro lado, en cuanto al peso molecular, la

limitación de oxígeno disuelto da lugar a polisacáridos de menor peso molecular.

84

2. - PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

ProcedimientoExperimental

2.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

El trabajodescritoen estaMemoriaha precisadode la utilización y puestaa punto de

diversas técnicas, tanto de experimentación como de análisis; a continuación se detallan cada

unade ellas,asícomolos equiposy el materia] queha sidoempleado.

2.1.- EQUIPOS

En esteapanadosedescribenlos numerososequipose instalacionesnecesariospara

llevaracabola experimentaciónrealizadaen estetrabajo.

Para obtenerlos datos experimentalesnecesariosparamodelizar la producciónde

xantano se han realizado experimentos en un biorreactor comercial, empleando una incubadora

orbital para la preparación de los inóculos. Además de estos equipos,ha sido necesariala

utilización de otros para conseguir la esterilidad de los medios y las temperaturas programadas

en el mantenimientoy crecimientodel microorganismo.Tambiénha sido necesarioutilizar y

disponerde un buennúmerode aparatosde medidaparaanalizarla evoluciónde los diferentes

componentesdelprocesoobjetode estudio.

85

Procedirnieu/o Experimental

A continuaciónsedan las caracteristicasprincipalesde los equiposempleados:

• FERMENTADOR COMERCIAL

El proceso de fermentacióncon microorganismosse ha llevado a cabo en un

biorreactor BIOSTAT Mde tipo tanque agitado, diseñado y comercializado por BRAUN. Está

constituido por un tanque de cultivo de 2 L de capacidad y con los sistemas de medida, control

y regulación de pH, oxígeno disuelto, temperatura y velocidad de agitación, de acuerdo a un

diseño modular e insertados en una cabina metálica. En la Figura 2.1 se muestra un esquema

del biorreactor empleado, que consta de los siguientes elementos:

Reactor:estáconstruidoen borosilicatocon un volumen total de 2 L y un volumende

trabajo de 1,5 L. La vasija está constituida por una doble pared de vidrio que se

encuentra cubierta por una capa de acero inoxidable con tres orificios de 19 mmde

diámetro y siete orificios de 6 mmde diámetro, unidas mediante un anillo de acero

inoxidable, que se detalla en la Figura 2.2.

Sistemade Medida y Control de Temperawra:el fennentador BIOSTAT M lleva un

controlador PID, con un alto grado de eficacia. La temperatura del medio de cultivo es

medida mediante un sensor de temperatura Pt-lO0, a la vez que un segundo sensor

mide la temperatura del fluido calefactor que circula a través de la camisa del reactor.

Ambas señales son llevadas al regulador de temperatura que opera sobre el sistema

mediante una resistencia de 500 W (Figura 2.3). La temperatura de operación es

seleccionaday ajustadamedianteun indicadordigital, con unasensibilidadde 0,10C.

Sistemade azitacMny aireación: la unidadde agitaciónestáformadapor un motorde

70W de potenciamáxima,que ejercesuacciónsobreunavarílla de aceroinoxidable,

sobre la que se encuentrandos agitadoresde turbina de cuatro palas rectas.Este

sistema garantiza una velocidad de agitación adecuada en procesos en los que se llega a

alcanzarunaelevadaviscosidaden el caldo.

La velocidadde agitaciónesmedidapor un tacómetro,ajustableentreO y 1990 r.p.m.,

con una resolución de 10 r.p.m. El valor fijado se presenta en un indicador digital y es

reguladomedianteun controladorPI.

86

ProcedimientoExperimental

La aireación del caldo se consigue suministrando aire mediante un compresor,

filtrándose a través de un filtro que posee una membrana de 0,2 ~m,para conseguir la

esterilizacióndel aireque se introduceen el reactor.El aire se distribuye en el interior

mediante un difusor toroidal. El caudal de aire es ajustado mediante una válvula y

medidopor un rotámetro.

Sistemade mediday control de oxígenodisuelto: La medidadel oxígenodisuelto es

realizada empleando un electrodo esterilizable, fabricado por IINGOLD. Este electrodo

funciona mediante el principio de polarización y consta de un ánodo de plata y cátodo

deplatino separadosde la disoluciónamedirpor unamembranadeteflón.

La señalde medidaesamplificaday convenidaen unaseñaldigital. La concentración

de oxígeno disuelto puede ser controlada mediante la acción sobre el caudal de aire o

bien mediante la velocidad de agitación. En la Figura 2.4 se presenta un esquema del

sistema de control de oxigeno disuelto.

Sistemade mediday control de oH: El pH del mediode cultivo es analizadoen línea

mediante un electrodo esterilizable fabricado por INGOLD. Opera en un rango de

medida de 2 a 12 unidades de pH, disponiendo de una compensación manual o

automática de temperatura. La señal de medida, previamente amplificada, es

alimentadaa un controladorde tipo PI. Unavez fijado el valor de pH al quese desea

trabajar es mantenido por la acción del controlador sobre sendas bombas de

alimentación de álcali o ácido, como se muestra en la Figura 2.5.

Sistemade mediday control de Espuma:la apariciónde excesiva espuma es combatida

mediante la introducción de un compuesto antiespumante. Para la detección de espuma

se utiliza un simple sensor de contacto, donde la parte metálica del reactor actúa como

tierra. La señal de salida del sensor es enviada al módulo de control de espuma que

actúasobre la bombade dosificaciónde antiespuniante.El tiempo de respuestadel

controlador puede ser ajustado mediante un potenciómetro. En la Figura 2.6 se muestra

un esquemadel sistemade mediday controlde espuma.

87

Pí-ocediínienwExperimental

Figura 2.1.-Esquemadel Fermentador Braun modelo BIOSTAT M.

Fermernadorcomercialde 2 1.

88

ProcedimientoExperimental

Figura 2.2.-Alzadode la vasijadefermentación.

89

Píoced¡niien¡oExperimental

Figura 2.3.-Esquemadel sistemade medida y control de temperatura.

SEÑAL CONTROLADOR DECONSIGNA TENFERATURA

SALIDA DE AGIlA

90

ProcedimientoExperimental

Figura 2.4.-Esquemadel sistemade medida y control de oxígenodisuelto.

F~LTROAIRE

RO! AMETRO

AIRE

AMPLIFICADORDE SEÑAL

— — COUTROLADOR

ELECTRODO •—~.~J~jjjjjj--— ———1SEÑALCONSIGNADE Di

---e- WQROLAOOROC VELOCIDAD

9’

ProcedimientoEvpcrirnental

Figura 2.5.-Esquema del sistemade medida y control del pH.

92

ProcedimientoExperimental

Figura 2.6.-Esquemadel sistemade control y medida de espuma.

—~--2CONTROLADOR

——1

TIEMPO GEDOSIFICACION

DUR A O O NDOS IP OAGIO N

SUSTANGIAANTIE SP UMA NTE

93

ProcedimientoExperimental

• INCUBADORAORBITAL

Parael crecimientode los microorganismosdurantela preparaciónde los inóculosen

matracesErlenmeyers se ha empleado una incubadoraorbital GALLENKAMP modelo

IINR-200. Con lassiguientescaracterísticas:

Rangode temperatura:de +5 0(3 a 70 0C.

Variación máxima de temperatura: + 0,50(3.

Fluctuación de temperatura interna: 0,10C.

Rangode velocidaddeagitación:de 40 a 400 r.p.m. y con un radioorbital de 32 mm.

Capacidad: 30 Erlennieyers de 250 ml o número equivalente de otro tamaño, con cambio

de plataforma.

• ESTUFA DE CULTIVO

La estufabacteriológicaempleadade la marca SELECTA, modelo 2000207,es de

convecciónnatural. Poseeuna homogeneidadde ± 2,5 % y una estabilidadde + 0,5 %,

pudiendo regular la temperatura desde la ambiental + 5 0C hasta600C.

• CAMARADE FLUJO

Para la manipulación de microorganismos en condiciones estériles se ha trabajado en

una cámara de flujo laminar vertical de la firma TELSTAR modelo MICRO-V, capaz de

desarrollar una velocidad de impulsión de 0,45 mIs.

• ESTIJFA DE SECADO Y ESTERilIZACIÓN

Estaestufa es de la firma SELECTA, modelo S-202, con termómetrode referencia,

termostatode regulaciónde la temperaturay termostatode seguridad.

94

ProcedimientoExperimental

• BALANZADE PRECISIÓN

Parala cuantificacióndel pesode los diferentescompuestosempleadosse ha utilizado

unabalanzadigital marcaSARTORIUS,modeloHandy.Estabalanzapermiteobtenerpesadas

del ordende miligramoscon unafiabilidadde + 0,1 mg.

• CENTRIFUGAS

Parala centrifugaciónde las muestrassehanempleadodostipos de centrífugas,una

de la firma HERMLE, modelo Z 230, con capacidadparaocho tubos de 10 ml cadauno;

alcanzaun máximo de 5000 r.p.m.- lo que correspondea 2000 g- duranteun tiempo

controladode hastaunahora.

Parala preparaciónde las muestrasparacitometríade flujo, la centrífugaempleadafue

de la marcaSELECTA, modeloCentrolitcon una capacidadpara30 Eppendorf,alcanzauna

velocidad fija de 10000r.p.m. (18000g) duranteun tiempoquepuedeserprogramado.

• URMIETRO

La medida del pH de las muestrasse ha realizadocon un pHmetro de la marca

CRISON, modelo MICROPTII 2002. Tiene una resoluciónde 10” y lleva incorporadauna

sondaCAT de temperatura,por lo que es capazde realizarla correcciónautomáticade la

lecturadel pH anteun cambiodetemperatura.

• VISCOSIMETRO

Para la medida de la viscosidad se ha empleado un viscosímetro BROOKFJELD

SYNCHRO-LECTRIC modelo LVT, con microadaptador,capazde medir a 0,3; 0,6; 1,5,; 3,

6; 12; 30 y 60 r.p.m.,con un spindledel n0 18; se ha utilizado, conectadoal microadaptador,un

bañotermostatizadomarcaTANSON TC9,con unaprecisiónde + 1 0C.

95

ProcedimientoExperimental

• ESPECTROFOTÓMETROde ABSORCIÓN tJV/VIS

La medidade la absorbanciade las muestrasseha realizado en dosespectrofotómetros

13V/VIS, uno de la firma SHIIN’IADZU , modelo SHIMADZULIV 1603 y otro de la marca

PERKIN ELMER, modelo552 13V/VIS.

• ESPECTROFOTÓMIETROde FLUORESCENCIA

Para medir la fluorescencia de las muestras se ha empleado un espectrofluorímetrode la

marca PERKII4 ELMIER modelo MIPF-44 E.

Para el Joduro de Propidio, la longitud de excitación y emisiónfueron,respectivamente,

de 536 y 623 nm, empleandounarendijade 19 paraexcitacióny de 5 paraemisión.

Parael Isotiocianatode Fluoresceina,las longitudes de ondade excitacióny emisión

fueron, respectivamente, de 494 y 520 tun, con una rendija de 4 para excitación y de 2 para

emisión.

• AUTOCLAVE

Para la esterilizacióndel material, a 1200 C durante20 minutos, seha empleadoun

autoclavemarcaRAYPA, serie“Sterilmatic-C” modeloAE-l 10.

• ELECTRODO de AMONIO

En la medidade la concentracióndel nutrientenitrogenadodisuelto se ha utilizado un

analizador electro-quín-úco marca ORION, modelo 720A. La medida se realiza por

desplazamientodel amonio contenidoen las muestrasal aumentarel pH. Las moléculasde

amonio en disoluciónpasana amoniacoy ésteatraviesala membranaselectivadel electrodo.

El amoniacoque se introduceen el electrodoescapazde producirunaseñaleléctricaque, una

vez analizada y comparadacon la curva de calibrado, proporciona la medida de Ja

concentraciónde amonio.El intervalode concentraciónpuedevariarentre 1 M y 5.1 ~ M.

96

ProcedimientoExperimental

• CROMATOGRAFíALIOUIDA de ALTA RESOLUCIÓN (HPLC

)

El equipode cromatografialíquida de alta resolución,HPLC, que se esquematizaen

la Figura 2.7, presenta las siguientes caracteristicas técnicas:

Bomba: KONTRONJKSYRUMENTS(325 System), capaz de mantener un caudal

constanteentre0,1 y 5 mL/mm a unapresiónquepuedevariarentre 1 y 450 bar. Puede

trabajar tanto en régimen isocrático como en gradiente,tanto de caudal como de

composición,ya queestádotadade un mezcladorde trescanales.

Inyector Automático. KONTRON JNSTRUMENTS-360,con capacidadpara 60

muestrascontenidasen viales de 2 mL. Tiene la posibilidad de termostatizarlas

muestrasy variar la cantidadde muestrainyectada,aunqueen todos los análisis

realizadossehautilizado un volumende muestrade 20 mL.

Horno: PERiKJN-ELMiER LC-l 00, mantienela temperatura5 0C por encimade la

ambientaly hasta99 0C, con una precisiónde ± 0,1 0C. La transmisiónde calor se

realiza por convección forzada de aire caliente. Está diseñado para albergar dos

columnasde cromatografiade hasta35 cmde longitud.

Detector:SEDEX 45, detectorde dispersiónde luz («light scattering»). Se basaen la

dispersiónde luz queseproduceal incidir un rayo sobreun nebulizadoquecontienela

muestraaanalizar.Es necesariofijar unascondicionesde temperaturade mediday de

composicióny presiónen el gasqueseutilizará paranebulizarla muestra.

97

ProcedimientoExperimental

Filtro

u

Reservadedisolvente

PrecolumnaBomba

Inyectorautomático

Columna

lI~tector de di spersionde luzAdquisiciónde datos

Figura2.7.-Representaciónesquemáticadel equipode HPLCutilizado.

• CONTADORde PARTÍCULAS

Parael contajedel númerode células,necesarioparael procesamientode las muestras

por Citometríade Flujo, se empleóun contador COULTER modelo ZM empleandoun tubo

de 30 ~tmy un canalizadoracopladomarcaCOULTER,modeloCHANNELIZER 256.

• CITOMETRODEFLUJO

Para el análisis de componentesintracelulares, se ha empleadoun citómetro

IBRYTE-HS (Biorad, Hempstead13K), con lámparade Xenonde 75 W, filtro de excitación

de 488 nm, filtros de emisión de 510 nm parala fluorescenciaverde y de 600 nm parala

fluorescenciaroja. El equipo perteneceal Centro de Citometría de Flujo (CMF) de la

U.C.M., situadoen la Facultad de Farmacia. Los componentesbásicosde un citómetrode

flujo sonlos siguientes(Figura2.8):

98

ProcedimientoExperimental

Sistemade Flujo de Fluidos: El flujo producidoes un flujo laminar, en el que se

mezclandos tipos de fluidos: el fluido de la muestray el fluido de la vaina. Las

partículas o células deben estar en suspensión, y son analizadas una a una, en el seno

del líquido.

SistemasOpticosy Fotodetector:El flujo de partículaso células pasaa travésde una

zonailuminadapor un rayo de luz focalizado.El impactodel rayo con cadacélula

genera señalesópticas que, una vez recogidas por medio de detectores, son

convertidasen señaleso eventoselectrónicosque midenlamagnitudde cadapulso.

SistemaElectrónicoy Computador:Los pulsosgeneradosson a suvezdigitalizados

y computerizadosen un tiempode milisegundos.Todo estopermite,por un lado, la

visualizaciónen pantallaen tiemporealde las medidasefectuadasen relacióna cada

uno de los parámetros analizados, la discriminación de panículas o células y

establecerventanas,puertaso regioneselectrónicasde acotacióno exclusión,que

posibilitan la adquisición,almacenamientoy/o análisisde eventoscorrespondientes

únicamentea unas determinadassubpoblacionesde interés, o bien la separación

fisica de subpoblaciones.Además la CMF permite la obtención de medidas

semicuantitativasy análisismultiparamétricosmuy precisos.

99

ProcedimientoExperimental

AguapresurizadalE*

r 1

SuspensiónW celular

fluorescente ¡— —, —, Detector ¡

Colección delentes

N

N .

Flujo N ¼.

NS

luz Q.$ijjj6%%%Fuente d~~X

Mistogramas‘4’

Figura 2.8.-Representaciónesquemáticade un citómetro de flujo

Rayo de luzexcitado

1~

cg 1

NS

Detec’tbr,~de luzdisnersa

NS

100

ProcedimientoExperimental

2.2.- MATERIALES EMPLEADOS

2.21.- Nlicroor2anismo

El microorganismoempleadoen el presentetrabajoha sido Xanthomonascampestris

NRRLB-1459. La bacteria se obtuvosolicitándolaa la siguientecoleccion:

Microbiologist Culture Collection Research.Fermentation Laboratory of United States.

DepartmentAgricultural. 1815North UniversityStreet.Peona.Illinois. 61604 U.S.A.

Existentres cepasdel microorganismo,como ya ha sido indicado en la Introduccion.

Comoallí secomentó,las cepasSm y Vs se producenpor degeneraciónde la cepaL, debidoa

un envejecimientodel cultivo, quepuedeser aceleradopor unaconservacióndeficiente.Por lo

tanto, es necesariomantenerla bacteriacomo cepaL, paraobtenerun xantanocon buenas

propiedadesy conbuenrendimiento.En la Figura2.9 se muestraunaplacade la cepaL, donde

puedeapreciarseel aspectode las coloniasde la bacteria.

Parala conservacióny el mantenimientode la cepade Xanthomonascampestrisse

describenen la literaturadosprocedimientos(Jeanesy col., 1976>:

- Conservacióna 1ar20 plazo: esun tipo de conservaciónno propagativa(la bacteriano

crece ni se reproduce).Este tipo de conservaciónse recomiendarealizarla liofilizando una

pequeñapartedel cultivo que seencuentraen condicionesóptimas.Tambiénsehan descrito

otrastécnicascomola congelacióny la conservaciónentirasde papel(Jeanesy col., 1976).

- Conservacióna corto plazo: este tipo de conservaciónes semipropagativa(la bacteria

crece y se reproduce).Se realiza en slants (tubos con medio sólido), pero requiere una

renovacióndel cultivo cadaquincedías(De Vuyst y col., 1 987ay b; Sumany Rogovin, 1970)

ya que si no se realizantransferenciasdel cultivo más o menosfrecuentes,la cepapuede

degenerara Sm (Cadmusy col., 1976).

En estetrabajose realizóla conservaciónde la siguienteforma:

101

ProcedimientoExperimental

- A largo plazo: seconservéel microorganismotanto liofilizado como por congelación.El

liofilizado se realizóen la empresaPI-IARMAMAR S.A.. creciendopreviamente,en medio

líquido el liofilizado obtenidode la colecciónamericanay realizandounacentrifUgacióndel

caldo,paraobtenerlas célulasqueposteriormentese liofilizan y encapsulan. La congelación

Ñerealizadaen Eppendorfscon glicerinaal 10%y posteriorcongelacióna la temperatura

de-250C.

- A cortoplazo: el microorganismoesconservadoen medio sólido, en estetrabajo se ha

empleadomedio YMagar.Los slantssonincubadosduranteun periodode 1 8 a 20 horasen

estufa de incubacióna 250 C y manteniendoposteriormenteel slant a 40 C durante un

periodode 14 díascomomáximo.Trasesetiemposerenuevael cultivo traspasándoloaotro

slantcon medio YM-agar.

Figura 2.9.-Fotografla de las coloniasformadaspor Xantho,nonascampestrissobreYMagar.

102

ProcedimientoExperimental

Paraobservarla viabilidad de la cepade X campestris,el procedimientoconsisteen

realizarsiembraspor agotamientode asaen placa Petri en YM agar. Las placasse incubana

250 C durantetresdías.

2.2.2.ReactivosUtilizados

En la Tablas2.1 a 2.6 aparecenlos reactivosempleados,tantoparala preparaciónde

los mediosde cultivo como aquellosque sehan ido utilizando en el análisis de los diferentes

componentesdel sistema.

En la Tabla 2.1 se muestran los reactivos empleados para la conservacion,

mantenimientoy crecimientodel microorganismo.En la Tabla 2.2 se recogenlos reactivos

empleadosen la preparacióndel medio óptimo de producción,denominadoen lo que sigue

como medio A (García-Ochoay col., 1992). En la Tabla2.3 seindicael agenteprecipitante

empleado en la extracción del producto. En las Tablas 2.4 y 2.5 figuran los reactivos

utilizadosen estetrabajoparael análisisde los componentesintracelularesy, finalmente,en

la Tabla2.6, los empleadosparael análisisde algunosde los componentesextracelulares.

Tabla 2.1.- Reactivos empleadospara los medios de crecimiento y mantenimientodemicroorganismos

Compuesto Marca Código

Agar-Agar PROBUS 29210

D(+) GlucosaAnhidra PANREAC 141341

Extractode Levadura OXOUJ L2 1

Extractode Malta OXOID L39

PeptonaBacteriológica OXOID L3 7

103

ProcedimientoExperimental

Tabla 2.2.-. Reactivosempleados(García-Ochoay col., 1992).

parael medio de producciónde xantano,Medio A

Compuesto Marca Pureza

Química

Código

Cloruro de Magnesio

AcidoCítrico Crista/Lado

PROBUS

PROBUSPuro

120410

11510

ÁcidoBórico PANREACPuro

23687

ÁcidoClorhídrico PANREACPuro

35%141019

Nitrato deAmonio PROBUS 21310

CarbonatoCálcico PROBUSPuro

1092 1Puro

Cloruro de Hierro (III) PROBUSPuro

91410

Oxido de Zinc PANREAC 15682

Fosfato PotasioMono-básico PANREACPuro

98%141509

Hidróxido de sodio PANREAC 141687970

Sacarosa PANREAC 176820Puro

Tabla 2.3.- Reactivos empleados para la precipitación y extracción del producto obtenido.

Compuesto Marca PurezaQuímica Código

isopropanolVIUDA eHIJOSde

MANUEL RIESGOPuro

104

ProcedimientoExperimental

Tabla 2.4.- Reactivos empleadosEspectrofluorimetria.

en los análisis por Citometría de Flujo y en la

Compuesto Marca Pureza Código

Química

Tris(hidroximetil) aminometano PANREAC Puro 131940

Cloruro Sódico PANREAC Puro 141659

Glutaraldehído RIEDEL-DEHAEN 25% 62621

Deoxiribonucleasa1 SIGMA 90 % DN-25

RibonucleasaA SIGMA 85 % R5503

loduro de Propidio SIGMA 95-98% P-4170

Isotiocianatode Fluoresceína SIGMA 90 % F-7250

RojoNilo SIGMA - N-3013

Albúminade Suerode Bovino BOEHRINGER-MANNHEIN - 10222

DNA de Timode Bovino BOEHIRIINGER-MANNHEIN - 109223

RNA de Levadura BOEHRIINGER-MANNHEIN - 104175

Tabla 2.5.- Reactivosempleadospara la realizaciónde análisismediante pruebasbioquímicas.

Compuesto Marca Pureza CódigoQuímica

Lisozima I3OEHRINGERMANNHEIM Puro 107255

Citrato de Sodio SIGMA 99% 54641

Dodecii Sulfatode Sodio SIGMA >99% L5901

SulfatoCúprico PANREAC Puro 141648

Tartrato de Sodioy Potasio PANTREAC Puro 141729

Reactivode Folin ANALEMA Puro PS

Fenol PANREAC Puro 141322

los

ProcedimientoExperimental

Tabla 2.6.-Reactivosempleadosparael análisisde azúcares

Compuesto Marca PurezaQuímica

Código

Kit enzimáticoSacarosa/Glucosa BOEI-IIRINGER-MANNHEIN - 139041

Acetonitrilo RIEDEL-DE HAÉN 99,8 % 34881

2.2.3- Composiciónde los MediosEmpleados

• MEDIOde CRECIMIENTO

VM Extractode Levadura 3 g/L

Extracto de Malta 3 g/L

GlucosaAnhidra 10 gIL

• MEDIOde PRODUCCIÓN

MEDIOA

Acído Bórico 0,006 g/L

Acido Cítrico 2,100 g/L

Acido Clorhídrico 0,130 mL

CarbonatoCálcico 0,020 g~L

Cloruro de Hierro (III) 0,0024g/L

Oxido deZinc 0,0060g/L

Fosfato PotásioMono-Básico2,866 g/L

Clorurode Magnesio 0,507 gIL

Sulfato Sódico 0,089 gIL

Nitrato Amónico 1,1440gIL

Sacarosa 40,00 gIL

Se ajustael pH a 7 con unadisolucióndeNaOH.

106

ProcedimientoExperimental

2.2.4.- Composicion de las Disoluciones

• DISOLUCIONES

Tampón y Preparacionesnara Análisis

TAMPÓN

Tris Hidroximetil Aminometano

Cloruro Sódico

0,1M

0,IM

Se ajustael pH a 7,5 con HCI

TAMPÓN B

Dodecil SulfatoSódico

Tris Hidroxim. Amino Met.

Citrato Sódico

Cloruro Sódico

1 ,5%(w/v)

10 mM

lmM

10 mM

Se ajustael pH a 8 con HCI

• REACTIVOSLOWRY(Lowry y col., 1951)

LOWRYA

LOWRYB

LOWRYC

Carbonatode Sodio

Hidróxido Sódico

Sulfatode Cobre

Tartratode Sodioy Potasio

LOWRY A: LOWRY B

TAMPÓN TRIS

2 % (w/v)

0,1 N

0,5%(w/v)

1 ,O%(w/v)

50:1

107

ProcedituienboExperimental

2.3.-REALIZACIÓN de un EXPERIMENTO

Todos los experimentos llevados a cabo en el presentetrabajo se han realizado en

fermentador.Para ello, se ha empleadoun biorreactorde la marcaBraun, modelo BIOSTAT

M, tal y como seha comentadoen el apartado2. 1. El desarrollode un experimentose detalla

a contrnuac¡on:

Para la preparación del inóculo e inoculación en el fermentador, se parte de un slani del

microorganismoque no tenga más de tres días.Con asa de siembra,se obtiene un ioop de

inóculo que se transfiere al medio de crecimiento,en el que se va a prepararel inóculo

(contenidoen Erlenmeyero en tubo de ensayo, segúnel caso);en esta operaciónse debe

trabajar siemprecercade la llama del mecheroBunseny flamear la bocadel Erlenmeyero del

tubo de ensayo,tanto después de abrirlo, como antesde cerrarlo. El medio de crecimiento

inoculado se cultiva en la incubadora orbital en las condicionesóptimasparaXanthomonas

carnpeshls(Santos,1993), quesonlas siguientes:temperatura2S~C, velocidadde agitaciónde

210 durante 12 h en el medio de crecimientoYM.

Una vez transcurridoel tiempode incubacióndel inóculo, se lleva éstea la cámarade flujo

-previamenteesterilizadacon alcohol-y se toma, de modo estéril, una pequeñacantidadpara

realizardiluciones y conocerla concentraciónde biomasaobtenida.Este último detalle es

inprescindiblepara la repetitividad delos resultadosobtenidos en diversosexperimentos.

El procedimientoa seguirpara llevar a cabo la esterilizacióndel biorreactor esel siguiente:

antesde ser introducidoen el citadoautoclave,se prepara,de modoque seconecteal cuerno

del fermentadorlo más rápidamenteposible.Se deben colocar filtros, tanto para la entradade

airecomo a la salidadel refrigerante,que se cubrencuidadosamentecon papelde aluminio y

se sellan con cinta adhesiva.Mi mismo, se colocan los electrodosde oxigeno disuelto,

antiespumay pH -ésteúltimo debecalibrarseantesde la esterilización-y se cubrentambién

con papel de aluminio y con cinta adhesiva.Tambiénse cubre con papel de aluminio el

conectorde la sondade temperaturaPt-l00 y la salidademuestras.

El ferinentadorse debeesterilizarcon el medio a empleardentro, por lo que se deben

pinzartodaslas gomasdesaliday entradaparaevitarpérdidas.Cuandoel medioquese va a

emplearen el experimentono se puedeesterilizartodojunto -porcontenerla mentecarbonada

y salesinorgánicas-,se introduceen el reactoruna partedel mismo, conteniendotodos los

componentesexcepto la mente de carbono. El sustrato carbonado se prepara en un frasco

aparte-de los preparadosparacontroldel pH, consalidaal fermentador-y se esterilizaunidoal

mismo, tomando la precauciónde pinzarla gomaque los une,paraevitar que haya pasode

liquido de uno a otro.

/08

ProcedimientoExperimental

Unavez introducido todo en el autoclave,se esterilizaa 1200Cdurante30 minutos. Después

de la esterilización,se quita la cinta adhesivay el papel de aluminio y se conectael

ferinentador al cuerpo del mismo; tambiénse conectala entraday la salidade aguade la

camisay se abre la válvula de llenado.Se conectanel agitador,los tres electrodosy la bomba

peristáltica,paraque se introduzcael sustratocarbonado,si es el caso. El biorreactorse debe

dejar duranteal menosseis horasdespuésde realizar los pasoscomentados,para que el

electrodo de oxigeno disuelto se polarice antesde ser calibrado.Transcurridoel tiempo de

polarización,el fermentadorya se encuentraa la temperaturadeseada.Unavezes introducida

la fluentedecarbono,secalibrael electrodode oxigenoconnitrógenoy aire,fijando asi el cero

vel l00% de saturación,respectivamente,antesde realizarlainoculación. Se fija la agitación

en 210 r.p.m.y el caudaldeaireen 1 L/L/ntn.

Finalmente,serealiza la inoculación, una vez preparado el inóculo, como se ha comentado

previamente,y conocidala concentracióndebiomasaen el medio,seprocedea la inoculación

en el fermentador.Paraello, se introducea travésde una membranapreparadaal efecto,

medianteunajeringaestéril.La membranase cubrecon alcoholy se prendefuego cuandose

va a realizarla inoculación.

Para llevar a cabo el seguimiento de la evoluciónde este sistemadurante el proceso,sc realiza

la toma de las muestrasa distintos tiempos, así como el análisis de las mismas. En el

fermentador, la tomademuestrasserealizapor la salidasuperior. Unaveztomadala muestra

sepinzala gomay se introducealcohol por el extremo inferior, hasta la siguiente muestra,para

evitarcontaminaciones.

Las muestrasdebensertomadasencondicioneslo másasépticasposibles,por lo que los tubos

donde van a ser almacenadasdeben ser esterilizadospreviamente. Unaveztomadala muestra,

es centrifugadaa 4000 rpm. <2860 g> durante 30 mlii. con el fin de separar el caldo de las

células,y de estaformapararel crecimientoy la evoluciónde sustratosy productos.Unavez

centrifugadassonalmacenadasa 40 C para el posterior análisisde cadacompuesto.

Preparacionesespecialesde las muestras,como las necesariaspara contar el número de

células,o analizarpor fluorescencia,citometría de flujo o microscopiaelectrónica,sedetallan

en puntos siguientes,dentro de los protocolosespecíficospara el análisisde cada componente.

109

P,-ocedímicn/oExperimental

2.4.- METODOS DE ANÁLISIS DE COMPONENTES EXTRACELULARES

2.4.1.- Análisis de Biomasa

Para el análisis de A? campestris como biomasa se ha empleadoun método

turbidimétrico, es decirun métodoóptico basadoen la absorbanciaquepresentanlas bacterias

en longitudesde ondadel espectrovisible. Consisteen medirla absorbanciade la muestraa

una cierta longitud de onda, frente a un blanco.La longitud de ondaempleadaen el presente

trabajo, para este análisis, fije de 540 nmy el blanco utilizado, agua destilada.

El calibradodel método se realizó en un trabajo previo (Santos,1993).El ajuste de los

datos experimentalespor regresiónlineal a la expresiónde Lambert -Beer apareceen la

ecuación[2.1].

c~~j (g ¡ L) 0.285 . <540 nm) [2.1]

En la Figura 2.10 se muestrala recta de calibradoobtenidade la relación entrela

absorbanciamedidaa 540 nmy la concentraciónde la bacteria.

En cuanto al seguimientode la biomasadurante los experimentoslas muestras

obtenidas,durante la producciónde xantano,eran tratadassegúnel siguiente protocolo

experimental:

Se toma una muestradel biorreactor y se diluye con aguadestilada,de modo que la

alisorbanciamedidaentredentrode la región lineal de la curva de calibrado.El valor de

absorbanciaobtenido a 540 nm es convenido en concentraciónmediante la ecuación

[2.1], que luegoes corregida de acuerdoa la dilución realizada previamente.

110-

ProcedimientoExperimental

.4

u

20

Figura 2.10.- Recta de calibrado para la medida de biomasa de Xanthomonascampestrispor relaciónentrela absorbanciay el pesoseco.

2.4.2.-Medida de la Concentración del Sustrato Carbonado

Parala determinaciónde la concentracióndel sustratocarbonado,estoes sacarosa,se

han utilizado dos técnicasdistintas, una basadaen una prueba enzimáticaque ha sido

realizadamedianteun kit comercial y la otra basadaen la cromatografialíquida de alta

resolución(HPLC) utilizando un detectorde dispersiónde luz. La primeratécnicase empleó

inicialmente,pero cuandose dispusodel equipode cromatografialíquida de altaresoluciónse

empleóestatécnicaen lugarde latécnicaenzimática.

Parala determinaciónde la sacarosa,medianteun kit enzimáticocomercialse empleó

un testde combinaciónde la marcaBoehringer-Mannheim(n0 de catálogo139041).Antesde

aplicarel kit de medidaa las muestras,esnecesariosometerlasa un determinadotratamiento

térmico, para detener las reaccionesenzimáticasde las células bacterianasque puedan

interferir en la medida.Dicho tratamientoserealizaconformeal siguienteprotocolo:

Se introducenlas muestrasen baño de aguaa 800C, duranteunos 15 minutos, y se

centrifuganposteriormentea 5000 r.p.m. durante20 mm., siendo el sobrenadantede esta

última operación, generalmentediluido, el que se utiliza para la determinacióndel azúcar

correspondiente.\~ 4=

7 fl$>

~1 ~ —

Q5 1,0 1,5

Abs(S~mi)

Proccdim¡en/o Experimental

Paracl análisisde sacarosa,se determinael contenidoen D-glucosaantesy despuésde

la hidrólisisenzimáticade la sacarosa.Unavezpreparadala muestracomo se ha indicado, los

pasosa seguirson los siguientes:

Inversiónenzimática:La sacarosase hidrolizamediantela 13-fructosidasa(invertasa)a pH 4,6

en O-glucosay D-flvctosa,deacuerdoa:

Sacarosa * Fructosa /3— Fructosidadasa glucosa+ i~ — fructosaD [2.2]

Determinaciónde glucosa:Se añadela enzimahexokinasa(1-11K), que cataliza-apH 7,6- la

fosforilación de la O-glucosacon adenosín-5-trifosfato(ATP) bajo la forma simultáneade

adenosín-5-difosfato (ADP). La glucosa-E-fosfato formada (G-6-P) es oxidada

específicamentepor el nicotinarnin-adenin-dinucleátido(NADP> en presenciade la glucosa-

6-fosfato-dehidrogenasa(G6P-DH) a gluconato6-fosfato, formándose, a la vez,

Nicotinamin-adenin-dinucleótido-fosfato(NADPH). La cantidad de NADPH fonnada

durante la reacciónes estequiométrica,con respectoa la cantidadde 0-glucosa,y se

determinapor suabsorbanciaa 340 nm.

D — <Pu cú~ a + -IT? Ffexoqu¿nasa (Y/u casa—E — P + <ID? [2.3]

<3—6-- 1’ + NADP~ (36P—Dfcf. — G/uconuto6p± NADPfI w 1< [2.4]

El cálculode la cantidadde sacarosapresenteen la muestrase realizaprinerosustrayendo

de la lecturade la absorbanciadela muestrala obtenidaparael blanco:

AA = AA9- AM [2.5]

Y el cálculode la cantidaddesacarosa,por la siguienteecuación:

U’

= /000 [2.6]

Siendo:V, el volumen del test, V~ el volumen de la ¡nuestra,M el pesode la sustancia

analizadael pesode la sustanciaanalizadad el pasoóptico de la cubetay 3 el coeficientede

extinción molardel NADPH.

Como ya ha sido comentado,el análisis de este disacárido también fUe realizado

mediante I{PLC. Para esta técnica, la preparaciónde la muestrasolamenteprecisa la

separaciónde las célulasdel caldode fermentación.Estaseparaciónpuederealizarsetantopor

centrifUgación a 5000r.p.m (2000g) durante15 minutos, como por filtración a través de un

1/2

ProcedimientoExperimental

filtro Millipore de 0,2 ~tm. Como ya se ha comentado,paraesteanálisis se ha utilizado un

cromatógrafomarcaKONTRON, modelo SEDEX45, con detectorde dispersiónde luz. Las

condicionesutilizadashan sido las siguientes: la columnaempleadaha sido tipo Nucleosil

NH2 de Sgm, con unasdimensionesde 250 x 4,6 mm. Se ha empleadocomo eluyenteuna

mezclaAcetonitrilo/aguaMili Q en proporción 75:25, con un caudal de 1 L/min. En cuanto al

detector, es de dispersiónde luz, trabajandocon unagananciade 6, una presión de aire de 1,9

atm. y a 280 C de temperatura.

En la Figura 2.11 se muestrala curvade calibradoparala sacarosa y la Ecuación [2.7]

da la relaciónentreel áreadel cromatogramay laconcentraciónde esteazúcar.

Cs(g/L) = 0,00863A

[2.7]

.4

1

2.4.3.-Análisis del Sustrato N¡tro2enado

La concentraciónde nitrógeno(en forma de sal de amonio) ha sido medida en

discontinuo,medianteun electrodode membranasemipermeablede la casaORJON, modelo

720A. El procedimientoseguidoparael análisisdel amonioha sido el siguiente:

~ooA

Figura2.11 — Rectade calibradoen HPLC parael análisisde sacarosa.

113

ProcedimientoExperimental

Sc toma una muestrade 10 mL y se adicionauna disoluciónde NaOH, hastaalcanzarvalores

de pH superioresa lo (momentoen el que el indicadorsuministradopor el fabricante,azulde

timol. vira de incoloro a azulado);a pH alcalinose libera el nitrógenoamónicopresenteen la

muestra, pasando a amonio gaseoso. El amoniaco generado atraviesa la membrana

semipermeabledel electrodoy produceuna señalenel detector.Estaseñalse comparaconlos

datosdel calibradoy~ automáticamente,apareceen la pantalladel aparatola concentraciónde

nitrógeno presente en la muestra. El calibrado se realiza introduciendo dos patronesde

concentraciónconocida(10 y 100 p.p.m.).El intervalo deconcentraciónde calibradoes de O a

¡00 p.pm. l~os patronesson analizadosdel modo indicado y la pendientees calculaday

almacenadapor e] aparatode modoque, una vez realizadoel calibrado, la concentraciónes

leidadirectamenteen el aparato.

2.4.4.-Análisis de Xantano

El análisisdel xantano sellevó a caboestableciendouna relaciónentre la viscosidad

del caldo y la concentraciónde xantanoen una muestra dada. La viscosidadse mide

generalmentea 30 r.p.m. entre25 y 300C (Silman y Rogovin, 1970 y 1972; Cadmusy col.,

1976 y 1978: Souwy Demain,1979; Tait y col., 1986; De Vuyst y col., 1987ay 1987b). En el

presentetrabajo, el análisis del contenidoen xantanode las muestrasse realizó mediantela

determinación_dela viscosidad,medidaa 25 0C y 30 r.p.m. , de acuerdoa un procedimiento

previamenteestablecido(Santos,1993).

Pararelacionarla viscosidaddel caldocon la concentracióndexantanoen el mismo, se

realizó el calibrado del método.Segúnlas característicasdel xantanodisuelto,la relaciónentre

la viscosidadde la disolucióny la concentraciónde xantanopuedeser muy diferente(Casas,

1989); en consecuencia,paracalibrar este métodode análisis se empleóel propio xantano

obtenido en cadaexperimentopara realizar el calibrado. El procedimientoseguido fue el

siguiente:

Se tomaun caldo resultantede la fennentacióny se añadeun volumen conocidode alcohol

isopropílico (IPA), precipitandoel xantanoy quedándoseen suspensiónlas bacterias.La

relacióncaldo:IPAes normalmentesuperiora 1:2,3, debidoa que no se empleóninguna sal

para no falsear la medidapor pesada.Despuésde filtrar, lavar y secar, se mantieneen una

estufa a temperaturade 50 0c, hasta pesadaconstante.Por otra parte. se realizanvarias

dilucionesdelcaldodefermentaciónysemidesuviscosidada25 0C y 30 r.p.m. Los valores

obtenidosencadacasoseajustarona unaecuaciónde tipo potencial,por lo que las ecuaciones

114

ProcedimientoExperimental

de calibradose recogenen cadaexperimento,es decir, cambianlos valoresde a y de b en la

ecuaciónsiguiente:

= a ¡4 [2.8]

La relación entre la viscosidad aparente del xantano (g~) con su concentración (gIL)

de acuerdo con la Ecuación [2.8] para cada experimento, se muestra en la Tabla 2.7.

Tabla 2.7- Valores de los parámetros a y b de la ecuación [2.8] para los diferentesexperimentosrealizadosen los que sevarian las condicionesque se indicanen la primeracolumna.

Experimento b

250C, 257 pp.mNB0 0,12 0,97

280 C. 257 p.p.mNH2 0,34 0.70

310C,257p.p.mNH¿ 0,43 0,51

340 C, 257 p.p.mNI-l< 2,05 0,34

28~C, 65 p.p.mNI-1$ 0,77 0,32

280 C, 130 p.p.mNH¿ 0,77 0,31

280 C, 475 p.p.mNH 0,23 0,71

115

ProcedimientoExperimental

2.5.- ANÁLISIS de COMPONENTES INTRACELULARES

Para el desarrollo de Modelos Cinéticos QuímicamenteEstructuradoses necesario

realizarel análisisde ciertoscomponentesintracelularesduranteel proceso,comoya se citó

en el primer capítulo de esta Memoria. El análisis de estoscomponentespermiteexplicarla

evolución del sistema cuando el microorganismoes sometido a determinadosfactores

externosque puedenafectaral crecimientoy por tanto a la evoluciónde sus componentes

estructurales.

La Citometría de Flujo (CMF) pareceser la mejor técnicapara poder realizar un

seguimiento del proceso, teniendo en cuenta los cambios producidos intracelularmente

cuando el microorganismo se encuentra bajodiferentescondicionesambientales.

La técnicade la CMI esanalíticay preparativa,y se puedeutilizar parael análisis

de células tanto eucariotascomo procariotas.Se basaen la medida de la emisión de

fluorescenciay dispersiónde luz inducidospor la iluminación apropiada de células o

partículas en suspensión para ser analizadas en el seno de un líquido con flujo laminar

(Maftah y col., 1993).

La CMFpresenta importantes ventajas con respecto a otras técnicasanalíticas,por

ejemplopermitela caracterizaciónde célulasindividualesen términosde distribuciónde sus

componentes,talescomoDNA, RNA, y proteinas,o bien de sus propiedadestales como

viabilidad, tamaño, variación morfológica (complejidad), etc.; además,permite análisis

multiparamétricoscon alto gradode precisión.En la Tabla 2.8 semuestranalgunosde los

principales parámetros biológicos ana]izablespor CMIF, tanto mediante el uso de

fluorocromoscomo sin ellos, siendo posible tambiénel análisis simultáneode varios de

estosparámetros.

El citómetro empleadoen este trabajo, como ya se indicó en el apartado2.1,

perteneceal CAL del servicio comúnde investigaciónde la Facultadde Farmaciade la

U.C.M (marcaBryte,modeloHS, BioradHempteadUK).

116

ProcedimientoExperimental

Tabla 2.8.-Parámetrosanalizablesmediante Citometria de Flujo.

PARÁMETROSESTRUCTURALES

PARÁMETROSFUNCIONALES

SINFL UOROCROMO¡

VolumenCelularComplejidadCelular

Pigmentos

Potencial REDOXViabilidad celular

CONFLUOROCROMO

MacromoléculasOrgánulos Subcelulares

ReceptoresMetabolítos de Bajo Pesomolecular

Etegridad de membranaMovimientos iónicos

Potencial de MembranaViabilidad CelularSíntesisde DNA

Transporte Celular

Estatécnicaha sido habitualmenteutilizadaparaanalizarcélulaseucariotas(Hullet y

col., 1969; Criasman y col. 1975),especialmente células sanguíneas. Su aplicación para el

análisisde célulasprocariotases menor, debidoa queel contenidoen constituyentesobjeto

de análisis (componentesintracelulares),en dichascélulas procariotas,es de dos a cuatro

órdenesde magnitud inferior que en eucariotas,lo cual haceque se requieranequipos

muchomássensibles(Steeny Boye, 1980; Steeny col., 1982).

Existen pocos estudios donde se empLee la CMF para el seguimientode los

componentesde la poblaciónduranteun procesofermentativo,esto es,parael estudiode

transformacionesmicrobianas(Bailey, 1978; Fazel-Madjlessiy col., 1979; Agar y Bailey,

1982;Alberghinay col., 199; Alberghinay Porro, 1993).

Bailey y colaboradores(Bailey, 1977; Bailey y col., 1978; Fazel-Madjlessiy Bailey,

1979) emplean la CMIF para conocer la evolución de componentesintracelulares en

bacterias,apuntandola necesidadde conocerla cantidad de cada componentepara la

aplicaciónde ModelosCinéticos.

A. pesar de las enormesventajasde la CMIF frente a otras técnicas,como las

microbiológicaso bioquímicasconvencionales,estatécnicapresentainconvenientesa la

hora de emplearlos datosnecesariosparala formulaciónde Modelos Cinéticos,debido a

117

Procedimlento Experimental

que dichos datosvienendados en unidadesrelativas(unidadesde fluorescencia)y no en

absolutas(unidadesde concentración),comoesnecesarioparadichatarea

Para obtener valores cuantitativos mediante Citometría de Flujo es necesario

disponer de estándarescon los que poder comparar,para interpretarcorrectamentelos

resultadosrelativosobtenidosporCMF (Alberghinay col. 1991).Paralas distribucionesde

tamañoy volumencelularesen diferentesexperimentos,el canalizadorpuedesercalibrado

mediante estándaresde tamaño y volumen conocido. Sin embargo la medida de

fluorescencia es siempre relativa, no disponiendo de estándaresde componentes

intracelularesde concentraciónconocidapara el calibrado del aparato.Algunos autores

realizanuna comparaciónentrelos datosde Intensidadde Fluorescencia(IF) con los datos

cuantitativos obtenidos medianteotras técnicas;por ejemplo, Agar y Bailey (1982) y

Alberghinay col. (1991)empleantécnicasbioquímicasparadeterminarestarelación, pero

sólo Agar y Bailey. (1982) muestranuna correlaciónentreel númerode canaldel citómetro

con la cantidad de componente por célula obtenido por análisis mediante técnicas

bioquímicas.

Basadosen el trabajo llevado a cabopor Agar y Bailey (1982), seabordóel estudio

paraestablecerunacorrelaciónentrelos datosobtenidosmedianteCMF con otras técnicas

de análisis.

2.5.1.-Análisis de ComponentesIntracelularesporEspectrofotometríade Absorción

Con el fin de llevar a cabo unacuantificaciónde los componentescelularesy, de

esta forma, obtener datos cuantitativos con los que relacionar los de Intensidad de

Fluorescencia(IF) obtenidosmedianteCMF, se realizóla puestaa punto de técnicasparael

análisisde proteínatotal, DNA y RNA a lo largo de una fermentaciónllevadaa cabopor

Xanthomonascampestrisrealizada en fermentadory bajo las condiciones óptimas de

producciónde xantano(Santos,1993).

2.5.1.1.-Análisis de Proteínas

Para realizar la cuantificaciónde proteínastotales se empleóel método de Lowry

(Lowry y col., 1951),por seruna de las técnicasmás habitualmenteutilizadas.Se trata de

1/8

ProcedimientoExperimental

un método colorimétrico basadoen el hechode que los gruposfenólicosde las tirosinas

presentesen las proteínasreducenel reactivode Folin, dandoun complejode colorazulado

cuya intensidades proporcional a la concentraciónde proteína. Para la formación del

complejoazuladoesnecesarioque las tirosinasesténaccesiblesal reactivode Folin, paralo

cualseañadenionescalcioque seunena las proteínasdandocomplejosproteína- calcio.

Previoa la aplicación de estatécnica,fUe necesarioponera punto un protocolo de

roturacelulary homogeneizaciónde las célulasquees detalladoa continuación.

El primer pasoa realizares el lavado y rotura de células,con estaetapa se pretende

obtenerel homogeneizadode la muestrasobreel que se va a realizarel análisis.Paraello,

se toma un volumendeterminadode muestray secentrifuga durante30 minutosa 4000

r.p.m. (2860 g) con el fin de separarlas célulasdel medio de cultivo. Se resuspendeel

precipitadoen tampón Tris. Estaoperaciónse deberealizaral menoscinco veces,conel

fin de eliminar todo el polisacáridoque pudiera estar pegado a las células, lo cual

introduciríaun error enormeen esteensayoen concreto,debidoa la interferenciaentreel

vantanoconel reactivode Folin.

Se vuelve a centrifugara 4000 r.p.m (2860 g) durante15 minutos y el precipitadose

resuspendeen 2 mL de unadisoluciónde lisozima(10 mg/mL en tampónTris). Se agita

y sonicadurante1 minuto pararomperlos agregadosquepudierandificultar la acciónde

la enzima.A continuación,se incubala muestraa 37 oc durante30 minutos;pasadoeste

tiempose añade lOO ktL del TampónB. Se incubacon estetampón durante10 minutosa

37 0C. Finalmente,se adiciona 1 mL de una disolución de NaOH IN paradetener la

reacciónenziunática.

Una vez obtenido el homogeneizado,se toma 1 mL y se le añaden5 mL del reactivo

Lowry C (Lowry A:Lowry B, 50:1), seagitae incubadurante30 minutosa temperatura

ambiente.A continuaciónse añaden0,5 mL del reactivode Folin (dilución 1/2), seagitabien la mezclae incubadurante30 minutosa temperaturaambiente.

Finalmente se procedea la lectura de la absorbanciaa 500 nm, empleandocomo

blancoaguadestiladaa la quese le hayaefectuadoel mismo tratamientoquea las demás

muestrasdesdela etapade adiciónde la lisozima, la cualserácuantificadatambiéncomo

proteínay cuyaconcentracióndebeserrestadaentodaslas muestras.

Los valoresde absorbanciaobtenidosson extrapoladosen la curva patrón previamente

realizada con patronesde Albúmina de suerode bovino (BSA) con concentraciones

entre10 y 100 pg/mL.

119

ProcedimientoExperimental

La Ecuación[2.9] es la obtenidamedianteajustepor regresiónlineal de los valoresde la

absorbanciaconla concentración,el valor del coeficientede correlaciónobtenidode este

ajustees r0,998.En la Figura2.12 semuestranlos resultadosobtenidos.

cA =4/~,674>

PR [2.9]

Figura 2.12.-Calibrado para proteínas obtenido mediante el métodode Lowry.

Se realizaronmedidasde la evolución de proteínasa lo largo de una fermentación

para la producciónde xantano empleandoeste método. La Figura 2.13 muestra los

resultadosobtenidosparados ensayosrealizadoscon cadauna de las muestrastomadasa

diferentes tiempos. Como puede observarse,ambos ensayosproporcionan resultados

similares, lo que estaríaindicando la buenareproducibilidaddel métodode Lowry parael

análisisde proteínas.

0,16

A(500nm)

120

Procedimlento Experimental

O lO 20 30 40 50 60

t(h)

proteínasintracelulares de XanthomonascampestrispormétodoLowry.

o

0.6

0,4

0,2

0

Figura 2.13.- Evolución deanálisiscon el

2.5.1.2. Análisis de Ácidos Nueleicos

Los ácidosnucleicosde la bacteriaobjetode estudiofueronextraídosy purificadosa

partir de las célulasmedianteun procedimientoque puedeconsiderarseuna modificación

del métodode Sambrook(Maniatisy col., 1983).

El análisisrequierede la digestiónenzimáticaconRNAasaparala medidadel DNA

y con DNAasaparael análisisde RNA, puesamboscomponentesinterfierenen el análisis

debido a que la técnicase basaen la absorbanciaa 260 nm que es la longitud de onda

característicade los cromóforosde los ácidosnucleicos,estoes,de las basesnitrogenadas.

Inicialmenteserealizóel análisispreviaroturade célulasy posteriordigestióncon la

enzimacorrespondiente,pero debido a la labilidad de las moléculasde ácido nucleico se

invirtió el orden en esteprotocolo, es decir una primera etapaen la que se trataba con

DNAasa o RNAasa(previapermeabilizaciónde las célulasa las enzimas)y una posterior

etapa de rotura celular, de esta forma se consiguió una significativa mejora en la

repetitividadde los resultados.

0

121

ProcedimientoExperimental

El protocolo de preparaciónde las muestraspara el análisis de Ácidos Nucleicos

medianteel métodode SambrookModificado se detallaa continuación:

En primer lugar debe realizarseel lavadode las célulasmediantecentrifligaciona 4000

r.p.m. (2860 g) durante30 minutosy resuspensióndel precipitadoen el tampónTris. Esta

operación se repite 5 veces para eliminar el xantano adherido a las células. A

continuaciónse procedeal fijado de las células,con ello se pretendeabrir poros en la

pared de la bacteriapara permeabilizarlaa las enzimasque se van a emplear.Paraello,

una vez lavadaslas célulasse centrifugana 4000 r.p.m. (2860 g) durante15 minutosy se

resuspendenen 3 mL de la disoluciónde glutaraldehidoal 3% en Tris 0.1 M - NaCí 0.1

M. se agita y sonicadurante 1 minuto para disgregarlos agregadosde células,que se

formancon frecuencia,y finalmentese incubadurante4 horasa 40C.

Una vez eliminado el glutaraldehidomediantecentrifugacióna 4000 r.p.m. (2860 g)

durante15 minutos,y la posteriorresuspensiónen tampónTris, las muestrassonpasadas

a Eppendorfpreviamenteesterilizados.Las células son centrifugadasa 10000 r.p.m.

(18000 g) durante10 minutosy resuspendidasen una disoluciónde DNAasa 1 mg/mL

cuandose quieraanalizarRNA y en una disoluciónde RJNAasa1 mg/mL cuandolo que

se quiereanalizares DNA. Se incuba,en amboscasosa 370C.durante30 minutos.

Pasadoel tiempo de incubación,las célulasson tratadaspara conseguirsu rotura. Para

eflo, se centrifugaa 10000 r.p.m. (18000 g) durante10 minutos y se resuspendeel

precipitadoen una soluciónde lisozima lO mg/mL se agita e incubadurante15 minutos

a 37 T y, a continuación,se añade lOO gL de tampón3, se incubadurante15 minutos

a 370 C y se mezcla cada5 tninutospor inversión.

Pasado el tiempo de incubación, se realiza la extraccióny purificación del ácido

nucleico, para lo cual seañaden400 gL de fenol (equilibradoen tampónTris), se agita

suavemente y se centrifuga durante5 minutosa 10000 r.p.m. con esto se consiguela

desproteinización,quedandoel ácido nucleicoen la fase superior.Dicha fasesepasaa un

Eppendorf limpio, añadiéndose400 .ii de una disolución de cloroformo - alcohol

isoamulico. se agita y centrifuga a 10000 r.p.m. durante5 minutos. Se pasa la fase

superiora Eppendorflimpio y se repite estaoperación2 ó 3 veces(fenol, cloroformo-

alcohol isoarnilico). Finalmentesepasala fase superiora un tubo de vidrio estéril y se

añaden2 mL de etanol al 90 % (a 40C) dejándoloresbalarpor las paredespara que

quedendosfases.Se dejaprecipitarde 1 a 4 horasa -700C.

Se recogeel ácidonucleicoprecipitadomediantecentrifugación,se lava el precipitado

con 500 4L deetanolal 70 %.y despuésseresuspendeenimLde tampónTris.

122

ProcedimientoExperimental

Luego se preparandiluciones a partir del ácido nucleico resuspendidoempleandoel

mismo tampón.

Se lee la absorbanciaa 260 nm. Tambiénes necesariomedir la absorbanciaa 280 nm

paraconocersi el ácidonucleicoextraídoestaimpurificadocon proteínas.Si el cociente

entrela lecturade absorbanciaa 260 nm y el de 280 nm esaproximadamente1,8 el DNA

estápuro; en cuanto al RNA este cocientedebeserpróximo a 2, parapoder considerar

que se ha purificado. Para convenir los valores de absorbanciaen concentraciónse

realizade la siguienteforma (Sambrooky col., 1987):

ParaRNA: 1 unidaddeabsorbanciaes aproximadamente40 yig/mI.

ParaDNA: 1 unidadde absorbanciaes aproximadamente50 É.tg/mL.

Los resultadosexperimentalesdel análisisde las muestrastomadasdel fermentador

se muestranen la Figura 2.14 parael DNA y en la Figura 2.15 para el RNA. Como se

puedeobservar,los valoresobtenidosen cadaensayosonbastantediferentesy, por tanto, el

método no permiteobtenerresultadosrepetitivos.La dispersiónobtenidaen los resultados

proporcionadosporel análisisdescritohaceque estemétodono seaaplicableparaconseguir

datos utilizablesen el desarrollode modeloscinéticos,ya que en ocasionesel error llega al

70%. No obstante,hay que comentarquedesdeun punto de vistacualitativo los resultados

son buenos,debidoa la buenapurificacióndel ácidonucleico.

0,4

0,2

Q

0.00 0 20 30 40 50 60

t (h)

Figura 2.14.-Evoluciónde la concentracióndeDNAel métodode Sambrookmodificado.

de Al campestrismedidapor

223

ProcedimientoExperimental

.4

0

30

(h)

Figura 2.15.- Evolución de la concentración de RNApor el métodode Sambrookmodificado.

De todo lo anteriorsobreel análisisde componentesintracelularesmediantepruebas

bioquímicasbasadasen la medidade absorbancia por espectrofotometríade absorciónse

puedeconcluir que el método Lowry permite una buenacuantificaciónde las proteínas,

mientras que el método de análisis de ácidosnucleicosno aportaresultadosrepetitivos,

debidoa ciertosinconvenientesque puedenresumirseen los siguientesaspectos:

Las sucesivascentrifttgacionesrequeridasen el análisis puedenprovocarla pérdidade

ciertacantidaddel componente.

2.- Puede existir un elevado error en el método debido a la interferencia1 y en la

absorbanciaa 260 nm, entrelas proteínasy los ácidosnucleicos.

3<- La ruptura y degradaciónde las moléculasa analizar(debido a su labilidad) pueden

suponertambiénuna fuenteimportantede error.

de Xi campestris medida

124

ProcedimientoExperimental

2.5.2.-Técnicasde Fluorescencia

Debido a que no se obtuvieron buenos resultadoscon las técnicas basadasen la

espectrofotometríade absorciónpara la cuantificaciónde componentesintracelularesy su

posteriorrelacióncon los datos obtenidosmedianteCMI, fue necesariobuscarotratécnica

que permitiesesolventarlos inconvenientesobservados,básicamenterelacionadoscon la

roturay extraccióndel componenteintracelular.

Porello, la técnicaque se empleófUe la Espectrofluorimetría(EFM), que se basa,al

igual que la CMI, en la medida de la intensidadde fluorescenciade los fluorocromos

unidos de forma específicaal componenteobjeto de análisis. La gran ventajaofrecidapor

estatécnicaesquela preparaciónde las muestrases idénticaa la seguidaparaCitometriade

Flujo, es decir no implica rotura celular ni extraccióndel componente.Ademáspermite

obtener curvas patrón para la correlaciónentre la intensidad de fluorescenciacon la

concentracióndel componente.

El fluoróforo más habitualmenteempleadopara la tinción de proteínas es el

[sotiocianatode Fluoresceína(ITCF), el cual forma uniones covalentespermitiendoel

análisisde proteínatotal (Petit y col., 1993).

El protocolode preparaciónde las muestrasparael análisisde proteínasmediante

ambastécnicas t1uorimétricas (CMF y EFM) se detalla a continuacióny se presenta

esquematizadoen la Figura2.16.

En primer lugar debe realizarseel lavado y fijado de las células, siendo estaetapa

idénticaa la ya descritaen el apanadoanterior.Con ello, ademásde eliminar el xantano

pegadoa las células,se consigue la perrneabilizaciónde la pareddel microorganismo

paraqueentrentanto los fluorocromoscomo las enzimas.

Con el fin de llevarsiempreun determinadonúmerode célulasal Citómetro,es necesario

ajustarla concentraciónde las mismas.Esteajustese harealizadopor contajemediante

el contadorde partículasCoulterCounterconun tubo de 30 l.tm, y diluyendolas muestras

en tampónTris para llevarun númerode célulasen un intervaloentre500-2000cel4tL.

Una vez ajustadala concentración,las muestrassonpasadasa Eppendorfestérilescon el

fin de procedera la tinciónespecífica.

125

ProcedimientoExperimental

MUESTRA

Cenírijugac¡on:000 r.p.m.10 m¿nuut

SOBRENADANTE PELLET(Células)

LAVADO Cenlrifugación5000 r.p.m.

110mmCELULASLAVADAS

Cenrrifugación5000r.p.m., 10 muzFIJADO ResuspensiónRe/leíGlutaraldehido 300

4/r 40(’

CELUL4SFIJADAS}Ceníríjúgación5000r.p.m.LO mit?.Resuspensión en TampónTris

AJUSTECONCENTRÁClON

~ÍNAS

TINCIÓNcon¡Tel’ (0.1 íng/mL)

I Incubar4’ C

40 mm

LAVAR EDICESTIONRNAasa DIGESTIÓNDNAaso

(1 mg/LI, 37’ C, 4Omin) <1 mg/mL.37”(’, 40 mm.)

TINCIÓNconIP (0.1 mg/mL)

¡Incubar 4 “C, /0

MEDIDA en CITÓMETRO DE FLUJO y en FLUORÍMETRO

Figura 2.16.- Protocolo de preparación de las muestras para análisis porEspectrofluorimetriay Citometríade Flujo.

126

ProcedimientoExperimental

Parala tincióncon ITCE se centrifugaa 10000 r.p.m. (18000g) durante10 minutos.El

precipitadoes resuspendidoen una disoluciónde ITCF de 0,1 mg/mL se agita e incubaa

40C durante1 hora,posteriormentese lavanlas célulastres vecesen TampónTris, para

eliminar el excesode fluoróforo que podríaprovocarproblemasen la fluorescenciade

fondo enel análisis.

Para la lectura de fluorescencia en el espectrofluorímetro, la longitud de onda de

excitación hasido 498 nm conuna rendijade 4, para la emisión, la longitud de ondafue

de 520 nm y unarendijade 2. La temperaturade análisisfue 250 C en todoslos casos.

Los valoresde fluorescenciaobtenidossonextrapoladosen la curva patrónpreviamente

realizada con uSA (albúmina de suero de bovino) de concentraciónconocida, para

obtenerlas curvascorrespondientesserealizó el calibradode la siguienteforma:

Calibrado del Análisis por FluorimetríasaraProteínas

Parael calibradode proteínasse empleó albúminade suerode bovino(BSA). Debido a

que el fluoróforo empleadopara la tinción de proteínas(Isotiocianatode Fluoresceina)

emite fluorescenciatanto si se encuentraunido a las moléculasde proteínacomo si no lo

está, fue necesarioeliminar el excesode ITCF paraevitarde estaforma la fluorescencia

de fondo.Paraello, se aplicó unadisoluciónde 1 mg/mL a unacolumnade filtración de

membrana(PO lO). Las primerasfraccionessonlas correspondientesa la proteinaunida

al ITCE. Se realizó una valoraciónde la concentraciónproteicade estafracción,paralo

cual se empleóel método deLowry (Lowry y col., t951).A partir de estadisoluciónse

preparanmuestrasen un intervalo de concentraciónentre 0,01 a 0,5 mg/mL. Los

resultadosde la relación intensidad de fluorescencia(IF) con la concentraciónde

proteínassereflejanen la Ecuación[2.10], enesteajusteel coeficientede correlaciónfue

de r0,952.

c;~(g/L) = 1,931W3 .jJ7F ED [2.10]

La Figura 2.17 muestralos resultadosobtenidosal analizar la evolución de las

proteínasmedianteespectrofluorimetríaa lo largo de la fermentación. Los datos son

expresadosen concentración, por extrapolaciónde la intensidad de fluorescenciade

acuerdoa la ecuación[2.10]. Los resultadosparalos dos ensayosrealizadossonrepetitivos

al igual que ocurríacon el análisismedianteel métodoLowry.

Aunque los resultadosobtenidospara el análisis de proteínasmedianteel método

Lowry eran repetitivos,se decidió realizarla correlaciónde los datos obtenidosmediante

127

ProcedimientoExperimental

CrVIF con los obtenidos medianteespectrofluorimetría.La razón ftmndametnales que la

preparaciónde las célulasporambastécnicasde análisises idéntica.

0

0.

Para llevar a caboel calibradode los datos obtenidosporCMF con los obtenidos

por EFM se emplearon50 muestras,las cualesse obtuvierona lo largo de un proceso

fermentativo con el fin de obtenerdatos a lo largo de toda la fase de crecimientodel

microorganismoy así obtenertodo el intervalo de concentraciónposible de proteínas.La

Figura 2.18 muestrala relaciónentreel valor de Mean (intensidadmediade fluorescencia

porcélula)con el contenidoporcélula(g/célula)de proteínaobtenidoal extrapolarlos datos

de IFF en la Ecuación [2.10]. La curva de calibradose ha obtenido con muestrascon un

númerode células comprendidoentre200 a 2000 cel! gL. La Ecuación[2.111muestrala

correlaciónobtenidade estaforma:

C(g/L) = (0,25 IF—5,9S) ED NC [2.11]

0,8

o

0.4

(It

Figura 2.17.-Evoluciónde proteínasobtenidamedianteEFM.

128

ProcedimientoExperimental

-é

Q

IF (nnn)

Figura 2.18.-CalibradoCMF - EspectrofluorimetríaparaProteínas.

Para el Análisis de Ácidos Nuteicos,el fluoróforo empleadopara la tinción de

ambostipos de ácidosnucleicosesel loduro de Propidio (II’) que esun agenteintercalante

entreparesde basesenácidosnucleicosde doblehebra;por tanto seunetanto aDNA como

a RNA, lo que implica que debe realizarseun tratamientoprevio con RNAasa o con

DNAasaen fUnción del ácidonucleicoa analizar(Petit y col., 1993).

Se puedenempleartambiénfluoróforosespecíficosparacadatipo de ácidonucleico,

por ejemplonaranjade acridinaparaRNA y DAPJparaDNA (Mafiah y col., 1993),pero,

en principio, se decidió realizar el estudio con IP, por ser uno de los fluoróforos más

habitualmenteempleados.

El protocolo de preparaciónde las muestrasparael análisis de ácidosnucleicos

medianteambas técnicas fluorimétricas (CMF y EFM) se muestratambién de forma

esquemáticaen la Figura 2.16, presentadaanteriormente,el protocolo de este análisis se

detallaa continuación:

15,

20 30 40 60 60 70 80

129

ProcedimientoExperimental

En primer lugar, debede realizarseel lavadoy fijado de las células,siendoesta etapa

idéntica a la va descritaen el apartadoanterior. Con ello, ademásde eliminarel xantano

pegadoa las células,se consigue la permeabilizaciónde la pared del microorganismo

paraque entrentanto los fluorocromoscomo las enzimas.

Con el fin de llevar siempreun parecidonúmerode células al citómetro, es necesario

ajustar la concentración de las mismas.Esta operación se ha realizadomedianteel

contadorde paniculasConíter Counter con un tubo de 30 ~¡m,y diluyendolas muestras

en tampónTris parallevar un númerode célulasenun intervaloentre500-2000cel4tL.

Debidoa que cliP se unetanto a DNA como a RNA, debehacerseun tratamientoprevio

con DNAasao RNAasa,segúnel componentea analizar(Petit y col., 1993).Lasetapasa

seguir, unavezfijadas las células,sonlas siguientes:

Digestión con enzimas. Se reparte 1 mL de cada muestraen tubos lBppendorfy se

centrifugana 10000 r.p.m. (18000g) durante10 minutos.Se resuspendeel precipitadoen

una disolución de DNAasa 1 mg/mL en Tris 0.IM-NaCI, (pH 7,4) para el análisis de

RNA, y en tina disolución de RNAasade 1 mg/mL en Tris 0,1 M-NaCI, (pH 7.4) parael

de DNA; se agita e incubaa 37 0C durante40 minutos.

Parala tinción con IP primero es necesariocentrifugar a 10000 r.p.m. durante lO

minutosparaeliminar la enzima.El precipitadose resuspendeenuna disoluciónde IP de

0,1 mg/mL en Tris posteriormentesc debe agitar y, protegidode la luz, incubara 4 ~C

durantelO minutos.

Para la lectura fluorescencia de las muestras teñidas con IP debenemplearselas

siguientes condicionesde análisis en el Espectrofluorimetro: longitud de onda de

excitaciónde 536 nin y una rendija de 19. Para la emisiónse empleó una longitud de

ondade 623 nm y unarendijade 5. La temperaturaempleadaduranteel análisisfue de

25~ C en todoslos casos.

Los valores de fluorescenciaobtenidosson convenidosen concentracionesde DNA y

RNA por calibrado. Paraobtenerlas curvascorrespondientesse realizó el calibrado de

lasiguienteforma:

Calibradodel Análisispor FluorimetríaparaÁcidosNucleicos

Parael calibradode DNA y RNA se emplearon,respectivamente,patronesde DNA de

timo de bovino y RNA de levaduraen un intervalode concentracionesentre0,001 a 0.1

mg/mL. Tiñendoconloduro de Propidio0,02mg/mL. ya quese comprobóque éstaera la

concentraciónde saturaciónde la disoluciónde 0,1 mg/mL de DNA y RNA para el IP.

130

ProcedimientoExperimental

Los resultadosobtenidosdel ajuste por regresiónlineal de losdatos deconcentraciónde

las disolucionespatróncon los valoresde Intensidadde Fluorescencia(1pE), se muestran

en las ecuaciones[2.12] y [2.13]:

<g L)=3,68!0’ UF> ED [2.12]

Cj(g Lp’ 3,4610> lE . ED 12.13]

Siendo [F~ la intensidadde fluorescenciamedidaen el fluorimetro y FD el factor de

dilución de la muestraanalizada.

Parael análisisde las muestrasen el Citómetro de Flujo las condicionesempleadasson:

Filtro parala excitaciónde 488 mn, mientrasque paraemisión el filtro empleadofue de

600 nm. La fuentede iluminación fue una lámparadexenonde 75 W.

Unavezpreparadaslas muestrasprocedentesdel fermentador,siguiendoel protocolo

que se ha indicadomás arriba,se obtuvieronlos resultadostanto de su análisismediante

EFM comoporCMF.

En el casodel análisis utilizandoCMI, seobtieneun histogramapormuestra,con

una serie de datos estadísticos,como son la mediade la intensidadde fluorescenciapor

célula (Mean) y el coeficientede variación (CV), ademásde indicar el númerode células

por unidadde volumen.Los histogramasobtenidosen el análisisde muestraslo han sido de

forma monoparamétricapara cadacomponente.La abcisarepresentala distribución de la

señalde fluorescenciaen canalesy la ordenadael númerorelativo de células.En la Figura

2.19 semuestraun histogramatipo, de los obtenidosparauna muestraanalizadamediante

CMF. Se muestraen la citadafigura un histogramacorrespondientea la fluorescenciaverde

(FLI) que es la fluorescenciaemitida por las proteínasteñidas con isotiocianato de

fluoresceína.El otro histogramamuestrala fluorescenciaroja (FL2) que esla fluorescencia

emitida por los ácidosnucleicos(DNA y RNA> teñidoscon loduro de propidio. En ambos

casosla fluorescenciamedia por célula aportael valor Mean, necesariopara realizar la

cuantificacióndel componentecorrespondiente.

Las Figuras 2.20 y 2.21 muestranla evoluciónde DNA y RNA obtenidasmediante

espectrofluorimetriaa lo largo de la fermentación. Los datos son expresadosen

concentraciónpor extrapolaciónde la intensidad de fluorescenciade acuerdo a las

131

ProcedimientoLrperimental

ecuaciones[2.12] y [2.13], para DNA y RNA, respectivamente.Los resultadosobtenidos

paralos dos ensayosrealizadosson repetitivosy evitan los problemasencontradoscon los

métodosbasadosen la espectrofotometríade absorcion.

4,

o.0~

¡ 2

FL2FLI 2 2170

4.’c.20•(-y

54;?

156

Figura 2.19.- Histogramatipo de una muestra obtenida mediante CMF. FI] es lafluorescencia verde (proteínas) y FL2 la fluorescencia roja (ácidosnucleicos).

0,4

10

7

0,0

Figuras 2.20.- Evolución de RNA duranteEspectrofluorimetría.

la fermentación analizado por

4~~1

132

ProcedimientoExperimental

0,4

0.2

rj~

0,0

50 60

Figura 2.21.- Evolución de RNA durante la fermentación analizado porEspectrofluorimetria.

De lo visto en esteapartadoparael análisisde ácidosnucleicosmediantetécnicas

basadasen la medidade la fluorescenciade las célulasteñidascon IP, sepuedeconcluir que

la espectrofluorimetríaes una técnica que permite la correcta cuantificación de los

componentes intracelulares,dadala repetitividadde los resultadosconseguidosen dos

análisisde las mismasmuestras.Por lo tanto, con estatécnicase puedenobtenerresultados

fiablesparael seguimientode ácidosnucleicosduranteun procesomicrobiano.No obstante,

ya se comentó anteriormenteque, debido a las enormesposibilidadesque presenta la

Citometríade Flujo frentea otrastécnicas,erainteresanteemplearestatécnicaparaefectuar

el seguimientode los diferentes componentesintracelulares.Ahora bien, es necesario

encontrarla forma de obtenerresultadoscuantitativoscon dicha técnica.Debido a que la

fluorimetríarinde resultadosfiablesparaobtenerunarelacióncuantitativacon los datos de

intensidadde fluorescenciade la CMF —como hicieron Agar y Bailey (1982)-, sepensóen

obtenerunarelaciónentrelos datoscuantitativosconseguidosmedianteespectrofluorimetría

y los datosen unidadesrelativasobtenidosporCitometríade Flujo.

Ya que el protocolo de preparaciónes idéntico para ambastécnicas,la misma

muestrafue analizadautilizandoambosmétodosde análisis. LacorrelaciónCMTF-EFM para

DNA y RNA fue realizadamedianteel análisis de 50 muestrasparacadaclasede ácido

nucleico. La misma muestraera analizadamedianteambastécnicasen un intervalo de

133

O lO 20 30 40

t (h)

ProcedimientoExperimental

tiempo no superiora 5 horas,paraevitar posibleserrorescomo consecuenciade la pérdida

de fluorescencia.Es importantellevar al citómetromuestrascon un númerode célulaspor

unidadde volumen muy similar, prácticamenteigual, con el fin de que los histogramas

fuesen siempre comparables,por lo que las muestras analizadastenían todas tina

concentracióncelularcomprendidaentre200 a2000eel/gL. Otroaspectoimportantea tener

en cuenta,a la hora de realizarel caJibrado,es el intervalode concentraciónde cadatipo de

ácido nucleico pues era absolutamentenecesariocubrir todo el intervalo que permitiese

posterioresanálisis,durantetodo el ciclo celular de la bacteria.Paraello, las 50 muestras

analizadasfueron tomadasdurante las diferentes etapasde la fase de crecimiento de

Xanthomonascampestrisy, de estaforma, se obtuvo todo el intervalo de concentración

posible.En la Figura 2.22 aparecereflejadala relación entre las medidasconseguidaspor

CMF y EFM para ácidosnucleicos. Como puedeverse en dicha figura, las pendientes

obtenidasal representarconcentraciónpor célula vs. “mean” son igualespara ambostipos

de ácidosnucleicos,por tanto,el ajustepor regresiónlineal serealizó uniendo lo obtenido

parael DNA y lo obtenidoparael RNA. El resultadode este ajusteaparecereflejado en la

ecuación[2.13].,en la que es necesarioconocerel númerode células(NC); estedato,como

ya seha comentado,esobtenidotambiénmedianteCitometríade Flujo. El coeficientede

regresiónobtenidoenesteajustees r0,996.

C~\V~\~(gXL) = 0,11 JEúwr ED NC [2.14]

o

y.,

2

70

IF(n~n)

Figura 2.22.-RelaciónentreIF obtenidaCMF y concentraciónobtenidapor EFM

20 30 40 50 60

234

ProcedimientoExperimental

2.6.-MÉTODOSMATEMÁTICOS

Debido a que en la presenteMemoria ha sido necesariola aplicaciónde diferentes

técnicasde cálculo, se va a dedicareste apartadoa realizaruna breve descripciónde las

mismas.

Las técnicasmatemáticasempleadasse puedendividir en dos grandes grupos:

técnicasde estimaciónde parámetrosa partir de datosexperimentales(regresión)y técnicas

de simulaciónde la evolucióndel sistemacon lasvariablesestudiadas.Todos los programas

de cálculo empleadosse han desarrolladopara llevar a cabo este trabajo y han sido

realizadosen FORTRAN 77. A continuaciónse expone brevementeel fundamentoy la

forma de aplicaciónde estastécnicas.

2.6.1.-TécnicasdeEstimacióndeParámetros

Las técnicas de estimación de parámetros o regresionesse han empleado

principalmenteen la aplicacióna datosexperimentalesde los modeloscinéticospropuestos,

pero han sido necesariaspreviamenteen la obtenciónde las expresionesde calibradode las

diferentestécnicasde análisisempleadascomentadasanteriormente.

Para la obtenciónde las ecuacionesde calibrado de los diferentesmétodosde

análisisse ha utilizado en todos los casosregresioneslineales,con ordenadaen elorigeno

sin ella, dependiendodel método de análisis empleado. El criterio de optimización

empleadoha sido el de los mínimoscuadrados:

y

t ~yexp — Y¡eor Y -4 mínimo [2.15]¡=1

En los casosen los quesehaempleadoestetipo de regresión,paradescribirel grado

de ajustesehatenido encuentael coeficientede regresión,r.

En el casode la aplicaciónde estastécnicasde regresióna datosexperimentales,

en todos los casosse han utilizado métodos no lineales basadosen el algoritmo de

Marquardt (1963). Dependiendodel modelo a aplicar, se ha llevado a cabo el ajusteen

135

ProcedimientoExperimental

simple-respuestao en múltiple-respuestazesdecir, seha ajustadoúnicamentela evolución

de un componente,generalmentedebidoa que en la expresiónque representasu velocidad

de producciónno apareceningún otro componente(simple-respuesta);o, por el contrario.

si las velocidadesde producciónde varios o todos los componentesclave del sistemaestan

tnterrelacionadases necesario llevar a cabo la regresión simultánea de todos los

componentes(múltiple-respuesta).En este último caso, se hace necesarioigualar los

residuosde los diferentescomponentes,en caso de que los valoresde unoscomponentes

respectoa otros presentendiferenciassignificativasen órdenesde magnitud.es decir, se

hace necesario“pesar los residuos” para que todos los valores presentenla misma

significaciónen el algoritmo de regresión,que de nuevooptimiza la sumade los cuadrados

de los residuos(ecuación[2.15)).

La obtención de todos los parámetroscinéticos se ha llevado a cabo tanto en

términos de velocidades de produccióncomo de velocidadesde reacción, empleando

siempreel método integral, ya que es el mejor método para llevar a cabo estecálculo

cuando se cuentacon datos integrales(evolución de la composicióndel sistemacon el

tiempo). En el caso de plantear los modelos cinéticos términos de velocidadesde

producción,es decir, como un conjunto de ecuacionesdiferenciales, ha sido necesario

acoplarun métodonuméricode integraciónde las citadasecuaciones,debidoa que los datos

experimentalesobtenidosson, como seha indicado,datos integrales.El métodonumérico

de integraciónempleadoha sido el algoritmode Runge-Kuttade cuartoorden,por lo quese

ha hecho necesario acoplar este algoritmo en forun de subrutinas a los programas

desarrolladospara el ajustede los datosexperimentalesa cadamodelo cinéticopropuesto.

En la Figura2.23 sepuedeobservarel diagramade flujo general delprogramade regresión

no lineal empleadoen los diferentesmodeloscinéticosajustados.

Cuandoseempleael métodode velocidadesde reacción,el ajustese lleva a caboen

simple-respuesta,empleandocomo método de integraciónde las ecuacionescinéticasel

algoritmo de Simpson,siendo necesario,en estecaso,acoplaruna subrutinacon el citado

algoritmoal métodono lineal de ajuste.En la Figura2.24 se recogeel diagramade flujo que

resumeestemétodode cálculo.

En el caso de que el ajuste realizadocon los modeloscinéticos a los diferentes

experimentosllevados a cabo proporcioneuna evoLución lógica de los parámetrosque

136

ProcedimientoExperimental

contienen, se lleva a cabo de nuevo el ajuste de todos los datos de los diferentes

experimentosintroduciendo,en el lugar de los parámetrosdel modelo la expresiónque

correspondasegúnlaevoluciónobservadaen los ajustesprevios.

En todas las regresionesno lineales llevadas a cabo se han consideradocomo

indicativos de la bondaddel ajusteobtenido los siguientesparámetrosestadísticos:E de

Fischer,indicativo del gradoglobal de ajuste;t de Student,indicativo del grado de ajuste

parámetroa parámetro(relacionadocon el intervalodeconfianzade los parámetros:valores

mínimo y máximo proporcionadospor el algoritmo de regresión); y SRC o suma de

residuos al cuadrado, indicativo de la calidad en la reproducción de los datos

experimentales.La comprobaciónde la bondaddel ajuste,en lo referentea los parámetros

estadísticoscomentadosse realizaapartir de la comparacióncon los valoresde los mismos

parael 950o de confianza,segúnel númerode parámetrosa calcular y el númerode datos

queseempleanen el ajuste.

2.6.2.-Simulacióncon los ModelosCinéticos

Las simulacioneso prediccionesque se llevan a cabocon los diferentesmodelosa

los que se hanajustadolos datosexperimentalessirven paracomprobarqué influenciasson

capacesde predeciren cadacaso.Paraello, únicamenteesnecesariorealizarla integración

conjuntade todaslas ecuacionesdiferencialesque formanlas velocidadesde produccióndel

modelocinéticodel que se trate.Los programasdesarrolladospararealizarlas simulaciones

necesitanúnicamenteel algoritmo de Runge-Kuttade cuartoordenparala integracióndel

modelo y proporcionarlos valoresde las concentracionesde los diferentescomponentes

clave del sistema, una vez introducidos los valores de los parámetrosa emplearen la

simulación,así como los valoresde las variablesa emplear(temperatura,agitación,caudal

de aire,etc.) y los valoresde las concentracionesinicialesde los nutrientesy de la biomasa.

En la Figura 2.25 se recogeel diagramade flujo generalde los programasempleadospara

realizarla simulacióncon los modeloscinéticos.

137

ProcedimientoExperimental

sí

Figura 2.23.-Diagramade flujo del programade regresiónno lineal en múltiple respuestaempleadobasadoen el algoritmode Marquardt (1963).

NO 1INVERCálculo de inversak

RUNOE NEcuacionesdiferenciales

138

ProcedimientoExperimental

sí

Figura 2.24.- Diagramade flujo del programade regresiónno lineal en simple respuestaempleando el método en velocidadesde reacción con el algoritmo deMarquardt (1963).

139

ProcedimientoExperimental

INICIODIMENSIÓN

RUNGFNEcuacionesdiferenciales

ARCHIVORESULTADOS

RESULTADOS

Figura 2.25.-Diagramade flujo del programade simulaciónempleado.

RLTNOKNAlgoritmoRunge-Kutta

140

3.- RESULTADOSEXPERIMENTALES

ResultadosExperimentales

3.- RESULTADOS EXPERIMENTALES

Se han realizadodiversos experimentos,en todos ellos utilizando Xanthomonas

campestrisparaproducir xantano,el polisacáridocuyaspropiedadesse describieronen la

Introducción.En dichosexperimentossehanmantenidoconstantesunaseriede condiciones

de operación,previamenteestudiadasy optimizadasen otros trabajos (Santos, 1993 y

García-Ochoay col., 1997). Estascondicionesde operaciónsonlas siguientes:

- Inóculo, realizado en una etapa en el medio YM a partir de un cultivo en medio

sólido (YM agar) de menos de tres días. El inóculo se incuba en incubadora

orbital durante12 horasa 280 C.

- Medio de Producción: estemedio esel denominadoMedio A, y quefue descrito

en el apartado 2.2.3 de esta Memoria, con el que se consigue un rápido

crecimientode X Campestris y una producciónadecuadade xantano(García-

Ochoay col., 1992).

- pH inicial de 7,00 dejándolo evolucionar libremente a lo largo de la

fermentación.

141

ResultadosExperimentales

- Temperatura, la optimizada para la producción es de 280 C. si bien se ha

experimentadoa diferentestemperaturascomo 25, 3 1 y 34 o C, para tratar de

describir la influenciade estavariablecon un modelo cinético.

- Agitación programada,ya que el extraordinarioaumentode viscosidad,debidoa

la produccióndel polisacárido,haceque no puedaemplearseuna agitaciónfija.

Si la velocidadde agitaciónes inicialmentemuy alta, las bacteriassufrendaños

celulares,pero si no se subela agitacióncuandoaumentala viscosidad,no se

consigueuna eficiente velocidadde transportede oxígeno, y su concentración

disminuyehastacero, lo cualafectade formanegativaal microorganismo,quees

aerobioestricto,y en consecuenciaa la produccióndel polisacárido.

En los experimentosrealizados,sehan variadodoscondicionesde operacion:

- Temperatura,como ya fue establecidoen un trabajoprevio (Santos, 1993) la

temperaturainfluye de forma considerableen la producción,por ello se han

realizadoexperimentosa cuatrotemperaturasdiferentes25, 28, 31 y 340 C.

- Concentracióninicial de nitrógeno, siempreen forma de amonio, se han

realizadoexperimentoscon cuatrovaloresde concentraciónde amonio: 65, 130,

257 y 475 p.p.m..

En total se hanrealizado7 experimentos,cuyascondicionesse muestranen la Tabla

3.1. La programaciónde la agitación,aún siendosimilar en todos los experimentos,varia,

debidoa queel aumentode la agitaciónesrealizadosegúnla evoluciónde oxígenodisuelto

en cada caso, y dicha evolución no ha sido igual en los distintos experimentos,pues el

cambiode todasestascondicioneslleva a unaevolucióndel sistemabastantediferente.

A la hora de planificar el seguimientode los distintos componentesdel sistemaa

estudiar,sehizo un planteamientopreviode los modeloscinéticosque iban a seraplicados

de modoquees lógico pensarque paralos ModelosCinéticosNo Estructurados,estoes los

modelosmás sencillos,el númerode componentesa analizarseareducido,mientrasque el

142

ResultadosExperimentales

número de componentesa seguir y/o analizaraumentecon el grado de complejidaddel

modelo.En los modeloscinéticosmáscomplejosaplicados,los denominadosEstructurados

o de Célula, esnecesariorealizarel análisis de componentesintracelulares.

Por ello, desdeel principio se realizóel seguimientoy análisisdel mayornúmerode

componentescon el fin de aplicar los diferentestipos de modelospropuestospara los

mismosexperimentos.Además, todos los experimentosfueron repetidosdos vecescon el

fin de tenerel mayor númerode datosa lo largodel tiempode fermentación.Debido a que

el tiempo a que se tomaronalgunasde las muestrasen las dos fermentacionesrealizadasen

las mismascondicionescoinciden,los valoresobtenidossepresentancomo la mediaentre

ambos en la tabla correspondiente.Los resultadosde los distintos experimentosse

representanen lasTablas3.2 a3.8, unaparacadaexperimento.

Tabla 3.1.-Experimentosrealizados: condicionesvariadas

ExperimentoMedio A

Concentración NH4~(p.p.m.)

Temperatura(0C)

1 257 25

2 257 28

3 257 31

4 257 34

5 65 28

6 130 28

7 475 28

‘43

ResultadosE?vperimentales

Tabla 3.2.- Resultadosobtenidosen el Experimenton0 1. Condicionesexperimentales:250C, 257 p.p.m. de amonio inicial y agitaciónvariable(210r.p.m. iniciales)

Tiempo Biomasa(It) (g/L)

0,00

1,00

2.00

4,00

5,75

7,75

9,00

10,00

12.00

16,50

1 7,00

20,00

24,00

24.50

25,00

25.75

28,00

29,00

29,50

32,75

34,75

35,00

3 8.00

50,00

50,50

52,25

55,00

56,75

0.010

0,011

0,012

0,0 17

0,028

0,048

0,065

0,07 1

0,106

0,350

0,4 lO

0.62 5

0,780

0.862

0,901

0.930

0,93 8

0,989

1,222

1,400

1,530

1.560

1,590

1,618

1,620

1,680

1.680

1 ,680

O->(0/ sat)

95,5

86.2

79,8

69,0

59,0

55,0

35,0

25.0

15,0

30,0

15,0

8,0

50

25,0

18,0

14,0

7.0

20,0

16,0

18,0

13,0

8,0

12,0

11,0

15,0

12,0

16,0

13.0

Agitación¡ (rpm)

210

210

210

210

210

210

210

210

210

350

350

350

350

400

400

400

400

550

550

550

650

650

650

750

750

750

860

860

NH4

(g/L)

0,3 10

0,300

0.290

0,270

0,250

0,2 10

0,190

0,180

0,160

0,080

0,070

0,060

0,077

0,073

0,069

0,067

0,055

0,050

0,045

0,03 5

0,029

0,025

0,022

0,021

0,020

0,020

0.020

0,020

Sacarosa(gIL)

40,0

39,9

39,5

39,0

38,0

37,8

37,2

36,7

36,9

36,2

35,6

35,2

35,0

34,8

34,0

33,9

32,0

31,0

30.0

28,0

25,5

24,3

23,9

16,9

16,5

16,0

15,9

15,7

Xanrano(g/L)

0.33

0,33

¡ 0,35

0,39

0,40

0,44

0,48

0,49

0,50

0,89

0,96

1,00

1,20

1,85

2,12

2,20

2.32

3,57

4,44

5,00

5,51

6,05

7,20

11,38

12,38

13,20

13,99

14,26

DNA(gIL)

0,0025

0,0027

0,003

0,003 5

0,0045

0.0082

0,011

0,019

0,022

0,036

0,070

0,150

0,190

0,2 10

0,250

0,270

0,290

0,320

0,340

0,349

0.3 70

0,400

0,420

0,430

0,430

0,430

0.430

0,430

RNA(g/L)

0,00 18

0,0019

0,002 1

0,0031

0,0055

0,0078

0.0095

0,012

0,019

0,063

0,073

0,108

0,14

0.155

0,162

0,167

0,168

0,178

0,2 19

0,259

0,270

0,280

0,283

0,288

0,290

0,304

0,306

0,306

Proteinas(g/L)

0,005

0.005

0.006

0,009

0,011

0,020

0.021

0,030

0,032

0.089

0,120

0,198

0,260

0,350

0,450

0.460

0,469

0,500

0,600

0,720

0,750

0,780

0,800

0,820

0,830

0,830

0,830

0,830

‘44

ResultadosExperimentales

Tabla 3.3.- Resultadosobtenidosen el Experimenton0 2. Condicionesexperimentales:280C, 257 p.p.m.de amonio inicial y agitaciónvariable(210r.p.m. inicial)

Tiempo Biomasa 02 Agitación N1-bt Sacarosa Xantano DNA RNA Proteínas(h) [ (g/L) (%) (rpm) (gIL) ~ J~fi~ ~ (gIL) (gIL)

0,309

0,300

0,298

0,287

0,280

0,275

0,269

0,266

0,254

0,247

0,220

0,190

0,166

0,140

0,100

0,082

0,073

0,055

0,045

0,025

0,0 13

0,00 1

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

36,5

36,4

36,0

36,0

35,9

35,7

35,0

34,7

34,0

33,8

33,5

32,9

32,0

31,8

28,7

26,0

25,0

24,0

23,0

21,0

20,2

18,0

17,2

12,0

10,6

10,6

10,6

10,6

0,00

2,00

4,00

7,00

9,00

12,00

13,00

14,50

16,00

16.50

19,50

23,50

24,00

24,50

28,00

32,00

33,50

34,00

38,00

38,50

39,50

41,50

42,00

43,75

48,00

48,50

52,00

59,00

0,070

0,084

0,099

0,130

0,156

0,209

0,229

0,288

0,300

0,350

0,480

0,620

0,663

0,790

0,910

1,220

1,252

1,350

1,400

1,450

1,500

1,548

1,560

1,580

1,580

1,580

1,580

1,580

100,0

73,0

¡ 59,0

34,0

24,0

16,5

10,5

8,0

5,0

35,0

25,0

15,0

5,0

28,0

19,0

15,4

10,2

24,5

18,5

10,0

5,0

17,0

28,0

21,8

20,3

30,0

28,0

21,0

210

210

210

210

210

210

210

210

210

310

310

310

310

380

380

380

380

550

550

550

550

650

650

650

750

850

890

890

2,19

2,19

2,19

2,19

2,23

2,29

2,33

2,39

2,59

2,62

2,99

3,90

5,82

6,21

7,30

7,59

7,78

8,10

8,40

8,90

10,48

11,20

12,00

13,28

14,90

15,13

15,22

15,20

0,017

0,03 1

0,037

0,042

0,049

0,065

0,085

0,120

0,137

0,165

0,199

0,235

0,240

0,250

0,290

0,330

0,33 5

0,3 50

0,3 70

0,3 75

0,3 80

0,3 90

0,395

0,395

0,395

0,3 95

0,3 95

0,395

0,0 12

0,020

0,021

0,030

0,035

0,042

0,048

0,054

0,081

0,088

0,110

0,149

0,160

0,170

• 0,199

0,215

0,229

• 0,230

0,255

0,260

0,265

0,269

0,270

0,270

0,270

0,270

0,270

0,270

0,035

0,039

0,044

0,050

0,05 8

0,069

0,089

0,092

0,115

0,129

0,135

0,210

0,250

0,320

0,480

0,600

0,7 10

0,720

0,760

0,765

0,772

0,775

0,780

0,780

0,780

0,780

0.780

0,780

14S

ResultadosExperimentales

Tabla 3.4.- Resultadosobtenidosen el Experimenton0 3. Condicionesexperimentales:310C, 257 p.p.m.de amonioinicial y agitaciónvariable(210r.p.m. inicial).

1 1 1Tiempo

(h)Biomasaft¿LL.

~2

(% sat)

Agitación(rpm)

NH4

...=±LSacarosa

~Xantano

(gIL)DNA(gIL)

RNA(g/L)

Proteinas(gIL)

0,220

0,219

0,212

0.200

0,197

0,190

0.189

0,180

0.172

0,170

0,084

0,064

0,057

0,056

0,050

0,048

0.030

0,027

0,025

0.0 15

0,010

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

40,0

40,0

40,0

39,9

39,9

39,9

3 9.89

39,80

39.50

38,20

38,00

36,50

36,00

34,00

33,00

32,00

30,00

29,70

29,20

28,30

27,00

26,02

25,60

25,00

24,60

24,20

0,00

0,50

1,15

3,00

3.50

6,00

8.00

8,50

9,00

10,00

12,00

14.50

15,00

16.00

18,50

20,00

23,50

24,00

24,50

25,00

26.50

27,00

28,00

30.00

31,75

35,00

0.130

0,150

0,158

0,169

0,173

0,199

0,230

0,25 1

0,304

0,385

0,420

0,550

0,590

0,600

0,680

0.700

0,890

0.900

0,950

0,985

0.990

1,026

1.026

1,07 3

1,058

1,05 8

90.0

59,0

46.0

34,1

23,0

14,5

35.0

22.0

12,8

10.0

6,0

32,0

20,0

12,0

8,0

4,0

22,0

18,8

17,0

10,0

20,0

1 8,0

15,0

20,4

16,3

15,0

210

210

210

210

210

210

350

350

350

350

350

450

450

450

450

450

500

500

500

500

580

580

580

700

700

700

0,39

0.39

0,39

0.46

0,47

0,53

0,60

0,67

0,87

0,87

0,91

0,99

1,10

2,30

3,20

3,50

4,30

4,80

5,20

5,90

6,20

7,00

7,21

8,07

8,67

8,60

0.0 12

0,0 12

0,0 12

0,0 13

0,015

0,018

0,021

0,02 8

0,030

0,032

0,036

0.048

0,067

0,072

0,082

0,100

0,126

0,129

0,130

0,132

0,143

0.145

0,152

0,158

0,160

0,160

0,003

0,004

0,006

0,007

0,010

0,0 16

0.0 10

0,021

0,024

0,030

0,03 3

0,040

0,05 5

0,065

0,078

0,099

0,116

0,122

0,126

0,129

0.13 1

0,13 3

0,13 8

0,142

0,143

0,143

0,010

0.0 12

0,0 14

0,025

0,027

0,050

0,078

0,086

0,095

0.116

0.160

0,230

0.250

0,280

0,3 20

0,400

0.470

0.500

0.530

0,564

0,580

0,590

0.590

0,5 90

0,590

0,590

146

ResultadosExperimentales

Tabla 3.5.- Resultadosobtenidosen el Experimenton0 4. Condicionesexperimentales:340C, 257 p.p.m. de amonioinicial y agitaciónvariable(210r.p.m. inicial).

Tiempo(It)

Biomasa(gIL)

02

(% sat)

Agitación(rpm)

N1-W~ Sacarosa...ÁÉLL....J (gIL)

Xantano....Ls~LL...

DNA 7 RNA ¡Proteínas~

0,00 0,045 97,70 210 0,202 40,0 0,94 0,011 0,008 0,020

3,00 0,087 81,00 210 0,175 39.8 0,99 0,021 0,015 0,043

6,00 0,104 70,00 210 0,161 38,9 1,00 0,026 0.019 0,520

9,00 0,122 60,00 210 0,156 38,3 1,13 0,030 0,022 0,061

12,00 0,135 67,50 250 0,148 37,9 1,16 0,033 0,024 0,067

14,00 0,191 50,00 250 0,147 36,8 1,20 0,047 0,034 0,095

14,50 0,200 45,00 250 0,145 35,7 1,30 0,100 0,036 0,102

18,00 0,280 30,00 250 0,143 34,1 1,50 0,070 0,050 0,140

20,00 0,320 29,00 250 0,142 34,2 1,90 0,080 0,057 0,160

24,00 0,407 41,20 280 0,140 33,0 2,05 0,101 0,073 0,203

24,50 0,496 32,30 280 0,139 32,5 2,20 0,124 0,089 0,248

30,00 0,698 28,10 280 0,133 31,4 4,47 0,174 0,125 0,349

33,00 0,739 20,50 280 0,127 30,5 4,98 0,184 0,133 0,369

36,00 0,820 45,00 350 0,125 28,9 5,75 0,205 0,147 0,410

36,50 0,890 40,00 350 0,122 28,0 6,50 0,220 0,160 0,440

40,00 0,950 38,00 350 0,120 27,9 7,50 0,237 0,171 0,475

42,00 1,090 43,00 350 0,119 27,8 8,00 0,272 0,196 0,540

45,00 1,089 42,00 350 0,110 27,5 8,12 0,272 0,196 0,540

48,00 1,089 45,00 350 0,110 27,2 8,12 0,272 0,196 0,540

147

ResultadosExperimentales

Tabla 3.6.- Resultadosobtenidosen el Experimento no 5. Condicionesexperimentales28’ C, 65 p.p.m. de amonio inicial y agitaciónvariable(210r.p.m. inicial)

Tiempo(h)

Biomasa O->( IL) (%)

7~iaciónNH4~

fL~~L1J~2Sacarosa

(g/L)Xantano~

DNA(g/L)

RNA Proteínas( L) ( /L)

0,0650

0,0620

0,0600

0,05 50

0,0500

0,0400

0,0330

0.0220

0.0 180

0,0 120

0,0 lO

0,008

0,007

0,005

• 0,004

0,0009

0,0008

0,0008

0,0008

0,0008

0,0008

0,0008

0,0008

0,0008

40,00

39,86

39,68

39,42

39,00

38,63

37,50

36.25

35.00

34,18

33,87

3 3,654

33,39

32,50

28,00

27,55

26,25

26,00

26,00

26,00

26,00

26,00

26,00

26,00

0,00

1,50

3,00

4,50

6,00

8,50

12,00

16,00

20,00

23,50

24,50

25.25

26,00

27.50

31,00

32,50

33,00

35,00

40,00

40.50

43.00

47,50

50.50

55,00

0.00853

0,0093 8

0,00980

0,0110

0,0 140

0,0330

0,05 20

0,1250

0,290

0,640

0,660

0,680

0,690

0,700

0,700

0,700

0,700

0,700

0.700

0,700

0,700

0.700

0,700

0,700

99.80

93.90

92.82

91,20

87,30

82,50

72.00

56.00

35.00

22,10

19,10

45,00

32,00

25,00

19,00

54,00

43,00

42.00

40,00

3 8.00

38,50

39,00

40,00

41,00

210

210

210

210

210

210

210

210

210

210

210

250

250

250

250

400

400

400

400

400

400

400

400

400

0,402

0,402

0,402

0,5 12

0.6 18

0,72 1

0,980

1,230

2,700

3,520

4,680

6,120

6,850

7,220

8,112

9,850

10,12

10,12

10,12

10,12

10,12

10,12

10,12

10,12

0,00 1

0,002

0,003

0,005

0,006

0,0 10

0,0 12

• 0,030

0,041

0,054

0,056

0,05 8

0,060

0.065

0,065

0,065

0,065

0,065

0.065

0,065

0,065

0,065

0,065

0,065

0.0008

0,0009

0,00 1

0,00 1

0,002

0.003

0,004

0,004

0,010

0,0 18

0,026

0.030

0,03 4

0,03 8

0,038

0,03 8

0,03 8

0,03 8

0,03 8

0,03 8

0.038

0,03 8

0.03 8

0,03 8

0,003

0,004

0,004

0.006

0,007

0,0 17

0,029

0,073

0,142

0,258

0,330

0,3 50

0,372

0,400

0,420

0.420

0,420

0,420

0.420

0,420

0,420

0,420

0,420

0,420

148

ResultadosExperimentales

Tabla 3.7.- Resultados obtenidos en el Experimento n0 6. Condicionesexperimentales280C, 130 p.p.m.r.p.m. inicial).

de amonio inicial y velocidadde agitaciónvariable (210

Tiempo(h)

Biomasa(g/L)

O,(% sat)

Agitación(rpm)

NH4~

(g/L)Sacarosa

(g/L)Xantanoj(~¿

DNA..ÁsIL...

RNA~

Proteinas(g/L)

0,130

0,129

0,129

0,128

0,128

0,127

0,127

0,126

0,120

0,110

0,063

0,044

0,020

0,012

0,009

0,007

0,004

0,003

0,002

0,002

0,002

0,002

0,002

39,7

39,5

39,3

39,0

38,7

38,5

38,0

37,7

36,7

35,9

34,9

34,6

33,3

32,5

31,0

30,2

29,0

27,5

26,0

24,0

23,5

21,7

21,0

0,00

2,50

3,50

5,50

7,50

8.50

9,25

10,50

16.00

20.00

24,25

25.00

26,50

28,50

30,50

31,50

32,00

33,50

38,00

45,00

49,00

50,00

51,00

0,011

0,0 15

0,017

0,026

0,027

0,034

0,055

0,07 5

0,098

0,300

0,5 80

0,654

0,69 1

0,703

0,706

0,708

0,709

0,710

0,712

0,712

0,7 12

0,712

0,712

100,0

98,0

93,0

86,0

78,0

70,0

67,0

55,0

35,0

26,0

18,0

45,0

33,0

32,0

29,0

25,0

23,0

20,0

19,0

30,0

21,0

19,0

18,0

210

210

210

210

210

210

210

210

210

210

210

310

310

310

310

310

310

310

310

450

450

450

450

0,521

0,52 1

0,52 1

0,54 1

0,56 1

0,58 1

0,623

0,792

1,480

1,980

2,3 50

2,297

3,297

4,016

5,105

5,920

7,080

8,939

10,300

11,200

11,500

12,000

12,900

0,001

0,002

0,002

0,004

0,005

0,006

0,008

0,012

0,0 15

0,045

0,079

¡ 0,082

0,103

0,105

0,105

0,106

0,106

0,106

0,106

0,106

0,106

0,106

0,106

0,00 1

0,00 1

0,002

0,003

0,003

0,004

¡ 0,006

0.009

0,020

0,036

0,069

0,078

0,083

0,084

0,084

0,085

0,085

0,085

0,085

0,085

0,085

0,085

0,085

0,006

• 0,008

0.010

0,0 14

• 0,015

0,0 19

0,027

0,03 2

0,056

0,174

0,336

0,379

0,400

0,405

0,409

0,4 10

0,4 13

0,413

0.415

0,4 15

0,4 15

0,4 15

0,4 15

149

J?esidta¿losE.vperimenudes

Tabla 3.8.- Resultadosobtenidosen el Experimento n0 7. Condicionesexperimentales280 C, 475 p.p.m. de amonioinicial y agitaciónvariable(210 r.p.m. inicial).

• Tiempo(It)

0,00

1,00

4,00

6,00

7.50

8,50

9,50

12,00

16,00

22,50

23,00

23,50

26.00

29,00

30,50

32.50

34,00

34,50

35,00

¡ 42,00

45,00

47,50

50.50

55,00

Biomasa(g/L)

0.005

0,006

0,009

0,0 12

0,022

0,03 1

0,047

0,068

0,08 5

0,180

0,214

0,320

0,470

0,608

0,750

0,820

0.850

0,890

0,920

0,990

0,990

0,990

0.990

0.990

O,(%)

100,0

97,3

86.5

80,0

77.3

65,0

55.0

40,0

26.0

10,0

60,0

49,6

35,0

20,0

10,0

8,0

50,0

42.0

30.0

22,0

12,0

8,0

35,0

20,0

Agtación(rpm)

210

210

210

210

210

210

240

210

210

210

310

310

310

310

310

310

350

iSO

350

350

350

350

400

400

NH4 ¡ Sacarosa

(g/L) -j

0.475

0,475

0,475

0,468

0,453

0,445

0,440

0,429

• 0400

0,3 65

0,3 55

0,3 20

0,300

0.285

0,231

0,166

0,140

0,135

0,130

0,130

0,130

0,130

0,130

0,130

40,00

38,90

39,80

39,70

39,50

38,40

37,90

37,00

36.75

36,00

35,75

35,00

34,50

34,00

33,80

33,00

29,50

28,50

27,70

26,00

25,00

23,20

23,10

23,10

Xantano

(gIL)

0,86

0,86

0,866

0,866

0,86

0,86

0,93

1,02

1,09

1,13

1,32

¡ 1,42

1,48

1,51

1,63

1,72

2,58

3,75

4,00

6,90

9,50

11,39

11,39

11.39

DNA

(gIL)

0,001

0,002

0,003

0,004

0.006

0,009

0,013

0,040

0,063

0,092

0,093

0,098

0,100

0.103

0,125

0,146

0,170

0,173

0,175

0.176

0.176

0,176

0.176

0,176

RNA(g/L)

0,001

0,001

0,002

0,003

0,003

0,008

0,011

0,032

0,05 3

0.079

0,08 8

0,09 1

0,092

0.13 1

0,142

0,152

0,158

0.159

0,160

0,161

0,161

0,161

0,161

0,16!

Proteinas(g/L)

0,003

0,004

0,006

0.0 II

0,0 15

0.023

0.034

0,065

0,160

0,230

0,245

0,25 3

0,255

0,350

0,420

0,465

0,467

0.467

0.467

0.467

0.467

0,467

0,467

0,467

150

ResultadosExperimentales

Como ya se comentó en el apanadoanterior, ProcedimientoExperimental, el

xantanose siguió por medidade la viscosidaddel caldo, realizandoel calibradoal final de

cadaexperimento,pues el xantanoproducidoen las diferentescondicionesde operación

empleadasno presentasiemprela misma relaciónentreconcentracióny viscosidad.Para

cadaexperimento,las ecuacionesfinalmenteutilizadasfueron las siguientes:

Parael Experimentonl:

C~(gXL) = 0,12 y0097(cp) [3.1]

Parael Experimenton0 2:

0 70Cp(g/LÁO,34p< (cp) [3.2]

Parael Experimenton0 3:

C~(g XL) t0,43.,u0

051(cp) [3.3]

Parael Experimenton0 4:

C~(g/L) 2,O5.,u0

0’3~(cp) [3.4]

Parael Experimenton0 5:

C~(g/L) = 0,77 y0

03tcp) [3.5]

ParaelExperimenton0 6:

C~(g/L) = 0,77 ,u0

03(cp) [3.6]

Parael Experimenton0 7:

C~(g XL) = 0,23 tUa’(cjJ) [3.7]

La viscosidadaparentedel caldo se midió con un viscosímetroBROOKFIELD

SIINCHRO-LECTRIC modelo LVT, a una temperaturade 25 0C y a una velocidadde 30

r.p.m.

151

4.-MODELO CINÉTICO

NOESTRUCTURADO

Modelo CinéticoNo Estructurado

4.- MODELO CINÉTICO NO ESTRUCTURADO

Los Modelos CinéticosNo Estructurados(MCNE) son los modelosmás sencillos

empleadosparala descripciónde sistemasmicrobianos.La cantidadde microorganismose

expresamedianteel término de biomasao población microbianaen unidadesabstractasde

vida, ignorándosela estructurainternadel microorganismoo célula que componela biomasa

puesse consideraa la poblacióncomo unaunidadhomogénea.Como ya ha sido comentado,

estetipo de modelossonuna gran simplificación del problemareal, y suelenserusadoscon

fines tecnológicos,ya que proporcionanecuacionessencillascon sentido fisico, en las que se

trataal microorganismocomounaespeciereactantesencilla,aunque paraserútiles deben de

describir un número suficiente de componentesdel sistema;es decir, a pesar de ser los

modelosmássimples,requierenla medidade varioscomponentesquepermitanla descripción

de, al menos, la evoluciónde la biomasa,la frentede carbono,el productoy otros sustratos,

como la frentede nitrógeno.

La producciónde xantanoha sido modelizadaempleandoestetipo de modelospor

varios autores(Morainey Rogovin, 1966y 1971; Weissy Ollis, 1980; Quinlan 1986; Pinches

y Pallent; 1986; Schweickarty Quinlan,1989); no obstante,estosautoresno tienenen cuenta

en sus ecuacionestodos los nutrientesesencialesde estesistema.

153

ModeloCinéticoNo Estructurado

Estudiosexperimentalesllevadosa caboen un trabajoprevio (Santos,1993) apuntan

claramentela dependenciade la velocidad de crecimiento del microorganismode las

concentracionesde nitrógenoy de oxígenodisueltoen el medio. En la Figura4.1 se muestran

los resultadosexperimentalesobtenidosen el Experimento2, donde se observanclaramente

estas dependenciasentre nutrientes y crecimiento de microorganismoy formación del

producto.El sustratolimitante en esteexperimento,debidoa las condicionesempleadas(280

C, medio A. con 257 p.p.m. de amonio y programaciónde la velocidadde agitación)es la

fuentenitrogenada,de modo que, cuandoel amonio seagota,el microorganismoentraen la

faseestacionariadel crecimiento.Además,hay que destacarque la concentraciónde amonio

influye en la biomasafinal obtenidaen cadafermentación,de modo que con concentraciones

iniciales de amonio bajas. la biomasafinal también lo será; estaproporcionalidadentre

biomasafinal y concentracióninicial de sustratonitrogrenadoes ciertahastaun cierto valor

de concentraciónde amonio, ya que para concentracionespor encimade un valor critico,

puedetenerun efectotóxico parala célula.

Debido a que Xanthomonascampestrises una bacteriaaerobiaestricta, el oxígeno

disuelto en el mediopuedeserun nutrientelimitante del crecimientodel microorganismo.No

obstante,en estecaso,el oxigenodisuelto no actúade limitante del crecimientoya que los

experimentoshansido realizadosconprogramaciónde agitaciónparacompensarla bajadade

concentraciónde oxigeno por el consumode las células en el crecimientoy ademáspor el

aumentode la viscosidaden el medio,comoconsecuenciade la producciónde xantano.Como

puedeapreciarseen la Figura 4.1, su concentraciónno desciendehastacero si no que

permanecealrededordel 10%del valorde saturación.

En cuantoa la formaciónde xantano,sepuedeobservaren la misma figura que se

trata de un producto asociado al crecimiento, es decir se forma a medida que el

microorganismoestácreciendo,si bien el incrementomayor de concentraciónse produce

cuandoel microorganismoseencuentraen la faseestacionariadel crecimiento.Porotro lado,

se observa la estrecharelaciónentre la formación del productoy el consumode la fuente

carbonada.

154

Modelo CinéticoNo Estructurado

0.35

.8

[.6 0,30

025¡.2

~L0 0,20

U 0.8 0,15 U

0,6 ojo

0.4

0,2 0,05

0.0 0,00

2.030 z

“st,

U o

1,0

U

0.5

0,0

Figura4.1-Resultadosexperimentalesobtenidosenel experimenton0 2, realizadoa280C,con 257 p.p.m. de amonio y agitación variable (210 r.p.m inicial).

Se han propuestovarios modelos no estructuradospara la modelización de la

producción xantano(Moraine y Rogovin, 1966 y 1971; Souw y Demain.1980; Pinchesy

Pallent,1986;DeVuyst y col,. 1987ay b). Estosmodelospuedenclasificarseendosgrupos:

- Aquellos que consideranel crecimientoy la produccióndependientesde diferentes

nutrientes.

- Aquellos que expresanel crecimientoy la producciónsólo en ffinción de la biomasa

y suevoluciónconel tiempo.

Al primer grupo citado pertenecenlos modelospropuestospor Moraine y Rogovin

(1966y 1971),y porQuinlany colaboradores(Quinlan y col., 1986; Schweickarty Quintan,

155

20

30~ifl

1Jode/o (‘PuÁtico No Estruciurado

1989>. La diferencia entreellos estáen el tipo de ecuacionescinéticasempleadaspara la

evolucióndel crecimientoy la descripciónde la producción.

Moraine y Rogovin(1966y 1971) empleanecuacionestipo Monod (Ecuaciones(4.1]

y (4.3]). paradescribirla evoluciónde xantanoy biomasa,considerandoel nitrógeno como

limitante del crecimiento,ecuación(4.1] y la fuentede carbonolimitante parala producción

de xantano,ecuación[4.3]. Laevoluciónde los dossustratoscon el tiempovienenexpresados

utilizando dos coeficientesestequiométricos(ecuaciones[4.2) y [4.4)) denotadospor Yp~5 e

YXN. Estemodelo puedeserexpresadopor el siguientesistemade ecuaciones:

dC~ _ ¡¿~ C~ •C [4.1]

dt K~+ (j

dE’5 _ 1 dC1, [4.2]

di’ Y di’

dC~ _ <E’5 [43)— .Cx

dt K5-vQ

dC~ ~Á.dQ [4.4]di’ ~ dt

El modelo de Quinlan (1986) y Schweickarty Quintan (1989) tambiéndescribenel

consumode nutrientesmediantelas ecuaciones[4.2] y [4.4]; sin embargo,la biomasay la

producciónde xantanono vienendadaspor ecuacionestipo Monod, sino potencialesde la

forma expresadaen las ecuaciones[4.5] y [4.6]:

dC~ = . ~05 [4.5]di’

dC~ = * ~

Porcombinaciónde las ecuaciones[4.4] y [4.5] seobtienela ecuaciónlogística:

cdCYk A,, [4.7]

di’ X y - k Y.

Weissy Ollis (1980) y Pinchesy Pallent (1986)proponenmodelospertenecientesal

segundogrupo,esdecir, aquellos dependientessolamentede la biomasay suevolucióncon

el tiempo. Expresanel crecimientocomo función de la concentraciónde biomasamediantela

156

ModeloCinéticoNo Estructurado

ecuaciónlogística,puesestafunciónpresentaunatendenciasimilar a la curvade crecimiento

del microorganismo,ecuación[4.8]. La producciónde xantanoy el consumode la fuentede

carbonoviene dado por ecuacionestipo Luedeking-Piret(ecuaciones[4.9) y [4.10]). Sin

embargo,estosautoresno tienenen cuentala fuente de nitrógeno.Por tanto, estemodelo

vieneexpresadoporlas siguientesecuaciones:

dC~ Cx [4.8]

dt

dC~ _ _ .c±n.dQ [4.9]

dr dt

dC~ a.c<~.dCx [4.10]

dr di’

El modelo de Pinches y Pallent (1986) emplea las mismas ecuacionespara

crecimiento,xantanoy consumode la frentede carbonoque el empleadopor Weissy Ollis

(1980),pero incluyen la ecuación[4.4] para la evoluciónde nitrógenoy añadenla ecuación

[4.11] para el consumo de oxígeno (sin incluir su transporte),el cual dependede la

concentracióndebiomasay de la velocidadde crecimiento:

dE’0 CBdCV [4.11)

tú di’

Ninguno de estos autoresempleatécnicasde regresiónparaobtenerel valor de los

parámetrosque aparecenen las ecuacionesanteriores,por el contrario empleantécnicasde

estimaciónpor simplificación de ecuacionesen puntossingulares,obteniendounos valores

de los parámetrosqueproporcionanun ajusteexperimentalde forma aceptable,aunquesolo

paraun experimentoen cadacaso.

En la Tabla4.1 se resumenlos modeloscinéticosno estructuradosparala producción

de xantanoen forma diferencial,incluyendoel que secomentaráen el próximoapanado.En

ella sehanconsideradolos cinco modelosmásrepresentativos,así como las cincorespuestas

posibles,expresadasen concentracionesmásicas(gIL). Sólo dosde estosmodelosconsideran

las cincorespuestas.

157

J~.

O 0 O e O O o o ci, fl e O.

e. o o ch z o O e.

-t e O e. e ~1 o-

o ci, -e ~1 -t -t o e e) o o’ e o-

O e e. e 9

Gr

o O 3m

zm

CV + ~<

Kb

*

‘y

—J

ti-] IIqN o

t st

z~

Ct

st st

ModeloCinéhcoNo Esi’ructurado

4.1.- FORMULACIÓN DEL MODELO

En trabajosprevios (Santos,1993 y García-Ochoay col., 1995) se ha propuestoun

MCNE parala producciónde xantano.En estemodelo setienen en cuentalas dependencias

del crecimientoy la producciónde nutrientes,incluyendo una expresiónpara describir la

evolución de otro nutrienteesencialen el sistema:el oxigenodisuelto.

El crecimiento del microorganismoviene dado mediantela ecuaciónlogística, la

cualesobtenidaporcombinaciónde las ecuaciones[4.4] y [4.5].

Los resultadosexperimentales,obtenidosen un trabajoprevio (Santos,1993, García-

Ochoay col., 1997),muestranclaramenteque cuandola fuentede nitrógenoesel sustrato

limitante, el parámetroCxm puedeserreemplazadopor:

= Cx» + [4.12]

Si la ecuación.[4.12] essustituidaen la ecuación[4.7], se obtiene la ecuación

logísticaen formadiferencial

IrdC\. — -¿~ ±C1¿C<j— 1 [4.13]

di’ YI%v>) C~, + li~ C~

Esta última ecuacióntiene en cuentatanto el crecimientocomo el consumode la

frentenitrogenada.El consumode la frentede carbonoseexpresateniendoen cuentaque

esutilizada tantoparamantenimientocomoparacrecimiento,incluyendo en “crecimiento”

la producciónde xantano,puestoque el polisacáridoes,en realidad,la cápsulabacteriana,

de acuerdoa la ecuación[4.14]:

dE’5 — ~, 1 dC~<. [4.14]

di’ Y~ di’

La integraciónde estaúltimaecuación,con la condiciónde contorno,t=0 .. C5

proporcionala siguienteexpresión:

159

ModeloCinéticoNo Estructurado —

ky >x<> +C~. j ¿. <‘y” ¿3- )~iv

[4.15]IC.~ )l 1

La producciónde xantanose expresamediantela ecuación[4.6] (Quinlan, 1986;

Schweikarty Quinlan, 1989) y la evoluciónde oxígenodisuelto se describemediantela

Ecuación[4.16]:

dC0 * —un0 ¡ dE’

)

di’ = kLaU (E’0 —C<3) C~. + [4.16)- - y ~it’0,1~

Estaecuación[4.16] incluye un términoparala transferenciade oxígenodesdeel gas

y otro parael consumo de oxígeno- tantoparamantenimientocomo paracrecimiento-tal y

como fue propuestopor Pinchesy Pallent (1986). Para ello, es necesarioemplearuna

expresiónpara el coeficiente de transferenciade oxígeno, para lo cual se ha utilizado la

expresióndadaen la ecuación[4.17] (Gómez,1995):

k1a~=3,08IcY4V%43N175 ~ -0>39 [4.17]

Sustituyendola ecuación[4.15] en la ecuación[4.6] se puedeexpresarla velocidad

de producciónde xantanodeacuerdoala ecuación[4.18]:

dE’

di’ — ~ (Z~ -k<C>~..m8

—< + C~ [4.18]~\IV

LnijI— C~ +Y~ CV, Lí~exPk4ÁvCÑÚi.i~ <.C~ .(c~ Cx)

160

ModeloCinéi’ico No Estructurado

En la expresión anterior se identifican tres sumandos,el primero expresala

producciónmáxima de xantanoa cada tiempo, alcanzablesi el sustrato carbonadose

emplearaúnicamenteendichaproducción;el segundotérminoexpresala cantidadde frente

carbonadaequivalentea la cantidadde xantanodesviadoparamantenimientode las células

en estadoviable; el tercer sumandoindica la cantidadde xantanono producidaa cada

tiempo, debidaal consumode sustratocarbonadopara la formación de masacelular, es

decir,empleadaen el crecimiento.

Por tanto, el modelo constade siete parámetros,los representativosde la biomasa,

queen estecasoson e YXN, y los parámetroscorrespondientesa la evolucióndel azúcar,

el xantanoy el oxigenodisuelto: ni5, Yxs, k~, ni0 e

4.2.- AJUSTE DE LOSDATOS EXPERIMENTALES

La aplicación del modelo a los datos experimentales,para el cálculo de los

parámetroscitados,se tuvo querealizarde la siguienteforma:

• Primeroseobtienenlos valoresde kx e Y~, representandoel primero la velocidad

de crecimientoy el segundola concentraciónmáximaalcanzablede biomasaa partir

de la cantidad de sustratonitrogenadoinicial empleadoy la cantidadinicial de

biomasaal principio de la reacción.La obtenciónde estosparámetrosseha llevadoa

cabo medianteregresiónno lineal en simple respuestaacopladaal algoritmo de

Runge-Kutta,aplicadaa laecuación[4.13].

• Una vez calculadosestosparámetros(kx e YxN), sonsustituidosen la ecuación

[4.13], empleándose,juntocon las ecuaciones[4.14] y [4.16], parael cálculode los

parámetrosni5, Yxs y k~, por aplicación de una regresiónno lineal en multi-

respuestaacopladaal algoritmo de Runge-Kuttade cuartoorden(parala integración

de las ecuacionesdiferencialessin integraciónanalíticaposible).

161

Modelo CinéticoNo Estructurado

• El cálculo de los parámetrosm02 y Yo2x se realizaaplicandouna regresiónno

lineal simple-respuestaal conjunto de ecuacionesdiferenciales formado por las

expresiones[4.14], [4.161,[4.17] y [4.18] sustituyendolos valoresde los parámetros

calculadoshasta el momento en las tres primerasecuacionescitadas, siendo,por

tanto, los únicosparámetrosa calcularm02 e Yo2x. En estecaso,al igual que con la

biomasa,no seaplica la regresiónen múltiple respuesta,debido al menorpesoque

en la minimizaciónde la suma de residuospresentaríala ecuaciónde evolución de

oxígeno.

dE’0 * ___ ___di’ =kLaÍ. (E’0, — Coijy’ . dCx $..tn<jj> E’~ [4.19]

En la ecuación [4.16], correspondientea la correlación del coeficiente

volumétrico de oxigeno en el proceso, es necesario sustituir la ecuación

correspondientede calibrado de la concentraciónde xantanoen función de la

viscosidadparacadaexperimento.Porotro lado,el cálculode las concentracionesde

oxígenodisueltoen cadamomentoen términos de moles/L, se realizaempleandola

expresión:

C0(mol/L) = 2,3~1O~ E’0 (so) [4.20]

En la que se ha supuestoque la concentraciónde saturaciónde oxigeno

disueltoen las condicionesde trabajoes de 2,3.1(0mol/L (correspondientea 280C y

1 atm).

En las Tablas4.2 a la 4.8 se recogenlos valorescalculadosde los parámetrosfisicos

y estadísticosobtenidosde la aplicacióndel ModeloCinéticoNo Estructuradoa los datosde

los experimentosrealizados(experimentosdel 1 al 7). Así mismo, las Figuras 4.2 a 4.8

muestranla reproducciónde los datosexperimentalescon el MCNE aplicado.En todaslas

figuras, la líneacontinua correspondea los valoresproporcionadosporel modelo MCNE,

y los simbolos a los datos experimentalesobtenidos del análisis de los diferentes

componentesdurantela fermentación.

162

Modelo CinéticoNo Estructurado

La Tabla 4.2 muestralos parámetrosobtenidosdel ajustede] experimenton0 1,

realizadoa 250 C y con 257 p.p.m de amonio inicial , todos los valoresde los parámetros

cumplenlas restriccionesestadísticas,estoes, ninguno incluye el cero en sus intervalosde

confianzay seobservaque los valoresobtenidosde la t de Studentmásbajoscorresponden

a los parámetrosobtenidosdel ajustede la concentraciónde oxigeno (m0 , Y0j, y los

valoresmásaltos, a los obtenidosdel ajustede la concentraciónde azúcar( ms, Yxs y kv).

En la Figura 4.2-a, se muestrael ajustede la evoluciónde la biomasaa la ecuaciónlogística,

dondese observala buenareproducciónde los datos experimentalesa estafunción; sin

embargo,en la misma gráfica se muestranlos resultadosobtenidosen el ajuste de la

evolucióndel nitrógeno,dondepuedeobservarsequeestemodeloes incapazde predecirun

buenaevoluciónde estecomponente.En cuantoa la evolucióndel restode componentes,

tanto la evoluciónde la sacarosay como la del xantanosonbuenos,mientrasque parael

oxígenono se consigueun buenajuste(Figura4.2-b).

Los parámetrosobtenidosdel ajusteal MCNE del experimenton’ 2 realizadoa 280

C y con 257 p.p.m de amonio inicial, son recogidosen la Tabla 4.3, donde se puede

observarque los intervalosde confianzade los parámetrosobtenidosdel ajusteal MCNE no

incluyen el cero y que, al igual que en el experimentoanterior, se observanunos valores

muy bajos de la t de Studentpara los parámetroscorrespondientesa la evolución de

oxígenodisuelto,quedandoreflejadoen la mala reproducciónde estecomponente,tal como

muestrala Figura 4.3-b; mientrasque paralas concentracionesde sacarosay xantanolos

resultadosdel ajustesonbuenos.En la Figura4.3-asemuestrala excelentereproducciónde

la concentraciónde la biomasacon la ecuaciónlogística,mientrasque la reproducciónde la

evolución del amonio de nuevo es defectuosa,aunquees mejor que la obtenidaen el

experimentoanterior.Se reproducebienel consumode la fuentenitrogenadadurantela fase

exponencial,no siendobuenoel ajusteen la faseestacionariadel crecimiento.

En la Tabla4.4 aparecenreflejadoslos parámetrosfisicos y estadísticosobtenidos

porajustede los datosdel experimenton0 3 realizadoa310 C y con 257 p.p.mdeamonio

inicial al MCNE, dondevuelvea observarseque, aunquelos valoresson significativos,los

valores de la t de Studentobtenidospara m0~ e son muy bajos, quedandoesto

reflejadoen la malareproducciónde la concentraciónde oxígeno(Figura4.4-b),si bienhay

que comentarque,encomparacióna los dosexperimentosanteriores,la reproducciónde los

163

ModeloE’inéi’ico No Estructurado

datos experimentaleses algo mejor. En la Figura4.4-a se muestrala reproducciónde los

valoresexperimentalesde la biomasay de la concentraciónde amonio, siendolos resultados

muy similares a los observadosen los casosanteriores,es decir, un buen ajustepara la

biomasay peorparala evoluciónde la fuentenitrogenada.

Los parámetrosobtenidospara el experimenton~ 4 realizadoa 340 C y con 257

p.p.m de amonio inicial serecogenen la Tabla 4.5-a. Se puedeobservarque al realizarel

ajustede esteexperimentoal MCNE el valor obtenidodel parámetrom5 es negativo, lo que

indicaríaque a estatemperaturaesteparámetrono tiene influenciay, fisiológicamente,que

el microorganismono consumeazúcarparasumantenimiento.Parapoderrealizarel ajuste

posterior de la evolución del oxígeno en simple respuesta,es necesarioemplear los

parámetrosms, Yxs y k~ obtenidosdel ajuste en múltiple-respuestadel xantanoy la

sacarosa.Debidoa que no es posibleintroducir un valor de m~ negativo,sevolvió a realizar

el ajustefijando m8 en valor cero, obteniéndoseasí nuevos valoresde Yxs y k~, los cuales

se muestranen la Tabla4.5-b.Estosnuevosvaloresde los parámetrosfreron utilizadospara

la obtenciónde los correspondientesparael oxigenodisuelto. Las restriccionesestadísticas

se cumplenparatodos los parámetros,los intervalosde confianzason estrechos,siendoalgo

másamplios parael parámetroY~~,parámetroque a suvez presentaun valor de la t de

Student muy bajo,reflejándoseen la malareproducciónde los datosexperimentalesde la

evoluciónde la concentraciónde oxígenodisuelto que se muestraen la Figura 4.5-b. En

cuanto a la reproducciónde la biomasa,es buena, no siendo así para la evolución del

amonio,tal comomuestrala Figura4.5-a.

En la Tabla4.6 semuestranlos resultadosobtenidosde la aplicacióndel MCNE al

experimenton0 5 realizadoa 28 0C y con 65 p.p.m.de amonio inicial. Los intervalosde

confianzaparalos parámetroscorrespondientesalajustede la concentraciónde oxígenoson

muy amplios, presentandoun valor de la t de Studentbajos,estando el parámetro Y0<

prácticamenteen el límite del valor teórico, tabuladoparaun 95% de confianza.La Figura

4.6-amuestrala buenareproducciónde la biomasacon la ecuación logística,mientrasque

la evolución de nitrógeno,muestraun mal resultadoen cuantoa la reproducciónde los

resultadosexperimentales.En la Figura4.6-bapareceel ajustede la evoluciónde xantanoy

de sacarosa,en los que el resultadoes aceptable,mientrasque para la concentraciónde

oxígenola reproducciónobtenidano essuficientementebuena.

164

Modelo CinéticoA~o Estructurado

La aplicacióndel MCNE al experimenton0 5 realizado a28 C y con 130 p.p.m.

de amonio inicia! proporcionalos parámetrospresentadosen la Tabla 4.7. Paratodos los

parámetrossecumplenlas restriccionesestadísticasimpuestas,esdecir ningúnparámetro

incluye el cero,obteniéndoselos menoresvaloresde t parael parámetroY0~. Estoúltimo

se refleja en la mala reproducciónde la evolución del oxígeno,la cual apareceen la

Figura4.7-b.Parala concentraciónde sacarosay la concentraciónde xantanode nuevose

obtieneun buenajuste.En la Figura4.7-a, se observacómo la evoluciónde la biomasaes

perfectamentereproducidapor la ecuaciónlogística. En cuanto a la concentraciónde

amonio, pareceque la reproducción,obtenidapor ajustede los datos experimentalesal

MCNE, esbuenaparaesteexperimento,tal comoseobservaen la Figura4.7-a.

Por último, la Tabla 4.8 muestralos valores fisicos y estadísticosobtenidospor

ajustea estemodelo parael experimenton0 6 realizadoa 28 0C y con 475 p.p.m. de

amonio.Tanto los parámetrosrepresentativosde la biomasa,como los correspondientesa

la sacarosay xantanocumplen tasrestriccionesestadísticasimpuestas.El parámetromox

proporcionaun valorque incluye el cero,obteniéndoseun valor de la t de Studentque está

por debajo del tabulado.En cuantoal parámetroY0~, poseeun valor de t de Student

muy bajo, prácticamenteen el límite delvalor tabuladoal 95%de confianza.La evolución

de oxigeno disuelto (Figura 4.8-b) obtenidade esteajuste,al igual que en todos los

experimentosanteriores,no esbuena,sin embargo,tambiéncomo en casosanteriores,la

reproducciónobtenidaparaevoluciónde sacarosay xantanoesaceptable.La reproducción

de la evoluciónde la concentraciónde biomasa(Figura4.8-a)de esteexperimento,al igual

que en todos los anteriores,es muy buena.En cambio, parala evolución del amonio, la

reproducciónobtenidano se correspondebiencon los valoresexperimentales,tal como se

ha ido viendoen el ajustedel restode los experimentos.

165

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ModeloCinéticoNo Estructurado

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Figura4.4- Ajuste de los datosexperimentalesdel experimenton0 3 al MCNE, realizadocon Xanthomonascampestrisa la temperaturade 310 C, medio A (257p.p.m.deamonio),programaciónde agitación(210 r.p.m. inicial).

(a) Evolucióndebiomasay amonio(b) Evolucióndexantano,azúcary oxígenodisuelto

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Figura 4.5- Ajuste de los datosexperimentalesdelcon Xanihomonascampesiris a lap.p.m. de amonio), programaciónde

(a) Evoluciónde biomasay amonio(b) Evoluciónde xantano,azúcary oxígenodisuelto

experimentou0 4 al MCNE, realizadotemperaturade 340 C, medio A (257agitación(210r.p.m. inicial).

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40 2.5

2.030

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cf 0.5

0 0.0

t(h)

Figura4.6- Ajuste de los datosexperimentalesdel experimenton0 5 al MCNE, realizadoconXanthomonascampestrisa la temperaturade 28’ C, medio A (65 p.p.m.deamonio),programaciónde agitación(210r.p.m. inicial).(a) Evoluciónde biomasay amonio(b) Evoluciónde xantano,azúcary oxígenodisuelto

0 10 20 30 40 50

176

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ModeloCinéticoNo Estructurado

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Figura 4.7-

2.0

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0.5

0.0

2.5

2.0

1.5 Yo

LO

0.5

del experimenton0 6 al MCNE, realizado¡a temperaturade 280 U, medio A (136deagitación(210r.p.m. inicial).

Ajuste de los datosexperimentalescon Xanthomonascampestrisap.p.ni.deamonio),programacton

(a) Evoluciónde biomasay amonio(b) Evoluciónde xantano,azúcary oxigenodisuelto

2.0

O lO 20 30 40 50 60

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178

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Modelo CinéticoNo Estructurado

2.0

1.5

3<1.0

0.5

0.0

40

~3O

0-

<4js20

>0

o

Figura 4.8- Ajustede los datosexperimentalesdel experimento7 al MCNE, realizadoconXanthomonascampestris a la temperaturade 28~ C, medio A (475 pp.ni. deamonio),programaciónde agitación(210r.p.m. inicial).(a) Evolución de biomasay amonio(b) Evoluciónde xantano,azúcary oxígenodisuelto

0.5

0.4

02~

(y

0.2

0.1

2.5

2.0

&1.0 <4

0.5

0.0

30

(h)

180

Modelo CinéticoNo Estructurado

4.3.- DISCUSIÓN

4.3.1- Variacióndel Valor de los Parámetroscon lasVariables

4.3.1.t- Influencia de la Temperatura

En el primer capitulo de este trabajo, ya fue comentadala importancia de la

temperaturaen la produccióndexantano.En trabajosprevios(Santos,1993; García-Ochoay

col., 1995), se observóla influencia de esta variable sobre la produccióndel polisacárido,

obteniéndoseun máximo de producción a 280C. Como en todo proceso químico, la

temperaturadebeinfluir mucho,exponencialmente,en la velocidadde las reaccionesquímicas.

Sin embargo,al evaluarun procesocomplejo,comoel crecimientode un microorganismoy la

producción,en estecaso, de un polisacárido,dichainfluenciapuedequedarenmascarada.No

obstante,esde esperarque la temperaturainfluya en el valor de los parámetroscinéticosy de

equilibrio queaparecenen las ecuacionescinéticas.Estoseanalizaa continuación.

En las Figuras4.9 y 4.10 se muestranlas evolucionesde los parámetrosobtenidosdel

ajusteal MCNE paralos experimentosrealizadosa diferentestemperaturas.

En la Figura4.9 (a y b) semuestranlas evolucionesde los parámetrosrelacionadoscon

el crecimiento,obtenidosdel ajustede los datosexperimentalesa la ecuaciónlogística. Se

observaqueel parámetrokx, indicativo de la velocidadde crecimiento(Figura4.9-a),muestra

unatendenciadescendentecon latemperatura.El parámetroYxsÑ (Figura4.9-b)en cambiono

parecemostrarunaevoluciónclaracon la temperatura.Porello, no esposiblerealizarun ajuste

de estosparámetrosafimcionesmatemáticasquelos relacionencontemperatura.8-

0$ -t

6—0.6 —

5—

04—

3 ¡

25 30 35 25 30 35Tc¡q,erat,ira (~Q Terq,emtura (‘C)

Figura 4.9.- Evolución de los parámetroscon la temperaturaobtenidospor ajustecon laecuaciónlogística.

(a)

5’

(b)

5’5’

181

ModeloCinético No Estructurado

En la Figura4.10 (a, ti, c) se muestranlas evolucionesde los parámetrosrelacionados

con las ve!ocidadesde produccióndel xantano y consumode azúcar en fimción de la

temperatura.La tendenciade m8 y Yxs presentaun valor máximo a 310 C, mientrasque el

parámetrok~ parecemostrarla mismatendenciaperocon un máximo en 28 o

En la Figura4.10 (d y e) semuestranlastendenciasde los parámetrosrelacionadoscon

el oxígeno-m0 e YJ~- respectoa la temperatura.Puedeobservarseque ambosparámetros

tienen una tendenciamás o menos lineal con dicha variable; m0 muestra una evolución

ascendente,mientrasque Y0~presentaunaevolucióndescendente.

0.5

04

0.3

02

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0.000

30 35Uemrc ¡aura(‘U)

35

35

Figura4.10.-Evoluciónde los parámetrosdel MCNE con la temperatura.La líneadiscontinuaindica la tendenciateóricade los parámetrosy la continuael ajustedel modeloen funciónde la temperatura(MCNE(T)).

(a) m~ (b) Yxs (c) k~ (d)m02 (e) Y01.

(b)

o a

20 25 30

-A- (c—-y’-.,.. ¡

Ir — .a-,., 5’ 2Ml25 30

Tcn,pemtura(’C)

(e) —

25 30Tcflveratura (‘U)

182

ModeloCinéticoNo Estructurado

De acuerdo con estasobservaciones,se pensóque los parámetroscorrespondientesa

m~ y ky. , podíanser ajustadosen función de la temperaturade acuerdocon la expresiónde

Ratkowskyy col. (1983),segúnla ecuación[4.211:

k<T)=< Ci~(TTrnrn) Ji -exp(C2a(T-Tmb)]}2 [4.21]

El parámetroYxs, en cambio,sesupusoconstanteduranteel ajusteen el que se dejó

flotar el restode los parámetros.debidoa queel valor delparámetroobtenidoparatodaslas

temperaturasessimilar.

En la Figura 4.10 (d y e) semuestranlas tendenciasde los parámetrosrelacionados

con el oxigeno - e Y0.’>.. - respectoa la temperatura.Puede observarseque ambos

parámetrostienenunatendenciamáso menoslineal con dichavariable.- rn0, presentauna

evoluciónascendente,mientras,Y02~ presentatendenciadescendente.

El ajusteconjunto de todos los datos de los experimentosrealizadosa diferentes

temperaturas(experimentosdel 1 al 4) al MCNE (T) (Modelo CinéticoNo Estructuradoen

función de T) para m5, Yxs y k~ fue realizadoen múltiple-respuesta,considerandocomo

respuestas:sacarosay xantano.Debidoa las tendenciaspresentadasporestosparámetrosen

función de la temperatura, -mostradas anteriormente en la Figura 4.10 (a, b, c),

respectivamente-se realizó el ajuste de acuerdoa las funciones representadasen las

ecuaciones[4.22] a [4.24].EsteMCNE(T) tienenueveparámetros:Ci, Trnin, C2, Tmax, C %, T

mli,, C 2, T ‘max y C3:

m5(T)={ Cj(T-T).H-exp<>C,.<T-T [4.22]

= ( C’1 . (T - T’mrn) [1 exp(C%. (T - [4.23]

Y (T)=C3 [4.24]xs

La Tabla 4.9 muestralos parámetrosobtenidosdel ajustede los cuatroexperimentos

realizadosa distintas temperaturasa este modelo en función de dicha temperatura. Como

puede observarse,los parámetros correspondientesal parámetro m5 dan un resultado

estadísticoaceptableal igual que sucedecon el parámetro Yxs dondeseobservael valor

elevadode la t de Student.Encuantoa los parámetrosCí’ y C,’, correspondientesal ajustedel

¡83

ModeloCinético Nro Estructurada

parámetrok~ a una función de tipo Ratkowsky. se observaque ambosincJuyen el cero y

ningunosuperael valorde t de Studenttabulado.

En cuantoa la evoluciónde la concentracióndeoxígenodisuelto, el modeloen función

de la temperaturaha sido realizadoen simple respuesta.En estecaso,el ajustede los datos

experimentalesse ha hecho teniendo en cuenta la evolución lineal de los parámetros

relacionadoscon este componente,esto es, ni0 e ~%x. En este caso, se tienen cuatro

parámetrosen el modeloen funciónde la temperatura:a, ~3,a’, ~‘, tal comose muestraen las

ecuaciones[4.25j y [4.261:

ni0 (T) = a + /T T [4.25]

= a’+fi’T [4.26]

Los valores de estos cuatro parámetros,así como sus valores estadísticosde se

muestrantambién en la Tabla 4.9. Como puede observarse,los parámetros ci’ y 13’

correspondientesal parámetroYo2x incluyen el cero, y ninguno cumple las restricciones

estadísticasimpuestas,es decir, que los valoresde t de Studentobtenidosno superanlos

valorestabuladosteóricos.

Los ajustes de los parámetrosen función de la temperaturaa las funciones

matemáticasquesehanmostradosepresentanen la Figura4.10,dondeaparecencomolínea

continua. Este ajuste es el resultado de sustituir las temperaturasen las siguientes

ecuacionescon los valorescorrespondientesde los parámetrosobtenidos(con un 95% de

probabilidad):

= {O,227 . ([—16,6) [i —exp(&068 (T — 3554)42 [4.27]

= {O,OO I52~(T —17,36)11—exp(O,65] IT — 39,23)42 14.281

Y (T)=O,1445 [4.29]xs

m0 (T) = 9,8? io-3 + (—2,6 ](74) •T [4.30]

Y (T)=—5,6±O,89•T [4.31]0,X

184

Modelo Cinético No Estructurado

Todos los datosexperimentalesobtenidosen los experimentosrealizadosa diferentes

temperaturashansido reproducidosmediantela sustituciónde lasecuaciones[4.27]a [4.31]en

el MCNE. Las Figuras4.11 a 4.12 muestranla reproducciónde los resultadosexperimentales

con dichoMCNE (T).

Como eslógico, y ya que no seha conseguidounabuenaestadísticade los valores

de los parámetrosen función de la temperatura,este modelo MCNE(T) no mejora la

reproducciónde los datosexperimentalesobtenidosexperimentoa experimento.De hecho,

en alguno de los experimentos,como a 280 C y 250 C, la reproducciónde los datos

experimentaleses mucho peor que la obtenida con el MCNE, especialmenteen la

descripciónde la evolución del oxígeno. Por ello, no es posible aceptareste modelo

MCNE(T) como válido, y podemosconcluir que el modelo cinéticono estructuradono es

capazde predecirlaevoluciónde los parámetrosenfunciónde la variabletemperatura.

185

Qn Qn Qn -c 4:.

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Qn 00 o .4. -al Qn

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,,

ModeloCinéticoNo Estructurado

40U

50

20

1.5

Lor=

0060

Ajuste de los datosexperimentalesdel experimenton0 1 alMCNE(T) realizado con Xanthomonas campestris a latemperaturade 250 C, medio A (257 p.p.m. de amonio),programaciónde agitación(210 r.p.m. inicial).

40-

30

20-

u’

lo—

o

Figura 4.12.-

o LO 20 30 40 50 60

25

20

‘.5

to&a

QS

QQ

t<h)

Ajuste de los datosexperimentalesdel experimentono 2 alMCNE(T) realizado con Xanthomonas campestris a latemperaturade 2W C, medio A (257 p.p.m. de amonio),programacióndeagitación(210r.p.m. uncial).

40-

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Figura 4.11.-

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187

ModeloCinéticoNo Estructurado

-s

7;Q-.

Figura 4.13.- Ajuste de los datosexperimentalesdel experimentono 3 alMCNE(T) realizado con Xanthomonas campestris a latemperaturade 310 C, medio A (257 p.p.m. de amonio),programaciónde agitación(210 r.p.m. inicial).

40

3‘0

3‘fi

20-

lo-.

Figura 4.14.

O lO 20 30o I~)

40 50

LS

20

ES

lo

05

00

Ajuste de los datosexperimentalesdel experimentono 4 alMCNE(T) realizado con Xanthomonas campestris a latemperaturade 340 C, medio A (257 p.p.m. de amonio),programacióndeagitación(210r.p.m. uncial).

LS

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1.5

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1.0

05

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u. 4

4

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• 4 .• .. • u

• 4 44 4*

.4 4

• AA A A

441AS A-A A-A

188

ModeloCinéticoNo Estructurado

4.3.1.2- Influencia de la Concentración de Amonio Inicial

La concentraciónde amonio esuna variableimportanteen el procesode producción,

puesesel nutriente limitante en el crecimientoen el medio de producciónempleado.Es un

componentequeinfluye significativamenteen la concentraciónde biomasaobtenidaduranteel

proceso.Por estarazón se ha realizado el estudiode la influencia de esta variable en los

parámetrosdel modelo.

La evolución de los parámetrosobtenidos de la aplicación del MCNE a los

experimentosrealizadoscon diferentesconcentracionesde amonio se muestraen las Figuras

4.15 y 4.16.

En la Figura 4. 15 se muestranlas tendenciasde los parámetrosrelacionadoscon el

crecimiento,dondese observaque, al igual que ocurriacon la temperatura,no esposible

relacionarlos parámetrosde crecimientoobtenidoscon funcionesque los relacionencon la

concentraciónde amonio. Se observaque el parámetrokx -indicativo de la velocidadde

crecimiento- muestrauna tendenciadescendentecon la concentraciónde amonio. El

parámetrorelativo al rendimientode amonio en biomasa(YxIÑ) presentaun valor máximo

en 65 p.p.m. y un valormínimo en 514 p.p.m.,mientrasquecon 130 p.p.m. y 257 p.p.m. no

presentadiferencias significativas.

35

~11— 30 ~

25 H

20 —2

~- ‘~-1lOt

06— 5—4

o—0 ¡00 200 300 400 500 0 00 200 300 400 500 600

Anxn¡o (mm) ánn,ío (mm>

Figura 4.15.- Evolución de los parámetrosdel crecimiento en función de laconcentracióndeAmonio.

a)kx

189

1•1~1~1~

(a)a,’

5’-c

1 l 1 2

o (b)?

oo

- Vot/e/oCinéticoNo Estructurado

En La Figura 4.16 (a, b. e) se muestranlas tendenciasen función de la concentración

inicial de amonio, de los parámetrosdel MCNE relacionadoscon las velocidadesde

produccióndel azúcary dcl xantano:m5, Yxs y k?. Laevoluciónde los parámetrosrelacionados

con la evolución del oxigeno, mo~eYox, aparecenen la Figura 4.lód y 4.16e,

respecúvarnente.

Ninguno de los parámetrosdel MCNE muestrauna tendenciaclara ni lógica en

funciónde la concentraciónde amonio.Porello, en estecasono es posiblesiquieraplantear

ecuacionesmatemáticaspara proponer un modelo cinético en función de la variable

estudiada,tal comoseintentó en el casode la temperatura.Además,con estemodelo no fue

posible obtenerunabuenareproducciónde la evolucióndel amonio, tal como fue mostrado

en las Figuras4.2aa 4.Ba. Por tanto, eslógico pensarque el modelo es incapazde mostrar

una evoluciónde parámetrosen funciónde estavariable.03 5

0.4 4

035 5’ 5’ 5’

(a>

5’

lOO 200 300 400AnxniO<rplr)

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40

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600

600

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0.00) -

0.000—

(b)

~~1/ Y \

It¡1 5’

-a.

O lOO 200 300 400 500Araimio (mm)

U U

O lOO 200 300 400Anxnao (mm)

500 600

O lOO 200 300 400 500 600Amoujo (m~<)

Figura tU- Evoluciónde parámetrosdel MCNE con la concentraciónamonio.

03

0.

0.0

¡<02<

¡¡0)5

y

600

¡<.0]

0005

1 (d)

N.

190

ModeloCinéticoNo Estructurado

4.3.2.- Simulación de una Operación Discontinuscon el Modelo Cinético NoEstructurado

La realización de simulacionescon modeloscinéticosconstituyeuna herramienta

predictiva muy útil, permitiendo prever lo que ocurre cuando se modifican ciertas

condicionesduranteel proceso,sin necesidadde experimentar,lo cual permite un gran

ahorrode trabajoy tiempo. La simulacióndebede serrealizadacon un modelocorrecto,es

deciraquelcuyo planteamientoy parámetrospermitanpredecirde la formamásfiable lo que

puedeocurrir ante cambiosen las condicionesde operación. De esta manera,una vez

obtenidoslos parámetrosde un modelo bajo ciertas condicionesde operaciónes posible

realizarsimulacionesconsiderandootras condicionesiniciales (temperatura,velocidadde

agitación, cambiosen la composicióndel medio, etc); otros tipos de reactores(air-lifts,

columnas,etc) o cambio en las dimensionesdel reactor empleado.Todo ello implica la

utilidad de realizarunasimulaciónparaefectuarun cambiode escalaen el proceso.

Por todo ello, es importanteconocer quéescapazde predecirel modeloplanteado

de forma adecuada,hayquesaber,también,qué variablesinfluyen en el proceso,y cuánto,

esdecir, evaluarla sensibilidaddel sistemafrenteadiferentescondicionesde operación.

La forma más adecuadade efectuar las simulacionescon un modelo cinético-es

empleandoparámetrosen funciónde las variablesde operaciónquepudieraninfluir.

En estecapítuloseha visto queel MCNE no ha podido serobtenidoen función de

ninguna de las variables estudiadas—nitrógeno y temperatura-,por lo que realizar

simulacionesprobandodiferentesvaloresde estasvariablesno va apermitir obtenerbuenas

predicciones,puesel modelono contemplaestainfluencia.

Se hanrealizadosimulacionesque en principio, cabríaesperarmostraseninfluencia

en la evoluciónde componentes,como concentraciónde biomasainicial, concentraciónde

azúcarinicial y concentraciónde oxígenodisuelto.

Es lógico pensar que la concentraciónde biomasainicial influya en la evoluciónde

componentesdel sitema . Esta concentración de biomasainicial influye en primera instancia

191

Modelo Cinét¡coNo Estructurado

en la evoluciánde biomasatal como contemplala ecuación[4.131correspondientea la

ecuaciónlogísticaparael crecimiento.Además, al influir en la concentraciónde biomasase

verán afectadosel resto de componentesdel sistema,esdecir, concentraciónde sacarosa

(ecuación [4.15]), evolución de oxígeno disuelto (ecuación [4.16]) y evolución de la

concentraciónde xantano(ecuación[4.18]), puestodasincluyen el término de biomasaen

sus expresiones.

En cuantoa la influencia de oxigeno disuelto, sólo cabepensarque al modificar

algunacondiciónenel biorreactorque alteresuconcentración(velocidadde agitación)sólo

seve afectadala propiaevoluciónde estecomponente,puesa la vistade las ecuacionesdel

modelo no estructurado,sólo sereflejará la influenciaen el coeficientede transferenciade

materia(ecuación[4.17]), y éstaen la ecuación[4.18], correspondientea la evoluciónde

oxígenodisuelto.

Finalmente,la influenciade la concentracióninicial desacarosaseverá reflejada

tanto en la evoluciónde la concentraciónde producto(ecuación[4.18]), como en la propia

evolucióndelazúcar,tal como indica la expresióndadapor la ecuación[4.15].

Así pues,se han realizadodiversassimulacionesparaobservarla influenciade ¡os

factorescomentadossobrela producción,el crecimientoo la evoluciónde oxígenodisuelto

durantela fermentación.

En La Tabla 4.8 se muestranlas condicionesde operaciónempleadasen diferentes

simulacionesque han sido realizadascon el MCNE en operaciónen discontinuo. Las

simulacionessehanrealizadocambiandoel valor inicial de diversosfactorescuyainfluencia

en el procesoesde sobraconocida(Santos,1993).

192

ModeloCinéticoNo Estructurado

Tabla 4.8 .- Simulacionesrealizadascon el MCNE en operacióndiscontinua.

Simulación Valores

Influencia de la concentracióndebiomasa inicial

Cxo = 0,03 g/LCxo 0,07 g/LCxo = 0,50 g/LCxo 1,00g/L

Influencia de la concentraciónazúcarinicial

C50 10g/LCso = 20 g/LC50 = 40 g/LCso SOgfL

Influencia de la concentracióndeoxígenodisuelto

Agitación constantePerfil de agitación

4.3.2.l~..Influencia de la Concentraciónde BiomasaInicial

Tal como muestra

biomasay se observósu

modelo: sacarosa,xantano,

la Tabla 4.8, se probaron cuatro concentracionesiniciales de

influencia en la evolución de los diferentes componentesdel

oxígenodisuelto y biomasa.

La influencia de la biomasainicial en el crecimiento, a lo largo del tiempo de

fermentación,se muestraen la Figura 4.17. Como puedeobservarse,cuantomayor es la

concentracióninicial, mayores la concentraciónmáxima de biomasaal final del periodo

exponencialde crecimiento.

En cuanto a la influencia sobre la velocidad de producción de xantano y de

consumode azúcar(Figura4.18),sepuedeapreciarque cuantomayor es la concentración

de biomasamásrápidaes la producción,no habiendodiferencias en la concentraciónfinal

193

ModeloCinético No Estructurado

alcanzada,puestoque éstaseestabilizacuandose acabael azúcar.El consumode sacarosa,

comoeslógico. esmásrápidocuantomásrápidaes la produccion.

En la Figura 4.19 se observa la mala simulación obtenidapara la evolución de

oxígenodisueltopues, comoya ha sido comprobadoa lo largode estecapitulo estemodelo

no permitepredecir de formaadecuadala evoluciónde estavariable.En cuantoal valor de

la constantede tranferenciade oxígeno (k¡~av) su valor es mayor cuantomenor es la

biomasainicial, debido, lógicamente,a la relación de éste con la viscosidaddel caldo

(relacionadaa su vez con la concentraciónde xantano).Si se observa la Figura 4.18 de

nuevo, observamosque coincide, en tiempo,que las mayoresconcentracionesde xantano

corresponden,en la Figura 4.19, a los menoresvalores de kLaV, para finalmente

estabilizarse,al igual que la produccióndel polisacárido.

194

ModeloCinéticoNo Estructurado

3

2

(3<

o

0,3

0,2

cf

o,’

0.0

t(h)Figura 4.17.- Simulaciónrealizadaparala producciónde xantanoen operaciónen

discontinuocon el Modelo Cinéticono estructurado:influenciade laconcentracióninicial de biomasa sobre la evolución de biomasa.

Figura 4.18.- Simulación realizadapara la producción de xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético no estructurado: influencia de laconcentracióninicial debiomasasobrela evolucióndexantanoy sacarosa.

0 20 40 60 80

40

t(h)

195

ModeloCinéticoNo Estructurado

25

2,5

202,0

~I,5 I5~

~2x

1.0

0,5

5

0,0

Figura 419.- Simulación realizada para la producción de xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético No Estructurado: influencia de laconcentracióninicial de biomasasobrela evolucióndel oxígenodisueltoyel k¡ay

0 20 40 60 80

(h)

196

Modelo CinéticoA~o Estructurado

4.3.2.2.-Influenciade la Concentraciónde Inicial Azúcar

Se han realizadosimulacionescon cuatro concentracionesiniciales de sacarosa,tal -

como se ha mostradoen la Tabla 4.8. En cuanto a la influencia en la velocidad del

crecimiento.la Figura 4.20 muestraclaramenteque el modelo prediceque la concentración

inicial de sacarosano influye enel crecimiento.

Enla Figura4.21 puedeversecomo influyen las diferentesconcentracionesde azúcar

sobrela evoluciónde la biomasaduranteel proceso.El modeloprediceque cuantomayor es

laconcentracióndesacarosamayor esla concentraciónde xantano,siendocapazde predecir

que la produccióncesecuandola concentraciónde azúcarescero,debidoa que la ecuación

correspondienteala velocidadde producciónde xantanoaparecela concentraciónde azúcar.

La simulaciónparaobservarla evoluciónde oxígenodisuelto puedeobservarseen la

Figura4.22, dondeademásde observarla malapredicciónde estecomponentecon el modelo

cinético no estructurado,seobservala predicciónde la evolucióndel valor de kLaV mayor

cuantomenoresla concentracióninicial de sacarosa.

2,0

1,

1,

0,5

0,.

0,3

0,2

cf0,1

0,070

Figura 4.20.-

t (Ii)

Simulación realizadapara la producciónde xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético no estructurado: influencia de laconcentración inicial de sacarosa sobre la evolución de biomasa.

197

ModeloCinéticoNo Estructurado

-s

tE

(y

3

Figura 4.21.- Simulación realizada para la producción de xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético no estructurado:influencia de laconcentracióninicial de sacarosasobre la evolución de xantina ysacarosa.

y

80

70

60

SI)

406

30~

20

lo

o

Figura 4.22.- Simulación realizada para la producción de xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético no estructurado: influencia de laconcentracióninicial deazúcarsobrela evolución de oxígenodisueltoyktav.

198

50-

40

20

t (Ji)

t (Ji>

ModeloCinético No Estructurado

4.3.2.3.- Influenciade la Agitación

En las Figuras 4.23 y 4.24 se muestranlos resultadosobtenidos al realizar

simulacionesconelMNE con diferentesprogramacionesde la velocidadde agitación.Sehan

realizadosimulacionesconunaagitaciónconstantey un perfil de agitación.En la Figura 4.23

aparecela influenciade los dostipos de agitaciónsobreel crecimiento,el consumode fuente

nitrogenada,sobrela fuentede azúcary la produccióndelpolisacárido,observándosequeel

modelo es incapazde predecirla influenciade la velocidadde agitaciónen la evoluciónde

estoscomponentes.Dondesi se ve reflejadala influenciade la velocidadde agitaciónes en

la evolucióndeloxigenoy el valor de la transferenciade oxígeno.(kbav) tal como se muestra

en la Figura4.24.

J

40

30

20j~

(y

lo

o

«jo

tqi}

Figura 4.23.- Simulación realizada para la producción de xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético No Estructurado: influencia de lavelocidaddeagitaciónsobrela evoluciónde amonio,biomasa,sacarosayxantano.

2,0

0 20 40 60 80

199

ModeloCinéticoNo Estructurado

30

25

20

46lo

5

o

‘(jo

Figura 4.24.- Simulación realizada para la producción de xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético no estructurado: influencia de lavelocidaddeagitaciónsobrela evolucióndeoxigenodisueltoy lu¿Lav.

0*1*115

ab

iv

0 20 40 60 80

t(h)

200

Modelo CinéticoNo Estructurado

4.3.3.- Validez del ModeloCinéticoNo Estructurado

A lo largode esteapartadosehanido exponiendolos diferentesresultadosobtenidos

con el MCNE propuesto,tanto en ajustesa datos experimentalescomo en las distintas

simulaciones.Se ha visto que se ha conseguidoun buen resultadoal aplicar el MCNE a los

diferentesexperimentosrealizadosen estetrabajo en las evolucionesde biomasa,xantanoy

sacarosa;sin embargo,estemodeloesincapazde predeciruna buenaevolucióndel oxigenoy

del amonio.

Seha planteadoun modelocinéticono estructuradoen función de la temperatura(T)

de acuerdoa la tendenciaquepresentabanalgunosde los parámetrosobtenidosen los distintos

experimentos.No obstante,al reproducir los datos con el citado modelo en función de

temperatura, se observó que las reproduccionesobtenidas con el MCNE(T) no son

suficientementebuenas.

Para la otra variable estudiada,es decir la concentracióninicial de amonio, no fue

posiblesiquieraobtenerunarelaciónde estetipo, pueslos parámetrosobtenidosdel ajustecon

el MCNE no presentabanunatendenciacapazde respondera algunafunciónmatemáticaque

permitieseplantearun MCNE(NH4~).

Las simulacionesfueronrealizadastomandocomo parámetroslos obtenidospor ajuste

del experimentocentral—aquel realizadocon las condicionesóptimas (Santos,1993)-.Sehan

realizadolas simulacionesoportunascon el fin de observarlavalidezdel modeloplanteado.

Al compararlos resultadosobtenidosa partir de las diferentessimulacionescon los

resultadosexperimentales,seha podido llegar a las siguientesconclusionesrespectoa lo que

el Modelo CinéticoNo Estructuradoescapazdepredecir:

• La concentraciónde xantanose ve influida por la concentracióninicial de amonio,

observándoseun máximoen la produccióna 257 p.p.mde amonio, sin embargoel modelono

lo predice.

201

—liodelo CinéticoNo Estructurado

• La concentraciónde oxígenoen el medio se ve influida por la concentraciónde xantano

fonnado, el modeloesincapazde predecirla evoluciónde oxígenodisuelto segúnaumentala

concentraciónde polisacárido,ni tampocopredecirestaevoluciónsegúnse va aumentandola

velocidadde agitación.

• El modelo es capazde predecirbien la influenciade la concentracióndesacarosainicial

sobrela evoluciónde la concentraciónde polisacárido,en cambioes incapazde predecirde

formaadecuadala influenciadel azúcaren la evoluciónde la biomasa.

Por todo ello, se puedeconcluir que el modelo cinético no estructuradopermite

predecirbien la influenciade azúcarinicial en el medio,y la influenciade la biomasainicial,

en cambio no permite obtenerbuenasprediccionesde la evolución de oxígeno disuelto,

variablesesumaimportanciaen esteproceso.Así pues,el ModeloCinéticoNo Estructurado

no essuficienteparala descripciónde la producciónde xantano.Se hace,pues,necesario

mejorar el modelo de modo que se consiga una mejora en las predicciones de las

evolucionesde ¡os componentes.Ello implica teneren cuentaen el modelo factoresque

influyen en el procesoy, que no han sido consideradoshastael momento.En cl próximo

apanadose aplicará un modelo cinético más complejo, esto es un Modelo Cinético

Metabólicoque, es de esperar,mejoresignificativamentela descripciónde la producciónde

xantano.

202

5.- MODELO CINÉ ¡‘moMETABÓLICO

ModeloCinético Metabólico

5.- MODELO CINÉTICO METABÓLICO

Como ya seha visto, los modeloscinéticosno estructuradossonbuenosparadescribir

el sistemacuandola composicióncelularestáaproximadamenteen estadoestacionarioo no es

necesarioteneren cuentala influenciadeciertasvariablesen los valoresde los parámetros.Sin

embargo,en una situaciónen la tienenlugarcambiosen la composicióncelular, los modelos

no estructuradosproporcionanunapobreaproximacióna la realidad.Porotra parte,es lógico

pensar que los modelosno estructuradosno seancapacesde reflejar la influenciade ciertas

variables,fundamentalmentela composicióndel medio, tal como ha quedadoreflejadoen el

apartadoanterior. Parasalvarestasdebilidadesen estetipo de casos,hay que recurrir a los

modelosestructurados.

Estos últimos fueron clasificadospor Nielsen y Villadsen(1992) en varios tipos, tal

como se detalló en el primer capítulo de estaMemoria. Dentro de esta clasificación, se

encuentranlos ModelosCinéticosMetabólicos(MCM), los cualesno estructuranla biomasa,

peroplanteanrelacionesestequiométricasdefinidasparael metabolismodel sustratocarbonado

(Kogaycol. 1969;HallyBarford 1981;Barfordy col. 1992).

203

ModeloCinético Metabólico

En La literaturahay diversosModelosCinéticosMetabólicos(MCM), entendidoscomo

aquellosquehacen un tipo de estructuraciónsólo parael metabolismodel o de los sutratos

carbonados,sin diferenciarpanesen la biomasa,ya que la siguen considerandocomo en los

modelosno estructurados.Dentro de estetipo, existenmodelosmuy diferentes,muchosdc

ellospropuestosparaproblemasmuy especificosde forma teórica(Van Dedemy Moo-Young,

1973; Gerastsy col., 1990; Bibila y Flickinger, 1991), realizandosimulacionesa partir de

parámetrosestimadosde forma que no queda muy clara. Otros autoresplanteanestudios

metabólicosmásgenerales,como esel casode Koga y col., (1969)y del grupode Bardford

(Barford y col.. 1990; Hall y Bardford, 1981 Bardfordy Hall 1981;Bardford y col., 1992ay

1 992b), estos últimos autores proponeneste tipo de modelospara el caso específicode

Saccharomycescerevzs¿ae.

El único modelo de tipo metabólicopropuestoen la literatura parala producciónde

xantanoes el planteadopor Ponsy col. (1989).Estemodelofue formuladocon datosobtenidos

en operacióntipo batchy en un reactortipo columnade burbujeo.Consideranla biomasacomo

una entidadindependienteen el sistema,el crecimientoes consideradocomo no estructurado;

sin embargose estructurala producciónde xantano,esdecir, el modelo tiene en cuentael

metabolismodel sustratocarbonadoen el metabolismo celular. La Figura 5.1 muestrala

mterrelaciónentrela síntesisdel xantanoy el catabolismode la glucosavíaEntner-Doudoroff

en conjuncióncon el ciclo de Krebs.Las dos rutasno son independientesdebido a que los

sutituyentesde la molécula de xantano,acetatoy piruvato, presumiblementederivan del

acetilCoA y del fosfoenolpiruvato(PEP). En dicho esquemase muestraademásdónde se

requiereno generanlos compuestosde alta energía(ATP, GTP)y susprecursores(cofactores

reducidos,NADH,It FADH2).

20~

ModeloCinético Metabólico

UDP- GLc

/1

UDP-Ac Gle

LIPIDO-P.~1

1’4UMPLIPIDO-P-P-G(c

IDP-GIc IDP

LIP!DO-P-P-GIc-GIc

Fre GP—.Mari- GP—.Man lP—*GDP-ManRuta IIIEntner ~-UDPDoudoroft

Ir

PEP

LIPIDO-P-P y,

LIPIDO-P-P- Glc-GIc- Man

LIPIDO- P- P-Glc- GIc- Man

Ac-Glc

LIPIDO- P-P-GLc- GIc- Man

Ac-Glc

Man

LIPIDO-Gle-Gle- Man-Ac-GIc

¿ PVR= Man

MONOMERO DE XANTANO

Figura 5.1.- Rutas del catabolismode glucosa y síntesis de xantano empleadasporXanthomonascampestris.

GIc

¿Gle SP —.‘GIc—1P

— Gte— Gle—

Man

Ac Gte

Man= Pyr

205

ModeloCinético Meíabólicc

Las relacionesestequiométricasplanteadaspor estos autoresparala evoluciánde los

diferentescomponentessonlas siguientes:

Para la síntesis de xantano, Pons y col. (1989) proponen tres relaciones

estequiométricas.La primeraestablecela síntesisdel esqueletocarbonadoconteniendocuatro

hexosas(dosmanosasy dosglucosas)y una deácidoglucurónico:

5C6H1206+ 1 }(ATP + 1120)+ NaOH + 2NADP —* C30H47026Na+ 1 ]<‘ADP + Pi)

±(NADPH,FU)±5H20 [5.1]

La segundaecuacióndescribela sintesisde Acetil CoA, el precursordel constituyente

acetato:

C6HlrOú + JIDP + Pi + NADP~ + 3NÁ4D~+ 2CoASH~—> 2AcetilCozt+ IITP

+NADPH,H~ ±3(NADH,H~)±H20±2C02 [5.2]

El piruvatoesdirectamenteobtenidoa partir del fosfoenolpiruvato(PEP):

CÓH/2Oó+ Pi + NADP~ + 2NAD~ + 2CoASH—> PEZ’ + ,4cetilCoA+ NADPH, W±2(NADH,W)+ 1120±CO? [5.3]

Las ecuaciones[5.1] y [5.3] son multiplicadaspor los coeficientesestequiométricos

queestosautoreshan extraídode la literatura,y se muestranla siguienteecuación:

5,49C6FJj:Oá + 10,S9ATP+ 3,58(NADP~ NAD~)+ ],3SNaOH+ 0,6CoASH+ 0,302—* C3. 34His5802736NQ1,38+ bO,89(ADP+ Pi) [5.4]

338(NADPH,H4; NADE!, H~) + 0,6 CoA + 0,6C02

Parala producciónde xantano,seconsideraque el pesomoleculardel monómerode

xantano correspondea una fórmula empírica: C32,341Ls,580n,36Na,,3s,por lo que su peso

moleculares 906,2 g/mol.

Parael catabolismototal de la glucosa,considerandoque la ruta catabólicaes la de

Entner-Doudoroffen conjuncióncon el ciclo de Krebs,seasume:

C6H/206 + 3(ADP+ Pi) + 2FAD~ + 10NAD~ + 6H20—* 6C02+ 3ATP

+ 10(NADH,H~)+2FADH2 [5.5]

206<

ModeloCinético Metabólico

La energíade mantenimientose formulacomo:

ATP —* ADP+ Pi [5.6]

Parala fosforilaciónoxidativa:

NADH,H~ + 0,502 -* NAD~ ±H2O[5.7]

FADH2 + 0,502->FAD~ + H20

Las velocidadesespecíficasde crecimiento de las ecuaciones[5.4] a [5.7] son,

respectivamenteq ~, q c, q ni, q y q p. La relaciónentre las ecuaciones[5.61y [5.7] puede

expresarsecomo la relaciónq’p/ q?,siendo la relaciónP/O o númerode moléculasde ATP

formadasdurantela transferenciade un par de electronesa travésde la cadenarespiratoria

haciael oxigeno,queesel aceptorfmal de estoselectronesenlos organismosaerobios.

Ponsy col. (1989)planteanrelacionesestequiométricasparadiferentescomponentes

del sistema:

Velocidadde consumodeglucosa:

q’g = qj +5,49 q’x [5.8]

Velocidadde producción de CO2:

q rn. = q c~05 [5.9]

Velocidaddeconsumode oxígeno:

q0=0,5q’~ [5.10]

Velocidaddetransferencia de oxígeno:= kLaV [5.11]

CbMax(C*~Co,)

Velocidadde produccióndecofactores:

[5.12]

207

Modelo Cinético Metabólico

VeLocidadde consumode ATP:

qÁTP=]O,89qX+q,,, [5.13]

Velocidadde produccióndeATP:

q ÁT~” =3 qj ±qj [5.14]

Se asume estado pseudoestacionariopara cofactores y balancesde ATP. Las 7

ecuaciones([5.8] a [5.14]) del modelo implican 10 incógnitas,donde nueveson velocidades

especificasqg, q’c, q’x, q’ccn, q’o2, q?,qp, q1w, qATP y la concentraciónde oxígenodisuelto.

Un aspectoimportantequeconsideranestosautoresesel mecanismoparala energíade

mantenimiento,proponiendoque el consumode energía para este mantenimientopodría

proporcionarrendimientosteóricosde xantano Yg.x entre 0,9 y 0,77 g de xantano/gde

glucosaparavaloresde P/Oen un rangoentre3-0,5 respectivamente.Estono pareceapoyarlos

resultadosexperimentales,los cualesno excedende 0,7 g de xantano¡gde glucosa

Entrelas suposicionesdel modelohayqueconsiderar:

• El requerimientode ATPparala síntesisde xantano(1O,89q’x) no iguala la velocidad

de síntesisq’ATP puestoque la demandade ATP paramantenimientoq’,,, espositivo.

• Asumenque los requerimientosde ATP parael mantenimientosonproporcionalesal

requerimientoparala síntesisde xantano,lo cualrinde:

_ [5.15]q ~

Si se sustituyela ecuación [5.15]en la [5.13]se obtienela ecuación[5.16]:

~ATP _____ — 89+ E [5.16]

Estaecuaciónindica que la cantidadde ATE’ implicado en la síntesisde xantanoes

mayorquela cantidadque estequiométricamentepredicela ecuación[5.4].

2 08a

Modelo Cinético Metabólico

• Los resultadosexperimentalesmuestran la clara influencia del coeficiente de

transferenciade oxigenosobrelas velocidadesespecíficas.Esto debeser expresadoa

través de la limitación de oxigenosobrela velocidadespecifica ¿opIadaal consumo

de oxígeno,de acuerdoa:

qrMCO: [5.17]

q = (Kc+ Co2)

Cuandoel oxígeno no es limitante, se obtiene el valor máximo, q’rM. Cuando el

oxígenoes limitante , esdecir suconcentraciónes cercanaa cero, la ecuación15.17]

quedacomo:

qrM Co

;

[5.18]qr= Kc

• La relaciónfmal estábasadaen las investigacionesde Rbels (1983).La relaciónPÍO

de 3 esestequiométricamentepoco realistaparalos organismosen vivo. EJ valor P/O

debeser máspequeñodebidoa la fosforilaciónoxidativa.Basadosen la condiciónde

Róelsde no limitación de oxigeno,el valor másalto de PÍO esde 1,2 mol ATP/mol de

cofactor. Por tanto, Pons y col. (1989) asumenque la relación entre la tensiónde

oxígenoy PÍO esfuncionalmentesimilar a la relaciónentretensiónde oxigenoy la

velocidadderespiración:

q~ _ 1,2 Co; [5.19]qr — (Kc+Co;)

Lasecuaciones[5.16],[5.17]y [5.18]introducentresnuevoscoeficientesF, q’rM y ‘Cc.

La constantede Michaelis, ‘Cc, es estimadacomo el valor más bajo de tensión de

oxígenodisuelto (2% de saturaciónde aire correspondea Kc = 4,6 . 10.6 molfL). El

coeficienteq’~ escalculadoa partir de la velocidadespecíficamáximade producción

de xantanoen tanqueagitado con limitación de oxígeno(q’xirO,2S g de xantano/g

biomasa h) el correspondientevalor de q’~M=8.10~3 mol NADVg biomasa h.

Finalmente,el valor de F esestimadoen 23 mo] de xantano/molde ATP empleado

paramantenimiento.Esto rinde un valor de Y’X.ATP de 34 mol ATP/mol de xantanoy

unaimportanteeficienciaen el turnoverdeATP en xantanode l0,89/340,32.

Portanto, el modelopropuestoporPonsy col. (1989)sepuedeescribir,adaptándoloa]

métodoutilizado en estaMemoria:

209

Íklodelo Cinético A’Íetabólk~

Evoluciónde biomasa:

Evoluciónde xantano:

Evoluciónde glucosa:

Evoluciónde oxígeno:dC0

,

dt= kLaV(C * —Co:) — ros

Asumiendoestadopseudoestacionarioparala concentraciónde oxígenodisuelto:

dC<

)

dt

Las velocidadesde reacciónplanteadaspara las reaccionesdel esquema,en el que

intervienenla biomasa,el sustratocarbonado,oxígenoy dióxido decarbono son:

Parala biomasa:

r x = Ch qr.

Parala glucosa:

Kg = C8 qr

(1 + 4. Y? -

(3,58 + 4~ Y’r - ArZ’)

Y’x - MP(5,49+ 20,77 Y’~• - p + (—•—---—-)

________________ 3(3,58+4Y’r-ATP)

Para el oxígeno:

Para el dióxido de carbono:

r o~ = 0,5 Ch qr

[5.281r CO: = 0,3 r’x + Ch~/2

dCb—=/;dt

dCx=

[5.20]

[5.21]

dCg

¿It[5.22]

[5.231

[5.24]

[5.25]

[5.26]

[5.27]

21 Oa

ModeloCinético Metabólico

Las ecuacionescinéticasdel modelo las planteande la siguienteforma:

l—Ct [5.29]rh=/JMCh.( )

Ch,.q’r = qrM Co: (Kc Coz) [5.301

Y’r - = l,2~ Coz~/(Kc — Coz) [5.31]

Ch~. =6,35ACb—Cho [5.32]

Ponsy col. (1989) sólo realizanajustede datosexperimentalesde la biomasaparala

cual empleanla ecuaciónlogística.Parael restode componentesrealizansólo una simulación.

Parala integraciónde las ecuacionesdiferencialesempleanel algoritmo de Runge—Kuttade

cuarto orden. Al comparar los resultadosobtenidosde la simulación del modelo con los

resultadosexperimentalesconfirmanla validezdel modelopropuesto.

Ponsy col. (1989)planteanel modelo queseha descritoparaun reactortipo columna

de burbujeo,porello, no esposiblela aplicacióndirectade estemodelo propuestoa los datos

experimentalesobtenidosen el presentetrabajo.unido a esto, tampocorealizabanun ajustede

los datosexperimentalesparaobtenerlos parámetrosdel modelo.Poresto,seha formuladoun

modelo cinéticometabólicoparala producciónde xantanoen un tanqueagitado,teniendoen

cuentaparaello algunasde las consideracionesplanteadasenel Modelo Metabólicopropuesto

porPonsy col. (1989).

21]

ModeloCinético Metabólico

5.1.-FORMuLACIÓN DEL MODELO

En estecaso, al igual que en el anterior, el modelo propuestodescribeel crecimiento

del microorganismomediantela ecuaciónlogística, como función de la concentraciónde

nitrógeno.Sin embargo,el modeloestructurala producciónde xantano,es decir el modelo es

metabólicamenteestructurado,puestiene en cuentael metabolismode la fuentede carbono

dentrode la célula.Se hantomadotodaslas relacionesestequiométricaspropuestaspor Ponsy

col. (1989)a excepciónde la planteadaparael xantano,puesel pesomolecularmedio del

precursorde xantanono es906,2 , comosuponenestosautores,sino queespróximoa 923 por

lo que la relación estequiométricapara la producciónde xantanoqueda conformea la

ecuación [5.33]:

549C6H¡206 + l~89ATP+3.58(NADPj)VADV~ 1.38NaO!!

±U6CoAS!!+a3o, -4Cnn H

49.%ÍO?suNaíJs+O6CO

2 [5.33]

±5.38í-j,O±1089(ADP+ Pi) +3.58(NADPH,H~;NADH,Ht) +0.6CoA

Las relacionesestequiométricaspara el catabolismototal de la glucosa,energía de

mantenimientoy fosforilaciónoxidativa,vienendadaspor las ecuaciones[5.5], [5.6] y [5.7],

propuestaspor Ponsy col. (1989).

Por tanto, las velocidadesde producciónde los componentes,suponiendoque toda la

sacarosa-sustratocarbonadoempleadoen estetrabajo- esasumidoen las ecuacionescomo

glucosa,son:

dC3 — 5,49 ri—r~ [5.34]

¿It

dC~ = ri [5.35]

dt

= —10,89ri+3re--r3 ±rs [5.36]¿It

dCCof — 3,58 ri + 12 r~ — r4 [5.37]

¿It

dC02 =—0,3r1 —0,5r4 +kLaV (CC0) [5.38]

¿It

212

Modelo Cinético ;Vletabólico

SegúnPonsy col (1989)la cinéticade la reaccióndadapor la ecuación[5.7] es:

k4Co:______ Cxr4=K4+ Co:)

[5.39]

Para la reacciónde la ecuación[5.33], la producciónde xantano,Ponsy col. (1989)

proponen:

= r4.[1±4 Y’rp

3,58+4Y,trp,p[5.40]

Suponiendoestadopseudoestacíonarioparalos cofactores:

dCcoj = O = 3,58 ri + 12 r~ —

[5.41]¿It

Sustituyendoen estaúltima ecuaciónlas ecuaciones[5.39]y [5.40]y despejandor2, se

obtiene:

!Á1~3~58C 1+4. Y’rp

3,58±4.YÁTrP)J

Portanto, lasvelocidadesde reacciónquedande la siguienteforma:

(c~rx=kx ¡ +Cxo ¡Y Yw~’ )

k4Co2ri =

K4 + Cm

1 k4~Co

,

r2 = —. _________

12 K4+Co,

CxJ’l— Cx

Y Cxo + Yxv CNO)

Cx j358+4JflTPP j

[5.43]

[5.44]

[5.451CxI’1YATPPjI ji

Los valoresde Y,~, y YATPP sehan fijadoen los propuestosporPonsy col. (1989):

Co[5.46]

[5.47]

[5.42)

Yrp W,2~

K4 + Co.

YATPP 34

213

Modelo Cinético Metabólico

Quedandoasíel modelocinéticometabólico(MCM), formadoporel siguientegrupo

de ecuacionesdiferenciales:

Parala biomasa:

dOy (Cv 6 Cx

¿It = kv.y0 + C,i — Cx +Yxw Cx) [5.48]

Parael azúcar:

dCs J 5,94 dO” 1 MCc, F( 1+4Yrp Ml___=180 — ____ . ___—-—. - Cx.tl—358d¿It 923,2 ¿It 12 K4±Co, L’K 3,58±4YITPP )jJ

1 ¿ICx

Yxs ¿It [5.49]

Parael producto:

k4 Co, ( 1±4Y1~

,

___r:923,2. K4±CO,K3, Cx [5.50]

¿It 58 + 4. YATPP

Parala evoluciónde oxígenodisuelto:

¿ICo, — 0,3 dC~ k4Co, Ck(C*C)’ dCx [5.51]

¿It 923,2 ¿It K4±Co Yox ¿It

El valor del coeficiente volumétrico de transferenciade oxigeno se ha calculado

empleandola mismacorrelaciónqueparael MNE, quevienedadopor la ecuación[4.23].

Por tanto, el Modelo Cinético Metabólico propuestotiene de siete parámetros,los

representativosde la biomasa: k~ y YxN -obtenidosde la mismaformaqueen el MINE- y los

parámetroscorrespondientesa la evoluciónde azúcar,xantanoy oxígenodisuelto: k4, 1<4, Y~<5,

Yox. En estecaso,la aplicacióndel MCM a los datosexperimentalesparala obtenciónde los

parámetrosserealizó de la siguienteforma:

21~

ModeloCinético Metabólico

• Primeroserealizó el cálculode los parámetrosrelacionadoscon el crecimiento:kx eYxrÑ.

Estosparámetrosse obtienenmedianteregresiónno lineal en simple respuestaaplicadaa la

ecuación [5.48] (estosajustesson,por tanto, los mismosque los realizadosen el capitulo

anteriordel MCNE, por lo queno se volveránaexponer).

• Luego se aplicóuna regresiónno lineal en múltiple-respuestaa las ecuaciones[5.49]a

[5.51],obteniendoasí los valoresde los parámetrosk4, K4, Yxs andYox. Debido a quelos

datos experimentalesde la frente carbonaday del xantanoeran 1 05 dos órdenesde

magnitudmayoresquela concentraciónde oxígenodisuelto,esnecesariopesarlos residuos

paraoptimizarel valorde los parámetros.Además,en la ecuación[4.23],correspondientea

la correlacióndel coeficientevolumétrico de oxigeno, es necesariosustituir la ecuación

correspondientede calibrado de la concentraciónde xantanoen ifinción de la viscosidad

paracadaexperimento.

215

Modelo CinéticoMetabólico

5.2.-AJUSTEDE LOS DATOS EXPERIMENTALES

Parala aplicacióndel modelocinéticometabólicoplanteadosehanrealizadolos ajustes

de los experimentosdel 1 al 7. Al efectuarel ajustede los datosexperimentalesobtenidos, se

observóqueel modeloeraincapazde ajustarlos datosde ciertosexperimentosdebidoa la falta

de convergenciadel algoritmo. En la Tabla 5.1 se muestranlos resultadosde los parámetros

fisicos y estadísticosde los experimentosdonde sepudoaplicarel MCM.

Todoslos ajustesrealizadoshanproporcionadonivelesde confianzasuperioresal 950~,

hay que apuntarque los valoresobtenidosparael parametroK4 sonmucho másaltosque la

concentraciónde oxígeno disuelto, por lo que las ecuaciones[5.39] y [5.46], puedenser

simplificadasa orden 1 de la siguientemanera:

k4Co•Cx~kCo Cx [5.52]

Kq±Co

Yrp=L2 Co, k’Co, [5.53]

K4±Co, -

Los datos experimentalesfueron nuevamenteajustados,teniendo en cuenta estas

modificaciones.Para diferenciar el modelo en el que r4 e son ecuacionesde orden 1

respectoal anteriorque aparecíancon cinéticastipo Monod sedenominóa estemodelo como

Modelo CinéticoMetabólicoSimplificado(MCMS).

En las Tablas5.2 a 5.8 serecogenlos valoresde los parámetrosfisicos y estadísticos

obtenidosde la aplicacióndel MCMS a los experimentosdel 1 al 7. Las Figuras 5.2 a 5.8

muestranlas reproduccionesdel modelocorrespondientesacadaexperimentoal realizardicho

ajuste.En estasfiguras, la líneacontinuarepresentala reproducciónobtenidade la aplicación

del modelomientrasquelos símbolosindican los puntosexperimentales.

En la Tabla5.2 semuestranlos parámetrosobtenidosporajustedel experimentono i,

realizadoa 250C y con 257 p.p.m. de amonio inicial, como puedeobservarse,todos los

parámetrosobtenidoscumplen las restriccionesestadísticasimpuestas,todos los parámetros

presentanintervalosde confianzaestrechos,presentandovalorestantode la t de Studentcomo

de la F de Fischerelevados.En cuantoa la reproducciónde Josdatosexperimentalesreflejada

en la Figura 5.2, se observaque paraeste experimentoel modelo predicede forma adecuada

216

ModeloCinéticoMetabólico

tanto la evoluciónde la concentraciónde xantanocomo la concentraciónde sacarosa.Parael

oxígeno,si bienno estanbueno,el valorteóricomejoranotablementela reproducciónobtenida

con el MCNE, comose puedecomprobaren la Figura4.2 del capítuloantenor.

Los parámetrosobtenidosdel ajustedel experimenton0 2, esdecir el realizadoen las

condicionesóptimasde producción:28 0C y 257 p.p.mde amonio(Santos,1.993),aparecenen

la Tabla5.3. Todos los parámetrosobtenidosrindenintervalosde confianzasuperioresal 95%,

si bien hay queapuntarqueel valor de t de Studentdel parámetroYox esrelativamentebajo.

El ajustede los datosexperimentalesobtenido paraeste experimentoes significativamente

mejorque el quese obtuvoparael mismo experimentoconel MCNE. Paraesteexperimento,

el MCMS muestrauna excelentereproducciónde la evolución de los tres componentes

(sacarosa,xantanoy oxigenodisuelto)tal como seobservaen la Figura5.3.

En la Tabla 5.4 se muestranlos parámetrosobtenidosde la aplicación de modelo

experimentorealizadoa 310C y con 257 p.p.m. de amonio inicial (experimenton0 3). Al

igual que en los dos experimentosanteriores,secumplenlas condicionesestadísticasparala

de Studenty la F de Fischer.Se obtieneunabuenareproducciónde los datosexperimentalesde

la evoluciónde oxígenodisuelto,de la concentracióndexantanoy de sacarosa,tal comopuede

observarseen la Figura5,4.

En cuantoal experimenton0 4, realizadoa 34 0C y con 257 p.p.m.de amonioinicial,

se observa que el valor del parámetrok’ (Tabla 5.5) es significativamenteelevado en

comparacióncon el que presentaen los experimentosanteriores,mostrandoun valor de t de

Studentmucho menorque el obtenido en los ajustesde los experimentosrealizadosa otras

temperaturas.La reproducciónobtenida(Figura 5.5) no estan buenacomo en los dos casos

anteriores,perosuperacon muchoa la obtenidaconel MCNE.

En la Tabla 5.6 aparecenlos valoresde todos los parámetrosobtenidosal aplicarel

MCMS al experimenton~ 5, realizado a 28 0C con 65 p.p.m.de amonio.En dichatabla

puedeapreciarsequese cumplenlas restriccionesestadísticas,siendoel valor másbajode t de

Studentel obtenidoparael parámetroYox. En cuantoa la reproducciónde la evoluciónde los

los componentescon estemodelo, seobtieneuna evoluciónde la concentraciónde sacarosa

aceptablemientras que la evolución de la concentraciónde xantano y oxígeno disuelto

difieren bastantede las obtenidasexperimentalmente,tal comomuestrala Figura5.6.

217

Modelo CinéticoMetabólico

Parael experimenton0 6, realizadoa28 0C y con una concentraciónde amonio inicial

de 130 p.p.m, vuelve a observarseque todos los parámetrossuperanlos valores teóricos

tabuladosde t de Stt¡denty F de Fiseher.En la Figura 5,7 aparecenlas reproduccionesde las

evolucionesde los diferentescomponentesobtenidasal aplicarel MCMS. en estafigurapuede

observarseun buen ajuste a los datos experimentalestanto de la concentraciónfuente

carbonada,como de Jaconcentraciónde xantanoy del oxígenodisuelto.

La Tabla 5.8 muestra los parámetros obtenidos del ajuste al modelo para el

experimentorealizadoa 28 0C con 514 p.p.m. de amonio (experimenton0 7). Hay que

destacarel valor significativamentealto del parámetrok’, el cual es aproximadamente2

órdenesde magnitud superior al obtenido en el resto de experimentos.Además, el valor

obtenido para la t de Studentno superael valor tabuladocon un 95% de confianza. Otro

parámetroen el que se obtieneun valor bajo de la t de Studentes k, este parámetroentra

dentrodel limite teóricoperoel valor es bajoen comparacióncon los experimentosanteriores.

En cuanto a la reproducciónde los datos experimentales,en la Figura 5.8 se observauna

reproducción aceptable para la evolución de sacarosa, no siendo tan buena para la

concentraciónde xantanoni parael oxígenodisuelto.

2/8

ModeloCinéticoMetabólico

Tabla5.1. -Valoresfisicos y estadísticosde los parámetrosobtenidosmedianteel ajustede losdatosde los experimentos2,3, y 4 al MCM.

TPa,.

Valorn Parámetros t Studeu,t F Fiseber

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y 0,552 0.535 0.5 19 68,77

2,080 66984 317 2.0610’Nt 6.229 6,073 5,918 80.26

y 3.670 3.183 2.696 13,07

199 2778 2.48 2,09

It 5.97.10’ 5,95 [0< 5.94102 805,6

0.2 It) 0,177 0,145 0,87

Yox [54,8 117,3 79.82 6,26

31

kx 0,472 0,446 0.421 36,71

2,145 4(42 3.74 [.4110’St 4,652 4,325 3.998 27,29

y 6,912 6,030 5,148 13.67

It 6.66.10< 6,66.102 6.66.10.2 I.38.I0~

¾, 0,168 0.155 0.143 24,80

37.55 33.55 29,55 [6,77

1>. 0,439 0,423 0,408 57,76

2,262 4263 4,26 0.80:101YXÑ 5,021 4.732 4,443 34,53

y 0.808 0.759 0,711 31,45

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Yxs 0 153 0 130 0,107 11,29

Yo~ 3487 31,29 27,71 1754

219

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Figura 5.3.-

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Reproducciónde los experimentalespor ajuste por ajusteexperimenton0 2, realizadoconXanthotnonascampestrisade 280 C, medioA (257 p.p.ni.de amonio),programaciónder.p.m. inicial).

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i,ú

o

1,0 ~(2

0,5

0,0

al MCMS della temperaturaagitación (210

2,5

2,0

1,5 Z2

-yo“os

0,5

0,0

al MCMS della temperaturaagitación (210

t (h)

t (Fi)

227

ModeloCinéticoMetabólico

404

35,

30—

(3,

--Ay->

25—

20-

15—

lo—

5—

oo 10 20 30

2.5

2,0

3-1,0e->

0,5

0,040

t (Fi)

Figura 5.4.- Reproduccióndeexperimentono 3,de 310C, medioAr.p.m. inicial).

40-

35

30

5cf

25

20

‘5

lo-

5

o

los experimentalespor ajuste por ajusteal MCMS delrealizadocon Xanthomonascampestrisa la temperatura(257 p.p.m.de amonio),programaciónde agitación (210

2,5

2,0

1,5o

1,0

0,5

Figura 5.5-- Reproducciónde los experimentalespor ajustepor ajuste al MCMS delexperimenton0 4, realizadoconXanthomonascarnpestr¡sa la temperaturade340 C, medioA (257 p.p.m.deamonio),programaciónde agitación (210r.p.m. inicial).

—— .—— . a

a. AC~,a

a

•• 4

t (h)

228

Modelo CinéticoMetabólico

cf

Figura 5.6.-

cf

Reproducciónde los experimentalespor ajustepor ajusteexperimenton0 5, realizadoconXanthornonascampestrisade 280 C, medio A (65 p.p.m.de amonio),programaciónder.p.m. inicial).

25

20

t5~’

o

05

al MCMS della temperatura

agitación (210

2,5

2,0

15’b

1,0

0,5

0,0

Figura 5.7.- Reproducciónde los experimentalespor ajustepor ajusteal MCMS delexperimento~0 6, realizadoconXanthomonascampestrisa la temperaturade 280 C, medio A (130 p.p.m. de amonio),programaciónde agitación(210 r.p.m. inicial).

o 3J(h)

t (h)

229

ModeloCinéticoMetabólico

u

<Ay-,

Figura 5.8.- Reproducciónde los experimentalespor ajuste por ajusteexperimenton0 7, realizadocon Xantho,nonascampestrisade 280 C, medio A (475 p.p.m.deamonio),programaciónder.p.m. inicial).

al MCMS della temperatura

agitación (210

2.5

zo

L5

oEo

1,0 ~

230

ModeloCinéticoMetabólico

5.3. DISCUSIÓN

5.3.1.- Variacióndel Valor de los Parámetroscon las Variables

5.3.1.1.- Influencia de la Temperatura

En la Figura5.9 semuestranlas tendenciasde los parámetrosdel modelo(MCMS) con

la temperatura.No sehanconsideradolos parámetroscorrespondientesal crecimientodebidoa

quela biomasaseha consideradosin estructuracióny, portanto, los resultadossonlos mismos

queenel MCNE. vistosenel capítuloanterior.

En cuantoa los parámetroscorrespondientesa la evolución de las concentracionesde

sacarosa,xantanoy de oxigeno disuelto obtenidos del ajuste de los datos a diferentes

temperaturas,la tendenciapresentadapor los parámetrosYox y k esmuy similar, ambos

parámetrospresentanun máximo, en tomoa 28 oc paraVox y a 3 ¡ o c parak. Los otros dos

parámetrosdel modelo -Y=~sy k-’ presentan una tendencialineal con la temperatura.El

parámetrorelativo a la velocidadde desaparicióndel azúcar,Y~<s , decrece, mientrasque k,

parámetrorelacionadocon la velocidadde aparicióndel producto,aumentacon el incremento

de dichavariable.

De acuerdo con estas tendencias, los cuatro experimentoshan sido ajustados

conjuntamenteal MCMS, teniendo en cuenta la influencia de los parámetros con la

temperatura,de la mismaformaque serealizóparalos parámetrosdel modeloMCNE, visto en

el capítuloantenor.

Los parámetrosk y Yox puedenponersecomo fUnción de la temperaturade acuerdo

con la expresiónde Ratkowskyy col. (1983),dadaen las ecuaciones[5.54]y [5.55],mientras

queYx~ y k’ han sido ajustadosa expresioneslineales(ecuaciones[5.56]y [5.57]).

El ajustede todos los experimentosal MCMS (T) (Modelo Cinético Metabólico

Simplificado en fhnción de T) fUe realizado en múltiple-respuesta,considerandocomo

respuestas:sacarosa, xantano y oxigeno disuelto. Las tendenciaspresentadaspor estos

parámetros,asícomoel ajustea lasecuaciones[5.54]a [5.57]semuestranen la Figura5.9:

231

ModeloCinéticoMetabólico

k(T) / O - (T - T,~o-,.> -[1- expí’C: - IT - Tmax))Jf [5.54]

y0»(T)z{ C’1 (7’ -T’,~,~) fi -exp(C’-, -<‘7’- [5.55]

Y~s = a±/3-7’ [5.561

kYT)=a÷/3-T [5.57]

Este modeloMCMS(T), tienedoceparámetros:C1, Tmin, C2, Tn,a,c,Cí, T’min, C2, Ti,,a<,,

a, fl, a’ y fl’, tal como seindica en las ecuacionesanteriores.En la Tabla 5.9 aparecenlos

valoresde los parámetrosy sus estadísticas,obtenidosdel ajustede los cuatro experimentos

realizadosa diferentestemperaturas,dondelos parámetrosrelativosa la frentecarbonada,al

xantanoy al oxigenodisuelto han sido puestos en función de la temperaturade la forma

indicada.Comoseobserva,paratodos los parámetrosse cumplenlas restriccionesestadísticas

superandosiempreel valor teóricode t de Studenty de F deFischer.

Las tendenciasobtenidas para estos cuatro parámetroscuando son ajustados

conjuntamente,se mostraronen la Figura 59, donde el resultadode esteajuste erael

representadopor la línea continua. Este ajustees el resultadode sustituir los valoresde

temperaturaen las ecuaciones[5.54] a [5.57] con los valoresde los parámetrosobtenidos,

de la siguienteforma:

¡«7’,> (0,94-(7’ -19,45)-fi- exp(1,399-(7’ -34,24 [5.58]

k’(T) —2,913+ 2,048 7’ [5.59]

( 0,571 - (T -24,35)11- exp(—0,20S(T~ 37,16))]/2 [5.60]

Todos los datos experimentalesobtenidos en los experimentosllevados a cabo a

diferentestemperaturashan sido reproducidosmediantesustituciónen las ecuaciones[5.58]a

[5.61] dentro del modelo cinético. Las Figuras 5.10 a 5.13 muestran una excelente

reproducciónde los resultadosexperimentalescon el MCMS(T).

232

Mode/oCinéticoMetabólico

120

100-

~,, 80~ 60’~ 40-

20-

o20 25 30 35

T<0C)0,25

0,2 — —— ,% —— -—

045 1~>

0,1

0,05

o20 25 30 35

Tc7’C)

Figura5.9- Evolución de los parámetrosdel MCMS con la temperatura.La líneadiscontinuaindica la tendenciade los parámetrosobtenidosexperimentoaexperimento,la línea continua representael ajustea las ecuaciones[5.54] a[5.58].

140120-100780-6040-207

o20

180160140120

x 100o

>- 80604020

o20

Sr—

25 30 35

T(0C)

GOx

25 30 35

T (OC)

233

‘0 4-

‘-O

4-

La Os

—a

U.>

La o-.>

o [4 [4 La

[4 4-

b 00

o -:4

La U—>

‘0 o o-.>

o [4 U.> La

H U.> 4-

[4 [4U.

>

‘0 U-> y-.>

o O ‘-O

U.>

—4

E.

E o

la -w la’

E e, o

o-.>

[4 0

4 4-

~4

2- [4O

La ‘00 0

0-~

[4 Os

[4

‘ ‘-0

—

[4.

0 $.

—4

-O

Li,

o-.> -~ [4 La

0 00

La

L L La Os

4 4- U.>

—-

o

— —.

U.>

— ~‘

[4 o 4-

00

‘ ‘CM

— o-.>

1’->

b~

oo-

.>LI

,Li

i

Os

--a

.9 U.

>

e e-.> 4.

O

U.>

4-

4-

e e-.>

‘C ‘0

: :0 .~ La

4 4.

o1

o~ E o

‘OH

.>.> 4- 2

4-

4..>4

-

2

g‘~

o os

¿.> o

Os

Lii

9 9C

i~

La —a 90

O-

~

e, O •4

‘-0 Os

o

e, 0— o

U.>

La

‘0

O O.

e, ~O

.e

,-y

-4 ‘0

o o.

1, o

o-.>

00Q

n

o

la e- la ~Jt

-O—

<D

O-t

-t~

~0

—‘e

•0

~.

oU

,

Li

CL ‘e

U>la U

,4

”—

•n

o 2;

OO

‘oO

la‘e

-i la—

O

aC

L—

O-t O

O-

‘e o O-

la O o a ci, o O

-o ‘e O

-la O U, o -e o O -j <o la CD U, O

-o ‘e

ModeloCinéticoMetabólico

2,5

2,0

15—~

o1,0:

0,5

0,0

Figura 5.1O-

(-5-4$9(y

Reproducción de los datosmedioA (con 257 p.p.m.der.p.m.)al MCMS (T).

del experimenton0 1 realizadoa 250 C,amonio)y programaciónde agitación(210

2,5

2,0

1,5?

ib-

1,0 ~

0,5

0,0

Figura 5.11.- Reproducción de los datos del experimenton0 2 realizadoa 280 C,medio A (con 257 p.p.m. deamonio)y programaciónde agitación(210r.p.m.)al MCMS (T).

40

35

30

20-

15•

un

25

(-5--4

cf

O 10 20 30 40 50 60

t (h)

t(h)

235

ModeloCinéticoMetabólico

40

35

30

(-5-

$9cf

25

20

I5

I0~

5

o

Figura 5.12.-

40

35

30

$9zU

25

20

[5

lo

5

o

Reproducciónde los datos del experimenton0 3 realizadoa3¶O c, medio A

(con 257 pp.m. de amonio) y programaciónde agitación(210 r.p.m.) alMCMS (T).

2,5

2,0

l,5~

ib-

3-

1,0

0,5

Figura 5.13.-Reproducción de los datos del experimento ~0 4 realizado a 340 C, medioA (con 257 p.p.m.deamonio)y programaciónde agitación(210r.p.m.) alMCMS (T).

2,0

1.5-2

1~0

(-y

0,5

0,04020

t (h)

t (h)

236

ModeloCinéticoMetabólico

5.3.1.2.- Influencia de la Concentración de Amonio

Comoya sevió anteriormente,el ajusteobtenidocon el MCMS no permitióunabuena

reproducción de los datos experimentalesde los experimentosrealizadoscon 65 p.p.m.

(experimenton0 6) y con 514p.p.m.(experimenton0 7). Parael ajustedel experimentocon 514

p.p.m.de amonioel valor delparámetrok’ eramuy elevado, y el valor de la t de Studentpara

el citadoparámetroera inferior al valor tabulado.Parael experimentorealizadocon 65 p.p.m.,

aunque se cumplían las condicionesestadísticas,se observóque la reproducciónde la

evoluciónde la concentraciónxantanoy dela concentracióndel oxigenono erabuena.

Los experimentosllevados a cabo con 130 p.p.m. y 257 p.p.m. de amonio rendían

buenosresultados,tantodesdeun punto de vista estadístico,como en la reproducciónde los

resultadosexperimentales.

En la Figura 5.14 se muestrala evolución de los parámetrosdel MCMS con la

concentracióninicial de amonio empleada.Aunqueparael casode los parámetrosk’ e Yxs

(Figura 5. 14-by 5.14-d,respectivamente)parecenmostrarunatendenciaquepodríaajustarse

a una fUnciónmatemáticatipo Ratkowsky, no ocurrelo mismo paralos parámetrosk e

(Figura 5.14a y 5.14c, respectivamente).Por ello, no resulta planteable ningún modelo

(MCM) en fUnciónde lavariableconcentracióninicial de amonio.

237

Modelo CinéticoMetabólico

5)00 —

-1)00 -

x00 -

~oo-

1000 -

O—

600-

MX) —

cÚ —

300 —

20<1 -

1(X) —

1)

‘—n’ í y ¡

0 lOO 200 300 400 500Amonio (ppm)

0 [00 200 300 400 500Amonio (ppm)

so

60-

-40-

20 —

0—

020 —4

tOi5

1)10 —

600o

O -:

0 100 200 300 400 500 600Amonio (ppm)

1 ¡ i 1 i ¡

lOO 200 300 400 500 600Amonio (ppm)

Figura 5.14.- Evoluciónde los parámetrosdel MCMS con la concentraciónde amonioinicia].La línea discontinua indica la tendencia de los parámetros obtenidosexperimentoa experimento.

238

(a)

— — — — ~ —

1,1•1’1’1•

(b)

,,

A’~1~¿’0-1-

— —1- -H

1

(d) -

•1~

3$ ~It

ModeloCinéticoMetabólico

5.3.2.- Simulación con el Modelo Cinético Metabólico

Ya fue comentadoen el capítulo anterior la gran ventajapredictiva de realizar

simulaciones,unavezcomprobadoqueel modelocinéticoobjetode estudioesválido.

En este capítulose havisto que el MCM hapodido serobtenidoen función de una

de las variablesestudiadas,concretamente,de la temperatura.En cambiono sehaplanteado

un modeloquetengaen cuentala variaciónde la concentracióninicial de amonio, lo cuales

lógico si se tieneen cuentaquela concentraciónde amonio sólo influye en el crecimiento-

biomasa-y, en el modelo planteadoen estecapitulo, se ha consideradoeste componente

como no estructurado,esto es, expresadode la misma forma que en el MNE y, por

consiguiente,mediante la ecuaciónlogística.

Las simulacionesrealizadasen este capítulo son las mismas que en el capítulo

anterior.Se hanrealizadoaquellascon las que,en principio, cabríaesperarmayor influencia

en la evolución de componentes,comobiomasainicial, concentraciónde azúcarinicial y

concentraciónde oxigenodisuelto.

La concentración de biomasa inicial influye en la evolución de componentesdel

sistema.Estaconcentraciónde biomasainicial influye en primerainstanciaen la evolución

de biomasatal como contemplala ecuación[5.48] correspondientea la ecuaciónlogística

para el crecimiento! Por consiguiente,influirá en la evolución de la sacarosa(ecuación

[5.49]), de laconcentraciónde xantano(ecuación[5.50]) y del oxígenodisueltoen el medio

(ecuación[5.51]).

En cuanto al cambio de alguna condición que afecte a la evolución de oxígeno

disuelto, en estemodelo se verá la influencia no sólo en la evolución de este componente

sino en la velocidadde producciónde xantano,tal como se puedeapreciaren la ecuación

[5.50] y en la evoluciónde la concentraciónde azúcar,como se indica en la expresióndada

porla ecuación[5.49].

Finalmente,la influenciade la concentracióninicial de sacarosaseverá reflejada

en la propiaevolucióndel azúcar,tal como indica la expresióndadapor la ecuación[5.49].

239

ModeloCinéticoMe/abdico

Por el contrario, en la evolución del productono debede influir, pues la ecuaciónque

expresala citadaevolución(ecuación[5.50]), no presentaen suexpresiónla concentración

del azúcar.

En la

simulaciones

simulaciones

influenciaen

Tabla 5.10 semuestranlas condicionesde operaciónempleadasen diferentes

que han sido realizadascon el MCM(T) en operaciónen discontinuo. Las

se han realizado cambiando el valor inicial de diversos factores cuya

elprocesoesde sobraconocida(Santos,1993).

Los parámetrosdel modelo fueron obtenidosen función de la temperaturamediante

expresionesdadasen !asecuaciones[5.58] y [5.61], puesla formamásadecuadade realizar

simulacioneses teniendo en cuenta la influencia de las variables en los parámetrosdel

modelo cinético planteado. Esto ha sido posible para los experimentosrealizadosa

diferentestemperaturaspero no para la variable concentraciónde amonio como ya seha

comentado.

Tabla 5.10 .- Simulacionesrealizadascon el MCMT (T) en operación

Simulación Valores

Influencia de la biomasa inicial

Influencia del azúcar inicial

Influencia del porcentaje deOxígeno Disuelto

Influencia de la agitación

Cxo = 0,03 gILCxo 0,07g/L

= 0,50 g/LCxo = 1,00 gIL

Cso IOg/lCso= 20 gIl

40 gIlCsoSOg/l

C02= 10%= 20%

Agitación constantePerfil deagitación

240

ModeloCinéticoMetabólico

5.3.2.1.- Influencia de la Concentración Inicial de Biomasa

La influencia de la biomasainicial en el crecimiento,a lo largo del tiempo de

fermentación,se muestraen la Figura 5.15. Como puedeobservarse,cuantomayor es la

concentracióninicial, mayor es la concentraciónmáxima de biomasaal fmal de la

fermentación.

Encuantoa la influenciasobre la velocidadde produccióndexantanoy consumo

deazúcarse puedeobservaren la Figura 5.16, queel modelo prediceun máximo parala

producciónde xantano.Es decir, de las cuatroconcentracionesinicialesde biomasainicial

utilizadasen la simulación,el modelo prediceun máximo de producción de xantano con la

concentracióninicial de 0,07 gIL. En cuantoa la evolucióndel azúcar,como es lógico, la

tendenciaguardarelaciónconla concentraciónde xantano,estoes, en aquelloscasosen los

queel modelopredicemásxantano,tambiénpredicemayorconsumode la fuentecarbonada

y viceversa.

En la Figura 5.17 se observa la significativa mejoradel MCMS(T) en cuantoa la

simulaciónde la evoluciónde la concentraciónde oxígenodisuelto respectoa lo obtenido

con el MCNE. En la citadaFiguraseobservaque el valor de] coeficientede transferencia

de oxígeno(kLav), esmásbajo cuantomayores la concentraciónde xantanoobtenido.La

bajada de oxígeno disuelto también es mayor cuanto mayor es la producción del

polisacárido.

241

ModeloCinéticoMetabólico

4u

Figura 5.15.-

(3-

acf

SimulaciónMCMET con diferentesconcentracionesinicialesdebiomasa, influencia en laevoluciónde biomasa.

60

Figura 5.16.- SimulaciónMCMI con diferentesconcentracionesinicialesde biomasa,influenciaen la evoluciónde laconcentraciónde xantanoy de sacarosa.

0.30

025

020

0,1 5

j

0.10

0.05

0,00

t <h)

30

t (Fi)

242

ModeloCinéticoMetabólico

>1

(-3

o

25

20

15-y6(4,1

lo

5

o

Figura 5.17.- SimulaciónMCMT con diferentesconcentracionesiniciales de biomasa,influenciaenla evolucióndel oxígenodisueltoy en la transferenciade oxígenokLaV.

243

2,5

2,0

0,5

0 20 40 60

t (h)

ModeloCinéticoMetabólico

5.3.2.2.-Influenciade la ConcentraciónInicial deAzúcar

Se han realizadosimulacionesde cuatrooperacionescon concentracionesiniciales

diferentesde sacarosa,tal como se ka mostradoen la Tabla5.10.

En cuantoala influenciaenel crecimiento,la Figura5.18 muestraclaramentequeel

modelo predice que la concentracióninicial de sacarosano influye en la velocidad del

crecimiento, independientementede la concentracióninicial de la que se parta, ni la

concentraciónde biomasani el consumode la fUentenitrogenada,seven afectados.

En la Figura5.19 puedeversecomo influyen las diferentesconcentracionesiniciales

de azúcarsobre la velocidadde producciónde xantanoduranteel proceso.El modelo es

incapazde predecirla influenciadel azúcaren laevolucióndel producto,ya que la cantidad

de xantanoobtenidaessiempreigual, independientementede la concentraciónde azúcarde

la queseparta.

La simulaciónparaponerde manifiesto la influenciade la concentracióninicial de

azúcaren la evolucióndeoxígenodisueltoy el valor de kLav apareceen laFigura5.20. En

ella seobservaque el MCMT no es capazde predecircambiosen la evoluciónde dichos

1 -I~ 1componemesal cambiarestavariable,lo cual es lógico, debido a que¡a concenLraclonue ¡

xantano,directamenterelacionadacon la viscosidad,no seve influida por lo queel valor de

kLaV tampocoseveráafectado,ni portanto la concentraciónde oxígenodisuelto.

244

Modelo CinéticoMetabólico

cf

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

0,3

0,2

cf0,I

0,0loo

Figura5.18.- SimulaciónMCNE condiferentesconcentracionesinicialesdesacarosa,influenciaen laevoluciónde la biomasa

(-y-

(-y.>

t (Ii)

Figura 5.19.- SimulaciónMCMI condiferentesconcentracionesinicialesdesacarosa,influenciaen la evoluciónde sacarosay xantano.

t (h)

0 10 20 30 40 50 60 70

245

A-/adelaCinéticoMetabólica

2,5

2.0

¡-5

-t

O

(-3

¡,0

0,5

0,0

Figura 5.20.- SimulaciónMCMT condiferentesconcentracionesinicialesde sacarosa,influenciaen la evolución de la concentraciónde oxígenodisuelto y elvalor de kíav.

25

20

I5

I0-i

5

o‘0

t (h>

246

ModeloCinéticoMetabólico

5.3.2.3.- Influencia de la Agitación y del porcentaje de Oxígeno Disuelto

En la Figura 5.21 se ofrece la influencia de la agitación. Se han realizado

simulacionescon una agitaciónconstanteen todo el procesoy con un perfil de agitacion.

Puedeapreciarseque al realizar la simulacióncon un perfil de agitación,seobservauna

mayor velocidadde producciónde xantano.En cuantoa la evoluciónde la concentración

de sacarosa,evidentemente,cuanto mayor es la velocidadde producciónde xantano,se

predice un mayor consumo de la frente carbonada.La evolución de generaciónde la

biomasano se ve afectadaporel tipo de agitación.

En la Figura 5.22 aparecen las simulaciones realizadas con diferentes

concentracionesde oxígenodisuelto,con 10 y 20%del valor de saturación.Cuantomayor

es la concentraciónde oxígenodisuelto, el modelo predice una mayor concentraciónde

xantano,y por tanto un mayor consumode sacarosa.Al igual que en el caso anterior, la

evolucióndc la concentraciónde biomasano seve afectadapor laconcentraciónde oxígeno

disuelto.2,0

1,5

Z 10u4su

0,5

0,0

45

40

35

30

25~

u

‘5

lo

5

o70

t (h)

Figura 5.21.- SimulaciónMCMST convaloresde kLav, influencia en la evoluciónde labiomasa, xantano y evoluciónde azúcar.

247

ModeloCinéticoMetabólico

2- 45

40

1,5-

30

25~~ tO (-5-

202

(3<

0,5 10

5

0,0 0

Figura 5.22- Simulación MCMST con diferentesconcentracionesde oxígenodisuelto, influenciaen la evolución de biomasa,xantanoy sacarosa

t (h)

248

Modelo CinéticoMetabólico

5.3.3.-Validez del Modelo Metabólico

A lo largo de esteapartadosehanido exponiendolos diferentesresultadosobtenidos

con el MCMT propuesto,tanto los obtenidosen ajustesa datosexperimentalescomo en las

distintassimulacionesrealizadas.

Se han obtenidobuenosresultadosal aplicar el MCMT a los diferentesexperimentos

realizadosen este trabajo, describiendoadecuadamentelas evolucionesexperimentalesde

xantano,sacarosay oxígenodisuelto.Entreestosresultadosno sehanpresentadolos resultados

correspondientesa la evoluciónde biomasay concentraciónde amonio puesson los mismos

queen el casodel modeloanterior MCNE.

Se ha conseguidoplantearel modelo cinéticometabólicoen función a una de las dos

variablesestudiadas,concretamente,de la temperatura(T), de acuerdoa la tendenciaque

presentabanlos parámetrosobtenidosal realizarlos ajustesde los experimentosrealizadosa

diferentestemperaturascon el MCMTS. Se ha realizadola reproducciónde los datos

experimentalescon el MCMTS (1), consiguiéndoseun mejor resultado,en cuanto a la

descripciónde la evoluciónde los componentes,quelos obtenidospor ajustecon el MCNE

No fue posible obteneruna relación de los parámetroscinéticos calculadospara

experimentosrealizadoscon distintasconcentracionesde amonio,debidoaque los parámetros

obtenidosno presentabanuna tendencialógica respectode la concentracióninicial de dicho

sustratonitrogenado.

Las simulaciones,pues, fueron realizadastomandolos parámetrosen función de la

temperatura.Al compararlos resultadosobtenidos de las diferentes simulacionescon los

resultadosexperimentales,seha podidollegara lassiguientesconclusiones,en cuantoa lo que

el Modelo CinéticoMetabólicoescapazdepredecir:

• El modelo cinético metabólico es incapaz de predecirpor medio de simulacionesla

influenciade la concentracióninicial de azúcar en laevoluciónde la biomasa.Tampoco

predice ningunainfluencia de este componenteen la evoluciónde la concentraciónde

xantano. Experimentalmenteesto no es cierto, pues la concentracióndel sustrato

carbonadotieneinfluenciaen la concentracióndel polisacárido(Santos1993).

249

ModeloCinéticoMetabólico

• El modelo predice un máximo en la producción de xantano cuando se realizan

simulacionescon diferentesconcentracionesiniciales de biomasa(Figura 5.16), si bien

estoúltimo no fue observadoexperimentalmente(Santos,1993).

• El MCMT es capazde predecirla influenciadel oxígenoen la velocidadde producción

de xantanopero no en la evolución de la concentraciónde biomasa.Los resultados

obtenidosen los ajustesa datosexperimentalessobrela evolución de estecomponente

han permitidoobservarla validezdel MCMT parala reproducciónde la concentración

del oxígeno, mejorandosignificativamentelos resultadosde la evolución de oxigeno

obtenidosporel MCNE.

Por todo esto, el Modelo Cinético Metabólico permite una buenareproducciónde

datos experimentalesde la concentraciónde xantano,sacarosay oxigeno disuelto. Este

último componenteno pudoserreproducidode formaadecuadapor el MCNE.

Porotro lado, en lo que respectaa la evoluciónde biomasao partede crecimiento

del modelo,deberíarealizarseunamejoraparapoderexplicarla influenciadel oxigenoen el

crecimiento,pues desdeun punto de vista fisiológico no tiene sentido que una bacteria

aerobiaestricta,comoXanthomonascampestris, no se veainfluida por la concentraciónde

oxigenodisuelto en el medio. Se planteaahorala necesidadde estructurarla biomasapara

tratar, además,de predecirla influenciade la otra variable estudiada,-la concentraciónde

amonio-, que influirá, como es lógico en la parte correspondienteal crecimiento del

microorganismo.

Con el MCMT se ha estructuradoel metabolismode la fuente carbonadaen la

producción, es ahora necesario estructurar la biomasateniendo en cuenta la frente

nitrogenada. En el próximo apartadose aplicaráun modelo cinéticomáscomplejo,estoes

un Modelo Cinético de Célula, el cual describirá el crecimiento de Kant/tomonos

campestristeniendo en cuenta el sustrato nitrogenado en la síntesis de componentes

intracelulares,tales como proteínasy ácidosnucleicos, por lo que la biomasaaparecera

estructuradaen varioscomponentes,lo cualcomplicael modelode formasignificativa.

250

r

6.- MODELO CINE liCO

DE CÉLULA

ModeloCinéticode Célula

6.- MODELO CINETICO DE CÉLULA

La principal característicade Los modeloscinéticosde célula es que describenla

biomasaconsiderándolaformadapor varias especies,teniendoen cuenta los componentes

intracelulares,como ácidosnucleicos,proteínas,lípidos e hidratosde carbono,proponiendo

parasudescripciónun esquemade reacciónsimplificado.

Todoslos modelosde estetipo existentesen la literaturaexplicansólo el crecimiento

de microorganismos,y están desarrolladospara aquellosmuy conocidoscomo la bacteria

Escherichia coli o la levadura Saccharomycescerevisiae. Los modelos de célula se

caracterizanpor tener un elevadonúmerode parámetros(entre 74 y 200), los cualesson

obtenidossiemprede datosde la bibliografia. En ningún trabajose presentan valoresde los

parámetros calculados mediante ajuste de datos experimentales. Esto es debido

fundamentalmentea dos razones:una con relación al elevadonúmero de parámetros que

presentanlos modeloscinéticosde célula, lo que implica una gran dificultad a la hora de

abordar matemáticamenteel problema; la otra, tiene relación con el análisis de los

componentesclave del sistema.El seguimientode componentesintracelularespresentauna

especialdificultadparaobtenerdatosfiablesquepuedanserutilizadosen el modelocinético.

251

ModeloCinético de C.’élula

En este capítulo se propone un modelo de célula para el crecimientode la bacteria

Xanthomonascampestris,estoes,un modelo quetieneen cuentala evoluciónde componentes

intracelularesque formanpartede la biomasadel microorganismo.Se tratapuesde un modelo

de crecimientoque constade un númerode parámetrosaproximadamentede 10, algo inferior

a los planteadoshastaahoraen la literatura(Esenery col., 1983)y que van aser determinados

por ajustede datosexperimentales.

En el modelocinéticode célulaqueseva a plantear,se estructuratanto e] metabolismo

del sustratocarbonadocomoel nitrogenadoen el crecimientodel microorganismo.Se incluirá

el metabolismodel sustratonitrogenadoen el interior de la célula,de unaformasimilar a Pons

y col. (1989), que plantearonel correspondienteal sustratocarbonadoen la producciónde

xantano.En la Figura 6.1 se muestraun esquemadel metabolismosimplificadode la glucosay

el amonio, particularizandoparaestabacteria,Xanthomonascampestris (Bradbury, 1984).

A la hora de plantear el modelo de célula para el crecimiento de Xanthomonas

campestris,hay unaseriede dificultadesa considerarpreviamente.

- Como ya se ha comentado,para obtenerdatos experimentalesque se puedan

emplearen el modelo, esnecesariodisponerde técnicasde análisis fiables para cl

análisisde componentesintracelulares.Esteesuno de los puntoscríticos, sobretodo

cuando el microorganismoa analizar tiene un tamañopequeñocomo una bacteria

(García-Ochoay col., 1998). No resulta sencillo encontrar la técnica de análisis

adecuadaque permita obteneruna buenaresolucióny fiabilidad de los datos de la

evoluciónde componentesintracelulares.Como ya se describióen el Capítulo2 de la

presente Memoria, existen diferentes técnicas para cuantificar los componentes

intracelulares,no obstante,no todasdanresultadosreproducibles,lo quehacenecesario

realizarun especialesfuerzoen la puestaa punto de técnicascon tal fin. Como ya se

indicó, la técnicade Citometriade Flujo fue elegidaparael análisisde la evoluciónde

los componentesintracelularesduranteel crecimientode Xanthomonascaínpestrisen

los experimentosllevadosa caboen estetrabajo.

252

ModeloCinéticode Célula

- Por otro lado, otro aspecto fUndamental es el conocimiento detallado del

metabolismodel microorganismocuyo modelo de célula va a serplanteado.En el

caso concreto del microorganismo empleado en este trabajo, existe suficiente

información en la literatura sobre las rutas catabólicasy anabólicasempleadaspor

Kanthomonascampestriscon diferentessustratoscarbonadosy nitrogenados,lo cual

facilita, desde este punto de vista, el planteamientodel modelo y permite así la

simplificación del citado metabolismomedianteel denominadolu¡nping, que consiste

en la agrupaciónde moléculascon fórmulasmolecularesmediasqueintervendrán,a su

vez, en reaccionesglobales,llegándosea formular un esquemasimplificado de

reacción.ATP

GLUCOSA Ribosa-6P . Fosforihosilpirofosfato

Glucosa-6P

Ac 6 Fosfoglucónico

irPiruvato

,4cet¡1coA

Oxa¡acetato

14TP

Isocilrato

¡IMP

4,ATP

NAD~

k AMINOÁCIDOS

¡

4,GTP

(iMP

4

,4TPNAD~

ir

OXIDACIÓN-REDUCCIÓN

dATP dGTP dCTP dUMP

dTTP

CO2 ATP

Figura 6.1.- Metabolismo simplificado de la glucosay el amonio en el crecimiento deXanthomonascampestris.

IMP

GMP

253

Modelo Cinético de (‘Ñu/a

6.1.-ETAPAS EN EL PLANTEAMIENTO DEL MODELO

Ya seha comentadola prácticainexistenciade precedentesen la literaturade estetipo

de modelos,especialmentede un modelo de estascaracterísticasparael sistemaobjeto de

estudio.Porello, se hacenecesariodesarrollaruna metodologíaparaabordarun problematan

complejocomoesel plantear,aplicary obtenerparámetrospor ajustede datosexperimentales

del modelo cinético de célula para el crecimientode un microorganismo,en estecasode la

bacteriaXanthomonascampestris.Es un problemarelativamenteparecidoal análisis de redes

complejasde reacciones.El análisis cinético de dichos sistemascomplejoses un problema

complicadoque precisamás infonnación que en el caso de reaccionessimples. La mayor

complejidadviene dadapor una estequiometríay una termodinámicamás complejasy un

número mayor de posibles modelos cinéticos -combinación de esquemasde reacción y

ecuacionescinéticasde cadareacción-entrelos quehay quediscriminar.

Se hanintentadovarios caminospararealizaresteanálisis cinético.Fundamentalmente

dos(García-Ochoay Romero,1993):

• Estudiarunaa unalasreaccionesdel esquema,parareducirla complejidaddel problemaa

unasumade reaccionessimples,si bienno siempreesposibleaplicaresteprocedimiento.

• Proponerun esquema,a menudo muy simplificado—molecular-,suponerunasecuaciones

cinéticas,calcular los parámetrosy compararcon los datos experimentalesobtenidos,

cambiandocualquierade las suposicioneshastaquela coincidenciaseaaceptable.

Si la reacciónesmuy compleja(craqueo,oxidaciónde hidrocarburos,por ejemplo),la

primerade las alternativasno esposible.La segundade las opcioneslleva aplantearesquemas

moleculares,muy simplificados, empleando lumping de las especiesquímicas, y con

ecuacionescinéticasparalas posiblesreacciones,aserposible,muy sencillas. Lasecuaciones

cinéticassuelensermodelospotencialesy enpocoscasoshiperbólicos.

Tras el cálculo de los parámetrosse puedeprocedera la discriminaciónentre las

distintosmodeloscinéticos.Los criteriosde discriminaciónutilizadosnormalmentehan sido

estadísticosy fisicos o impuestos(García-Ochoay col., 1 989ay 1 990a).

254

Modelo Cinéticode Célula

En consecuencialasetapasa seguiren la formulacióndel modelocinéticodecélulason

las siguientes:

• La primeraetapaen la formulacióndel Modelo Cinético de Célulaes la determinación o

elecciónde las especiesquimicasqueparticipan.

• Una vez conocidaslas especiesquimicas,se debeplantear un esquemasimplificado de

reacción.Parallegar a él, sedeberealizar un análisisexhaustivode los datosexperimentales.

Además,se aplicará lumping de las especiesquímicasque forman este sistema,llegando,

posteriormente,a la formulaciónde las ecuacionesde filiación (o relacionesestequiométricas

defmidas)de los diferentescompuestosqueintervienenen las reacciones.

• A continuación,se debe plantearun sistema de ecuacionesdiferenciales,que son las

velocidadesde producciónde los compuestosclave, las únicas independientesentresí. Los

métodosaplicadospara el cálculo de los parámetrosdel sistema citado se basan en una

regresiónde las ecuacionesa los datosexperimentales.

• Unavezcalculadoslos parámetros,esnecesariocomprobarla reproducibilidaddel modelo.

Para ello debe formularseel modelo cinético, mediantecombinación de las ecuaciones

cinéticasparadeterminarlas velocidadesde reacción. Si éste no es aceptable,es necesano

recurrir a otro modelo, siendo primordial el establecimientode criterios para realizar la

discriminaciónen estaetapa(García-Ochoay Romero,1993).

• Determinaciónde las EspeciesQuímicas

El estudioestequiométricodel sistemaobjeto de estudiopuedeserde notableayudaen

los primerospasosde la formulaciónde la redde reacción.La infonnaciónquesedebeobtener

es:

- El númerode componentesclave.

- El númerode relacionesindependientesentrelasespeciesquímicasqueparticipan.

- Cómopuedencalcularselos cambiosen la composicióndel sistemaconociendolos cambios

en la concentraciónde los componentesclave.

255

Modelo Cinético de Célula

Estainformaciónesmuy importanteparala determinacióndel métodoanalíticocapaz

de seguirlos cambiosen la composición.Además,puedeserde gran utilidad parala propuesta

del esquemade reaccióndebidoa queel númeromínimo de reaccionesquedebenincluirseen

el esquemadebe coincidir con el númerode variables independientesy con el númerode

componentesclave. En este caso,en principio, seha optadopor asumirla biomasapor tres

especiesintracelulares:proteínasRNA y DNA. Estahipótesisse contrastarámásadelante.

• Esquemade ReacciónSimplificado

La propuestadel esquemade reacciónes un aspectoque no está totalmente

sistematizado,cadaautortratade solventarsuproblemaparticularizandoparasucaso. El

problema puede ser muy diferente dependiendode la complejidaddel sistema objeto de

estudio,el cual cambiade acuerdoadiferentesaspectos:

- El primerpasoen el planteamientode cualquiermodeloesla propuestade un esquema

de reacción simplificado. Para ello, ante la falta de antecedentes,parecenecesario

realizarun riguroso análisis de los datos experimentales,químicos o bioquímicosdel

sistema.

- El númerode reaccionesy de especiesimplicadasvariansegúnlos casos,desdecuatro

a cinco especieshasta cientosde ellas, aunquecomo se verá más adelantees muy

convenienteque coincidan el número de componentesclave y el de reaccionesdel

esquema.

- En la mayoría de los casos, es casi imposible formular un esquemamolecular

simplificado debido a que el cálculo de cientosde parámetrospor regresiónde datos

experimentalesesprácticamenteimposible. En los casosmáscomplejos,hay también

posibilidadde formularcientosde posiblesmodeloscinéticos,entrelos quees necesano

discriminar. La mayoría de los trabajossobre casosprácticosde redesde reacciones

tratancon esquemassimplificados,con no másde seis reaccionesy, generalmente,el

mismonúmerode componentesclavey de relacionesindependientes.

256

ModeloCinéticode Célula

En resumen,el esquemade reaccióndebe ser relativamentesimple, pero capaz de

describirla realidaddel sistema,consiguiendounadescripcióncon un error del mismo orden

demagnitudqueel queseda en los datosexperimentales.

En muchosde los casos,el único camino para simplificar el problemaes empleando

lumping,quepermitereducirel númerode componentesa considerar.El lumpingasumequees

posible agruparcomponentesque participanen reaccionessimilares dentro del sistema. La

aplicaciónrigurosadel luniping solo se haestudiadoen sistemaslinealesmuy sencillos,en los

casosprácticosse ha aplicadode acuerdoal sentidocomún: por tamañode las moléculas,por

reactividad,etc.(García—Ochoay col., 1989a).

Propuestade las EcuacionesCinéticas

Al analizaruna red complejade reacciones,como debe serel esquemasimplificado

propuesto en el apartado anterior, las ecuacionesque ligan las magnitudes medibles

(velocidadesde produccióno concentraciones)con las magnitudesquehay quedeterminar,en

función de las condicionesde operación(velocidadesde reacción),son (García-Ochoay

Romero,1993):

NR

i”1

De cuya integración,según el método propuestopor Himeelblauy col. (1967), se

obtienela ecuación:

NRCj—C10 =Zvi~ j< r, .dtJj = ]...NC) [6.2]

o

Los métodosdiferencialesestánbasadosen la aplicaciónde la ecuación[6.1]a los NC

componentesclavedel sistema.Así, parael casode cinéticaspotenciales,la expresióndadapor

la ecuación[6.1]tomala forma:

dC NRR~= Á~=Zv,1.k,.fi(Cx);(C1=1...NC) [6.3]

257

ModeloCinético de Célula

El sistemade ecuacionesdiferencialesque se obtiene se puedeexpresaren forma

matricialcomo:

vr [6.4]

La aplicaciónde estemétodo lleva consigolas siguientesetapas:

• Cálculo de las velocidadesde producciónRj, para los NC componentesclave. Estecálculo

se realiza por ajustede los datos experimentalesa una función del tiempo conocida y

posteriormentese deriva analíticamente,obteniéndoselos valores discretos de las

velocidadescitadas si, como es habitual, se trata de datos integrales, composición‘,‘s

tiempo.

• Cálculode los parámetroscinéticosdel sistema;paraello, sepuedenrealizardiferentestipos

de regresiónlineal o no lineal y, ademássepuederealizar empleandosimple o múltiple

respuesta.

El método integral está basadoen la aplicación de la ecuación [6.2] a los NC

componentesclavedel sistema.En el casode una cinéticapotencial.dichaecuacióntoma la

forma:

VR

Cj—C~0 =Zvi1 k, ff(Ck).dt;(j=I...NC) [6.5]

El sistemade ecuacionesintegralesquese obtiene,se puedeexpresarmatricialmentede

la forma:

u~ r5 [6.6]

donder5 representael productode las integralespor las constantesde la ecuación[6.5].

Las etapasnecesanasparala aplicacióndel métodointegralson:

• Cálculo de las integralesde las velocidadesde reacciónr5, para las NR reaccionesque

tienenlugar. Este cálculo sepuederealizarmedianteel ajustede los datosa una función

conociday posteriorintegraciónanalítica,obteniéndoselos valoresdiscretosnecesariosde

dichasintegrales.

• Cálculo de los parámetroscinéticosdel modelo.Paraello, puedenseraplicadostanto la

regresiónlineal como la no lineal, comoen el casoanterior.258

ModeloCinéticode Célula

García-Ochoay col. (198% y 1 990b) pusieron de manifiesto la clara ventaja que

presentanlos métodosintegralesfrentea los diferenciales,cuandose dispone,como en este

caso,de datosde variaciónde la composicióncon cl tiempo, debido,ftmclamentatmente,a la

mayor precisiónde los métodosnuméricosde integraciónfrente a los de derivación. Así

mismo,propusieronel empleode un conjunto de ecuacionesen términosdevelocidadesde

reacción,en lugar de, lo habitualmenteempleado,en términosde velocidadesde producción

de los componentesclave(Garcia-Ochoay Romero,1993),de acuerdoa:

r y’. R [6.7]

Aunque la ecuaciónanterior solo es aplicable cuando y es cuadrada,es decir, el

númerode componentesclave es igual al númerode relacionesindependientes,el método

basadoen las velocidadesde reacciónpresentaventajas,tanto desdeun punto de vista de

cálculo -una matemáticamucho más sencilla, donde se individualiza el cálculo de cada

parámetro-,comodesdeel puntode vistaconceptual,de tratamiento,ya que,cuandoel número

de reaccionesdel esquemay el de componentesclaveseael mismo,al individualizarel cálculo

de cadaparámetro(k), sepuedetratar un sistemacomplejo de reaccionescomo la sumade

reaccionessimples. Para aplicar este método en su variedad integral, hay que realizar la

transformaciónde la ecuación[6.6]en la ecuación[6.8]:

r5 =v’ -C [6.8]

La aplicación de estaecuacióna los NC componentesclave del modelo cinético

conduceagruposde ecuacionesindependientesque permitencalcularlos parámetroscinéticos

del sistemapor aplicaciónde una regresiónlineal simple sin término independiente,de forma

individual (en el caso de modelospotenciales).La ecuación [6.8] desarrollada,se puede

escribircomo:

kfj1(CK ).dt=Zv •(Cj—C~0 >;(i= INI?) [6»]

259

ModeloCinético de Célula

• Formulación del Modelo Cinético

Una vez conocidaslas cinéticasaplicandométodoscomo el de las velocidadesde

reacción,esnecesariocalcularlos parámetrosrealizandoun ajusteen múltiple respuesta,es

decir no obteniendolos parámetrosde las reaccionesindividuales,sino de forma conjunta

mediantecálculopor regresiónde los datosexperimentales.

Unavez calculadoslos parámetroses necesariocomprobarla reproducibilidadque el

modelo cinético molecularproporcionade los resultadosexperimentales;si el ajusteno es

aceptable,sedeberecurrira otro modelo.

Los modelospropuestospuedenobtenersepor combinacionesentredistintascinéticas

dentrodel mismoesquemade reacciónpropuestoal formularel modelo.Muchasvecesocurre

que varios modelosson capacesde describirel sistema, de forma que, en este punto, es

primordialel establecimientode criteriosde discriminación.

• Criterios de Discriminación de Modelos

Como se ha indicado anteriormente,a veces se planteala necesidadde discriminar

entre un elevado número de modeloscinéticos, si bien muchosautoressolo presentanlos

resultadosobtenidoscon un solo modelo,sin llegar a describirpor qué lo han consideradoel

mejorfrente a otrosmodelos,en principio, igualmenteválidos.

Los criterios parala discriminaciónde modelosseagrupanbásicamenteen dos tipos

(García-Ochoay col., 1989y 1990):criteriosestadísticosy criteriostisicos.

- Los criterios estadísticosestán basadosen la comparación de los valores de la F de

Fischer y de la t de Student obtenidos del ajuste por regresión de los datos

experimentales,siendomejoraquelmodeloquepresenteestosvaloressignificativamente

másaltos. Así mismo,obtenerintervalosde confianzamuy estrechosindica un mejor

ajustedel modelo a los datosexperimentales,y por tanto un criterio de discriminación

entrevariosmodelos.Tambiénpuedencompararselos valoresde la sumade residuosal

cuadrado,considerandoigualesaquellosque esténpor debajo del errorexperimental.

260

ModeloCinéticode Célula

- Criterios Físicos (o impuestos),el primero es el obtenervalores positivos de los

parámetros(k y 10>0) en todos los ajustesrealizadoscon el modelo propuesto. El

segundocriterio eslaobservaciónde unavariaciónlógica de los parámetrosobtenidosen

los modelospropuestoscon las variablesque se estudian,por ejemplo temperaturao

variaciónen la composicióndel medio,enel casoqueseestáanalizando.

6.2.-MODELO CINÉTICO DE CRECIMIENTO DE Xanthomonoscampestris

En esteapanadoseva a realizarla aplicación de todo lo comentadoen el apartado

anterior, esdecir, se va a proceder a realizar el planteamiento de un modelo cinético de célula

parael crecimientode la bacteriaXanthomonascampestris.Para ello, se pondrá en práctica,

pasoa paso,la metodologíacomentadaenel apanadoanterior,en estecasoparaun sistema

biológicocomplejocomoesel crecimientode la bacteria.

6.2.1.-Determinaciónde las EspeciesQuimicasy Formulación del Esquemade Reacción

El primerpasoenel planteamientodecualquiermodeloesla propuestade un esquema

de reacción simplificado. Para ello, ante la ÑIta de antecedentes,parecenecesariorealizarun

rigurosoanálisisde los datosexperimentales,del crecimientodel microorganismo,obtenidos

en estetrabajo.

Se ha realizadoun seguimientode los componentesintracelularesde las células de

Xanthomonascampestrisa lo largo de todo el crecimiento del microorganismo. La técrnca

empleadaha sido la citomnetría de flujo. Con esta técnica se han obtenido resultados de

concentraciónde ácidosnucleicos(DNA y RNA), así como de proteínaintracelular (tanto

proteínasestructurales,como enzimas)porcélula.Comoya fue comentadoen el Capítulo 2 de

la presenteMemoria, los datosde intensidadmediade fluorescenciade cadacomponentepor

individuo, pueden ser convertidos en cantidad (g) de componentepor individuo, gracias al

calibrado obtenido, como indica la Figura 6.2. Los datos de contenido en g/célula, puedenser

puestosen unidadesde g/L (gramode componentepor litro de caldo),graciasa la aplicación

de la ecuaciones[2.111paraproteínasy [2.14]paraácidosnueleicos(DNA y RNA).

261

1VIodeloCinético de Célula

Ademásdel seguimientode los componentesintracelulares, se ha analizadootro

compuestoclave, en estecasoextracelular,importanteen el crecimientodel microorganismo,

esto es, la evolución de la concentración de amonio en el caldo. El metabolismo de este

sustrato nitrogenado es importante por serel sustrato limitante del crecimiento en el proceso, y

porque, una vezconsumido,estaráformandopartede ácidosnucleicos(DNA y RNA) y de

proteínas,principalmente.Portodo ello, un balancede materiaparael sustratonitrogenadoes,

sin duda,de ayudaparahacerla primeraaproximaciónal esquemade reaccióndel modelo

cinéticodecélula.

Comoyaseha indicado,el nitrógeno(en formade amonio)queseráconsumidoporel

microorganismo,irá a férmar los componentesintracelulares,pero ademásparte de éste

nitrógenopuedeser empleadoparasintetizarotras proteínasque no quedaránen el interior

262

g componentelcaldo

Figura6.2.- Unidadesde los datosobtenidosa partir del Citómetrode Flujo y su conversiónenotrasparaaplicaren el modelocinético

Modelo Cinéticode Célula

celular sino que seránexcretadasal caldo, Estasproteínas(proteínasextracelulares)no han

sido analizadas,perosuevoluciónpuedeserobtenidarealizandoel balancede nitrógenoantes

comentado.

Pararealizardichobalancede nitrógeno,hay quecalcularpreviamentela concentración

de nitrógenoque hay en la moléculade amonio (que es como semcorporaen el medio de

cultivo); seempleóla siguienteecuación:

14

Parael cálculo de la concentraciónde nitrógenoque hay en las moléculasmediasde

[os componentes intracelulares (deducidas por aplicación del lumping) se emplean las

siguientesecuaciones:

La relaciónentreLa concentraciónde nitrógenoy la concentraciónde RNA se

calculapor (C~5H11,750~375N3,75P3)

3 75~ 14Cvg~~(g/L)=C~4(g/L)~

491,16 [6.11]

La relación entre la concentraciónde nitrógenoy la concentraciónde DNA

(C95H1201 335N3q5P3),es:

486,41

Paraproteínas,seconsideróla fórmulamedia: C5,34H9640237N136S0099,con lo

quela concentraciónde nitrógenoapartirde la concentraciónde proteína,seajustaa la

siguienterelación:

~ / L) = C»JgXL) ,36 14 [6.13]133,848

En las Tablas6.1 a 6.7 semuestranlas concentracionesde nitrógenoempleadaspor

el microorganismo en la síntesis de los componentesintracelulares en los distintos

experimentosrealizadosen estetrabajo.En las citadastablassemuestranlas evolucionesde

nitrógeno(por moléculade amonio)CNA, así como las cantidadesde nitrógenoen DNA

(CN DNA), RNA (CN,RNA) y proteínas intracelulares (CN,PRJ). Además,seha realizadola

sumade estostrescomponentes(CNT), con el fin de compararlocon la concentracióninicial

263

ModeloCinético de Célula

añadiday la que todavía no ha sido consumida(en caso de que todavíaquede).De esta

manera,se puedecalcular la cantidadde nitrógenoque empleala bacteria,en cadacaso,

parala síntesisde proteínaextracelular,cuyo análisisno fue realizado,pero que puede

deducirsede acuerdoa la ecuación [6.14],asumiendoquela cantidadde amonio consumido,

no inmovilizadocomocomponente,va a parara proteínasextracelulares:

C~2~ =CNÁ0 —C~1,- —CÑÁ [6.14]

En la Tabla 6.1 semuestranlos resultadosdel experimentorealizadocon 65 p.p.m.

de amonio inicial (experimenton05). Si comparamosla cantidadde nitrógenototal con la

añadidainicialmenteen el medio de cultivo (0,0506g/L de nitrógeno),se observaque la

cantidadde nitrógenoencontradacomo sumade DNA, RNA y proteínasintracelulareses

mayorque la cantidadinicial de nitrógeno, llegándosea obtener0,083 gIL de nitrógeno

“rnmovilizado” en componentes intracelulares. Este balance podría indicar que el

microorganismopuedesintetizarestoscomponentesempleandootra fuentede nitrógeno,

por ejemplo aminoácidos procedentesde! medio YM, que es el medio empleadopara

realizar el inóculo en el biorreactor.O bien, podría ser que el microorganismoestuviera

empleandoesteamonioen “fabricar” componentescon unacomposicióndiferentea la que

tiene cuando la concentraciónde amonio es mayor, o lo que es lo mismo, con una

estequlometríadiferente. Además,se observaen la tabla que no hay síntesisde proteína

extracetular,salvo la que apareceentre las 3 a 16 horasde la fermentación,pero en la fase

estacionariade crecimientono parecequeexistaexcreciónde estetipo de proteínas.

Parael experimentorealizado con 130 p.p.m. (experimenton0 6), queapareceen la

Tabla 62, el balancedel nitrógenoindica que el nitrógenoinicial añadido0,1011 g/L se

encuentra en los componentesintracelulares hasta una cantidad máxima 0,084 gIL

(observadaen la faseestacionariade crecimiento),teniendoen cuentaque se ha consumido

completamenteel nitrógeno a lo largo de la fermentación,el nitrógenoque “falta” estará

formandopartede la proteínaextracelular,comorefleja la última colunmade la citadatabla.

En la Tabla6.3 semuestrael balancede nitrógenorealizadoparael experimentocon

la concentraciónde 257 p.p.m. de amonio inicial y unatemperaturade 280C (experimento

n0 2). En él, la cantidadinicial de nitrógenoañadidaen forma de amonio es de 0,24 gIL,

mientrasque la obtenidacorno biomasa(sumade componentesintracelulares)esde 0,183

264

ModeloCinéticode Célula

g/L, considerandoquetambiénha habidoun consumototal de nitrógeno,la última columna

indica la cantidadde nitrógenoqueformarápartede proteínaextracelular.

Para el experimentorealizado con 475 p.p.m. y 280 C (experimenton0 7), que

apareceen la Tabla 6.4, la cantidadde nitrógenoinicial es muy elevada(0,369 g/L), no

obstantesólo apareceen forma de componenteintracelular la cantidadde 0,1147 gIL. El

microorganismo,en este caso,no consumetodo estenitrógeno,quedandouna cantidad

residualal final de la fermentaciónde 0,062 gIL. Al realizarel balancede la mismaforma

que en experimentosanteriores, se obtiene cierta cantidadde nitrógeno en forma de

proteínaextracelular.como indica la última columnade la tabla. El hechode que en este

experimentono haya consumo total de amonio indica que en este caso el sustrato

nitrogenadono está siendo el nutriente limitante del crecimiento,como ocurre en los

demas.

En la Tabla 6.5 aparecenlos resultadosobtenidospara el experimentorealizadoa

250C y 257 p.p.m. (experimentoni), al igual que en otros, el balance de nitrógeno indica

que partees empleadoparala síntesisde componentesintracelulares,(0,16g/L) y otrapara

la síntesisde proteínaextracelular,puestodo el nitrógenoañadidoinicialmente(0,151 g/L)

seconsumecompletamentedurantela fermentación.

En la Tabla 6.6, se presentael balancede nitrógenoparael experimenton0 3, es

decir, el realizadoa M0C y 257 p.p.m.,con una concentracióninicial de nitrógenode 0,17

g/L, la cualesconsumidaprácticamente,encontrándosecasitodoel nitrógenoinmovilizado

en los componentesde la biomasa0,12 gIL (nitrógeno total) en la fase estacionariade

crecimiento,yenun porcentajemenorcomoproteínaextracelular(0,014 gIL).

Porúltimo, en laTabla6.7 apareceelbalanceparael experimentorealizadoa340C y

con unaconcentraciónde amonio inicial de 257 p.p.m (experimenton0 4). En estecaso,no

llega a consumirsetodo el nitrógeno añadidoinicialmente (0,157 gIL) pues quedauna

cantidad residual de 0,077 gIL. En esteexperimento,todo el nitrógeno consumidose

encuentrainmovilizado como componentesintracelulares,y un porcentajede nitrógenose

emplearáparala síntesisde proteínasextracelularesen la faseestacionariade crecimiento,

como indica la últimacolumnade la Tabla6.7.

265

ModeloCinético de Célula

Cálculo del nitrógeno aprovechadofermentaciónen el experimenton0 5,280C.

por Xandzoinonascanipestris durante lallevadoa cabocon 65 p.p.m.de amonioy

Tiempo CN,x CRNA(h) ( /L) ( IL)

CDNA( /L)

CPRÍ

(g/L)

SCDNA,RNN,PIU

IL (IL)0 0.0505 0.00016 0.00023 0.00062 0.0010 01.5 0.0497 0.000173 0.0482 0.00018

4.5 0.0466 0.00021

0.00025 0.00068 0.0011 00.00026 0.00071 0.0011 0.0011

0.0003 0.0008 0.0013 0.00256 0.0451 0.00027 0.00038 0.0010 0.0016 0.0037

8.5 0.0435 0.00063 0.00089 0.0023 0.0039 0.003012 0.0326 0.001 0.0014 0.0037 0.0061 0.011716 0.0256 0.0024 0.0033 0.0090 0.0148 0.010020 0.0194 0.0055 0.0078 0.0210 0.0344 0

23.5 0.0132 0.0123 0.0172 0.0463 0.0759 024.5 0.0093 0.0127 0.0178 0.0478 0.0783 025.25 0.0062 0.0130 0.0183 0.0492 0.0806 0

26 0.0015 0.0132 0.0186 0.0499 0.0818 0

27.5 0.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 031 0.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 032

32.50.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 00.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 0

33 0.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 035 0.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 040 0.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 0

Tabla 6.1.-

266

Modelo Cinéticode Cé/ula

Tabla 6.2.- Cálculo del nitrógeno aprovechadopor Xanthomonascampestrisfermentaciónen el experimenton0 6, llevados a cabo con 130amonio y 280C.

Tiempo CN.A(h) ( /L)0 0.1011

Cp.~Á(g/L)

C»~4

(g/L)CPRI

(g/L)

ZCDNA.RNA,PRI

<g/l)

CPRE

(g/L)

0.00021 0.0003 0.0008 0.00131 02.5 0.1008 0.00025 0.00035 0.00094 0.00154 03.5 0.0972 0.00031 0.00043 0.00116 0.0019 0.001885.5 0.0855 0.00035 0.00049 0.0013 0.00214 0.013317 0.0746 0.00040 0.00057 0.00152 0.00249 0.023848 0.0661 0.00048 0.00067 0.00181 0.00297 0.03192

9.25 0.0591 0.00092 0.0013 0.00348 0.0057 0.0361910.516

0.0528 0.00112 0.00157 0.00421 0.0069 0.041210.0248 0.0019 0.00267 0.00717

0.015880.011750.02602

0.064370.0555420 0.0194 0.0042 0.00592

24.25 0.0085 0.0051 0.00729 0.01955 0.03203 0.0604125 0.0073 0.0063 0.0089 0.0239 0.03915 0.05446

26.5 0.0058 0.0080 0.01133 0.03041 0.04982 0.0453528.5 0.0048 0.0092 0.01299 0.03487 0.05713 0.0390530.5 0.0031 0.0121 0.017 0.04562 0.07474 0.0231431.5 0.0019 0.0128 0.01808 0.04852 0.07949 0.0195732 0.00078 0.0132 0.01862 0.04997 0.08186 0.01836

33.5 0.00075 0.0138 0.01943 0.05214 0.08542 0.0148338 0.00066 0.0138 0.01943 0.05214 0.08542 0.0149247 0.00008 0.0140 0.0197 0.05287 0.08661 0.01431

47.5 0.00008 0.0140 0.0197 0.05287 0.08661 0.0143149 0.00008 0.0140 0.0197 0.05287 0.08661 0.0143150 0.00008 0.0140 0.0197 0.05287 0.08661 0.0143151

53.50.00008 0.0140 0.0197 0.05287 0.08661 0.014310.00008 0.0140 0.0197 0.05287 0.08661 0.01431

267

durante lap.p.m. de

Modelo Cinético de Célula

Tabla 6.3.- Cálculo del nitrógeno aprovechadopor Xanthomonascampestrisdurante lafermentación en el experimenton0 2, llevados a cabo con 257 p.p.m. deamonio.y28~ C

CRN4

(g/L)

XCDNA,RNA,PR¡Tiempo(h)

[ CNÁWg2~L=.

0.2403 0.0013

CDNA

( /L)

CpRI

(IL) J=~g~==

0.0048 1 0.0081

(gIL)0 0.0018 02 0.2333 0.0016 0.0022 0.0058 0.0097 04 0.2317 0.0019 0.0026 0.0068 0.0114 07 0.2232 0.0025 0.0035 0.0090 0.0150 0.0037

9 0.2177 0.0030 0.0042 0.0108 0.0180 0.006112 0.2138 0.0040 0.0056 0.0145 0.0242 0.0039

13 0.2092 0.0044 0.0061 0.0159 0.0265 0.0062

14.5 0.2068 0.0055 0.0077 0.0200 0.0333 0.0017

16 0.1975 0.0057 0.0081 0.0208 0.0347 0.0096

16.5 0.1921 0.0067 0.0094 0.0243 0.0405 0.0093

19.5 0.1711 0.0092 0.0129 0.0334 0.0556 0.015223.5 0.1477 0.0119 0.0167 0.0431 0.0718 0.022324 0.1291 0.0127 0.0178 0.0461 0.0768 0.0360

24.5 0.1088 0.0152 0.0213 0.0550 0.0915 0.04152832

0.0777 0,0175 0.0245 0.0633 0.1054 0.05870.0637 0.0234 0.0329 0.0849 0.1413 0.0368

33.5 0.0567 0.0240 0.0337 0.0871 0.1450 0.040134 0.0427 0.0259 0.0364 0.0940 0.1564 0.042838

38.5

0.0350 0.0269 0.0377 0.0974 0.1622 0.0448

0.0194 0.0279 0.0391 0.1009 0.1679 0.05450.05810.0618

39.5 0.0101 0.0288 0.0404 0.1044 0.173741.5 0.00078 0.0297 0.0417 0.1077 0.1793

42 0.00063 0.03001 0.0420 0.1086 0.1807 0.060643.7 0.00040 0.0304 0.0426 0 1100 0.1830 0.058548 0.00008 0.0304 0.0426 01100 0.1830 0.0588

48.5 0.00008 0.0304 0.0426 0.1100 0.1830 0.058852 0.00008 0.0304 0.0426 0.1100 0.1830 0

268

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.4.- Cálculo del nitrógeno aprovechadopor Xantho¡nonas campestrisdurante lafermentaciónen el experimenton0 7, llevados a cabo con 475 p.p.m. deamonio y 280C.

Tiempo(h)

CN,Á

(gIL)

CRNA

(g/L)

CUNA(gil)

CPRI(g/L)

ECDNÁ,LNA,pR,(gil)

CPRE(gil)

0 0.3694 0.0001 0.00016 0.00041 0.00068 02 0.3686 0.0001 0.00026 0.00067 0.0011 04 0.3678 0.00022 0.00032 0.00084 0.0014 07 0.3655 0.00043 0.00059 0.0015 0.0025 0.00099 0.3616 0.00050 0.0007 0.0018 0.0030 0.004312 0.3562 0.00067 0.00094 0.0024 0.0040 0.008713 0.3538 0.00089 0.0012 0.0032 0.0053 0.0097

14.5 0.3422 0.0011 0.0016 0.0041 0.0069 0.019816 0.3111 0.0016 0.0022 0.0059 0.0098 0.0480

16.5 0.2761 0.0017 0.0024 0.0062 0.0104 0.082419.5 0.1944 0.0024 0.0034 0.0089 0.0149 0.159623.5 0.1400 0.0061 0.0086 0.0222 0.0370 0.191924 0.1166 0.0090 0.0126 0.0327 0.0544 0.1978

24.5 0.0933 0.0117 0.0164 0.0423 0.0704 0.205228 0.0855 0.0157 0.0221 0.0571 0.0950 0.188432 0.0661 0.0177 0.0248 0.0640 0.1065 0.1963

33.5 0.0622 0,0190 0.0267 0.0689 0.1147 0.192034 0.0622 0.0190 0.0267 0.0689 0.1147 0.192038 0.0622 0.0190 0.0267 0.0689 0.1147 0.1920

38.5 0.0622 0.0190 0.0267 0.0689 0.1147 0.192039.5 0.0622 0.0190 0.0267 0.0689 0.1147 0.1920

269

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.5.- Cálculo del nitrógeno aprovechadopor Xanthomonascampestris durante lafermentaciónen el experimenton0 1, llevados a cabo con 257 p.p.m. deamonio y 250 C.

Tiempo(b)

CN,.%

(g/L)

CRNA

(g/L)

CDN..x(g/L)

CPRI

(g/L)

ECDNA,RNA,PRI

JI..

CPRE(gIL)

0 0 0.0017 0.0021 0.0051 0.0087 0,00125.7 0.3012 0.0061 0.0031 0.0085 0.0176 0.00247.7 0.2951 0.0069 0.0101 0.0211 0.0369 0.00349 0.2922 0.0111 0.0161 0.0321 0.0582 0.004310 0.2812 0.0123 0.0171 0.0351 0.0642 0.00531216

0.2761 0.0182 0.0261 0.0473 0.0911 0.00790.2741 0.0591 0.0872 0.1522 0.2961 0.0168

17 0.1813 0.0641 0.1093 0.1831 0.3562 0.020320 [ 0.1241 0.1082 0.1325 0.2811 0.5183 0.034624 0.0901 0.1323 0.1922 0.3503 0.6744

0.2522 0.3802 1 0.78550.0679

25 0.0851 0.1522 0.080228 0.0752 0.1711 0.2712 0.4411 0.8821 0.127129 0.0414 0.1802 0.2811 0.4702 0.9332 0.143832 0.0333 0.2301 0.3511 0.6502 1.2321 0,176434 0.0112 0.2606 0.3824 0.7025 1.3422 0.178435 0.0091 0.2707 0.4225 0.7201 1.3933 0.178538 0.0006 0.2805 0.4122 0.7811 1.4733 0.178550 0.0006 0.3002 0.4300 0.7811 1.5121 0.1785

270

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.6.- Cálculo del nitrógeno aprovechadopor Xanthomonascatnpestris durante lafermentaciónen el expenmenton0 2, realizadocon 257p.p.m.de amonioy 310 C.

CPRE

(gIL)

Tiempo(b)

CNA

(gIL)

CRNA

(gIL)

CUNA

(gIL)

CPRI

(gIL)

ECDNÁ,~Á,PRI

J¡~j~[

0.0156 000.51.15

0.1711 0.0025 0.0035 0.00950.1697 0.0028 0.00405 0.0108 0.0178 00.1677 0.0030 0.00426 0.0114 0.0187 0

3 0.1655 0.0032 0.00456 0.0122 0.0200 03.5 0.1=95 0.0033 0.00467 0.0125 0.0205 06 0.1512 0.0038 0.00537 0.0144 0.0236 08 0.1445 0.0044 0.00621 0.0166 0.0272 0.0074

8.5 0.1329 0.0048 0.00677 0.0181 0.0297 0.00829 0.1299 0.0058 0.0082 0.0220 0.0360 0.005410 0.1221 0.0074 0.0103 0.0278 0.0456 0.003112

14.50.1061 0.0080 0.0113 0.0304 0.0498 0.01500.0846 0.0105 0.0148 0.0398 0.0652 0.0211

15 0.0803 0.0113 0.0159 0.0427 0.0711 0.020716 0.0718 0.0115 0.0161 0.0434 0.0711 0.0279

18.5 0.0524 0.0130 0.0183 0.0492 0.0806 0.037920 0.0423 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 0.0456

23.5 0.0243 0.0171 0.0240 0.0644 0.1055 0.041024

24.525

0.0224 0.0173 0.0242 0.0651 0.1067 0.04180.0206 0.0182 0.0256 0.0688 0.1127 0.03760.0189 0.0189 0.0265 0.0713 0.1168 0.0352

26.5 0.0145 0.0190 0.0267 0.0716 0.1174 0.038927 0.0133 0.0197 0.0276 0.0743 0.1217 0.035928 0.0111 0.0197 0.0276 0.0743 0.1217 0.038130 0.0077 0.0206 0.0289 0.0777 0.1273 0.0359

31.7 0.0056 0.0203 0.0285 0.0766 0.1255 0.0398

0.0030 0.0203 0.0285 0.0766 0. 1255 0.0424

271

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.7.- Cálculo del nitrógeno aprovechado por Xanthomonascampes/Rsdurante lafermentaciónen el experimenton0 4, llevados a cabo con 257 p.p.m. deamonio y 340 C.

Cpftg

(g/L)

Tiempo

(h)

CN,Á(gIL)

CRNA] CDNAj

(g/L)~ Á~tL....J0.00019 0.00022 0.0002

SCDNA~NA,rRI

IL

CPRE1

(g/L)0 0.1521 DeDil 0

0,00113 0.1547 0.00029 0.0004 0.0010 0.00176 0.1462 0.00048 0.00067 0.0017 0.0029 0.00139 0.1361 0.00022 0.0010 0.0028 0.0046 0.001212 0.1151 0.0011 0.0014 0.0036 0.0060 0.001514 0.1143 0.0013 0.0018 0.0047 0.0078 0.0017

14.518

0.11040.1088

0.00140.0023

0.00190.0032

0.0050 0.00830.0083 0.0139

0.00220.0081

20 0.1052 0.0048 0.0067 0.0174 0.0289 0.002524

24.50.10110.0972

0.00670.0086

0.0094 0.0243 0.0405 0.01010.01100.0121 0.0313 0.0521

30 0.0933 0.0134 0.0188 0.0487 0.0811 0.012133 0.0855 0.0150 0.0210 0.0543 0.0903 0.015236 0.0855 0.0173 0,0243 0.0627 0.1043 0.0223

36.5 0.0777 0.0188 0.0264 0.0682 0.1135 0.025]40 0.0777 0.0269 0.0377 0.0975 0.1622 0.0252

0.0777 0.0269 0.0377 0.0975 0.1622 0,02520.0277 0.0269 0.0377 0.0975 0.1622 0.02520.0777 0.0269 0.0377 0.0975 0.1622 0.0252

272

Mode/oCinéticode Célula

Todosestosresultadossugierenqueel nitrógenoconsumidoporel microorganismova

a formarpartefundamentalmentede la biomasa(DNA, RNA y proteínaintracelular),y sólo

un pequeñoporcentajeva a constituir las proteínasextracelulares.Unaexcepciónla presenta

el experimentorealizadoa65 p.p.m.,dondeno ha sido posiblecenarel balancede nitrógeno,

probablementedebidoaquela estequiometriaasumidano esválidacon concentracionestan

bajasde nitrógeno,aspectoqueserácomentadomásadelante.Unavez realizadoel balance

de nitrógenoanterior,seobservóla evoluciónde los componentesintracelularesimplicados

directamenteenel crecimientodel microorganismo,puesel conocimientode suevolución

con el tiempo va a titeilitar los primerospasosenel planteamientodel modelo.En las

Figuras6.3 a6.9 semuestranlas evolucionesde los componentesintracelulares(DNA, RNA

y proteínas),asícomo la sumade estostres componentesestructurales de la célula, con el fm

de compararcon la biomasaexperimental.Así mismoapareceendichasfiguras el consumo

de amonio, ademásaparecela evolución de la proteínaextracelularcalculadade la forma

indicadaanteriormente.

Se puedeobservar que lasevolucionesde todos los componentes(eng/l..) en todoslos

experimentos es similar. El contenido en proteínas es siempre mayor que el contenido en

ácidosnucleicosy, dentrode éstos, la cantidaddeDNA essiempremayorque la de RNA. Por

otm lado, seobservala estrecharelaciónentrela síntesisde estoscomponentesy e] consumo

de nitrógeno,esdecir, cuando el sustrato nitrogenado se agota, el microorganismono puede

seguir sintetizando nuevasmoléculas,por lo que la síntesis de aminoácidosse detieney, en

consecuencia,la síntesisde ácidosnucleicos,lo queprovocaqueel microorganismoentreen la

faseestacionariadel crecimiento.Una excepcióna estaafirmaciónes la correspondienteal

experimento realizado con una concentraciónde amonio inicial de 0,475 gIL; en este caso,

cuandoel microorganismoentraen la fase estacionariadel crecimiento,todavía quedauna

concentraciónelevadadel sustratonitrogenadoenel medio, por lo quela entradaenestaIbse

sedebe,probablemente,aotro nutrientequesehaagotadoy no al nitrógeno.Además,en todas

las gráficasse ha representadola suma de los componentesintracelulares(DNA, RNA y

proteínas),queseha llamadobiomasateórica(Cxr~), seapreciaqueestasumaen todos los

casos es semejante al valor de la biomasaobtenidaexperimentalmente,existiendo una

diferencia-no muy significativa-enla faseestacionariadel crecimiento,debido a que no sehan

considerado otros componentes,como lípidos o hidratos de carbono,que, aunqueen mucha

menor cantidad, seencuentran en la biomasa, y pueden ser los responsablesde esapequeña

diferencia entre la biomasaexperimental y la teórica(DNA, RNA y proteínas intracelulares).

273

Modelo Cinético de Célula

0,8

0,6~

0,4-

(30,2 —

1~0 10

Figura 6.3.- Evolución de componentesintracelulares,fluente de nitrógenoy biomasadelexperimenton0 5. Condicionesexperimentales:CN665 p.p.m., Th 28 0C, Nvariable (210 r.p.m. inicial>.

2.0

1.5 —

I,0—

u

0,5 —

0.00 10 20

r30 40 50 60

t(h)

Figura 6.4.- Evolución de componentesintracelulares,fuente de nitrógenoy biomasadelexperimenton0 6. Condicionesexperimentales:CNO=130 p.p.ni., T 28 0C, N~=variable (210 r.p.m. inicial)

• ex

VA

~ %rot,, +CRNA+CDN

-s- - a -u. ----3.#

2,

y. ~gt” — - 0Q~’ O - - -

4,It,

‘7 .~o ~Ú~’v ~~v- y.>,1

‘—‘e

:

• -— -

20 30

(h)

40 50

e! ~ o,

5• .F0 0004 4 0

274

ModeloCinéticode Célula

2.0

1,5

I,0-

o

0,5—

0,0 ~o Jo 20 30 40 50 60

t(h)

Figura 6.5.- Evolución de componentesintracelulares,fuentede nitrógenoy biomasadelexperimenton0 2. Condicionesexperimentales:CNO=25’? p.p.m., fl 28 0C, N=variable(210 r.p.m.inicial)

2,0

1,5 —

¡ [0—

0,5,

0,0—

o 20 30 40

t(h)

Figura 6.6. Evolución de componentesintracelulares,fuente de nitrógenoy biomasadelexperimenton0 7. Condicionesexperimentales:CNO=475 p.p.m.,T= 28 0C, N=variable(210 r.p.m. inicial).

• CNAC

RNA

~ ~o• u

mio o

o

O

1P~ 000 0odio

g o

oji

tp

4~NA

o s1

.cxE,.,,

o CXT~<,~

uOc •,

ou

O‘.SS..•• •9s.. ollo 0~ ~

— —

275

• .0o

A CRNA

9u. u

O o

•

• UTM

u...

UD ~00

ou

• o0

r

10 20 30

o-O

40Y

50

t (Ii)

Figura 6.7.-

2,

1,5 —

-4

Eo

u

1,0—

0,5 —

0,04O

Evolución de componentesintracelulares,fluente de nitrógeno y biomasadelexperimenton0 1. Condicionesexperimentales:CNO=257 p.p.m., T= 25 0C, N=variable(210r.p.m. inicial).

¡ •

I0 20 30 40

t (h)

Figura 6.8.- Evolución de componentesintracelulares,fluente de nitrógenoy biomasadelexperimenton0 2. Condicionesexperimentales:CN@257p.p.nt,T 31 0C, Nvariable(210r.p.m. inicial).

ModeloCinético de Célula

2,0

1,5—

5

e

u

1,0—

0,5 —

0,0 ~1~

o 60

• 1

• CN ¡A C~A

9

O

a (‘

o u.....n-o o

u

u 0~ O- O

~ •q50 ~~AAA A~ WVV7 9

a a a- ---- -

276

Modelo Cinéticode Célula

2.0

1.5—

E

u

I,0—

0,5—

0,0o lo 20 30 40

t (h)

Figura 6.9.- Evolución de componentesintracelulares,frente de nitrógeno y biomasadelexperimenton0 4. Condicionesexperimentales:CNO=257p.p.m.,T= 34 <‘C, N=variable(210r.p.m. inicial).

¡ • ¡ •

•CNA

V C~

o• CYSi,ten

ocxT~ • u ~ a.O ~ O O O

Esaca

SO 0 0 0 00

~ 0 ~ ¿O~x x~X X XXe. •——.~~•~-• a

277

Modelo Cinético de Célula

Considerandotodosestosresultados,sepuedellegara plantearun esquemade reacción

sencillo paraexplicarel crecimientode la bacteriaXanthomonascampestris,tal como indica la

Figura 6.10. Unapartedel amonio va a ser empleadoparala formaciónde aminoácidosno

formadores de bases nitrogenadas (no formadores de ácidos nucleicos),en defmitiva, de

aminoácidosqueformaránexclusivamenteproteínas.Estasproteínaspuedenser intracelulares

o extracelulares.Otra parte del amonio se emplea para la formación de aminoácidos

formadoresde basesnitrogenadas(las que formaránpartede ácidosnucleicos).Estasbases,

asuvez, formaránporun lado RNA, porotroRNArn el cualsetranscribeaDNA. Es decir,el

RNA intracelular que se mide será, mayoritariamente,RNA que no evolucionahaciaDNA.

Este esquemaexplica la forma de las curvas de proteínasy RNA, que no correspondena

productosformadosenreaccionesen serie.

PROTEINAINTRACELULAR ]

FI~7flEZZZZ4~NA

Figura6.10.-Esquemade reacciónsimplificadoparael Modelo Cinéticode Célula deXanthomonascampesfis.

Aminoácidosnoformadoresde bases

PROTEINAEXTRACELULAR[ 1

278

ModeloCinéticode Célula

Una vez planteadoel esquemade reacciónsimplificado y consideradoel conocimiento

que se tiene del metabolismo del microorganismo, se deben plantear las relaciones

estequiométricasentre los diferentes compuestos.

- En la síntesisde las basesqueformanRNA sólo cedenátomosde carbonolos quesehan

denominadoaminoácidosformadoresdebases,cuya síntesissemuestraen la ecuación

(6.15]; mientrasque el restode aminoácidosque intervienenen la reacciónsólo ceden

gruposamino (NI-lfl, por lo que no sehan consideradocomo fórmula molecularen la

citadareacciónde síntesisde basesde RNA.

- En la síntesisde basesdel DNA, a partirde las basesdel RNAm, setieneen cuenta que

seproduceel mismoconsumode nitrógenoquesi seestuviesesintetizandoRNA. Si bien,

seconoceque, en la formaciónde DNA apartir de RNAm, seproduceunatransformación

en la basenitrogenada,es decir,el uracilo queformapartede los nucleótidosdel RNA, se

transformaen timina en el DNA, para lo que es necesarioun aporte de carbono e

hidrógeno,quesesuponequeviene de la frente de carbonooriginal empleada(sacarosa).

Además,es necesariala presenciade un intermedio reducido (IntRed) que realice la

reducciónparapasar la ribosaa desoxiribosa(ribonucicótidosa desoxirribonucleátidos).

Por tanto, el metabolismodel sustratonitrogenadosuponeuna estructuraciónde este

componenteen la biomasa,ya que es el citado compuestonitrogenado el que produce

aminoácidosy éstos dan lugar a proteínasy basesnitrogenadas,precursoras,de los ácidos

nucícicos.Si seaplica lumping en el sistema,englobandoaminoácidos,basesdel RNA y bases

del DNA en compuestoscon fórmulas molecularesmediasdel total de moléculasque los

forman, las reaccIonesglobales,que tienenlugaren la rutametabólicadel nitrógeno,se pueden

plantearlas siguientesrelacionesestequiométrieas(ecuacionesdefiliación):

279

,VfodeloCinético de Célula

- Síntesisde aminoácidosno formadoresdebases(r1):

0,933C6U1~O6+ 1,4NH ±O,2l6NAD~±0,ICoASH-t-ATP 7ZZ~

C56J-J~01O~3N~4S01~±O216(NADJ-I,fl+ )+0.lCoA+3.29h%O+(ADP+Pi)

- Síntesisde aminoácidosformadoresde bases(r,):

O,5C6H1,06+ + 2,2SNAD> z~’ C3 [-15503!V + 2,25(NADH,H ~)

- Síntesisde RNA (r3):

1.Or6HJ,06±qH5pN±Z74NF~±3.5ATP±3.5WAP’+0.2EGTÉ ±3QHf~3N5P3~

CqSLJI7PR7SNThP3±5.34k0±3.5(ADP+PP+3.5IÑV>4D[-fl- Sp-

O.2%GDP-i-Pi) +3QHJ,q0N5P,

- Síntesisde RNAm (r4):

L0W’~H,O6±C3H5503N+2,74N1-4+3,5A TP±3.5IN,4L1+0,2SGTI’ ÷3C101-112013N5P3zt’

Q5J-I~ 75O~ ~75iV375P3±5,34H20+3,5(ADP+Pi) ±3,5yN>4DHi- 5 ) +

O,2YGDP±PO±3C10H1=010N5P2

Síntesisde DNA (r5):

0,04C6U1,06+ 0,I2SNADP+ C9 5H11 750J375N375P3+ mt Red.

C95H1201375N375P3±6,125(NADPH,H~ ) + !ntOx.

[6.15]

[6.16]

[6. 17]

[6.18]

[6.19]

280

Modelo Cinéticode Célula

6.2.2.- Pronuestade EcuacionesCinéticas

Ante la falta de antecedentesen la literatura,y el desconocimientodel tipo de ecuaciones

cinéticasparalas reaccionesanteriores,se ha optadopor aplicar el método antescitado de las

velocidadesde reacción,junto con el métodointegral.Dicho métodoes aplicableal sistema

objeto de estudiodebidoa que el númerode componentesclave puedehacerseigual al número

de reaccionesdel esquemasimplificado, suponiendoestadopseudoestacionariode algunode los

componentesde estesistemaconcreto.

La aplicación de la ecuación[6.8] a los NC componentesclave del modelo cinético

conduceagruposde ecuacionesindependientesquepermitencalcularlos parámetroscinéticos

del sistemapor aplicaciónde una regresiónlineal simple sin término independiente,de forma

individual.

El primerpasoa realizaresel planteamientodel sistemade ecuacionesdiferenciales,para

ello se han realizadodos suposicionessobreel esquemasimplificadode reacciónanteriormente

propuesto:

• Simplificación 1 (MCC-1), donde seasumeestadopseudoestacionarioparaRNAm:

dCRNAm _ =0 [6.20]

dt —R~A

puestoque

RRNAm=r4—r5 [6.21]

seobtiene: [6.22]

Del mismo modo, se asume estado psedoestacionariopara los aminoácidos no

formadoresde bases:

dC00 — 1? = 0 [6.23]

dt aa~/f¿fi

281

ModeloCinético de Célula

puestoque

R =r,—r3 —r4

se obtiene:

r,=

La velocidadde consumode amoniovienedadapor:

dcNR4>

¿It—r, —2,75r3—2,75 r4

Sustituyendolas ecuaciones[6.22] y [6.25] en [6.26], se obtiene:

dCVR — 1,4

¿Itr1 —3,75r3—3,75’~

La velocidadde formacióndel RNA por:

dCRNA =

¿It

Mientrasquela velocidadde formacióndel DNA vienedadapor:

dCDÑÁ =

¿It

La velocidadde formaciónde proteínasintracelulareses:

¿It dt

[6.24]

[6.25]

[6.26]

[6.27]

[6.28]

[6.29]

dCPRE=1’3~ [6.30]

282

Modelo Cinéticode Célula

• Simplificación 2 (MCC-2»

Seasumeestadopseudoestacionariosólo paraRNAm (ecuaciones[6.201a [6.22],en este

casono se supone estasimplificaciónparalos aminoácidosno formadoresde bases,por lo que

la velocidadde consumode amoniovendrádadade formadiferenteal modeloMCC- 1, mientras

queel restode velocidades(paraRNA, DNA y Proteínasintracelulares)sonlas mismasqueen el

casoanterior.

Parael amonio:

dCÑÑ4+ =—1,4r~ —~ —2,75r3—2,75r4 =—1,4r, ~~‘2 —2,75r3—2,75r5

¿It[6.31]

Unavez propuestaslas velocidadesdeproducciónparacadacomponenteclaveespreciso

plantearestasecuacionesen términosde velocidadesde reacción,paraello se aplicala ecuación

[6.8] paraobtenerde forma individual cadaunadeestasvelocidades.

• Simplificación 1 (MCC-1):

- rsi vienedadapor:

= frl.¿It#Cppu—CPRJ)+(CPÑE) [6.32]

- y53 seobtieneal despejarde la ecuación[6.28],obteniéndosela expresion:

= frs . ¿It ~RNA — CRNÁO [6.33]

- rss se obtieneal despejarde la ecuación[6.29], obteniéndosela ecuación:

= fI ¿It «.‘DNA —CDÑÁO [6.34]

283

Modelo (‘luético dc Célula

• Simplificación 2 (MCC-2):

Tanto rs corno r53 y rs5 vienendadasde la mismaforma que en MCC-1, esdecir por las

ecuaciones[6.32),[6.33]y [6.34],respectivamente.

La diferenciaentrelas dossimplificacionesla marcala ecuacióncinéticar2. la cualviene

dadaporla siguienteexpresiónobtenidaal despejardela ecuación[6.31]:

S2 = fri di ——(2,YS(CPÚVA CItVÁO)+2,75.(CDNACDN#O )+l,4( C~

1~ — C¡~I?I0)) [6.35]

La aplicaciónde este método a los datosexperimentalesobtenidosen este trabajo fUe

realizadaen simple respuestaempleandoel método de integral, con una subrutinatipo

Simpson. Las funciones (f(Cj)) que sehan probado para cada una de las velocidadesde reacción

hansido:

Para las ecuacionesr1, r3, y r5, (ecuaciones[6.32], [6.33] y [6.34], respectivamente),

válidastantoparaMCC-l comoparaMCC-2, se hanprobadotrescinéticasdiferentes:

- Potencial 1:

- Potencial2:

5 k, ~ CÑ di = ~ (CJ -CN ¡ti = ¡NR) [6.37]

- Hiperbólica:

5 k1 .Cj . CN dí=XV,1 •(Cj—C1~ );p= 1 NR) [6.38]CN±K,

Parari, calculadasólo parala simplificación2 (MCC-2), comoya seha indicado,se han

realizadoajustescon doscinéticaspotencialesdel tipo queindica la ecuación[6.36]y la (6.37].

Debidoa que todos los experimentospresentanresultadossimilares, sehan elegido dos

experimentoscomo representativospara observar los resultadosde la aplicación de esta

metodología,y paraevitar alargarexcesivamenteel desarrollode la exposicióndeestecapitulo.

284

ModeloCinéticode Célula

Concretamenteel experimenton0 2, realizadoa 280C y con 257 p.p.m. de amonio, y el

experimenton0 4, realizadoa 340C y con 257 p.p.m. deamonio.

Los resultadosobtenidospara la velocidad de reacción r1, aplicandoeste método y

probandolas cinéticasque sehan indicado, semuestranen las Tablas6.8 a 6.14, donde se

observanlos valoresobtenidosparalos parámetrosde cadaunade las funcionesprobadas.

Todos los parámetroscumplenlas restriccionesestadísticasimpuestas,se observaqueel

valor de SRC (suma de residuosal cuadrado)es menor para las cinéticas hiperbólica y

potencial2. Estosecorroboraobservandoquelas formasde las curvas,tanto en forma integral

(Figuras6.11 y 6.12),como derivadas(Figura 6.13 y 6.14)seasemejanmuchomása la fUnción

queparael casode la cinéticapotencial 1, cuyasumade residuosal cuadradoesmuchomayor.

Las Figuras6.11 y 6.12 muestranlos resultados,portanto,parael valorde la integralde

r1 parael experimenton0 2 (280C, 257 p.p.m. de amonio)y el experimenton0 4 (340C y 257

p.p.m.), respectivamente.Las ecuacioneshiperbólica y potencial 2 son las que permiten

obtenermejorresultadorespectoal acercamientodelas curvasa la de la función.

En cuantoal valor de r1 ya derivado(Figuras6.13 y 6.14), se observaque la formade la

curva que correspondea la ecuaciónpotencial1 presentauna forma descendente,indicando

que no es posibleconsiderarestacinética en el modelo propuesto,mientrasque las cinéticas

hiperbólica y potencial 2 reproducenbien la forma que presentala función, siendo, en

principio, posibleconsiderarcualquierade lasdoscinéticasparael modelocinético.

Tabla6.8.- Parámetroscinéticosde r1 calculadosporajustede los datosdel experimenton0 1.

en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinéticas. Condicionesexperimentales:T=250 C, CN=257 p.p.m de amonio,N= variable(210 r.p.m.inicial) modelo de célula.

C¡nética

Valores de los paranietros t Student F Fischer

SRC

Mix Ópt Mía Obt. Teor. Obt. flor.

k c1 k,=0,132 k=O.129 k,=O,126 4,3.l0~ 2,086 925 4,35 0,92

¡c~ o u k,=1,097 kño,977 k,=0.857 6,3.I0~ 2,086 2432 4,35 0,23

k1 •c« k1=0,035

K1=0,003k,=O.028K1~0,002

k1=0,021K,=0,00i

8.1 i03 2,093 3331 4,38 0,12

285

Modelo Cinético de Célula

Tabla 6.9.- Parámetroscinéticosde r1 calculadosporajustede los datosdel experimenton0 2.

en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinéticas. Condicionesexperimentales:T=280 C, CN257p.p.m de amonio,N= variable(210 r.p.m.inicial).

Tabla 6.10.-

Cinética

Valores de los parametros t Student r FiseberSRCMáx Ópt Nlíu 0W.

k”0.152 k=0.150 I<~=0.148 i,iio~ 2.074 1120 4,54 0,85

k1 •c~ k,=0.44 k1=0.43 k1=0.45 8.3.10’ 2.074 1332 4.54 0.092

kft’0.051 k1’~0,050 k1~0.0490< + k K1=0.O05 K1=0.005 K,=0,005 3.1102 2.080 2331 4,60 0,012

Parámetroscinéticosr1 calculadospor ajustede losen simple respuesta a diferentes ecuaciones cinéticas.experimentales:T31

0 C, CN~257 p.p.m de amonio,N variableinicial) modelode célula.

Cinética

Valores de los parámetros t Student F Fiseher

SRCXláx Ópt Mm Obt. Teor. Obt. Teor.1

k,=0.315 k1=0.195 k1=0,075 4,3.10~ 2,080 925 435 15k,=0.704k o~ k1=0.590 k1=0,470 6.3. ¡o

3 2.080 2432 4,35 0.23

k ~ <jV k, ‘0,450 k1=0.310 k,=O.170

K1 K1 0,600 K1=0.390 K1=0,180s.í.ío

3 2,086 3331 3.52 0,12

Tabla 6.11.-Parámetroscinéticosde r1

4 en simple respuestaexperimentales:T34

0 C,inicial) modelo de célula.

datosdel experimenton0 3Condiciones(210 r.p.m.

Cinética

Valores de los parámetros t 5h¡dent F flscher

SRCMáx Ópt Mm Obt. Teor. 0W. Teor.

k ¡ kJO,143 k,=0.131 k,=0.O,11 4,310~ 2,060 925 4.35 3.75

c~ k1=0,237 k1=0,150 k1=0,063 6.3.10~ 2,060 2432 4,35 1.23

<~C..~ ±K¡

k=0.268K1=0,093

k1=0.173K,’~0.063

k1=0.095K,=0,033

8,1.10~ 2.064 3331 3.52 0.82

calculadospor ajustede los datosdel experimenton0

a diferentes ecuacionescinéticas. CondicionesCre257p.p.m de amonio, N variable(210 r.p.m.

286

Modelo Cinéticode Célula

Parámetroscinéticosde r12. en simple respuestaexperimentales:T=28

0 C,inicial), al modelode célula.

calculadosporajustede los datosdel experimenton0a diferentes ecuacionescinéticas. CondicionesCN65 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.

Tabla 6.13.-Parámetroscinéticosde r1

2. en simple respuestaexperimentales:T28

0 C,

Cinetica

Valores de los parámetros t Student F Fiseher

5RCMáx Ópt Mm 0W. Teor DM Teor.

k1 C\ k,=0.18 k,=’0,131 k1=0.082 4.3.10~ 211 925 4,38 2.95

k ~‘ c~ k1=0.288 k~=O.lSO k1=0.138 6.3.102 2 11 2432 4,38 0.55

k1=0.178 k1=0.173 k,=0.167 8,lA0~k1 <i~ (~ ~K, K1=0,066 K1=0,063 K,=0.060

212 3,55 0,182

calculadospora diferentes ecuacionescinéticas.CNl3O p.p.ni de amonio,N= variable

inicial), a] modelo de célula.

CinéticaValores de los parametros t Student F Fiseher

SRCMáx Ópt Mía CM. Teor. 0W. flor.

k1 c< k1=0.900 k1=0.900 k1=0,900 2.102 2,069 925 3,68 1,3

k1 cj Ej k1=5,830 k1~5.800 k,=5,770 410’ 2.069 1223 3,68 0.23

(i<+K¡ k1=0,069 k’=0.069 k1=0,069K1=0.010 K,=0,010 K1=0,010 3.102 2.074 1325 3,34 0.12

modelo de célula

Cinética

Valores de los parámetros t Student E Fiseher

SRCMix Ópt Mía CM. flor. CM. flor.

=0.131 k1=0,131 k1=O,131 4,3.10~ 2.080 955 4.30

4,30

0,72

0,11=0.151 k1=0.l50 k~=0,149 6,3.10~ 2,080 2432

k1c~ ~ k~=0.l73 ktO,173 kñ0J738,1.10~

=0,063 K,=0,063 K1=0,0632,086 3331 3,37 0,082

ajustede los datosdel experimenton0

Condiciones(210 r.p.m.

Tabla 6.14.- Parámetrosde r1 calculadospor ajustede los datosdel experimenton

0 2. ensimple respuestaa diferentesecuacionescinéticas.Condicionesexperimentales:T~28O C, CÑ=475 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m. inicial), al

287

Tabla 6.12.-

ModeloCinético cte Célula

¡ • ¡ ¡3•~‘ ——-.

2

u

/IP

o

1’ e<u

,141-~-u—-

40 50 60

Figura 6.11.-

Figura 6.12.-

Evolución mostradapor la integralde r1 con el tiempoparael experimenton0

2, realizadoa 280C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentescinéticasy sucomparacióncon la función correspondientea proteínas.

(h)

Evoluciónmostradapor la integral r1 conel tiempoparael experimenton

0 4,realizadoa 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probandodiferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.

0,30

0.25-

020-

1 IttEnc,a1 12 bn~c,ai2SI bpcrliolica

e-- --u- — -- —

0.15—

0.10-

0,05—

u0.00o lo 20 30

t(h)

0.8

0 0 20 30 40 50

288

ModeloCinéticode Célula

0012

0010

oms

0036

0032

a,50 60

Figura 6.13.- Evolución mostrada por rsi con el tiempo para el experimento n0 2,realizadoa 280C y 257 p.p.¡n.de amonio inicial probandodiferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.

t (h)

Figura 6.14.- Evolución mostradapor r51 con el tiempo para el experimenton

0 4,realizadoa 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probandodiferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.

0014

O lO 20 30 40O,’)

O lO 20 30 40 50

289

Alodelo Cinético de Célula

Los resultadosobtenidosparala velocidaddc reacción r3 (de formación de RNA),

aplicandoestemétodoy probandolas cinéticasque sehan indicado,se muestranen las Tablas

6.1 5 a ~ 1 donde se observanlos valoresobtenidospara los parámetrosdc cadauna de las

fimoionesprobadas.En todoslos experimentossesuperanlos valoresestadísticosteóricosde lii

Studenty de la E de Fischer, obteniéndosevaloressignificativamentebajos de SRC. La

cinéticapotencial1 es la quemuestravaloresmásaltosde la sumade residuosal cuadrado,lo

queindicaquedescribepeor la formade la funciónparar3, quelasotrasdoscinéticasprobadas.

Los resultadosde la integral de r53 paracadauno de los experimentostomadoscomo

representativos(experimenton0 2 y n0 4), semuestranen las Figuras6.15 y 6.16,mientrasque

la frmnción r3. paradichosexperimentos,aparecenen las Figuras6.17 y 6.18. Dondese puede

observaralgo similar a lo queocurríacon [avelocidadde reacciónr4 - estoes, las cinéticasque

mejor reproducenla forma de la fimción son la hiperbólicay la potencial2, mientrasque la

curvaparala ecuaciónpotencial1, sealejabastantede la formade la función,pueses una línea

descendente.

Tabla 6.15.- Parámetroscinéticosde ¡~3 calculadosporajustede los datosdel experimenton0

1. en simple respuesta a diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T250 C, CNzz257 p.p.m de amonio,N= variable (210 r.p.m.inicial).

Cinética

Valores de los parámetros t Student E Fischer5RC

Máx Ópt Mm 0W. Teor. 0W. Teor.

~< lq=O.O65 k,0.0348 k<0,004 1.5.102 2.086 1120 4,35 0.28

k u, u ,~ k,=0.295 I<~=0.259 k1=0,223 7.3.10~ 2.086 3332 4.35 0.08

A e ~4i¡k—0.035K1=0.112 k1=0.0344K1=0,0396 k1=0.033K1=0.033 4.1.10’ 2.093 4321 438 0.04

290

Modelo Cinéticode Célula

Tabla 6.16.-Parámetroscinéticosde r3 calculadospor ajustede los datosdel experimenton0

2. en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T280 C, CN257inicial).

p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.

Cinética

Valores de los parametros t Student E Fischer

SRC

Mix Ópt Mm Obt. flor. Obt. flor.

k1 c~ k=0,152 k1=0,045 k1=0,148 1,1.102 2,074 1120 4,54 1,8

0,92- - Q k,=0,44 k1=0.129 k1=0,45 8,3.10’ 2.074 1332 4,54

4.60 0,012A1 ~ k,=0,051K1=0.005

k1=0,013K1=0,080

k=0,049K1=0,005

3,1.102 2,080 2331

Tabla 6.17.-Parámetros cinéticosde r33. en simple respuestaexperimentales:T31

0 C,inicial).

calculadospor ajustede los datosdel experimenton0a diferentes ecuacionescinéticas. Condiciones

CN=257 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.

Cinética

Valores dc los parámetros t Student E Fischer

SRC

Mix Ó~>t Mía Oht. flor. Obt. Teor.k o

1 k1=0,052 k1=0,0408 k1=0,028 3,5.102 2,080 820 4,35 0,84

0’ c~ k,=0.224 k1=0,124 k,=0,024 5.3.10~ 2,080 1332 4.35 0.12

Cv4K,k1=0,026K1’~0.076 k1=0.023K1=0,074 k1=0,021K1=0,073 7.l.I0~ 2.086 5221 3,52 0.03

Tabla 6.18.-Parámetroscinéticosde r3 calculadospor ajustede los datosdel experimenton0

4. en simple respuesta a diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T340 C, CN257 p.p.m de amonio,N variable(210 r.p.m.inicial).

Cinética

Valores de los paranietros t Student E Fiseher

5RC

Mix Ópt Mm Oht. flor. Obt. Teor.

k1 c~, k1=0,039 k1=0,039 k1=0,039 1,2.10’ 2,060 725 4.35 2.5

k1 o, - (\, k1=0,455 k1=0,454 k1=0,453 2.3.10’ 2,060 1536 4,35 022

-- (~ #Ñ1

k,=0,049K1=0,057

k1=0,049K1=0.057

k1=0,049K[=0,057

4110’ 2,064 2325 3,52 0,43

29]

Modelo Cinético de Célí.¿La

Parámetroscinéticosde r35. en simple respuestaexperimentales:T=28

0 C,inicial).

calculadospor ajustede los datosdel experimentonoa diferentes ecuacionescinéticas. CondicionesCN=65 p.p.m de amonio, N= variable<210 r.p.m.

Tabla 6.20.-

Valores de los parasnetros t Studeut E Fiseher

Cinética Máx Ópt Mm Obt Teor. Obt Teor. ¡ SRC

k ~ lc~=0,039 k,=O.039 k,=0.039 1,2.10’ 2,11 725 4.38 3.1

¡ti Q ~< k1=0.454 k1=O.454 k1=0,454 2.3.10’ 2,11 1536 4.38 0.22

A, c~ kj0.049 k1=O.049 k1=0.049 4,1.10’ 2,12 2325 3,55 0.43

F,k1 K~ —0,057 K~=0,057 K~=0.057

Parámetros cinéticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento n

6. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinéticas. Condicione~experimentales: T=28

0 C, CN’43O p.p.m dc amonio, N= variable (210 r.p.m

inicial).

Valores de los parámetros t Studeut E Eischer

Cinética Mix Ópt ] Mm Obt. Teor. Oht. Teor. SRC

k c’¡ - k~=O.O7l k~=O.O7O k,=0.070 3.10’ 2.069 725 3,68 0.98

k o o- - k~=O.l8O k,=l.78 k~=l,76 i.io’ 2.069 1536 3.68 0,12

A1 - ~--‘ Lis k=0.02I3 k~=0.0212 k=0,021 2.10’ 2.074 2325 3.34 0.03

(~ +K~ K1=O,0002 K1=0.0002 K1=0.0002

Parámetros cinéticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento u

7. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinéticas. Condicione~

experimentales: T280 C, CN~”475 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m

inicial).

Valores de los parámetros t Studeat E FiseherCinética Mix Ópt Mm 014. Teor. Oht. Teor. SRC

=-lk - k

1=0.0417 k1~0.0417 k,=0,0417 2.10’ 2.080 725 4,30 4,2

k o- Y - Y k,=O.395 k~=0,392 k1=0.289 3.10’ 2,080 1536 4,30 0.33

k,=0.019 k1=0,019 k1=0,019 410’ 2086 2325 3,37 0.11¡ k[ -

0k. ~ -v

K1=O.002 K1=0.002 K~=0.O02

Tabla 6.21.-

Tabla 6.19.-

o

292

ModeloCinéticode Célula

‘

Figura 6.15

~

t (h)

Evolución mostradapor la integral de r3 con el tiempon

0 2, realizadoa 280C y 257 p.p.m. de amonio inicialcinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondiente.

t (h)

60

parael experimentoprobandodiferentes

O lO 20 30 40 50

O lO 20 30 40 50

Figura 6.16.-Evolución mostrada por la integral de r3 con el tiempo para el experimento

n0 4, realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes

cinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondiente.

293

ModeloCinético cíe Célula

0014

0012

0.01&

0.038

0.01>6

0.0)4

0032

50 60

Figura 6.17.-Evolución mostradapor r53 con el tiempoparael experimenton0 2, realizado

a 280C y 257 p.p.m. de amonio inicial probandodiferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondiente.

0.0116

0,004

0,092

O,cr~9

ti (h)

Figura 6.18.-Evolución mostrada por r53 con el tiempo para el experimenton

0 4, realizadoa 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probandodiferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondiente.

O lO 20 30 40t(h)

O lO 20 30 40 50

294

ModeloCinético¿le Célula

Los resultadosobtenidosparala reacciónr5 (parala formaciónde DNA), aplicando

el método de las velocidadesde reacciónpara determinarlas cinéticasque puedenser

empleadasen el modelo cinéticode célulaplanteado,se muestranen las Tablas6.22 a 6.28,

dondese presentanlos valoresobtenidosparalos parámetrosde cadauna de las funciones

probadas.En todos los experimentossesuperanlos valoresestadísticosteóricosde t Student

y de E de Fischer de los parámetrosde cadacinética, siendo algo peor las estadísticas

obtenidasparalos parámetroscorrespondientesa la ecuaciónpotencial1.

Las formas de las curvas para cadauna de las cinéticas,en comparacióncon la

función se muestranen las Figuras6.19 y 6.20 (para la integral de rs) y las Figuras 6.21 y

6.22 para r5 (derivada).Tal como ocurría en los dos casosanterioresse observaque las

cinéticasque mejor describenla forma de la función (f(Cj)) son las correspondientesa la

ecuaciónhiperbólicay a lapotencial2.

Los resultados que se muestran, como en los casos anteriores, son los

correspondientesa 1 experimenton0 2 (280C, 257 p.p.m. de amonio)y al experimenton0 4

(340C y 25’7 p.p.mj. Al igual que en las dos velocidadesde reacción anterioreslos

resultadosson similaresparatodoslos experimentos,por lo quesemuestranunosresultados

representativos.

Tabla 6.22.-Parámetros cinéticosde r5 calculados por ajuste de los datos del experimento

n0 1 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condiciones

experimentales:T250 C, CN257 p.p.m de amonio, N= variable (210r.p.m.inicial).

C¡nética

Valores de los parámetros t Student E Fiseher

SRC

Mix Ópt Mm Oht. Teor. 014. Teor.

k~=0,l52 k1=0,0922 k1—0,148 4.1.102 2,086 850 4,35 0.11

0~ k1=044 k~=0.348 k,=0.45 5.3.10’ 2086 2232 4.35 0,075

k, ~,C1~K1

k1=0,0601<~=0.058 k1=0,060K1=0,058 k1-=0,060K10,0 5,1.10’ 2,093 5241 4,38 0.03

295

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.23.-Parámetroscinéticos de r5 calculados por ajuste de los datos del experimenton

0 2 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T280 C, Cre257inicial).

p.p.m de amonio, N= variable (210r.p.m.

Cinética

Valores de los parametros t 5tudent E Fischer

SRCMix Mía Obt. Teor. Obt. Teor.

¡ti Ej k,=0.152 k,=O.0168 k,=0.148 i.í.104 2,074 1120 4.54 0,8

0.44 k,=0,175 k,=0,45 g.s.io 2,074 1332 4.54 0.19

~+K

1

k=o.ossK1=0,005

k,=0.0214K1=0.0075

k,=0,049K1=0,005 3,1.10’ 2,080 2331 4.60 0.01

Tabla 6.24.-Parámetroscinéticosde r5 calculadosporajustede los datosdel experimenton

0 3 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T310 C, CN257inicial).

p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.

CinéticaValores de los paranietros t Student E Fischer

SRCMáx Ópt Mía 0W. Teor. Oht. Teor.

u =0.057 k,=0,057 k,=0,057 2,1.10’ 2.080 1750 4.35 0,23

=0.179 k,=0.178 k,=0,176 3.3.10’ 2.080 3232 4,35 0,08

kñO.037~~ K=0,087

k~0.037K,~0,087

kñ0,037K

1=0,037 6.1.10’ 2.086 4241 3.52 0.025

Tabla 6.25.-Parámetros cinéticosde r3 calculados por ajuste de los datos del experimenton

0 4. en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T=340 C, CN=257 p.p.m de amonio, N variable (210r.p.m.inicial).

Cinética

Valores de los parametros t Student y Fischer

SRCMáx

ÓptMm Obt. Teor. Obt. Teor.

k=0.057 k,=0.054 k,=0,051 2,1.10’ 2.060 3078 4.35 1.4

c~ lt=O629 k,=0,629 k1=0.629 3.3.10’ 2,060 3282 4.35 0.11

A> <.~CV>KI

k,=0,078I<,=0,063

k=0.078K,=0,063

k,=0.078K,=0.063

7.1.10’ 2.064 2241 3,52 0.12

296

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.26.- Parámetros cinéticos de r3 calculadospor ajuste de los datos del experimenton

0 5. en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T280 C, CN65 p.p.m de amonio, N~ variable(210 r.p.m.inicial).

Tabla 6.27.-Parámetros cinéticos de r5 calculados por ajuste de los datos del experimento

n0 6, en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condiciones

experimentales:T280 C, Crl3O p.p.m de amonio, N variable (210r.p.m.inicial).

Tabla 6.28.-Parámetros cinéticosde r5 calculadospor ajuste de los datos del

n0 7. en simple respuestaa diferentesecuacionescinéticas.

experimentales:T280 C, CN=475inicial).

experimentoCondiciones

CinéticaValores de los paraniefros t Student F Fiseher

SRCMix Ópt Mm 0W. Teor. Oht. Teor.

k=0.054 k1=0.054 k1=0.054 2.1.10’ 2080 3078 4,30 3.4

¡ti u u~ k=0.629 k=0,629 k~0,629 3,3.I0~ toso 3282 4,43 0,8

A1 1Á +K~ k,=0,078K,=O,063 k,=0,078i(,=0,063 k1=0,078K,=0,063 7,1.10’ 2,086 2241 32,37 0,5

p.p.m de amonio, N variable (210r.p.m.

297

Modelo Cinético cíe Célula

0,3-

gro 0.2—

0. 1 -

0.0•O

Figura 6.19.-Evolución mostradapor la integralde r5 con el tiempoparael experimentou

0 2, realizadoa 280C y 257 p.p.m.deamonioprobandodiferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.

Jr~

(h)

Figura 6.20.-Evolución mostrada por la integral de r5 con el tiempo para el experimento

n0 2, realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinéticas

y sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.

3- 1 Rflo~4 1 - —-—u

2 R,t~,&a1 2

3 H~,al~lica~—1----

1¡

1 11

41

1

<1.

<~

--a>.

lo 20 30 40

(h)50 60

035

O lO 20 30 40 50

298

ModeloCinéticode Célula

0,0100

0,0075 —

te1- 0,0050—

0,0025 —

0,0030

Figura 6.22.-Evoluciónmostradapor r55con el tiempoparael experimenton0 4, realizado

a 340C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinéticas y sucomparacióncon la funcióncorrespondienteaproteínas.

O lO 20 30 40 50 60ti (h)

Figura 6.21.-Evolución mostrada por r55 con el tiempo para el experimento n

0 2, realizadoa 280C y 257 p.p.m.de amonio, probando diferentes cinéticas y sucomparacióncon la funcióncorrespondienteaproteínas.

1 Potenc¡a¡ 1 22Potendaj23 H~potóI¡ca

u

o lO 20 30 40 50t(h)

299

ModeloCinético cíe Célula

Los resultadosobtenidospara la reacción r2 (para aminoácidosformadoresde

bases),- válido sólo parala simplificación2, MCC-2-aplicandoel métododc las velocidades

de reacciónparadeterminarlas cinéticasquepuedenseraplicadasen el modeloplanteado,se

muestranen las Tablas6.29 a 6.35, dondese puedenobservarlos valoresobtenidosparalos

parámetrosde cadaunade las funcionesprobadas,en estecasosólo potenciales,asícomo los

valoresestadísticosde dichosparámetros.Como puedeapreciarse,la cinética que permite

obtenermejor resultadoes la potencial 1, es decir, la que viene en función sólo de la

concentraciónde nitrógeno,puescomopuedeapreciarseen las tablas,en la cinéticapotencial

2, el valor del parámetroobtenido(k2) paramuchosde los experimentosincluye cl cero en su

intervalode confianzay la sumade residuosal cuadradotienevaloressignificativamentemas

altos en todoslos experimentos,quelos obtenidoscon la ecuacióncinéticapotencial1.

Las Figuras6.23 y 6.24 muestranlas evolucionesde las curvasparala integral de la

ecuaciónr2 paralos experimentosque sehan tomadoa modode ejemplo(experimentosn0

2 (280C, 257 p.p.m. de amonio) y n0 4 (340C y 257 p.p.m.). Las Figuras 6.25 y 6.26,

muestranestos mismos resultadospara la ecuación correspondientea r2, para los

experimentosu0 2 y n0 4, respectivamente.En estasúltimas figuras sepuedeapreciarla

clara diferencia entre las dos cinéticaspotencialesprobadaspara estaecuación,siendo

significativamentemejor la obtenidacon laecuaciónpotencial1.

Tabla 6.29.- Parámetroscinéticosde r2 calculadospor ajustede los datosdel experimento

n0 1 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condiciones

experimentales:T250 C, CN=257 p.p.mdeamonio,N= variable(216 r.p.m.inicial).

Cinética Valores de los parámetros t Student E Eischer SRCMix Ópt Mm 014. Teor. Obt. Teor.

1< u- h=0,094 k>=0,091 k

1=0.088 1.1.102 2,086 1221 2.2 0.5

< Ej u~ k=0.580 k=0.250 k=-0.080 42,1 2,086 825 3.25 1,7

300

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.30.-Parámetroscinéticosde r2 calculadosporajustede los datosdel experimenton

0 2 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T~280C, CN257inicial).

p.p.m de amonio, N variable (210r.p.m.

Cinética

Valores de los parámetros t Studeot E Fiseher

Obt. k Teor. SRCMix Ópt Mm Oht. flor.

¡t, ~ k,~0,152 k1=0,0168 k,~0,148 3,1.102 2.074 1120 2.080 0.18

~> u~- cj k,=0,440 k1=0.175 k,=-0,090 62.5 2,074—

83,5 2,086 1.95—

Tabla 6.31.-Parámetros cinéticosde r2 calculadospor ajustede los datosdel experimenton

0 3 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T310 C, CN=257p.p.m deamonio,N variable(210r.p.m.inicial).

Tabla 6.32.-Parámetroscinéticosde r2 calculadosporajustede los datosdel experimento

n0 en simple respuestaa diferentes

experimentales:T’~340 C, Cre2S7inicial).

ecuacionesp.p.m de amonio

cinéticas.N variable

Condiciones(210 r.p.m.

Cinética

Valores de los parámetros t Student E Eischer

SRC

Mix Ópt Mm Obt flor Oht Teor.

¡t - ¿y k~=0.061 k1=0,055 k,=0,048 1110’ 2060 1225 4,35 0,5

o - ¿y, k,=1.521 k1~0,631 k,=0,259 352 2060 3251 4,35 2,3

30]

ModeloCinético ¿le Célula

Tabla 6.33.- Parámetroscinéticosde r2 calculadosporajustede los datosdel experimenton

0 4 en simple respuestaa diferentes ecuacionesexperimentales:T~2S0C, CN65inicial).

p.p.m de amonio,cinéticas.

N variableCondiciones(210 r.p.m.

Valores de los parámetros t Student E Fischer —

Cinética XIáx ÓiÚ Mm 014. ~Teor. 0W. jnor.

k¡ <y k> =0.560 k>=0,350 k>=0,140 i,i.i03 2,11 552 4.38 0,2

o, o, k1=2.140 k,=l,250 kL=’O.

3S0 8.3.102 2,11 875 4.38 7,2

Tabla 6.34.- Parámetros cinéticos de r2 calculados por ajuste de los datos del experimento

n0 6 en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinéticas. Condiciones

experimentales: T=280 C, CN=t30 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.

inicial).

Valores de los parametros t Stndent E Eischer

Cinética Nláx Ópt Mm Obt. Teor. Oht. 1 Teor. SRC

=0,158 k1=0,125 k,=0,092 ij.ío~ 2.069 878 3,68 0,23

ko-o k=1.47 k=0,69 k>=0.19 25,3 2.069 325 3.68 3,5

Tabla 6.35.-Parámetros cinéticos de r2 calculados por ajuste de [os datos del experimenton

0 7 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T=280 C, CN=475 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.inicial).

302

ModeloCinéticode Célula

Figura 6.23.-

60

Evolución mostradapor la integralde r2con el tiempoparael experimenton

0 2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.

0,150

0,125

0, l03 -

r, ~

a~o

a(25

0,030

t (h)

Figura 6.24.-Evoluciónmostradapor la integralde r2 con el tiempoparael experimento

n0 4, realizadoa 340C y 257 p.p.m. de amonioprobandodiferentescinéticas

y sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.

O iO 20 30 40 50

t (h)

o io 20 30 40 50

303

ModeloCinético de Célula

0,

(>035

0,030

0.025

0+0,020

(9,015

0,0>0

0,C05

0(1190

ti (h)

Figura 6.25.- Evolución mostrada por r52 con el tiempo para el experimento no 2, realizadoa 28

0C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinéticas y sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.

016

0,14

0,12

0,10

: 0.08

0,06

0.04

0.02

0.09

t (h)

Figura 6.26.-Evolución mostradapor r52 con el tiempo para el experimento n

0 4, realizadoa 340C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinéticas y sucomparacióncon la funcióncorrespondienteaproteínas.

0 lO 20 30 40

O lO 20 30 40 50

304

ModeloCinéticode Célula

De todo lo visto, se puedeconcluir que el método aplicado para obtener las

velocidadesde reaccióndel modelo de célula planteado permite discernir qué tipo de

cinéticasepuedeemplearparacadaunade las reaccionesdel esquemaelegido.

Sehaobservadoque las ecuacionesreaccionescinéticasr1, r3 y r5 (válidastanto para

el modelo MCC-l como parael MCC-2), presentanmejoresresultadoscon ecuaciones

cinéticasde tipo hiperbólico (ecuación[6.38]) o tipo potencial 2 (ecuación[6.37]), no

siendoposiblediscriminarmediantecriteriosestadísticoscuálde las dos ecuacionespuede

ser la másadecuadaparael modeloplanteado.Porestetipo de criterio se hadesechadola

ecuaciónpotencial 1 (ecuación [6.361) paraestasreaccionespues, aunquecumplía las

restriccionesestadísticasimpuestaspara sus parámetros,presentabavaloresde la t de

Studenty de la E de Fischersignificativamentemásbajos,y valoresde sumade residuosal

cuadrado(SRC) másaltos, lo queindica un peorajustea la funcióncon la que serealizala

comparación;esto último se veía corroboradoa la vista de las formas de las curvas

correspondientespara cada velocidad de reacción, donde la tendenciaen el error es

evidente.Quedó patenteque con la cinéticapotencial 1 se obteníancurvas con forma

descendentey no la curvasigmoidalquepresentanestasfuncionesf(C,) paracinéticastipo

hiperbólicoy potencial2.

Parala reacción2 (r2), correspondientea la velocidadde formaciónde aminoácidos

no formadoresdebases,sólo presenteen la simplificación2 (MCC-2), seha mostradoque

los resultadosmejoreshan sido los obtenidospara la cinéticapotencial 1, presentándose

valores estadísticosde los parámetrossignificativamentemejoresque con la cinética

potencial2. En cuantoa la formapresentadapor las curvasen comparacióna la función, se

observaclaramenteel mejorresultadode laecuaciónpotencial1, tantoen las figurasen las

que la aparecer2 integradacomo en las que apareceen diferencial, siendomás clara la

diferenciaen esteúltimo caso.

Se va a procederahora a realizar el ajuste en múltiple respuesta,empleando

regresiónno lineal paracadauna de las simplificaciones(MCC-1 y MCC-2) y probando

las cinéticasobtenidasen simple respuestaen esteapartado,con el fin de continuarcon la

discriminacióny llegaraobtenermodelocinéticode célulamásadecuado.

305

Modelo Cinético de Célula

6.2.3- Obtención de Parámetros por Ajuste en Múltiple Respuesta

El ajustede los datos experimentalesal modelocinéticode célulaha sido realizado

empleandoregresiónno lineal en múltiple-respuestaparacadauna de las simplificaciones

propuestasen el apartadoanterior. Se va a probar cada una de las ecuacionescinéticas

paralas velocidadesde reacciónque han resultadoconvenientesen el apartadoanterior,y

paralas dossimplificacionessupuestas,estoesparaMCC-1 y MCC-2.

Ajuste en Múltiple Respuestaparala Simplificación1 (MCC-1)

Las velocidadesde producciónde este modelo, como ya fue visto en apartados

anteriores,vienendadaspor las expresionesindicadasen las ecuacionesde la [6.27] a la

[6.30].

Las ecuacionescinéticasa probaren primer lugar seránlas de tipo potencial2, de

acuerdoa lo visto en el apartadoanteriory vienendadaspor las siguientesexpresiones:

A, C,- - CV [6.39]

= A,’ - [6.40]

El modelo MCC-1, considera3 respuestas(RNA, DNA y proteínaintracelular)y tres

parámetros(kí, k,’, k5).

Los parámetrosobtenidos, por ajuste al MCC-1 con cinéticas dadas por las

ecuaciones[6.39] a [6.41], para el experimenton0 1 realizadoa 250C y 257 p.p.m.,

cumplenlas restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.36),si bienpresentanun valorde

SRC (sumade residuosal cuadrado)relativamentealto, indicativo de que la reproducción

de datosexperimentalesespoco aceptable,tal como puedecomprobarse,a la vista de la

evoluciónde componentes,en la Figura6.27.

El ajustedel experimenton0 2 (280C y 257 p.p.m.)al MCC-1 permite la obtención

de los parámetrosque seindican en la Tabla6.3 7. Los parámetrosobtenidospor ajusteal

MCC-1 con las cinéticaspotenciales,superanlos valoresteóricosde la t de Studenty la E

306

ModeloCinéticode Célula

de Fischer. El valor de la sumade residuosal cuadrado,indicativo de la calidad de la

reproducciónestambiénun valor elevado,lo cualescorroboradopor la malareproducción

de los datosdel experimentorealizadoen estascondiciones,tal como indica la Figura

6.28.

Losparámetrosobtenidosparael experimenton<’ 3 realizadoa 310C y 257 p.p.¡n.,

de nuevo cumplen las restricciones estadísticas impuestas (Tabla 6.38), pero la

reproducciónde los datosexperimentales(Figura6.29)no esbuena.

Para el experimentorealizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial (experimento

no 4). los valoresfisicos y estadísticosde los parámetrossemuestranen la Tabla 6.39,

dondeseapreciaque secumplenlas condicionesestadísticasteóricas,y en la Figura6.30

muestra,a diferenciade los experimentosanterioresunabuenareproducción

El ajusterealizadoal MCC-1 con cinéticaspotencialespara el experimenton0 5

realizado a 28C y 65 p.p.m., muestraque los parámetrosobtenidos cumplen las

restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.40), si bien el valor de SRC (sumade

residuosal cuadrado)es significativamenteelevado,por lo que no seobtiene una buena

reproducciónde los datosexperimentales,tal comomuestrala Figura6.31.

Parael experimenton0 6, realizadoa 280C y 130 p.p.m., los parámetrosobtenidos

cumplenlas condicionesestadísticas,como semuestraen la Tabla 6.41, en cambio, es

incapaz de reproducir de forma adecuada los datos experimentales obtenidos, tal como

muestra la Figura 6.32.

Los parámetrosobtenidospor ajusteal MCC-1 con cinéticaspotenciales para el

experimenton0 7 realizadoa 28C y 475 p.p.m., tambiéncumplen las restricciones

estadísticasimpuestas(Tabla6.42)pero no pennitenunabuenareproducciónde los datos

experimentales,tal como muestralaFigura6.33.

307

ModeloCinético de (Álula

Tabla 6.36.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 1.Condiciones experimentales:T=250 C, CN~=25I p.p.m de amonio, Nvariable(210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-1.

ParámetroValores de los parametros

t Student F FischerMáx Ópt Mm

0,129 0,129 0,129 l,i.i03

377,20,169 0,149 0,129 7,l.l0~

y 0,714 0,706 0,697 2,3.102de Student(95%confianzar 2,080

E de Fischer(95% deconfianzaft2,49SRC=4.3

• AnuloA RNá7O

• Iixx~a

A—’ •~

u

¡

•u ,‘

a

• 0000

uO,Q~7

~ •~•• 50 ~

e. a- ¡

0 10 20 30

o

~AAA A

1~~~ ~

40 50 60

t (ti)

Figura 6.27.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 1 (250C y 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-1.

308

‘.5

1,0u

Modelo Cinéticode Célula

Tabla 6.37.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.Condiciones experimentales:Th280 C, CN257 p.p.m de amonio, N=variable(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.

1~

Figura 6.28.- Evoluciones de los componentesexperimenton0 2 (280Cy 257 p.p.m.

del sistema obtenidos por ajuste deldeamonioinicial) al modeloMCC-1.

t de Student ( 95% confianza~2,080F de Fischer ( 95%de confianzar 2,49

t(h)

309

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.38.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datosCondiciones experimentales: Th310 U, CN=257variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.

del experimento n0 3.p.p.ni de amonio, N

ParametroValores de los parámetros

t Student F F¡scherMáx Ópt Mm

0,098 0,088 0,078 1,1.102

573,250,014 0,012 0,010 5,i.i03

0,317 0,315 0,313 l,3.10~de Student( 95% confianzaft2,080

E deFischer( 95% dc confianzat2,49

Figura 6.29.- Evoluciones de los componentedel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 3 (310Cy 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-!.

310

SRC=1,05

(12

O lO 20 30 40

1(h)

Modelo Cinéticode Célula

Tabla 6.39.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 4.Condiciones experimentales:T340 C, CN=257 p.p.m de amonio, N=variable(216r.p.m.inicial), al modeloMCCI.

ParámetroValores de los parametros

t Student F FiscberMix Ópt Mm

0,226 0,176 0.126 3,1.l0~

~7,1.10 361,5k3 0,255 0,247 0,239

0,0759 0,0759 0,0759 2,3.10~-deStudent(95%confianza»2,080

FdeFischer(95% de confianza)=2,49

1,2

Lo

1QS

QÓ

Q4 -

00

t(b)

Figura 6.30.- Evoluciones de los componentedel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton

0 4 (340Cy 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-1.

311

SRC=0,85

O lO 20 30 40 50

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.40.- Parámetroscalculadospor ajuste de losCondicionesexperimentales:T280 C, CN=65(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.

datos del experimento n0 5.p.p.m de amonio,N variable

ParámetroValores de los parámetros

t Student F FiseherMáx Ópt Mm

0,580 0,577 0,574 3,1.10~

92,330,818 0,804 0,790 7,1.10~

1,375 1,375 1,375 2,3.102de Student( 95% confianza»2,080

F de Fischer(95% deconfianza»2,49

0,8

04-

(12—

00O

u •~. u• AmiioA RN~

y DN~o• l1r~a

o

• <

A~A A

- -v• A

lo 20 30

t(li)40 50

SRC=4,11

60

au

Figura 6.31.- Evoluciones de los componentedel sistema obtenidos por ajuste delexperimento n0 5 (28 oc y 65 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-1.

312

1

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.41.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0Condiciones experimentales:Th280 U, CN=l30 p.p.m de amonio,variable(210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-1.

6.

1Parámetro

Valores de los parámetrost Student F Fiseher

Máx Ópt Mío

0,286 0,23 0,174 8,1.10

723,750,326 0,324 0,322 2,l.10~

Y 0,761 0,761 0,761 5,9.10~deStudent(95% conflanzay2,O&O

F de Eischer( 95% deconfianza»2,49

i

¡

SRC=0,92

60

Figura 6.32.- Evoluciones de los componentedel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 6 (28 ocy 130 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-!.

313

0 10 20 30 40 50

t (h)

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.42.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimenton0 7.Condiciones experimentales:T280 C, CN=475 p.p.ni de amonio, Nvariable (210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-1.

ParámetroValores de los parametros

1 Student F FiseherMáx Ópt Mm

0.052 0,0414 0,030 1,1.102

382,150,057 0,054 - 0,051 7,l.10~

Y 0,294 0,294 0,294 1,9.l0~de Student (95% confianza»2,080

E de Fischer ( 95% de confianza»2,49

1

t (h)

Figura 6.33.- Evoluciones de los componentedel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 7 (28 ocy 475 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-!.

314

SRC=0,62

25

O lO 20 30 40 50

ModeloCinéticode Célula

De todo lo visto en este apartado,podemosconcluir que, en vista de los resultados

obtenidoscon MCC- 1 en múltiple respuesta,no se ha conseguidoun buenresultadoen el

ajuste de los datos de los experimentosrealizados,si bien hay algún experimento

(experimenton0 5), donde se ve una buena reproducciónde las evolucionesde los

componentesdel sistema.

Aunqueen todos los casosse superanlos valoresteóricosde la t de Studenty de la

E de Fischer,encasi todos los ajustesel valor de SRC (sumade residuosal cuadrado)ha

sido significativamenteelevado,lo cual indica la mala calidadde la reproducciónde los

datosexperimentalescon elMCC-1.

Como ya sevió en apartadosanteriores,los criteriosestadísticospuedensuponeruna

forma de discriminarentremodelos.Por lo que se puededescartarel modelo MCC- 1, de

acuerdoa estecriterio.

A pesarde quelos resultadosestadísticosdel ajustede las reaccionesindividualesal

aplicar simple respuestaeranindicativos de que el MCC-l era un modelo, en principio,

adecuadopara la descripcióndel sistema,no esasí cuandose aplica estasuposiciónen

múltiple respuesta,por lo que, en adelanteya no se consideraráestasimplificación y se

tendráen cuentasólo la simplificación 2 (MMC-2), que, comoseverá, es la que mejor

resultadopermiteobtenerparala reproducciónde los datosexperimentalesdel crecimiento

de Xánthomonascan-ipestris.

AjusteenMúltiple Respuestaparala Simplificación2 (MCC-2)

Las velocidadesde producciónde estemodelo, como ya fue visto en apartados

anteriores,vienen dadaspor las expresionesindicadasen las ecuaciones[6.26] para el

amonio, [6.28] parael RNA, [6.29] parael DNA y [6.30]paralas proteínasintracelulares,

El modelo MCC-2 considera4 respuestas(RNA, DNA, proteína intracelulary

amonio),pero el númerode parámetrosdependede la cinética que se pruebeparacada

reacción,puessepueden considerarecuacionescinéticashiperbólicasen algunasde las

reaccionesdel modelo(2 parámetros)y cinéticaspotenciales(1 parámetro).

31~5

Modelo Cinético ¿le Célula

Comoya se ha comentado—y seva a exponera continuación-el modelo MCC-2 es

el que mejor resultadoestadísticoproporciona,pero se debellegar a la discriminación

entre los modeloscinéticosgeneradosal teneren cuentadiferentesecuacionescinéticas,

mediantealgunode los criterioscomentadosanteriormente.

Ya semostróque la ecuacióncinéticacorrespondientea la velocidadde aminoácidos

formadoresde bases,r2, respondíaa unacinéticapotencial1, mientrasque la velocidadde

reacciónparaaminoácidosno formadoresde bases(rj), y las velocidadescorrespondientes

a la formación de RNA (y3) y de formación de DNA (rs), podrían respondertanto a

cinéticashiperbólicascomopotencialesdel tipo quedenominamospotencial2.

De la combinaciónde estascinéticas, en las reaccionesr1, r,’ y r5, se pueden

considerar,teniendoen cuentala simplificación2, cuatromodelos:

• MCC-3, suponey1, r3, r5 comoecuacionespotenciales2 yr2potencial1.

• MCC-4 suponer1, r3, r5 como ecuacioneshiperbólicasy r2 potencial1.

• MCC-5 suponepara r1 cinéticapotencial2; para r3, r5 cinéticashiperbólicasy r2

potencial 1.

• MCC-6 suponeparar1 cinéticahiperbólica;parar,’, r5 cinéticaspotenciales2 y r2

potencial1.

• MCC-3

En estecaso,el modelo MCC-3, se consideran4 respuestasy 4 parámetros.El ajuste

esrealizadoempleandoregresiónno lineal en múltiple respuestade la forma ya indicada.

Los resultadosdel ajustea estemodelosemuestrana continuación.

Los parámetrosfísicos y estadísticosobtenidos por ajuste al MCC-3, para el

experimentoni (250C y 257 p.p.m.deamonio),semuestranen la Tabla6.43,dondese

puedeobservarque sesuperanlos valoresteóricosde la t de Studenty E de la Fischercon

un 95~~ de confianza.Además, en la Figura 6.34 se representanlas evolucionesde los

componentesdel sistema,tanto los valoresteóricoscomolos reproducidospor el MCC-3,

pudiendoapreciarseel buenajusteentreambos.

El ajustedel experimenton0 2 (280C y 257 p.p.m.)al MCC-3 permitela obtención

de los parámetrosque se indican en la Tabla6.44. Los parámetrosobtenidospor ajusteal

316

ModeloCinéticode Célula

modelo superanlos valoresteóricosde la t de Studenty la F de Fiseherreproduciendode

formaadecuadalos datosdel experimentorealizadoen estascondiciones,tal como indica

la Figura6.35.

Los parámetrosobtenidosparael experimenton0 3 realizado a 310C y 257 p.p.m.,

tambiéncumplen las restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.45), permitiendo,de

nuevo,unabuenareproducciónde los datosexperimentales,como muestralaFigura6.36.

Parael experimentorealizadoa 340C y 257 p.pan.de amonio inicial (experimento

n0 4), los valoresfísicos y estadísticosde los parámetrossemuestranen la Tabla 6.46,

dondeseapreciaque los valoresteóricosde t de Studenty F de Fischersonsuperadosen

todos los casos, y la Figura 6.37 muestra la buena reproducción de los datos

experimentalesobtenidosparaesteexperimentoconel MCC-3.

El ajustede los datosexperñnentalesal MCC-3 con las cinéticasprobadasen esta

caso parael experimenton0 5 realizadoa 28C y 65 p.p.m.,muestraque los parámetros

obtenidos cumplen las restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.47) pero no se

consigueuna buenareproducciónde los datosexperimentales,tal como muestrala Figura

6.38,probablementedebidoa que,en esteexperimento,la estequjometriasupuestano debe

serciertaen estecaso.

El ajuste del experimenton 6, realizado a 28C y 130 p.p.m., muestraque los

parámetrosobtenidoscumplenlas condicionesestadísticasteóricas,como semuestraen la

Tabla6.48, y reproducede formaadecuadala evoluciónde los componentesdel sistema

conelMCC-3, tal como indica la Figura6.39.

Los parámetros obtenidos por ajuste al MCC-3 paraelexperimenton0 7 realizadoa

280C y 475 p.pan., de nuevo cumplen las restricciones estadísticasimpuestas (Tabla

6.49); la reproducciónde los datosesaceptable,como indica la Figura 6.40, si bien es

significativamentepeor que la obtenidaen el testo de experimentos,con los que seha

logrado reproducirperfectamentela evolución de cadauno de los componentes.Esto

podría ser debido a que la concentraciónde amonio es tan elevadaque podría estar

produciendoun ciertoefectotóxico en las células,por lo que existiríaunacierta inhibición

del crecimiento del microorganismo.

317

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.43.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 1.Condiciones experimentales:Th250 C, Crc257 p.p.m de amonio, Nvariable(210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-3.

ParámetroValores de los parametros

t Siudent ¡ F FiseherMix Ópt Mm

0,577 0,547 ¡ 0,517 2,2.l0~

1823,10,162 0,151 0,140 i,i.í03

0,234 0,225 0,216 1,2.l0~

0,040 0,035 0,030 3,2.10~de Student( 95% confianza»2,080

E’ deFiseher( 95%deconfianza»2,49

-o

-tQ)

los componentesexperimenton0 1 (25 0C y257p.p.ni. de amonioinicial) al modeloMCC-3.

318

SRC=0,088

t (h)

Figura 6.34.- Evoluciones de del sistema obtenidos por ajuste del

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.44.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 2.Condiciones experimentales:T280 C, CN=257 p.p.m de amonio, Nvariable(210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-3.

ParámetroValores de los parámetros

t Stiident F FiseherMáx Ópt Mía

0,573 0,57 0,567 5,2.10~

2725,10,155 0,152 0,149 4,l.10~

0,200 0,199 0,197 2,2.10~

0,040 0,038 0,036 8,2.10~deStudent(95%confianza»2,080

F deFischer( 95% deconfianza»2,49

1(5

t(h)

Figura 6.35.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 2 (28 oc y 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-3.

319

SRC=0,060

60

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.45.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimenton0 3.Condiciones experimentales:Th310 C, C~~257 p.p.m de amonio, N=variable(210r.p.m. inicial), al modeloMCC-3.

ParámetroValoresde los parámetros

t Student F FiseherMix Ópt Mm

0.378 0,375 0,371 3,2.10~

3825,10,104 0,103 0,102 3.1.10~

0,148 0,147 0,146 1,2.l0~

0.054 0,052 0,050 5,2.l0~deStudent( 95% confianza»2,080

F de Fischer( 95% deconfianza»2,49

1,25

1,00

c

o

0,75

0,50

025

0,00

Figura 6.36.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 3 (31 ocy 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-3.

320

SRC=0,008

20

t (Ii)

Modelo Cinéticode Célula

Tabla 6.46.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 4.Condiciones experimentales:T340 C, CN257 p.p.m de amonio, N=variable(210r.p.m. inicial), al modeloMCC-3.

ParámetroValores de los parámetros

t Student F FiseherMáx Ópt Mm

0,229 0,221 0,213 2,2.l0~

3895,10,083 0,082 0,081 s,i.io40,112 0,112 0,112 8,2.10~

0,024 0,022 0,020 7,2.l0~de Student(95%confianza»2,080

Fde Fiseher( 95% deconfianza»2,49

nEe3

SRC=0,031

Figura 6.37.- Evoluciones deexperimenton0 4

los componentesdel sistema obtenidos por ajuste del(340C y 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-3.

321

t (h)

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.47.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 5.Condicionesexperimentales: Th280 C, C~’65 p.p.m de amonio,N variable(210r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.

ParámetroValores de los parámetros

t Student F FiseherMáx ópt Mm

0,614 0,610 0.606 2,2.l0~

325,10,185 0,182 0,178 5,1.10’

Y 0,206 0.202 0.198 3,2.l0~

0,066 0,065 0.064 7,2.l0~de Student (95% confianza»2,080

F de Fischer( 95% deconfianza» 2,49 SRC=1,89

15u

30

t(h)Figura 6.38.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste del

experimenton0 5 (28oc y 65 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-3.

322

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.48.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 6.Condiciones experimentales:T280 C, CNl3O p.p.m de amonio, Nvariable(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.

ParámetroValoresde los parámetros

t Student - F FiseherMáx Opt Mm

0,591 0,571 0,551 2,2.l0~

986,20,141 0,141 0,141 í,í.ío4Y 0,195 0,195 0,195 1,2.lO~

0,042 0,039 0,035 3,2.102tdeStudent(95%confianza»2,080F de Fischer( 95% de confianza»2,49

E

1~

Figura 6.30.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 6 (28 0Cy 130 p.p.m.deamonio inicial) al modeloMCC-3.

323

SRC=0,75

t (h)60

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.49.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimenton0 ‘7.Condicionesexperimentales:T280 C, Ge475 p.p.m de amonio, N=variable<210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-3.

Paré metroValores de los parametros

t Student F FischerMáx Ópt Mm

0,613 0,610 0,607 2,2.102

295,10,184 0,182 0,180 s,í.ío~

0,212 0,202 0,192 3,2.10~

7.2.l0~0,067 0.065 0,062de Student ( 95% confianza» 2,080

E de Fischer( 95% de confianza»2,49

Ee

o2)

SRC=0,75

Figura 6.40.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modeloMCC-3.

324

t (h)

Modelo Cinéticode Célula

• MCC-4

En estecaso,el modeloconsidera4 respuestasy 7 parámetros,debidoa las cinéticas

supuestasen cadavelocidadreacción,esdecir las reaccionesr1, it3 y r5. que se consideran

hiperbólicas,mientrasque la r2 seconsiderapotencial1, comoen los modelosanteriores.

El ajuste es realizadoempleandoregresiónno lineal en múltiple respuesta.Los

resultadosdel ajusteaestemodelo(MCC-4) semuestrana continuación.

El ajustedel experimento n0 1 (250C y 257 p.p.m.)al MCC-4 permitela obtención

de los parámetrosque se indican en la Tabla 6.50. Los parámetrosobtenidospor ajusteal

modelo superanlos valoresteóricosde la t de Studenty la F de Fischerreproduciendode

forma adecuadalos datosdel experimentorealizadoen estascondiciones,tal como indica

la Figura 6.41.

Los parámetrosfisicos y estadísticos,obtenidos por ajuste al MCC-4 para el

experimenton0 2 (280C y 257 p.p.m. de amonio),se muestranen la Tabla6.5 1, dondese

puedeobservarque sesuperanlos valoresteóricosde tía Studenty de la F de Fisclier con

un 950o de confianza.Ademásen la Figura 6.42 se representanlas evolucionesde los

componentesdel sistema,tanto los valoresteóricoscomo los reproducidosporel MCC-4,

mostrándoseel buenajusteentreambos.

Parael experimentorealizadoa 310C y 257 p.p.m.de amonio inicial (experimento

n0 3), los valoresfisicos y estadísticosde los parámetrosse muestranen la Tabla 6.52,

dondese apreciaque los valoresteóricosde t de Studenty F de Fisclier son superadosen

todos los casos, y la Figura 6.43 muestra la buena reproducción de los datos

experimentalesobtenidosparaesteexperimentocon el MCC-4.

Los parámetrosobtenidosparael experimenton0 4 realizadoa 340C y 257 p.p.m.,

cumplen las restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.53),permitiendo,tambiénuna

buenareproducciónde los datosexperimentales,comomuestrala Figura6.44.

325

Moú cío Cinético de Célula

Los parámetrosobtenidospor ajusteal MCC-4 con las cinéticasprobadasen esta

caso para el experimenton0 5 realizadoa 280C y 65 p.p.m., también cumplen las

restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla6.54)pero no permitenuna buenareproducción

de los datosexperimentales,tal comoocurríacon el modelo anteriora éste,y se muestra

en la Figura6.45.

Parael experimenton0 6, realizadoa 280C y 130 p.p.m., Los parámetrosobtenidos

cumplen las condicionesestadísticasteóricas, como se puede ver en la Tabla 6.55, y

reproducede formaadecuadala evoluciónde los componentesdel sistemacon el MCC-4,

tal corno indica la Figura 6.46.

Los parámetrosobtenidosporajusteal MCC-4 parael experimenton0 7, realizadoa

280C y 475 p.p.m., cumplen las restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.56) y la

reproducciónde datoses aceptable(Figura 6.47), como ocurríaen el caso anterior,pero

peorque si se comparacon el restode los experimentos,lo que parececonfirmar el efecto

tóxico del amonio aelevadasconcentraciones,antescomentado.

326

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.50.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datosCondiciones experimentales:T250 C, CN~2S7variable (210r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.

del experimentop.p.nl

ParámetroValores de los parámetros

t Student F FiseherMáx Ópt Mm

- 0,11 - 3,1.1O~

2225,3

0,005 0,005 0,005 7,8.l0~

0,045 0,044 0,043 7,1.10~

0,049 0,048 0,047 6,2.10~

- 0,076 - 2,3.10~

0,0802 0,0801 0,080 5.102

- 0,05 - 5,23.10~deStudent(95%confianzat2,12

F de Fiscber( 95%deconfianza>’2,66

1,75

1,50

1,25

e

o

1,00

0,75

0,50

025

0,00

SRC=’ 0,091

Figura 6.41.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 1(25oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.

327

on 1.de amonio, N

t (Ii)

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.51.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimentou0 2.Condiciones experimentales:T280 C, CN=257 p.p.m de amonio, Nvariable (210 r.p.m. inicial) al MCC-4.

Parán etroValoresde los parámetros

t Student F FiseherMix Ópt Mm

- 0,10 - 9,2.10~

3825,3

0,133 0,131 0,128 8,8.i03

0,203 0,203 0,203 l,i.i04

0,047 0,049 0,048 4,2.10~

- 0,039 - 1,12.102

0,12 0,112 0,10 2.119

0,054 2.23.102de Student(95%confianza>’2,12

F de Fischer(95%deconfianza>’2,66

u

t (h)

SRC= 0,055

Figura 6.42.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste delexperimentono 2 (28oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4..

328

60

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.52.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 3.Condiciones experimentales:T310 C, C,~257 p.p.m de amonio, Nvariable (210r.p.m. inicial), al modeloMCC-4.

ParámetroValores de los parámetros

t Student F FiseherMáx Ópt Mm

- 0,102 - s,i.io~

14825,3

0,069 0,069 0,069 6,8.10~

0,022 0,022 0,022 2,l.10~

0,475 0,0513 0,0511 7,2.10~

- 0,0411 - 1,5.l0~

0,11 0,11 0,11 6.2.10~

- 0,113 - 5,23.10~deStudent( 95%confianza>’2,080

Fde Fischer(95% deconfianza>’2,49

1,25

1,00

¡8

0,75

0,50

0,25

0,00

t (h)

SRC= 0,0045

Figura6.43.-Evoluciónde los componentesdel sistemaobtenidosporajustedel experimenton0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonioinicial) al modeloMCC-4.

329

40

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.53.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 4.Condiciones experimentales:T340 C, CN257 p.p.m de amonio, Nvariable(210r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.

ParámetroValores de los parámetros

t Student F FiseherMáx Ópt Mm

- 0,106 - 3,1.1O~

1131.3

0.002 0,002 0,002 2,8.l0~

0,036 0,036 0,036 í,i.ío4

0,0503 0,0502 0,0501 2.2.10~

0,0542 0,0541 0,054 4,2.l0~

- 0,058 - 8.23.10~de Student ( 95% confianza>’ 2,12 SRC= 0,061E de Fiseher ( 95% de confianza>’ 2,66

‘75

1,50

.25

u

1,00

0,75

0,50

0,25

0,00O lO 20 30 40

t(h)

Figura 6.44.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 4 (34 0C y 257p.p.m.de amonio inicial) al modeloMCC-4..

330

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.54.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 5.Condicionesexperimentales:T2S0 C, CN65 p.p.m de amonio, N= variable(210r.p.m. inicial), al modeloMCC-4.

ParámetroValoresde los parámetros

t Student F FiseherMáx Ópt Mm

0,133 0,131 0,129 3,1.102

135,3

0,112 0,11 0,11 2,8.10~

0,029 0,026 0,023 1,1.10~

- 0,037 - 2,2.102

0,0479 0,0478 0,0477 4,2. ío3

0,099 0,099 0,099 5,1.10~

0,07 0,07 0,07 8,2.102de Student(95%confianza»2,179

E de Fischer( 95% deconfianza»2,70

fi

e!

Figura6.45.- Evoluciónde los componentesdel sistemaobtenidosporajustedel experimenton0 5 (28 0C y 65 p.p.n¡. de amonio inicial) al modeloMCC-4..

33’

SI4C=2,18

30

t (ti)

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.55.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento u0 6.Condiciones experimentales:Th280 C, C\130 p.n.m de amonio, N=variable (210r.p.m. inicial), a] modelo MCC-4.

ParámetroValores de los parámetros

t Student ¡ F Fischer

Máx ÓptM

Mm

0,152 0,150 0,148 3,1.10

1925,3

0,090 0,089 0,088 7,g•J93

0,029 0,029 0,029 7,1.l0~

0,039 0,035 0,033 6,2.l0~

0,06 0,06 0,06 2,3.10~

0,083 0,080 0,077 3.102

- 0,05 - 5,23.10~deStudent( 95% confianza»2,179 SRC= 0,52

60

E deFischer( 95% deconfianza»2,70

o

Figura 6.46.-

30

t (ti)

Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimento n0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.

332

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.56.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 7.Condicionesexperimentales:T280 C, C,r475 p.p.m de amonio,N= variable(210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-4.

ParámetroValores de los parametros

t Student F FiseherMáx Ópt Mm

0,130 0,130 0,130 3,1.10~

185,3

0,112 0,11 0,10 2,8.10~

0,026 0,026 0,026 i,1.104

0,037 0,037 0,037 2,2.10~

0,0478 0,0478 0,0478 4,2.10~

Kl5 0,100 0,099 0,098 5,i.i0

4

- 0,07 - 8,23.10~deStudent(95%confianza>’2,12

Fde Fischer(95% deconfianza»2,66

1

SRC= 0,95

Figura 6.47.- Evolucionesexperimento n0

t(h)

de los componentes7(280C y 475 p.p.m.

del sistema obtenidos por ajuste deldeamonioinicial) al modeloMCC-4.

333

1,75

Modelo Cinético de Célula

• MCC-5

Ya se hacomentadoque, debido a que podíanserempleadastanto las ecuaciones

cinéticaspotencialescomohiperbólicasen las velocidadesde reacciónparaproteínas(rí),

paraRNA (r3) y para DNA (r5), se han realizadoajustesconcinéticapotencialesen estas

tresreacciones(MCCI) y concinéticashiperbólicas(MCC-4). Se va a procederahoraa

realizaruna combinaciónde estascinéticasen estasreacciones,de formaque puedenser

planteadosdosmodelosmás,tal comoseha indicadoanteriormente.

En esteapartadose analizael modeloMCC-5, dondese suponecinéticahiperbólica

parala reacciónr1 y potencial2 para las correspondientesa ácidosnucleicos,estoespara

RNA y paraDNA. Paraestasúltimas, sehacela misma suposiciónpueses lógico pensar

que las velocidades de reacción de estos dos componentesestén estrechamente

relacionadas,esdecirrespondanal mismo tipo de cinética.

El modelo considera,al igual que en los dos casosanteriores,4 respuestas,pero

constade 5 parámetros.El ajusteesrealizadoempleandoregresiónno lineal en múltiple

respuesta.Los resultadosdelajusteaestemodelo(MCC-5) semuestranacontinuación.

En este caso no se va a considerarel experimenton0 5 (28C, 65 p.p.m. de

amonio), puescomo ya seha visto no se obtienenbuenasreproduccionesde los datos

experimentalescon ningunode los modelosanteriores,debido,probablemente,a que la

estequiometríasupuestano esválidaparaestaconcentracióntanbajade amonio.

El ajustedel experimenton0 1 (250C y 257 p.p.nt) al MCC-5 permite la obtención

de los parámetrosque seindicanen la Tabla 6.57. Los parámetrosobtenidosporajusteal

modelo superanlos valoresteóricosde la t de Studenty la F de Fischerobteniéndoseuna

adecuadareproducciónde los datosexperimentales(Figura 6.48),muy similar a los dos

modelosanteriores(MCC-3 y MCC-4).

Los parámetrosfisicos y estadísticosobtenidos por ajuste al MCC-5 para el

experimenton02 (280C y 257 p.p.m. de amonio),se muestranen la Tabla6.58, dondese

puedeobservarque sesuperanlos valoresteóricosde t de Studenty F de Fischercon un

95% de confianza.Además,en la Figura 6.49 seobservala buenareproducciónobtenida

conel modelo MCC-5 con los datosexperimentales.

334

ModeloCinéticode Célula

Los parámetrosobtenidosparael experimenton0 3 realizadoa 310C y 257 p.p.m.,

cumplenlas restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.59), pennitiendo,tambiénuna

buenareproducciónde los datosexperimentales,como muestrala Figura6.50.

Parael experimentorealizadoa3QCy 257 p.p.m. de amonio inicial (experimento

no 4), los valorestisicos y estadísticosde los parámetrossemuestranen la Tabla 6.60,

donde se apreciaque los valores teóricos de la t de Studenty de la F de Fischer son

superadosen todos los casos, y en la Figura 6.5 1, se aprecia también la buena

reproducciónde los datosexperimentalesobtenidosparaesteexperimentoconel MCC-5.

Para el experimento n0 6, realizadoa 280C y 130 p.p.ni., sepuedeobservarquelos

parámetrosobtenidoscumplenlas condicionesestadísticasteóricas(Tabla6.61). El MCC-

5 permite,tambiénparaesteexperimento,la reproducciónde formaadecuadalos datosde

esteexperimento,tal como indica la Figura6.52.

Los parámetrosobtenidosporajustealMCC-5 parael experimento n0 7 realizadoa

280C y 475 p.p.m., cumplen las restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.62) la

reproducciónesaceptable(Figura6.53), como ocurríaen el caso anterior,pero peor si la

comparamoscon el resto de experimentos,lo que parececonfirmar el ya citado efecto

tóxico delamonioaelevadasconcentraciones.

335

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.57.- Parámetroscalculados por ajuste de los datosCondiciones experimentales:T250 C, CN=2S7variable (210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-S.

del experimento n0 1.p.p.m de amonio, N

ParámetroValores de los parametros

t Student 1? FiseherMáx Ópt Mío

0,101 0,101 0,101 3,l.l0~

1525.3

0,02 0,02 0,02 4,2.l0~

0,189 0,189 0,189 í,í.ío5

Y 0,200 0,200 0,200 l,12.l0~

- 0,048 - 5,23.l0~de Student ( 95% confianza>’2,13

Fde Fischer( 95%deconfianza»2,60

1,75

1,50

1,25

-4

eu

11)0

0,75

0,50

0,25

0,00

Figura 6.48.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimento n0 1 (250C y 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-5.

336

SRC= 0,15

t (ti)

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.58.- Parámetroscalculadospor ajusteCondiciones experimentales:T=280variable (210 r.p.m. inicial) al modelo

de los datosC, C~=257MCC-5.

del experimento n0 2.p.p.m de amonio, N=

ParámetroValores de los parámetros

t Student F FiseherMix Ópt Mm

0,102 0,102 0,102 2,2.10~

2325,3

0,183 0,182 0,181

0,080 0,080 0,080 3,1.l0~

0,119 0,119 0,119 2,12.l0~

0,0384 0,0382 0,0300 8,23.l0~deStudent(95%confianza>’2,131

E de Fischer( 95%deconfianza»2,60

8

SRC=0,102

Figura 6.49.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimento n0 2 (280C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modeloMCC-5.

337

t (ti)

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.59.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 3.Condiciones experimentales:T=310 C, CN=257 p.pan de amonio, Nvariable (210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.

ParámetroValores de los parametros

t Student F FiseherMáx Ópt Mm

0,080 0.080 0,080 9,l.1O~

3985,3

‘ffi

0,0640 0,0639 0,0638 5,3.l0~

0,119 0,119 0,119 2,1.lO~

0,1702 0,1701 0,1700 3.I2.10~

- 0,0949 - l,23.10~deStudent(95%confianza>’2,12

E de Fischer(95% deconfianza>’2,85

.4

u

SRC= 0,010

Figura 6.50.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 3 (31 ocy 257 p.p.m. de amonioinicial) al modeloMCC-5..

338

20

t (ti)

40

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.60.- Paranietroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 4.Condiciones experimentales:Th340 C, CN=257 p.p.m de amonio, Nvariable (210 r.p.m. inicial) al modeloMCC-5.

ParámetroValores de los parámetros

t Student 1’ FiseherMáx Ópt Mm

0,10 0,10 0,10 5,l.i05

2112,8

0,0459 0,0458 0,0457 8,3.10~

0,113 0,113 0,113 9,1.10~

0,16 0,16 0,16 7,2.10~

0,0775 0,0773 0,0772 4,23.10~

de Student( 95%confianza»2,080Fde Fischer(95%deconfianza»2,49

1,75

1,50

1,25

E

1~1,00

0,75

0,50

0,25

0,00

L

Figura 6.51.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidospor ajuste delexperimentono 4 (34 C y 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-5..

339

SRC=0,12

t (ti)

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.61.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 6.Condiciones experimentales:T280 C, CN=13O p.p.m de amonio, N=variable(210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.

ParámetroValores de los parámetros

t Student ¡ F FischerMáx Ópt Mm

0,105 0,10 0,095 3,l.l0~

1125,3

0,045 0,042 0,039 4,2.l0~ ¡

0,302 04302 0,302 i,i.ío~ ¡

0,440 0,440 0,440 l.12.l0~ ¡

0,0553 0,0553 0,0553 5,23.l0~de Student( 95% confianza»2,080

E de Eischer ( 95%de confianza»2,49

O.

0.50

025

O.’

SRC= 0,96

60

Figura 6.52.- Evoluciones de los componentesexperimenton0 6 (280C y 130 p.p.m.

del sistema obtenidos por ajuste deldeamonioinicial) al modeloMCC-5..

30

t (ti)

340

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.62.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos de] experimento n0 7.Condiciones experimentales:T=280 C, CN=475 p.p.m de amonio, N=variable(210 r.p.m. inicial) al modeloMCC-5.

ParámetroValores de los parámetros

t Student F FiseherMáx Ópt Mm

0,102 0,10 0,098 5,i.i03

211,8

Kl1 0,063 0,062 0,061 5,3.l0~

0,199 0,199 0,199 2,1.10~

0,201 0,200 0,199 3,2.10~

- 0,059 - 5,23.102deStudent(95%confianza>’2,12

F de Fiseher( 95% de confianza»2,85

1,75

1,50

1,25

E

1~1,00

0,75

0,50

0,25

0,00

SRC=1,2

t (ti)

Figura 6.53.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton

0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modeloMCC-5..

34’

ModeloCinético de Célula

• MCC-6

Este modelo constade 4 respuestas,y 6 parámetros,debido a que las cinéticas

supuestasenestecasoparacadareacciónsonunacinéticapotencial2 pararj, hiperbólicas

parar3 y r5, y la mismaque encasosanteriores,cinéticapotencial1, parar2.

El ajusteha sido realizadoempleandoregresiónno lineal en múltiple respuesta.Los

resultadosdel ajustea estemodelo(MCC-6) semuestranacontinuación

Los parámetrosfisicos y estadísticosobtenidos por ajuste al MCC-6 para el

experimenton01 (250(2 y 257 p.p.m. de amonio),semuestranen la Tabla6.63, dondese

puedeobservarque sesuperanlos valoresteóricosde la t de Studenty de la F de Fischer

con un 95%de confianza.Además,en la Figura6.54 serepresentanlas evolucionesde los

componentesdel sistema,tanto los valoresteóricoscomo los reproducidosporel MCC-6,

mostrándoseel buenajusteentreambos.

El ajustedel experimenton0 2 (280(2 y 257 p.p.m.)al MCC-6 permite la obtención

de los parámetrosque se indicanen la Tabla6.64. Los parámetrosobtenidospor ajusteal

modelo superanlos valoresteóricosde la t de Studenty la F de Fiseherobteniéndoseuna

adecuadareproducciónde los datosexperimentales(Figura 6.55),muy similar a los dos

modelosanteriores.

Los parámetrosobtenidosparaelexperimenton0 3 realizado a 310(2 y 257 p.p.mde

nuevo cumplenlas restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.65),permitiendotambién

unabuenareproducciónde los datosexperimentales,como muestrala Figura6.56.

Parael experimentorealizadoa 340(2 y 257 p.p.m. de amonio inicial (experimento

n0 4), los valoresfisicos y estadísticosde los parámetrosse muestranen la Tabla 6.66,

donde se apreciaque los valoresteóricosde la t de Studenty de la F de Fischerson

superadosen todos los casos,y la Figura6.57 muestrala buenareproducciónde los datos

experimentalesobtenidosparaesteexperimentoconel MCC-6.

342

ModeloCinéticode Célula

Parael experimento n0 6, realizado a 280(2 y 130 p.p.m.,los parámetrosobtenidos

porajustealMCC-6 sonmostradosen laTabla6.67, dondesepuedeapreciarquesuperan

los valoresteóricosde la t de Studenty de la F de Fischer.La reproducciónde los datos

experimentalesconel MCC-6 essignificativamentebuena,tal como indica la Figura6.58.

Los parámetrosobtenidosporajusteal MCC-6, paraelexperimenton0 7 realizadoa

280(2 y 475 p.p.m., cumplen las restriccionesestadísticasimpuestas (Tabla 6.68),

superandolos valores teóricos de la t de Student y F de Fischer, y obteniéndoseuna

reproducciónaceptablede los datosexperimentalesde esteexperimento(Figura6.59).

343

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.63.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 1.Condiciones experimentales:T250 (2, C~=257 p.p.m de amonio, N=variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-6.

ParámetroValores de los parámetros

t Student F FiseherMáx Ópt Mío

0,673 0,67 0,667 2,2.l0~

1921,3

0,0311 0,0311 0,0311 2,5.l0~

Kl3 0,045 0,045 0,045 3,2.l0~

0,0575 0.0572 0.0569 2,1.l0~

Kl5 0,085 0.085 0,085 9,3.l0~

- 0,044 - 7,23.102

de Student( 95%confianza»2,093E de Fiseher( 95% deconfianza»2,63

u

SRC=0,11

60

Figura 6.54.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimento n

0 1(250(2y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-6.

344

t (ti)

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.64.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 2.Condiciones experimentales:T280 (2, (2N’C57 p.p.ni de amonio, N=variable (210 r.p.m. inicial> al modelo M(2(2-6.

ParámetroValores de los parámetros

t Student F FiseherMix Ópt Mm

0,302 0,30 0,298 2,2.10~

1989,3

0,018 0,018 0,018 7,5Á0~

0.0502 0,05 0,05 l,2.10~

0,039 0,039 0,039 3,3.10~

0,11 0,11 0,11 5,3.l0~

0,078 0,076 0,074 5,3.102

deStudent(95%confianza»2,093E de Fiseher( 95% deconfianza»2,63

175

1.50

125

-4

E

u

1,00

0,75

0,50

0,25

0,00

SR(2= 0,095

O

Figura 6.55.- Evoluciones de

345

t (ti)

los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 2 (2S 0(2 y 257 p.p.m.de amonioinicial) al modeloM(2(2-6.

Modelo Cinético de Célula

Tabla 6.65.- Parámetros calculados por ajuste de los datos del experimenton0 3.Condiciones experimentales:T310 (2, CN=257 p.p.m de amonio, N=variable(210 r.p.m. inicial) al modeloM(2(2-6.

ParámetroValores de los parametros

t Student F FiseherMáx Ópt Mm

0,402 0,401 0.400 4,2.10~ ¡

3899,3

0,018 0,018 0,018 í,5.i04

0,051 0,051 0,051 5,2.10~

0,036 0,036 0,036 7.2.10~

0,11 0,11 0,11 6.3.10~

- 0,076 - 1,23.102deStudent( 95%confianza»2.101

F de Fisctier ( 95%deconfianza»2,66

1,75

1,50

1,25

E

u

1,00’

0,75

0,50

0,25

0,00

Figura 6.56.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 3 (31 0(2 y 257 p.p.m. deamonioinicial) al modeloMC(2-6..

346

SRC=0,005

t (ti)

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.66.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 4.Condiciones experimentales:T=340 (2, (2r~e2S7 p.p.m de amonio, Nvariable (210r.p.m. inicial) al modeloM(2(2-6.

ParámetroValores de los parametros

t Student F FiseberMáx Ópt Mm

0,54 0,53 0,52 3,2.l0~

3911,2

0,0173 0,0172 0,0171 2,7.10~

0,05 0,05 0,05 4,3.10~

0,0359 0,0359 0,0359 5,3.l0~

0,103 0,10 0,101 4,3.l0~

- 0,0604 - 9,23.l0~de Student ( 95% confianza>’2,01

E de Fisetier( 95%deconfianza»2,66

1u.

SR(2= 0,011

Figura 6.57.-t(b)

Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 4 (34 0(2 y 257 p.p.m.deamonioinicial) al modelo M(2C-6..

347

1,25

ModeloCinélico de Célula

Tabla 6.67.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 6.Condiciones experimentales:T280 (2, (2N=130 p.p.m de amonio, Nvariable(210 r.p.m. inicial) al modeloMC(2-6.

ParámetroValores de los parámetros

t Student F Fiseher

0,801 0,800 2,2.l0~

1399,3

0.0271 0,0270 2,5.l0~

0,042 0,042 3,2.l0~

0,054 0.054 0,054 2,.10~

0.079 0.079 0,079 9,3.l0~

0,036 0,035 0,034 7,23.102

de Student ( 95% confianza»2,086E de Fischer(95%deconfianza»2,60

1 flO

‘-4

u

0.75

0.50

025

ono

SRC=0,894

Figura 6.58.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 6 (280(2y 130 p.p.m.deamonioinicial) al modeloM(2(2-6..

t (ti)

348

M’odelo Cinéticode Célula

Tabla 6.68.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimentoCondiciones experimentales:T~’280 (2, (2N475 p.p.m de amonio,variable (210 r.p.m. inicial) al modelo M(2(2-6.

ParámetroValoresde los parámetros

t Student F FischerMix

O

Opt Mm

0,532 0,531 ¡ 0,530 3,2.I0~

611.2

0,017 0,017 0,017 2,7.10~

1(3 0,055 0,05 0,05 4,3.1O~

0,03595 0,0359 0,3585 5,3.10~

0,10 0,10 0,10 4,3.10~

- 0,0604 - 9,23.10~deStudent( 95%confianza>’2,080

E de Eisctier(95% deconfianza»2,49

13

1,50

1,25

ne

1,00

0,75

0,50

0,25

0,00

SR(2= 0,93

Figura 6.59.- Evolucionesexperimenton~

de los componentes7 (280(2y 475p.p.m.

del sistema obtenidos por ajuste deldeamonioinicial) al modelo M(2(2-6.

349

on 7.

t(h)

Modelo Cinético nc Célula

6.2.4. Discriminación entre ModelosCinéticos

En el apanadoanteriorsehan mostradolos ajustesde los datosexperimentalesa los

diferentesmodelospropuestosparael crecimientode la bacteriaXanthomonascampestris,a

continuación se va a tratar de seleccionarel modelo de acuerdo a los criterios antes

comentados.

6.2.4.1.CriteriosEstadísticos

Entre los dosesquemasde reacciónsimplificadospropuestos,que correspondena los

modelos MCC-l y MCC-2, se ha observadoque el primero no permite obteneruna

reproducciónde las velocidadesde producciónde los diferentescomponentesclave de los

distintosexperimentosrealizados,por lo cual el citado modeloha sido descartadosegúnun

criterio estadístico,considerandoque el valor de SRC essignificativamentealto, lo que se

traduceen una mala reproducciónde los datos experimentalesde todos los experimentos

ajustadosconel MCC- 1-

Para MCC-2. se plantearondiferentesposibilidadesen función de las ecuaciones

cinéticasprobadasen rl, r3 y r5. La velocidadr2, en todos los modelosha sido potencial1,

pues,como ya sevió, pareceser la única cinéticacon la que seobtienenparámetroscon

valoresestadísticosaceptables.

Así pues, se realizó el ajuste con distintas suposicionesen las cinéticasde estas

reacciones,tal como se ha indicado en el apanadoanterior. Se han propuestoasí cuatro

modelos,cuyasvelocidadesde produccióncorrespondena la indicadaparala simplificación

2 (MCC-2), perovariandolas cinéticasde las velocidadesde reaccióny efectuandodiversas

combinacionesentre ellas <MCC-3, MCC-4, MCC-5 y MCCÓ). Como se ha podido

apreciar, estos cuatro modelos permiten, para todos los experimentos,obtener unos

parámetroscon valores estadísticossignificativamentebuenos.En todos los casos, los

valoresestadísticosde los parámetrosobtenidossuperanlos valoresteóricosde F dc Fischer

y de t de Student, obteniéndoseen todos los casosunos intervalos de confianza muy

estrechos.Por otro lado, los valoresde SRC(sumade residuosal cuadrado)parecenser

3S0

ModeloCinéticode Célula

indicativos de las buenasreproduccionesque se han obtenido en todos los ajustes; no

obstante,puestoque este valor es una forma de medir la reproducibilidadde los datos

experimentales,se muestranen la Tabla 6.69 los distintosvaloresde SRC obtenidosen cada

uno de los experimentos,paralos cuatromodelos,con el fin de analizarsi estepuedeserun

criterio de discriminaciónentreellos.

Tabla 6. 69.- Valoresde SRC (sumade residuosal cuadrado)obtenidosen los ajustesadiferentesmodelosde célulaparacadauno de los experimentosrealizados.

Experimento Experimento Experimento Experimento Experimento Experimento

n”1 n02 n~3 n04 n06 n~7

MCC-3 0,088 0,060 0,008 0,030 0,075 0,750

MCC-4 0,091 0,055 0,005 0,061 0,520 0,950

MCC-5 0,150 0,102 0,010 0,120 0,960 1,200

MCC-6 0,110 0,095 0,005 0,011 0,894 0,930

Se puede observarque los valoresmás bajos de SRC, indicativos de un mejor

ajuste,seobtienenpara los modelosMCC-3 y MCC-4, cumpliéndoseesto paratodos los

experimentos,lo que podríasuponerun criterio aceptablepara discriminar respectoa los

otros dosmodelospropuestos(MCC-5 y MCC-6). Estosúltimos dan buenresultadodesde

un punto de vista estadístico,y además,permitenobteneruna buenareproducciónde los

datosexperimentales,no obstantesegúnel criterio de discriminaciónpor el valorde SRC se

podríandescartarrespectoa los otrosdos.

En comparaciónal modelo MCC-3, que tiene 4 parámetros,los modelosMCC-5 (5

parámetros)y MCC-6 (6 parámetros)ajustanpeor, estoes, se obtienenvaloresde la suma

de residuosal cuadrado(SRC) másaltosa pesarde tenerun mayornúmerode parámetros,

lo cual permite un mejor ajustedebido a que, desdeun punto de vista matemáticose le

proporcionaal sistemaun mayor gradode libertad, lo que deberíapermitiruna mejoraen el

ajuste,esdecirvaloresmenoresde SRC.

35’

ModeloCinético de Célula

Por otro lado, el modelo MCC-4 que posee Y parámetros,no presentavaloresde

SRC significativamenteinferiores a los obtenidoscon MCC-3, a pasarde que seríade

esperarun mejor ajustedebido a que estemodelo disponede más gradosde libertad. Los

valores de la suma de residuos al cuadrado,presentadosen la Tabla 6.69, son muy

semejantesentre ambosmodelos,solo se obtiene un valor inferior de SRC respectoal

modelo MCC-3 parael experimenton06, en el resto,son superioresa los presentadosporel

MCC-3.

En vista de esto, se podría discernir entre ambos modelosdecantándonospor el

MCC-3, no obstantey dado la similitud en los valoresde sumade residuosal cuadradose

van a compararlos cuatro modelosmediantecriterios físicos, por si estospudieranaportar

datosparallegar a unaconclusiónmásclara.

Como se comentóal principiode estecapítulo,un criterio físico de discriminaciónes

la evoluciónde los parámetroscon las variablesestudiadas

Es necesariocomentarqueel experimentorealizadocon 65 p.p.m.deamonioinicial,

no ha sido consideradocomoexperimentocomparativocon los demás. A pesarde obtener

valores estadísticosaceptablespara este experimento,la reproducción de los distintos

componentesdel sistemano ha sido buena,observándosevaloresde SRC significativamente

elevados.Esto, como ya ha sido comentadoa lo largo de la exposiciónde este apartado

pareceser debido a que la estequiometríasupuestano sería la adecuadaen el caso de

concentracionestan bajasde sustratonitrogenado.Al principio de este capítulo, se pudo

observarque, al efectuarel balancede nitrógenoparalos componentesdel sistemaen este

experimento,“faltaba” nitrógeno,es decir la cantidadde nitrógenoque se adicionabaal

medio, era inferior a la encontradaen los componentes.Todo esto parece indicar que la

composicióndel microorganismocambialigeramentecon la composicióndel medio. Por lo

que, a ciertas concentracionesde sustratonitrogenado, la suposiciónefectuadapara el

modelo propuestopuedeno ser adecuadaen ciertos casos. Más adelantese volverá a

comentaresteaspectoy se realizaráun cambiode estequiometríapara verificar lo que se

acabade comentar.

352

ModeloCinéticode Célula

6.2.4.2.- Discriminación por Criterios Físicos: variación de los parámetros con lasvariables

En esteapartadose comparanlas distintastendenciasquepresentanlos parámetros

en función de las variables:temperaturay concentracióninicial de nitrógeno. Se van a

analizar las tendenciaspara cada una de los parámetrosen los modelos que han sido

finalmente considerados:MCC-3 y MCC-4, aunquetambién se incluyen los otros dos

modelosMCC-5 y MCC-6.

• Variacióndeparámetrosdel MC(2-3 con la temperatura

Como ya ha sido expuesto,estemodelo constade cuatroparámetros,debido a las

cinéticaspotencialessupuestasenestecaso.En las Figura 6.60 se muestranlas evoluciones

de los parámetroscorrespondientesa cadaunade las velocidadesde reacción.

La línea continua es la curva real obtenida del valor de los parámetros,la

discontinuaindica la tendenciade la función matemáticaa la que podría serajustadaa la

vista de dichaevolución.

Como se apreciaen la Figura 6.60, el parámetrok1, correspondientea la reacciónr1

(proteínas),muestra una tendencia descendentecon la temperatura. Los parámetros

correspondientesa las reaccionesde velocidadde ácidosnucleicos(Y y k5) muestranuna

tendenciamáso menosconstantecon la temperatura,Figuras6.áOby 6.60c.Aunque parece

quehayunaciertatendenciadescendente(líneacontinua),no sonvaloressignificativamente

distintos,por lo que se podríaconsiderarqueel valor esconstantecon la temperatura.

Finalmente el parámetrok2, correspondientea la velocidad de reacción de los

aminoácidosno formadoresde bases(r2), muestraunatendenciacon un máximo, lo cual

podría ser ajustado a una función tipo Ratkowsky, como ya se ha visto en capítulos

anteriores.

353

ModeloCinético de Célula

• Variación de parámetros del MC(2-4 con la temperatura

En cuantoa la evoluciónde parámetroscon estavariable,parael modeloMCC-4. se

aprecia que la tendenciapresentadapor los parámetrosde la reacciónr[ es distinta. El

parámetrok1, que es el parámetrodel numerador presentaun valor constantecon la

temperatura,mientras que el parámetrodel denominadorK1, presentauna tendencia

pasandopor un máximo,comoseindica en la Figura6.61 a.

Los parámetroscorrespondientesa las ecuacionescinéticas r3 y y5 presentan

tendenciassimilares con la variable en amboscasos,tal como indica la Figura 6.61b y

6.61c;sepuedeasumirque tanto los parámetrosdel numeradorcomodel denominadorde la

ecuacióncinéticacorrespondienteno varían con [atemperatura.

Por último, el parámetrok=correspondientea la reacciónr2, muestrauna tendencia

similar al casoobservadoen el modeloMCC-3, tal como indica la Figura6.61d.

• Variación deparámetrosdel MCC-5 con la temperatura

En estemodelo se consideróla velocidadde reacciónpara r1 como una cinética

hiperbólica,esdecircon dosparámetros,cuyaevoluciónse muestraen la Figura 6.62a. En

ella se apreciaque, al igual que en el casoanterior,el parámetrodel numerador(k1) presenta

una tendenciaconstantecon la temperatura,mientrasque el del denominadorpasapor un

máximo (Kí). Los parámetroscorrespondientesa r3 y r5 tienentendenciasconstantescon la

variable,como indican las Figuras6.62by 6.62c.

El parámetrok2 correspondientea la reacciónr2 no muestrala tendenciahiperbólica

observadaen el modelo MCC-3 y MCC4. En estemodelo,el parámetrok2 no parecetener

una tendenciaclara con la temperatura,lo que podríaser un criterio de discriminaciónde

estemodeloMCC-5, frentea los dosanteriores.

354

Modelo Cinético de Célula

• Variación de parámetros del M(2(2-6 con la temperatura

En este modelo se consideró la velocidad de reacción para r1 como una cinética

potencial tipo 1. Como se apreciaen la Figura6.63, el parámetro k1, muestra una tendencia

similar a una hipérbola invertida. Función muy diferentea la obtenidaen los modelos

anterioresy pocoexplicable

Los parámetroscorrespondientesa u y r5 tienen tendenciasconstantescon la

variable,como indica la Figura 6.63by 6.63c, al igual que ha sido observadoen el restode

los modelos,con independenciade quelas cinéticasfresenpotencialeso hiperbólicas.

El parámetrok2, correspondientea la reacciónu no muestrala tendenciahiperbólica

observadaen el modelo MCC-3 y MCC-4. La curvaesalgo mássuavea lo visto en estos

dosmodeloscomentados,tal como se apreciaen la Figura6.63b.

Denuevopuedeafirmarseque los modelosMCC-5 y MCC-6 no aportannadasobre

el MCC-3, ya que [a variacióndc parámetroscon la temperaturaes más razonableen [os

modelosMCC-3 y MCC-4.

355

ModeloCinético de Célula

0 6 -ia

:61o 1— 0½ vi.

06

1 ________________________

:4 26

1~

3 6161~1

II 60

TOTIVCntIta

¾

.

SO II 60

[oir cnt ira

(03<

O

420-j

630.]

0101

6.’ -

0.10-

0440.

1

o :6 SO lo

1.011, criC

c -

Figura 6.60.- Variación de los parámetrosdel modelo cinético de célula MCC-3 con laTemperatura.a) parámetroparalavelocidadr~ ti) parámetroparala velocidadr3c) parámetroparala velocidady5 d) parámetroparala velocidadr2

-0

Ienhientllra

356

Modelo Cinético de Célula

26 28 30 32 34

Tenperatra

36 28 311

renperawa

Figura 6.61.-Variación deTemperatura.a) parámetroparala velocidadr1c) parámetroparalavelocidadr5

los parámetrosdel modelo cinético de célula MCC-4 con la

b) parámetroparalavelocidadr3d) parámetroparalavelocidadr2

——u

— .--...

— -~1 ~~~—>-

//Y’ a

4

0,12

ojo—

0,08—

2 0,08-

11,04-

0.02-

0.00-

0.12

0.10

O .08

o .ió

¡¡.04

0.02

090

24

020

0.1 11

ti

•—

32 34

E0.10-

0,05

0.00-

Tenvedira

j 0.03 -

23 16 SO 30 32 34

TeripcriC ir a

357

;t’Iodeio Cinético de Célula

14.:¡J o —¡

¡26 j¡5 ¡¡

¡25

¡4.140.]

0.456

0,454

¡¡.025

4.¡4>014>

a

- ~ 4>———-a- <O/0< or\-g--r - - -

¡

54 ¡4

CflpOriCiiriI

--- -~‘- - —.— — ..-.-,4————

24 :8 34

si 28 44

cnt u-a

0-Ii

0.015 -

u1,

4.06 0-

44425-

-a--O

~-61

~0 —2

¡2-.. o’

24 28 14 ¡2 44

Icnpert ura

Figura 6.62.- Variación de los parámetrosdel modelo cinético de célula MC(2-5 con laTemperatura.a) parámetroparala velocidad~L ti) parámetroparala velocidadr3c) parámetroparala velocidadr5 d)parámetroparala velocidadr2

358

¡ -

-A— &

54

iJ

036

¡¡30-

4=11-

44=4-

t

¡¡0”

>4.25—

11

2-8

42 34

62 64

.4>4- —4---

4.

~1-. 4>

>4.-sn -

26 28 30 33 34

Tcnpetittra

24 26 28 30 32 34

1cnpcitta

0. ‘Co

44015-

4.050-

•1

—• k

A

24 28 28 30 32 34

Tenperaira

Figura 6.63.- Variación dc los parámetrosdel modelo cinético de célulaMCC-6 con laTemperatura.a) parámetroparala velocidadr1c) parámetroparala velocidadr5

b) parámetroparalavelocidadr3d) parámetroparalavelocidadr2

Modelo Cinéticode Célula

0»—

0.8 —

0?—

0.6

¡¡.5—

~ :7310.2-]

0.!

0.0

006-

o 004

¡3 0’

000

0.00, —

lenvenhira

E 0.04—

—.— k

¡ -—A— 4

--—A —-. —.

A——

—u— —.--.———0.02

4400

10.025

359

Xh)cle¡o <jinético (le (‘élula

• Variación de parámetros del MCC-3 con la Concentración Inicial de Amonio

En cuantoa la evoluciónde parámetroscon estavariable,parael modelo MCC-3, se

apreciaquela tendenciapresentadapor todoses similar.

En la Figura 6.64 semuestraque, paratodos los parámetrosde estemodelo, no hay

una tendencia,el valor es constante.Es decir, su valor no varia con la concentraciónde

amonio inicial, por lo que se concluyequela concentraciónde amonio inicial no influye en

la variaciónde los parámetrosdel modelo,tal como cabíaesperar.

• Variación deparámetrosdel MCC-4 con la ConcentraciónInicial deAmonio

En estecasosepuedeasumirque la tendenciade los parámetroscon la variaciónde

la concentracióninicial de amonioesconstante,al igual queen el casoanterior.

En la Figura6.65, aparecenrepresentados[osparámetrosen funciónde estavariable

paracadaunade las velocidadesde reacción.

• Variación de parámetros del M(2C-5 con la Concentración Inicial de Amonio

En estecaso, [a tendenciade los parámetroscon la variaciónde la concentración

inicial de amonio es también constante,al igual que en los dos casosanteriores.No

obstante,si observamosla Figura 6.66, los parámetrosk; y k5, Figuras 6.66b y 6.66c

respectivamente,muestrancierta tendenciahacia un mínimo con la concentraciónde

amoniode 257 p.p.m.

• Variaciónde parámetrosdel MC(2-6 con la ConcentraciónInicial de Amonio

Como se apreciaen la Figura 6.67, la tendenciade todos los parámetrosdel modelo

es constante,es decir, el valor de los parámetrosno cambia significativamentecon la

concentracióninicial de amonio,al igual queen los casosanteriores.

360

Modelo Cinéticode Célula

¡‘40 24>0 300 404 400

CM(P.P.m)

—. — 6,

b

=040 300

C~(pp.m)44>0 400

[r,7

¡ 4>..

c

_________ 4

¡00 =00 300 400 600

C<ppno)

rn4d

¡¡10 =00 304>

no)400 500

Figura 6.64.- Variación de los parámetrosdelconcentracióninicial de amonio.a) parámetroparalavelocidadr1c) parámetroparalavelocidadr5

modelo cinético de célula MCC-3 con la

b) parámetroparad) parámetropara

lavelocidadr3la velocidadr2

~—.—. ———.¡

• .-——-~ •L____ -

a

4< -

08.-

¡.4 4 —

¡¡.4 —

4.3 -

41-

0.4

:145.

II0.2

¡4,1

4-4II O

0.4

4.6

0.4 —

1 0.4 —

0.3

02 -

0. ¡

0.4

0,——

0.20—

4.45—

0-lo—

0.05

0-.,—

36]

Modelo Cinético de Célula

¡¡ 6 6

ti - —Ajo’

a¡4 1 •i-~- -~- - -~ - A

<i~1 .9-”’ - 1:4444 44>44 4444 440

4>’ ¡A—K ¡

b

4444

.¡61

140 144>

Qj(P p no>

604

- —2

e

tuis

¡444

4-¡04>

¡<¡<4

4>.->

<44>76

4,4)50

--4>240 =00 -4>44> 6<44>

4? ¡9pm>~6. -

de los parámetrosdel modelo cinético de célula MCC-4 con laconcentracióninicial de amonto.a) parámetroparala velocidadr1 b) parámetroparalavelocidadr3c) parámetroparala velocidadr5 d) parámetroparalavelocidadr2

--4——A -—

11

‘¡¡44

Figura 6.65.- Variación

362

4>35

a

4.14>

~

~

¡¡¡<0

4.140—404> ¡40

4.50

415

304>

C>4ppm)

400 4030

4>4.3,

b

4434

4” —

4=44

0.35

0,44>

44.45

441¡.4¡40 200 44>0 4410 400,

<¡--4

9.03,

446 e0.5

¡3--’

4>-;

0.2

0.4

0.0400 200

442

3110

C~<p.p.m)

400 500

-—E —— 4>,

d

230 400 4303 500

modelo cinéticode célula M(2C-5 con la

b) parámetrod) parámetro

parala velocidadr3paralavelocidadr2

C%(P.P.J30)

Figura 6.66.- Variación de tos parámetros delconcentracióninicial de amonio.a) parámetroparala velocidadr1c) parámetroparala velocidadr5

0=4

<0—

ModeloCinéticode Célula

e-

1

1

1 0.4

4440

363

3—leUdo (‘¿‘zétíco de Célula

4--~~~~~‘2-

4-

114>4 44>>>

¡¡

¡ —•— y¡_ a-

ti

<¡5A——-—

¡44444<> =41<>

¡4=41

~ — AA

4444> 4=4 $4144

¡ -.

Liii

c

.,--.4<—

A—

--A—-~

- A

0——--~

¡454--¡44 2450

44,1

--1

lOO -400 6<34=

,

¡¡.418

41.410‘-c—

4>2

d

½

44.44=

240 300 400 444

p no~

Figura 6.67.- Variación de los parámetrosdel modelo cinético de célula MCC-6 con laconcentracióninicial de amomo.a) parámetropara[a velocidadrj b) parámetrospatala velocidadr3c) parámetrosparalavelocidadr5 d) parámetroparala velocidadr2

364

.7’

- I-.k>

a

40

.5

¡¡46

ModeloCinético cíe Célula

Al aplicar, por tanto, los diferentes criterios de discriminación sobre los cuatro

modelosconsiderados,se concluyeque los modelosMCC-3 y el MCC-4 parecenser los que

mejorresultadopermitenobtener.

A pesar de que todos los modelos presentanuna tendenciaaceptablede los

parámetroscon las variables, hay que destacarque el MCC-6 presentael parámetro

correspondientea r2 con una tendenciacon la temperaturaque no parecemuy clara. El

MCC-~5, en la variaciónde parámetroscon el amoniopresentamínimospara r3 y r5, lo cual

no parecesermuylógico.

Por tanto, la evoluciónde parámetrosde los modelosMCC-5 y MCC-6 no parece

aportarningunaventajaque permitaconsiderarque estosmodelosmejoranla reproducción

de los datosexperimentalesrespectoa los otrosdosmodelosplanteados.

Hay que recordarque ambosmodelosposeenun númeromáselevadode parámetros

que el MCC-3, en cambio los valoresde SRC eranmayoresy, como se acabade ver, la

evolución de parámetrosde estos modeloscon las variablesno es indicativa de que se

mejoreel resultadoobtenidocon MCC-3 y MCC-4.

En cuantoal MCC-3 y MCC-4, presentanuna evolución razonablede todos sus

parámetroscon la temperaturay con el amonio.Porello resultamásdificil discriminarentre

ambos. No obstante,y como ya se comentó anteriormente,a pesarde que MCC-3 es el

modelo que presentamenor número de parámetroses con el que se obtienen menores

valoresde SRC. Si bienesteno esun criterio de discriminaciónmuy claro, seva a utilizar

paraelegir el MCC-3 frentea los demás,debidoa queesel modeloen el que el númerode

parámetroses menor (4 parámetros),lo cual simplifica mucho el problema, aspecto

fundamentalen ingeniería.

Por tanto, y debido a que se ha optadopor el MCC-3, se puedenplantearahora

parámetroscomo funcionesde la temperaturaparaestemodelo. Las funcionesse pueden

obtenerpor observaciónde la forma de las curvas de la Figura 6.62; tanto k3 como

presentabanunatendenciaconstantecon la variable,mientrasquer2 parecerespondera una

funcióntipo Ratkowsky,y r1 unavariaciónlineal descendente,de la siguienteforma:

365

ModeloCinético ¿le Célula

k1(T)= C1 ~2 ~ [6.42]

k3(T)= C3 [6.43]

k3(T) C5 [6.44]

r-(T) =1 C’,(T- T’,,03,)[l-exp(C’,.(T- T,ica))i)~ [6.45]

En cuantoal amonio,dadala tendenciaconstantede los parámetroscomo indica la

Figura 6.65, no ha sido necesarioplantearfunciones de los parámetrosen relación a esta

variable.

6.2.5.-Mejora de las DeficienciasObservadasen el ModeloCinético deCélula

A lo largo del apartadoanteriorse han ido exponiendolos resultadosobtenidosal

aplicar diferentesmodelospara la descripcióndel crecimientode Xanthornonascan-ipestris.

Se ha decidido discriminarel MCC-3 frenteal resto de los modelosplanteados,los cuales

también permitían obtener buenos resultados en la reproducción de los datos

experimentales

También se comentéque el experimentollevado a cabo con una concentración

inicial de amoniode 65 p.p.m.(experimenton0 5) no permitíaunaadecuadareproducciónde

los datos experimentalescon ninguno de los modelos planteados.Por otro lado, el

experimentorealizadocon 475 p.p.m. de amonio inicial seconsiguecon una reproducción

aceptable,si bien no tanbuenacomo la obtenidaparael restode experimentosrealizados.

Por tanto, en este apartado se comentaránlas deficiencias encontradasde la

aplicaciónde los modeloscinéticosde célula,y cómo es posiblerealizaruna mejorade estas

deficiencias. Estas mejoras han sido comprobadaspara los dos modelos que han

proporcionadomejoresresultados,estoesel MCC-4 y el MCC3.

366

ModeloCinéticode Célula

•Mejora del ajuste del experimenton0 5 (280 C y 65 p.p.m. de amonio inicial)

La principal deficienciadel modelo cinético de célula planteadoes la encontrada

parael experimentorealizadocon 65 p.p.m. de amonio inicial. Comoseindicó al principio

de estecapítulo, al realizarel balancede nitrógenocon la estequiometríasupuesta,no se

podía cerrar el balancede estecompuesto.Es decir, se encontrómayor concentraciónde

nitrógenoen formade componentesde la biomasa(DNA, RNA y proteínas)quela añadida

comoamonioen el medio de cultivo. Sepuedepensarquela estequiometríaconsideradano

seala adecuadaparaestecaso.

Es sabido que la composiciónde los microorganismoscambiacon la composición

del medio, de forma que la bacteriacon concentracionesmuy bajasde amonio puedeestar

produciendocomponentescon diferente composiciónque cuando la concentraciónde

amonio es máselevada.

Estecambioen la

para la formación de

correspondienteal grupo

nitrógeno(ci del grupoaminodel carbonoa y conotrols nitrógeno/sen [acadenalateral).

composiciónsereflejaráen el tipo (y proporción)de aminoácidos

proteínas. Existen aminoácidos con un solo nitrógeno (el

amino del carbonoa) y otros aminoácidosque poseenmás de un

Es evidenteque el microorganismodebeconsumirmásamonio cuandotengaque

produciraminoácidoscon másde un nitrógenoque cuandoel aminoácidoposeasolo uno.

Ante un cambioen la composicióndel medio, fundamentalmenteen ¡a fuentenitrogenada,

el microorganismoformará aminoácidosde un tipo y de otro, pero no en la misma

proporción. Debido a que no ha sido posible el análisis de dicha proporción entre los

diferentes aminoácidosque constituyenla biomasa,pues se escapaal alcancede este

trabajo, seha realizadounasuposicióncon el fin de verificar si estehechopuedeexplicar

[osresuLtadosencontrados.

La suposiciónefectuadaesque los aminoácidosformados

proteínas, en el experimento realizado con 65 p.p.m de

mayoritariamenteaminoácidoscon un sólo nitrógeno,por lo que

paralos aminoácidosformadoresde basesdadapor la ecuación[6.1

lasiguienteexpresión:

para la producción de

amonio inicial, son

la relación de filiación

5] vienedadaahorapor

367

Modelo Cinético de Célula

0,833C<~H~ O~ ±NH4t±]NAD’—+0,]4CoASH+ATPrt

7’

C5[1 ~5O,5NS0J4-4—i’NADI—J,W )+0.I4CoA±2.491-1,0±ADP±~ [6.46]

En cuanto a las ecuacionesdiferencialesparalas velocidadesde producciónde cada

uno de los componentesdel sistema,la únicaqueseve modificadaporel cambioefectuado

en la estequlometriaes la expresióndadapor la ecuación [6.26], correspondientea la

velocidadde consumode amonio,quedandoahorade la siguienteforma:

dC = 18 (——6 3 [6.47])—2,75•

de - /70,5 /03,5 - 491/6 486,4

El cambio en la estequíometríaha sido realizadoen los dos modelosque daban

mejoresresultados,estoesparael MCC-3 y el MCC-4.

Al efectuar el ajuste en múltiple respuestacon este cambio y considerandolas

cinéticasplanteadaspara MCC-3, seobtienenlos parámetrosque aparecenen la Tabla6.70,

donde puede observarseque los valoresestadísticossuperanlos valores teóricosde t de

Studenty F de Fischercon un 95 % de confianza.Ademásse obtienen valoresde dichos

parámetrossuperioresa los obtenidoscon la estequiometriaanterior. En la Figura 6.68 se

muestrala reproducciónde los datos experimentalescon el MCC-3, modificadoparaeste

caso, observándosela clara mejora en la reproducciónde los datos experimentalessi se

comparacon lo observadoanteriormenteen la Figura6.38.

Parael MCC-4, seobtienenresultadossimilares.En la Tabla 6.71 semuestranlos

valores de los parámetrosasí como las estadísticasobtenidasdel ajuste al modelo,

observándosequesesuperanen todos los casoslos valoresteóricosde t de Studenty de la F

de Fischer.En la Figura 6.69 semuestrala buenareproducciónde los datosexperimentales

con el MCC-4 modificado en comparacióna lo observado,paraestemismo modelo en la

Figura6.45.

368

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.70.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 2.Condicionesexperimentales:T=280 C, CN=65 p.p.m de amonio, N variable(210 r.p.m. inicial), al MCC-3

Valores de los parámetrost Student F Fischer

0,59 0,58 7,1.102

24300,158 0,155 7,1.10~

0,25 0,24 9,8.10~

0,05 0,049 7,3.10~deStudent( 95%confianza) 2,080

E de Fischer( 95%deconfianza»2,49

8

SRC=0,025

Figura 6.68.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 5 (28 0C y 65 p.p.m.deamonio inicial) al modelo MCC-3,concambioen laestequlometríade los componentes.

369

t(h)

Modelo Cinético de Célula

Tabla 6.71.- Parámetroscalculados por ajuste de losCondicionesexperimentales:1=280C, CN=óS(210 r.p.m. inicial), al MCC-4.

datos del experimento n0 2.p.p.m de amonio, N variable

ParámetroValores de los parámetros

t Student F FiseberMáx Ópt Mm

0,089 0,088 0,088 y,i.io~

4430

0,014 0,013 0.012 5,3.lO~

0,083 0,082 0,081 9,1.l0~

0,052 0,052 0,052 8,5.l0~

0,171 0,17 0,169 6,2.l0~

0,095 0,095 0,095 9,1.1 o~

0.013 0,013 0.013 6.23.10~

deStudent( 95% confianzar2,080F de Fiseher( 95%de confianza»2,49 SRC~ 0,012

—o OtO ~

20

Figura 6.69.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimentoit 5 (28~Cy 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4con cambioen la estequiometríade los componentes.

370

125

1,00

J.4

• AnunioA RNAy DNAO Pruteina• n¡on~a

.s u0,75-~

030-

-4

1.o

0,25-

0,000 0 30

t (h)

r40

~~1

50 60

ModeloCinéticode Célula

eMejora del ajuste del experimento n0 7 (28~ C y 475 p.p.m.deamonioinicial)

Como ya ha sido expuestoanteriormente,para el experimentorealizadocon una

concentración inicial de amonio de 475 p.p.m., se obtenían valores estadísticos

significativamentebuenosde los parámetros y una aceptablereproducciónde los datos

experimentalescon los modelos MCC-3 y MCC-4, esto es, los que pareceque mejor

describenel crecimiento de la bacteria.No obstante,si comparamoslas reproducciones

obtenidaspor ajustea los citadosmodeloscon las obtenidasparael restode experimentos,

se puedeobservarque la reproducciónde los datosexperimentalesde esteexperimentoes

significativamentepeor.

Una explicación a lo observado,podría ser el efecto tóxico del amonio para el

crecimientodel microorganismoa partir de ciertaconcentración.En la literatura aparecen

referenciassobreel efectotóxico de estecompuestoen el crecimientode microorganismos

(Cid y col., 1996).

La inhibición del crecimiento del microorganismopor la presencia de alguna

sustancia—que puedeser sustratoo producto-en ciertacantidad,ha sido consideradapor

muchosautores,pero la expresiónmáscomúnde inhibiciónporsustrato,esla propuestapor

Waymany Tseng(1976).Estosautoresconsideranque existeunaconcentracióncrítica del

sustrato(Cs~), por debajode la cual no produceinhibición del crecimiento,empleandola

expresión:

dC~ _ p14C5

ch — Q :. 678 = [6.48]

dC~ Fji_.c 1tít LKÑ-c?8 k/ (C~ Csc))jCx :. C~ =C~ [6.49]

Para el caso concretodel experimentorealizado a 475 p.p.m. se ha tomado el

término de inhibición de la ecuación [6.49] y se ha incluido en la expresióndadapor la

ecuación[6.30] correspondienteal términode aminoácidosno formadoresde bases,esdecir

aquellosqueformaránpartede las proteínas,las cualesformaránpartea suvez de la propia

biomasa,quedandolaexpresiónsiguiente:

371

Modelo Cinético de Cétu/a

— (p <i’p~~~ )—k1 ~

67.-Vc )‘ [6.50]

tít

La concentraciónde sustratonitrogenadocrítica (CNG), no se conoceen estecaso,

pero paracomprobaresteefecto inhibitorio se ha supuestoque este valor esde 350 p.p.m

de amonio.

Se ha realizadoel ajustede los datosexperimentalescon el modeloMCC-3 teniendo

en cuentaestamodificación.Los parámetrosobtenidosse muestranen la Tabla6.72, donde

se observa,además,el valor del nuevo parámetroconsiderado.k1 que es la constantede

inhibición por amonio. Los valores estadísticosde los parámetros superan los valores

teóricosde t de Studenty F de Fischer.En la Figura 6,70 semuestrala reproducciónde las

velocidades de los componentesdel sistema. Si se compara con la Figura 6.40,

correspondienteal ajuste de este mismo experimentocon el MCCI, se observa la clara

mejoraobtenidaal considerarel términode inhibición.

Para el ajuste con el modelo MCC-4, los valoresde los parámetrosobtenidosse

muestranen la Tabla 6.73, Los valoresestadísticosde los parámetrossuperanlos teóricos

de la t de Studenty de la E de Fisclier. La Figura6.71 muestrade nuevola claramejoríaen

la reproducciónde los datosexperimentalesal incluir el términode inhibición por sustrato,

al compararcon la Figura 6.47 correspondienteal ajusterealizadocon estemismo modelo

(MCC-4) sin considerarla inhibición por sustrato.Además se consigue un significativo

descensodel valor de SRC.

La tendenciade los nuevos parámetrosobtenidos al considerar el término de

inhibición en fimción de la variable concentraciónde amonio inicial se muestranen las

Figuras6.64 y 6.65, dondeaparecerepresentadoestevalor indicadopor un punto. Ambas

Figuras corresponden a la tendenciade los parámetrosobtenidos por ajuste de los

experimentosrealizadoscondiferentesconcentracionesinicialesde amonio,al MCC-3 y al

IvICC-4, y como sepuedecomprobar,dichatendenciano cambiacuandose incluye este

nuevotérminoal modelo parael experimentorealizadocon 475 p.p.m..

372

ModeloCinéticode Célula

Tabla 6.72.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datosCondiciones experimentales:T’280 C, C,e475variable(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3 con

del experimento n0 7.p.p.n¡ de amonio, Ntérmino de Inhibición.

ParámetroValoresde los parametros

t Student F FiseherMix Ópt Mm

0,53 0,52 0,51 2,1.10~

4635,3

0,154 0,15 0,147 8,2.10~

0,22 0,19 0,16 5,2.102

0,055 0,05 0,045 9,3.102

0,081 0,08 0,079de Student ( 95% confianza»2,080

E de Fischer ( 95% de confianza»2,49

1,75

1,50

1,25

1~u

1,00

0,75

0,50

0,25

0,00

SRC=0,05

50

obtenidospor ajuste delinicial) al modelo MCC4,

373

t (b)

Figura 6.70.- Evoluciones de los componentes del sistemaexperimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amoniocon término de inhibición.

ModeloCinético de Célula

Tabla 6.73.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datosCondiciones experimentales:T280 C, CN475variable(210r.p.m. inicial), al modelo MCC-4 con

del experimento n0 7.p.p.m de amonio, N=término de inhibición.

ParámetroValoresde los parametros

t Student F FiseherMáx Ópt Mm

0,122 0,121 0,12 5,í.104

5635,3

K1 0,102 0,101 0,10 7,1.10~

0,022 0,020 0,018 3,1.l0~

0,045 0.045 0,045 5,2.l0~

0,08 0,08 0,08 9,2.10~

0,082 0,078 0,074 3,1.l0~

- 0,05 - 9,23.l0~

0,067 0,067 0,067 9,5 io~de Student ( 95%conflanzat2,93

E de Eischer( 95%deconfianza»2,54

1.75

1,50

1,25

ou

1,00

0,75

0.50

0,25

0,00

SRC= 0,042

50

obtenidos por ajuste delinicial) al modelo MCC4,

t(h)

Figura 6.71.- Evoluciones de los componentes del sistemaexperimento n

0 7 (28 0C y 475 p.p.m.de amoniocon término de inhibición.

374

ModeloCinético de Célula

A lo largo de estecapítulose ha ido desarrollandoel planteamientoy ajustea datos

experimentalesde un Modelo Cinético de Célula para la descripcióndel crecimientodel

microorganismoobjeto de estudio, esto es la bacteria Xanthomonascampestris. De la

aplicación de toda la metodologíadesarrolladaen estecapítulo,seha llegado a dos modelos

que son capaces de describir adecuadamenteel crecimiento del microorganismo, no

observándose,en principio, diferenciassignificativasentreambos.

Se va ahoraa unir estemodelo de célula,con la partecorrespondientea la producción

del polisacárido.Concretamenteseha elegidoel MCC-3 pararealizarla última etapade este

trabajode investigación.De acuerdoa los criteriosde discriminaciónindicadosanteriormente.

Es necesarioahoraunir estemodelode célula -el cual permite predecircambiosen la

composicióndel medio considerando el metabolismodel nitrógeno estructuradoen la

biomasa(DNA, RNA y proteínas)-con el modelo cinético metabólico, el cual aportó

resultadosmuy buenosparala partecorrespondientea produccióndel polisacárido,tal como

se vió en el Capítulo 5 de la presenteMemoria.

Por tanto, en el próximo Capítulo se abordaráel planteamientode un modelo

QuímicamenteEstructuradoparala ProduccióndeXantano,el cual serárealizadocomo

sumade los dos modeloscomentados:el Modelo CinéticodeCélula y el Modelo Cinético

Metabólico.

375

7.- MODEL O CINÉ ricoQUÍMICAMENTE ESTRUCTURADO

Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado

7.- MODELO CINÉTICOQUÍMICAMENTE ESTRUCTURADO

Los Modelos QuímicamenteEstructuradosdescribenel metabolismocomo una red de

reacciones,empleandoparaello esquemassimplificadosde reacción,de la mismamaneraque

en los modelosmetabólicosy en los modelosde célulaya descritosanteriormente.

Un modelode estetipo se puede plantearmediantela unión de modelosmetabólicos

en los quese describela producciónde un productode interésconsiderandoestructuracióndel

sustratocarbonado,dentrode la redsimplificadade rutasmetabólicas-,con modeloscinéticos

de célula- que describenel crecimiento del microorganismoconsiderando la estructuración del

sustratonitrogenado,dentro de la red simplificada del metabolismo del microorganismo

productor-.

Los modelosmáscomplejosvistoshastaahorahan sido los modelosdecélula,con los

que podía realizarseuna buenadescripcióndel crecimientodel microorganismoteniendoen

cuentala evoluciónde unaseriede componentesintracelularesqueconstituyenla biomasadel

mismo. En la literatura existe escasainformación sobre este tipo de modelos, solo se han

realizadointentos por describirel crecimientoutilizando estos modelossobresistemasmuy

conocidos como Escherichia coli o Bacillus subtillis y, en ningún caso, sobre

microorganismosde interésindustrial.

377

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

Porestarazón,esnecesariala propuestade los modelosquímicamenteestructurados,es

decir, que considerenpor un lado los principios del modelo de célula, pero ademáslos del

modelo metabólico tratando de hacerposible la descripción de una producciónde interés

industrialy. con ello, utilizar la informaciónen el cambiode escaladel proceso.

A pesar de las grandes ventajas que pueden ofrecer los modelos químicamente

estructurados,no existeen la literaturaningúnprecedenteen la líneaindicada.La modelización

más complejavista hastaahorase ha quedadoal nivel de modelosde célula,dondetampoco

existen muchos trabajos. y donde se realiza únicamente,como ya se ha comentado,la

estimaciónde parámetrossin ajustede datosexperimentales.

En el capítulo5 de la presentememoriaseaplicó un modelo cinéticometabólicopara

la descripciónde la produccióndexantano.En estemodelo se estructuróel metabolismodel

sustratocarbonado,sin diferenciarpartesde la biomasa,ya que éstaera descritamediantela

ecuaciónlogística, es decir, se considerabano estructurada.Como ya fue comentado,los

resultadosobtenidoscon estemodelo fueronsignificativamentebuenosparala descripciónde

los componentesdel sistema,como xantano,fuentecarbonada(sacarosa)y oxigenodisuelto.

Además se planteó un modelo en función de una de las variables estudiada,esto es [a

temperatura.Las ecuacionesparalas velocidadesde producción,las ecuacionescinéticaspara

estemodelo,juntocon el valorde los parámetrosobtenidossemuestranen la Tabla7.1.

Por otro lado, en el capítulo anterior se planteó un modelo más complejo para el

crecimientodel microorganismo,dadoquesu descripciónhabíasido realizadahastaahorasolo

de forma no estructurada.Se trataahorade estructurarel metabolismodel sustratonitrogenado

parala descripciónde la partecorrespondienteal crecimientodel microorganismo,uniéndolo,

en este caso, con el metabolismocorrespondientea ¡a producción. Del planteamientoy

posterioraplicación del modelo cinético de célula, se obtuvo un modelo cuyos parámetros

pudieronserpuestosen función de la variabletemperatura, pero ademásno variaban con

relación al nitrógeno inicial puestoen el experimento;con lo que este modelo permite la

predicciónde cambiosen el sistemafrente a cambiosen la composicióndel mediode cultivo,

algo sin precedentesen la literatura,como ya seha explicado.Las velocidadesde producción

de los componentesdel sistemajunto con las ecuacionescinéticasde este modelo cinético

vienendadaspor las ecuacionesde la Tabla7.2.

378

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

Tabla 7.1. Ecuacionescorrespondientes al Modelo Cinético Metabólico planteadopara ladescripciónde la producciónde xantano.

MODELO CINÉTICO METABÓLICO

Para la biomasa:

dC~ ~ ~

diCx

+

[7.!]

4.

Velocidadesde

Producción

EcuacionesCinéticas

Para el azúcar:

¿1C~

di

5,94 dCp~180L 923,2 di

1 ¡<j

12 K4±C0,

Cx ji 3.5818

1 dC~

Yv~ d~Para el producto:

dC1. — 923,2

di +

1 + 4 L~8+4

7A 7?!’

¡<(7’) 1 094- (7’ -19,45)11- exp<’l,399 . IT - 34,24))112 [7.10]

Parámetros¡<(7’) = —2,913+2,0487’ [7.11]

con la {0597~<7’ -24,35)1!- expi—0,205(7’- 37,16)flí [7.121¡ Temperatura = ÚL340+(6 ,/ . 10’)•T [7.13]

Para la evoluciónde oxigeno disuelto:

dr 923,2 di +

l~

+ Co2

1 k4C0,r 12 K,, + C0,

y —¡yrp

E $~

~y +I<LCIV .(c—c0, )~ 1>‘ox

CxC ±1’

Y u NN

l+4Y;p jY

3~~8~44Á7P)

C

ti —3,581 1 + 4 YrpA ~3,58+ 4~ Li TPP

Co,

+

Li TPP~34

ji

[7.2]

[731

dCx

di[7.4]

[7.5]

[7.6]

[7.7]

[7.8]

[7.9]

379

Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado

Tabla 7.2. Ecuacionescorrespondientesal Modelo Cinético Metabólico planteadopara ladescripciónde la producciónde xantano.

MODELO CINÉTICO de CÉL ULA

Velocidadesde

Producción

Para La biomasa:

RNA

DNA

Proteínasintracelulares

dCA. — RNA dCD4tA+ +

di tít <It tít

di

dc /~j4.\•,.j

= y.

dr

dCPPJ=y1~ dC~~tít di

Para el amonio:

dC~~4. =181—1,4 1$ — 12

dt 136,5 103,5

,..,

275 ~)478,6 491,;

EcuacionesCinéticas

Parámetroscon la

Temperatura

C.C

= ¡<3 C,~

r3 =Ic~ C~ C<

=k2 CN

k~(T) 1,49—0,0367’

kg’1’) = 0,150

k~(T)=0.198

k,(77) = ( 0,041 iT - 21)/I -evxp(O,352 (T- 3508)4<

[7.14]

[7.15]

[7.16]

[7.17]

[7.18]

[7.19]

[7.20]

[7.21]

[7.22]

[7.23]

[7.24]

[7.25]

[7.26]

380

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

7.1.-PLANTEAMIENTO DEL MODELO

Se trataahorade plantearun Modelo QuímicamenteEstructurado(MQE) que, comoya

se ha indicado, se va hacercomo sumade un modelo cinético metabólicoy de un modelo

cinético de célula.

Se realizará, por tanto, la unión de los dos modelosde este tipo que ya han sido

aplicadosen el presentetrabajo.Al unir ambosmodelos,la partecorrespondientea biomasadel

modelo metabólico(ecuación[7.1]) quedaahoradesglosadaen las expresionesdel modelo

cinético de célula (ecuaciones[7.14] a [7.17]). Además,es necesariocambiar el término

correspondienteal rendimientode azúcaren biomasa(Yxs)de la ecuación[7.2], que debe ser

ahoradesglosadoen los términos correspondientesal azúcarque va a parara biomasa,de

acuerdoa las relacionesestequiométricasentreel azúcary los componentesdel sistema,vistas

en el capítuloanterior(ecuaciones[6.15]a [6.19]),los cambiossedestacanen negrita:

dC8 5,94 dCl, 1 kjC0 [ (1 + ~dr —180<— 923,2 dr 12 Ki + C0, . Cx .[I~3.58j3s8+ ~. Y,~JJJ

—0,933< ,> 0,5< )-.- 1,08< ) J,12.( [7.27]136,5 103,5 491,87 486,7

De estaforma, el modelo químicamenteestructuradopropuestoparala producciónde

xantanoconsta de 7 respuestas:las correspondientesa la biomasa,es decir, DNA, RNA,

proteínasintracelulares,la correspondienteal nitrógenoy lasde la partede producción,esdecir

xantano, sustrato carbonadoy oxígeno disuelto. Incorporando las ecuacionescinéticas

propuestasen anteriorescapítulos, el modelo propuestoconstade 18 parámetros,tal comoha

sido indicadoen lastablasanteriores.

En estecaso,no se va a realizarel cálculo de los parámetrospor ajustede datos

experimentalesdebido a que este modelo cinético es, en realidad, la suma de los dos

modeloscitados, cuyos valoresde parámetrosya habíansido obtenidospor ajustede datos

experimentales.Por otro lado, el abordajematemáticode un modelo de este tipo, con tan

elevadonúmerode parámetros,seríamuy complejo.

381

;VfodeloCinético Oi¡hnicamenreEsuz¿cturado

Por tanto, se van a emplearlos parámetrosobtenidosde cadauno de los modelos,

con el fin de observarsi el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructuradoplanteadoescapaz

de reproducirlos resultadosexperimentalesde cadauno de los experimentosllevadosa cabo

en estetrabajo. En la Tabla 7.3 aparecenlas ecuacionescon el valor de los parámetrosdel

modeloen función de la temperatura.

Tabla 7.3.-Valor de los parámetrosen funciónde la temperaturaempleadosQuímicamenteEstructurado.

parael Modelo

kIT,) 0,94 (T -19,45) [1- exp(1,399 •<T -34,24»j}2 [7.28]

kYT} = —2,913 + 2,048 T [7.29]

y0~ IYD = 0,597.iT -24,35)11-exp<—0205 <7’- 37,16)< [7.30]

Y,\%(T)= 0,3404(—6,1103)T [7.31]

Ic~(T) = 1,49 —0,0367’ [7.32]

kjT) = 0,150 [7.33]

<(7’) = 0,198 [7.34]

k,(T)={0,041(T-21)fI-exp(0.352(T-3S,O8))] [7.35]

382

ModeloCinéticoQuimicamenteEstructurado

7.2.- APLICACION DEL MODELO CON DATOS EXPERIMENTALES

Paraaplicarestemodelo, seha realizadola reproducciónde los datosexperimentoa

experimento,empleandolos parámetrosindicados, y se han comparadotanto con los

resultadosexperimentalescomo con ¡a reproducciónobtenidapor el modelo metabólico,

con el fin de observarqué mejoraspuedeaportar el Modelo Cinético Químicamente

Estructurado.

En las Figuras7. 1 y 7.2 semuestranlos resultadosde las reproduccionescon ambos

modelosparael experimentou0 1, llevado a caboa 250 C y con 257 p.p.m.de amonio

inicial. En la Figura 7.1 secomparanestosresultadosparala evoluciónde la biomasay de

amonio. Se puedeapreciar que el MQE (línea continua) predice una concentraciónde

biomasaen la fase estacionariaalgo inferior a la obtenidacon el MMET. Además,se

observala clara mejoria que introduce el MQE en la reproducciónde la evolución de

amonio. En la Figura 7.2 aparecela reproduccióncon ambosmodelosde la velocidadde

formaciónde xantano,de consumode azúcary evoluciónde oxígenodisuelto. En la citada

figura se puedever que el MQE predice una concentraciónde xantanoinferior a la que

predice el MMET, con lo que se explica la menor velocidadde consumode azúcar y

oxígenocon estemodelo en comparacióncon el modelo metabólico.Estasdiferenciasson

seguramentedebidasa la inferior cantidadde biomasaqueprediceel MQE.

En las Figuras 7.3 y 7.4 semuestranestosmismos resultadosparael experimento

u0 2, realizadoa 280 C y con 257 p.p.m. de amonio inicial. En la Figura 7.3 se observa

que MQE (línea continua), de nuevo, predice una concentraciónde biomasaen la fase

estacionariade crecimientoalgoinferior a la obtenidacon el MMET, no siendoasí durante

la fase exponencial.Ademásseobservala mejor reproducciónde la evolución de amonio

introducidaporel MQE. En la Figura 7.4 aparecela reproducciónconambosmodelosde la

velocidadde formación de xantano,de consumode azúcary la evolución de oxígeno

disuelto. El MQE predicetambiénen estecasouna concentraciónde xantanomásbajaque

la que seobtienecon el MIPvIIET y, en consecuencia,una menorvelocidadde consumode

azúcary oxígeno.

383

ModeloCinéticoQuiniicamenteEstructurado

Las Figuras7.5 y 7.6 muestranlas reproduccionesde los datosexperimentalesobtenidas

con ambosmodeloscomentados,parael experimenton0 3. llevado a caboa 3I~ C y con

257 p.p.m. de amonio inicial. Los resultados obtenidos para la biomasa y la evolución de

amonio aparecenen la Figura 7.5. En estecaso las diferenciasentreambasvelocidadesde

formación de biomasa no son muy significativas, si bien es ligeramente mayor la

concentraciónde la biomasaque prediceel MMET. Además,se observala clara mejoría

que introduce el MQE en la reproducciónde la evolución de amonio. En la Figura 7.6

aparecela reproduccióncon ambosmodelosde la velocidadde formación de xantano,de

consumode azúcary evoluciónde oxigenodisuelto. En la citadafigura se puedever que la

evolución de los componentescitados es muy similar, siendo ligeramente inferior la

velocidadde formaciónde xantanoen el MQE.

En las Figuras 7.7 y 7.8 se muestranestosmismos resultadoscon el experimenton0

4, llevado a cabo a 340 C y con 257 p.p.m. de amonio inicial. En la Figura 7.7 sepuede

ver que no hay diferenciassignificativasen la evoluciónde biomasaque predicen ambos

modelos;sin embargo,hay ciertadiferencia,como se ha ido viendo,en la reproducciónde

la evoluciónde amonio introducidapor el MQE. En la Figura 7.8 apareceLa reproducción

con ambosmodelosde la velocidadde formaciónde xantano,de consumode azúcary la

evoluciónde oxígenodisuelto.Sepuedeapreciarque apenashaydiferenciasen la evolución

de estoscomponentesen los dosmodelosque seestáncomparando.

En las Figuras7.9 y 7.10 se muestranlas reproduccionesde los datosexperimentales

parael experimenton0 5, realizado a 280 C y con 65 p.p.m. de amonioinicial. Hay que

destacarque, en estecaso,se empleael cambiode estcquiometríaparael amonio (ecuación

[6.47]), que ya fue visto en el capituloanterior.En la Figura 7.9 seobservaque la biomasa

obtenidacon el MQE es significativamentemenorque la obtenidacon e] MMET. En la

Figura 7.10 aparecela reproduccióncon ambosmodelosde la velocidadde formación de

xantano, de consumode azúcar yla evolución de oxigeno disuelto, observándoseque

tambiénla producciónde xantanoesmenoren el casodel MQE queen el MMET, lo que de

nuevoparecerelacionadocon la infraestímaciónde biomasa.

384

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

En las Figuras 7.11 y 7.12 se muestran las reproduccionesde los datos

experimentalespara el experimentoo’ 6, llevado a caboa 280 C y con 130 p.p.ni. de

amonio inicial. En la Figura 7.11 se observaque apenashay diferenciaentre la evolución

de biomasaobtenidapor el MQE y la obtenidacon el MMiET, si bien, en estecaso, la

concentraciónde biomasaen la faseestacionariade crecimientoobtenidacon el MQE es

mayorquecon el modelometabólico.En la Figura7.12 aparecela reproduccióncon ambos

modelosde la velocidadde formaciónde xantano,de consumode azúcary la evoluciónde

oxígenodisuelto,observándosequeno haydiferenciasdestacables.

En las Figuras 7.13 y 7.14 se muestranestos mismos resultadospara el

experimento n0 7, llevado a cabo a 280 C y con 475 p.p.m. de amonio inicial. En este

caso,el ajusteesrealizadocon el MCC-3 modificado,es decir, el que tiene en cuentael

término de inhibición del crecimientocon estaconcentraciónde sustratonitrogenado.En la

Figura7.13 seobservaque MQE (líneacontinua)prediceunaconcentraciónde biomasaen

la fase estacionariade crecimiento algo inferior a la obtenidacon el MMIET. Ademásse

observa,de nuevo, la mejor reproducciónde la evoluciónde amonio con el MQE. En la

Figura 7.14 se ha representadola reproduccióncon ambos modelosde la velocidadde

formaciónde xantano,de consumode azúcary la evoluciónde oxígenodisuelto.El MQE

predicetambiénenestecasounaconcentracióndexantanomásbajaa la que seobtienecon

el MJvIET y, en consecuencia,una menor velocidadde consumode azúcary oxígeno.

Si bien las diferenciasen las reproduccionesde los datos de cada uno de los

experimentosno son muy significativas, se observa que el modelo químicamente

estructurado predice, salvo en el experimento n0 6, una menor concentracióndel

polisacárido.Esto pareceser debido a que la biomasaque prediceel MQE es también

inferior a la queprediceel MIEMy ala obtenidaexperimentalmente.Como ya seha visto, la

curva de evolución de biomasa obtenida con el Modelo Cinético Químicamente

Estructuradoes, en casi todos los experimentos,inferior a la obtenida con el Modelo

CinéticoMetabólico. Estapequefladiferenciaen la biomasaeslaqueprovoca,por tanto, la

diferenciaen la predicciónde algunosotros componentes(xantanoy azúcar) en la parte

correspondientea laproducción.

385

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

2,0

Figura 7.1-

.4

ti.

=9

‘5’

Figura 7.2-

1,0

0,5

Ox)60

Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amoniodelexperimenton0 1 (25 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado(líneacontinua).

25

2.0

15

1.0 t

05

0~O

Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxigenodisueltodel experimenton0 1(250C y 257 p.p.m.deamonioinicial)entreelModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado (líneacontinua).

t(h)

40

O lO 20 30 40 50 60

(h)

386

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

~0

5’.4

=9zu

Figura 7.3-

(5.

a

0,6

0,4

0,2

0,060

Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amonio delexperimenton0 2 (28 0C y 257 p.p.ni. de amonio inicial) entre el ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo Cinético QuímicamenteEstructurado(líneacontinua).

2,5

2,0

o

lo ~‘u

0,5

0,0

t (h)

Figura 7.4.- Comparación de la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxígeno disuelto del experimenton0 2 (28 0C y 257 p.p.ni. de amonioinicial) entreel Modelo CinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado(líneacontinua).

1,2

1,0

0

30

t(h)

0 10 20 30 40 50 60

387

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

‘9=9u

=9u

Figura 7.5-

-4

(1‘-4

=95’

Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amoniode]experimento n0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado (líneacontinua).

2,5

2,0

x1,0

u

0,5

0,003

Figura 7.6.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxigenodisueltodel experimenton0 3 (31 0C y 257 p.p.m.deamonioinicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico(línea discontinua)y elModeloCinéticoQuimicamenteEstructurado(líneacontinua).

388

t(b)

45

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

2,0

1,5

0,5

O.

Figura 7.7-

(5-

5’

Figura 7.8.-

Comparación de la reproducción de la evolución de biomasa y amonio delexperimento n~ 4 (34 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado(líneacontinua).

2,5

2,0

I,5~

t.

lo‘1

0,5

0,0

Comparación de la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxigenodisueltodelexperimenton0 4 (340C y 257 p.p.ni. deamonioinicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y elModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado(líneacontinua).

389

‘5’.4

=95’

O lO 20 30 40

t(h)

t (h)

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

2.0

.5—

O

5u

1.0

0.5

0.0o I0 20 30 40 50 60

t (h)

Figura 7.9.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amonio delexperimento n0 6 (28 0C y 65 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado(líneacontinua).

(5-

u”

2,5

z0

“5;

t

toQ=

cts

QO

Figura 7.10.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxígenodisueltodel experimenton0 5 (28 0C y 65 p.p.¡n.deamonioinicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado (líneacontinua).

390

• •

• c~•

I~ U u

a

tu —e— —

t (h)

ModeloCinéticoQuímicamente Estructurado

2,0

1.5

5’

=96<

1,0

0.5

0,060

Figura7.11.-Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amonio delexperimenton0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial) entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado (líneacontinua).

(5.

.4

=9u”

2,5

2,0

1,5o

u1,0

0,5

0,0

Figura 7.12.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantano yoxigenodisueltodelexperimenton0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial)entreelModeloCinéticoMetabólico(linea discontinua)y elModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado (líneacontinua).

t(h)

t (h)

391

2,0

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

á5’.4

4u

Figura 7.13-

40

35

30

4

rs

25

20

I5

Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amoniodelexperimenton0 7 (28 0C y 475 p.p.ni. de amonio inicial) entreel ModeloCinético Metabólico ([inea discontinua) y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado <línea continua).

lo.

O

2,5

24

E5

o

CF

cts

00

Figura 7.14.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxígenodisuelto del experimenton0 7 (28 oc y 475 p.p.m. de amonio inicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico (líneadiscontinua)y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado (líneacontinua).

0 lO 20 30 40

t(h)

O lO 20 30 40 50L (h>

392

Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado

7.2.1. Meiora del Modelo QuímicamenteEstructurado

En vista de los resultadosobtenidos con el Modelo Cinético Químicamente

Estructurado,sepuedeconcluir que los resultadosobtenidosson,como cabíaesperarmuy

semejantesa los obtenidoscon el Modelo Cinético Metabólico. No obstante,en todos los

experimentoscon la excepcióndel experimentorealizadoa 130 p.p.m, seobservaque el

?vIQE predice una concentraciónde biomasaalgo inferior a la experimental,y también

inferior a la que prediceel modelo metabólico.Estadiferenciaen la biomasaserefleja en la

evolución de xantanoy azúcar, de forma que la concentraciónde xantanotambiénes

inferior en el MQE y por tanto también es menor el consumode azúcary de oxígeno

disuelto.

La diferenciade laconcentraciónde biomasacon el MQE respectoa la experimental

ya fue observadaen el capituloanterior.Esto puedeserdebidoa que estemodelo considera

la biomasacomo la suma de tres componentesintracelulares,es decir la suma de la

concentraciónde DNA, de RNA y de proteína intracelular en cada momento de la

fermentación,y puedeserque hayaotro componenteque tengaun pesoapreciableen dicha

biomasa.

Puede ser que el microorganismo,segúnlas condicionesen las que se realice el

proceso.acumuleotro compuestointracelularmente,probablementehidratosde carbono,los

cualesno hansido analizadosexperimentalmente.De esta forma, segúnLas condicionesa

las que se hayarealizadola fermentación,la diferenciaentre la biomasateórica(sumade

DNA, RNA y proteínasintracelulares)y la experimentalpuedesermayoro menor.

Porello, sehapensadoen realizarajustescon el ModeloQuímicamenteEstructurado

de los datosexperimentales,incluyendo un nuevotérminoen la ecuacióncorrespondientea

la evolución de biomasa,que corresponderáal componenteintracelular que se acumula

(hidratos de carbono), en la ecuación correspondientea biomasa.Así la velocidad de

producciónde biomasavienedadaahorade la siguienteforma:

cIC~ — dCP~PJA + dCDNA + dCppj Q%~. [7.36]

dt dt dt tít +kHc

393

¡VIoc/eleCinéticoQuímicamenteEstructurado

Ya se ha comentadola grandificultad, desdeun puntode vista matemático,de realizar

ajustesen múltiple respuestacon un modelo con un númerotan elevadode parámetros.Por

ello, los ajusteshansido realizadosfijando el valorde los parámetrosyacalculadosde la forma

explicada, y dejandoflotar únicamenteesteparámetrocorrespondientea hidratosde carbono

(kHc).

En la Tabla 7.4 se muestranlos valoresobtenidosdel parámetrokHc por ajuste en

múltiple respuestacon el modelo MQE paracadauno de los experimentosrealizadosen este

trabajo.

Tabla 7.4.- Valor del parámetro kuc obtenido por ajuste del MQE a los datos de losexperimentosllevadosa caboen estetrabajo. ________________

Panámetro t Student

¡ Experimento Max. Opt. Mm Obt. Teor

¡ 4.2. í04 TÑo”’ ““TéTif”’5,1.i0~ 2.9

2 302.10” 3.0110” TbéiÁ0’t5IO~ 2,92

3 1.51.10’

‘7717101

TIbio’ 1,49.10~ 4.2.1O~ 2.73

4 l,52.Iff’ ?,51.lO~ 6,1.10 3.25

5 2,7.I0~’ 2,71.10’ 2,71.10’ 5,1W 2,70

6 2,8.10~’ 2,8.10~ 2,8.10~ 7,2.10~ 2,92

7 3.21.10” ‘ 3.2.10’ 3,19.10’ 2.2.10~ 2,9

En las Figuras 7.15 a 7.28 se muestranlos resultadosobtenidosde la reproducción

de los datosexperimentalescon el Modelo QuímicamenteEstructuradoteniendoen cuenta

el término de hidratos de carbono en la evolución de biomasa. Al igual que en el caso

anterior, se muestranlos resultadosobtenidos con este modelo, indicados con línea

continua, y su comparacióncon el modelo cinético metabólico, indicado por línea

discontinua.Como puedeobservarseen las citadas figuras se obtiene una si~íflcativa

mejora en la reproducción de los datos experimentales,especialmenteen aquellos

experimentosdonde la diferencia entre la biomasateórica y la experimental era más

significativa.

Por tanto, se concluyeque al incluir el término de hidratosde carbonocomo otro

componentemás de la biomasase mejorasignificativamentela reproducciónde los datos

experimentalescon el ModeloQuímicamenteEstructurado.

394

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

2,0

1,5

u”-4

=96<

1,0

0,5

0,060

t(h)

Figura 7.15-

(3.4.59u”

Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amonio delexperimenton0 1 (25 ‘C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entreel ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo Cinético QuímicamenteEstructuradocon el términode hidratosdecarbono(líneacontinua).

2.5

2.0

1.5;

t.1.0 .s

0.5

0.0O lO 20 30 40 50 60

t (ti)

Figura 7.16.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxígenodisuelto del experimenton0 1(250C y 257 p.p.m.deamonioinicial)entre el Modelo Cinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructuradocon el termino de hidratos de carbono (líneacontinua).

rO lO 20 30 40 50

395

¡Viodelo CinéticoQuímicamenteEstructurado

2.0

“y

5’

.4

Figura 7.17-

LO

0,5

0.060

Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amonio delexperimenton0 2 (28 0C y 257 p.p.mn. de amonio inicial) entreel ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo Cinético QuímicamenteEstructuradocon el términode hidratosde carbono(líneacontinua).

(5.

=9cf

2,5

2,0

1<

o

IOy

0,5

0,0

tQ,)

Figura 7.18.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxigenodisueltodel experimenton0 2 (28 oc y 257 p.p.m.deamonio inicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamente Estructurado con el término de hidratos de carbono (líneacontinua).

t(h)

0 lO 20 30 40 50 60

396

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

5’.4

.59.5’

40

Figura 7.19- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amoniodelexperimenton0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructuradoconeltérminode hidratosde carbono(líneacontinua).

14.59u”

2,5

2,0

l,5

o

‘CF

0,5

0,040

t (ti)

Figura 7.20.- Comparación de la reproducción de la evolución de sacarosa,xantano yoxígenodisuelto del experimento n0 3 (31 0C y 257 p.p.n. de amonio inicial)entreel ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructuradocon el término de hidratos de carbono (líneacontinua).

O lO 20 30

t(h)

-y-0 10 20 30

397

Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado

2.5

5’

.59

.4

0,5

0.0

ci..4

.59u”

2.5

2,0

I,5’9

o4

1,0 ~u

0,5

0,0

Figura 7.22.- Comparación de la reproducción de la evolución de sacarosa,xantano yoxígenodisueltodel experimenton0 4 (34 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y elModeloCinéticoQuímicamente Estructurado con el término de hidratos de carbono (líneacontinua).

398

2,0

t(l¡)

Figura 7.21- Comparación de la reproducción de la evolución de biomasa y amonio delexperimento n0 4 (34 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo Cinético QuímicamenteEstructurado con el término de hidratos de carbono (líneacontinua).

(lii

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

30T

40 50 60

Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amoniodelexperimento n0 5 (28 0C y 65 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinéticoMetabólico (línea discontinua) y el Modelo Cinético QuímicamenteEstructuradoconel términode hidratosde carbono(líneacontinua).

4Q4

30-

u”20 J

lO-,

o1> 10 20 30 40 50

2,5

2,0

LS;

ao60

jo,)

Figura 7.24.- Comparación de la reproducción de la evolución de sacarosa,xantano yoxígenodisuelto del experimenton0 5 (28 ‘C y 65 p.p.m. de amonio inicial)entreelModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamente Estructurado con el término de hidratos de carbono (líneacontinua).

2,5

2.0-

‘.5

1.0-

u

0.0

• ¡

- r~4f~—.~ .- — n9•mp •mp 3 —

o lo 20

Figura 7.23-

a’;;a’;,

4 u 44

u.U

¡ u4 4 5

44 AA

.. e”‘0

aA

nfl..-& .A..’......A-- - -

399

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

lo 20 30

t(h)40 50

Figura 7.25- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amoniodelexperimento n0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial) entreel ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo Cinético QuímicamenteEstructurado con el término de hidratos de carbono (línea continua).

40

35

(Y-4

=9cf

30

25

20

‘5.

lo

5

2,5

2,0

1,5o

u

0,5

0 0,00 10 20 30 40 50 60

Figura 7.26.- Comparación de la reproducció¡v’~tle la evolución de sacarosa,xantano yoxigenodisueltodel experimenton0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructuradocon el término de hidratos de carbono (líneacontinua).

2,5

2.0 —

cftt

=96<

1,0

u

•

U.U

-<él0.SJ

0,0 ‘1~

o 60

400

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

5’

=9

6<

Figura 7.27- Comparación de la reproducción de la evolución de biomasa y amonio delexperimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructuradoconel ténninode hidratosde carbono(líneacontinua).

2,5

2,0

ti(Y

u”

A‘0A.

‘0

AA A-r QO

0 10 20 30 40 50 60

o,)Figura 7.28.- Comparación de la reproducción de la evolución de sacarosa,xantano y

oxigenodisueltodel experimenton0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial)entreel ModeloCinético Metabólico(líneadiscontínua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructuradocon el término de hidratos de carbono(líneacontinua).

2.5

O lO 20 30 40

t(h)

401

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

En vista de la importantemejora en los resultadosal incluir el componentede

hidratos de carbono en el modelo, es necesario ahora observar si el parámetro

correspondientea estecomponentetiene tendenciacon las variables, para llegar de esta

maneraa un Modelo QuímicamenteEstructuradodefinitivo.

En la Figura 7.29, se muestrala tendenciadel parámetrokHc con la temperatura

(líneacontinua); la línea discontinuaindica la forma de la curva(función) a la que podría

serajustadala evoluciónde esteparámetro,estoesunafunciónlinealdescendente.

En laFigura‘730 aparecerepresentadala evolucióndel parámetrokHc con respectoa

la concentracióninicial de amonio. Como se puede apreciar,se puedeasumir, que la

tendenciaesaun valor máso menosconstante,como indica la líneadiscontinua.

Por tanto, el Modelo QuímicamenteEstructuradoviene dado por las ecuaciones

[7.15] a [7.17] para DNA, RNA, proteínasintracelulares,respectivamente.Para la parte

correspondientea la producción, las ecuaciones[7.2] a [7.4] expresanla evolución de

sacarosa,xantanoy oxígenodisuelto. Finalmentela biomasavendrádadapor la ecuación

[7.35~¡, donde, a su vez, el parámetrokHc viene, en función de la temperatura,por la

siguienteecuación:

kuc(T)~ [7.36]

402

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

5

4

o3

‘1

o24

Tenperaura

7.29.- Variación del parámetro kHc delEstructuradocon la Temperatura.

3

co

z12

It

Oloo 200 300

Modelo Cinético Químicamente

400 500

S(Ppm)7.30.- Variación del parámetro kHc del Modelo

Estructuradoconla concentracióninicial de amonio.Cinético Químicamente

• 1 ¡

—e--Kl.

u

Figura

¡ 1 1 • ¡

26 28 30 32 34

u

ue

-J

Figura

403

ModeloCinético QuímicamenteEstructurado

7.3.-SIMULACIÓN CON EL MODELO CINÉTICO QUÍMICAMENTEESTRUCTURADO

Una vezplanteadoel modelo MQE definitivo, con los valoresde los parámetrosen

función de la temperatura, se puede emplear para realizar simulación de distintas

operaciones.Como ya se ha comentadoa lo largo de esta Memoria, las simulaciones

permiten estudiar la influencia de ciertos factores sobre el sistema consideradosin

necesidadde realizarla experimentaciónoportunaparaello.

La forma más adecuadade realizarsimulacionesesteniendoen cuentala influencia

de las variablesen los parámetrosdel modelo cinéticoplanteado. Estoha sido posiblepara

los experimentosrealizadosa diferentes temperaturas.Para los experimentosllevadosa

cabo con diferentes concentraciones iniciales de nitrógeno, no fue necesario tal

planteamiento,puespresentabanuna tendenciaconstantecon la concentraciónde nitrógeno

inicial, debidoa que las expresionesde las ecuacionescinéticasya incluyenel términode la

concentraciónde nitrógenoen dichasecuaciones.

Esto último no habíasido conseguidohastaahora,esdecir, ni con el modelo cinético

no estructuradoni con el modelo cinético metabólico se pudo obtener relación de

parámetroscon la variable concentracióninicial de amonio. La razón de ello es que el

sustratonitrogenadoeraabordado,en amboscasos,de forma no estructurada,por lo que

estosmodelosno erancapacesde predecirla influenciade cambiosen la composicióndel

medio, como,por ejemplo, de la concentracióninicial de amonio sobrela produccióndel

polisacárido.

El modeloquímicamenteestructuradoescapazde predecirlo mismo que sehabía

visto parael modelo cinéticometabólico(ver capítulo5 de estaMemoria),pero introducela

posibilidad de predecir la influencia de cambios en la composicióndel medio, en la

producciónde xantano,aspectosin precedentealguno. Por ello, únicamentesepresentaen

estecapitulo la principal mejoraen la predicciónque introduceel Modelo Químicamente

Estructuradoplanteado.

404

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

Se han realizado, por tanto, simulacionesvariando la composicióndel medio,

concretamenteen lo que respectaa la concentraciónde nitrógeno inicial. Han sido probadas

4 concentracionesiniciales: 70 p.p.m., 200 p.p.m., 250 p.p.m y 350 p.p.m., no se han

realizado simulaciones con concentraciones más elevadas debido al posible efecto

inhibitorio de amonio a partir de cierta concentracióncrítica, que se ha estimadoen el

mayorde los valoresanteriores.

En la Figura 7.31 se muestrala evolución de la biomasay de amonio con las

diferentes concentracionesiniciales de amonio. Se observa que cuanto mayor es la

concentraciónde amonio mayores la concentraciónde biomasaalcanzada,y que,portanto

laconcentraciónde sustratonitrogenadoinfluye notablementeen la velocidadde formación

de biomasa.

Aunque solo se muestralaevoluciónde biomasa,no hay que olvidarque éstaes,en

realidad,la suma de componentesintracelulares:DNA, RNA, proteínas intracelulares e

hidratosde carbono,cuyasevolucionesconel tiempo de fermentación puedenser predichas

conestemodelo.

La Figura 7.32 muestrala influenciade la concentracióninicial de amonio en la

produccióndel polisacáridoy enel consumode azúcar.Seobservaqueexisteun máximo en

la producción,de forma que la concentraciónen la que la velocidad de formación de

xantanoesmayorescon la concentraciónde 200 p.p.m, con concentracionessuperioreso

inferioresaéstalavelocidaddeproduccióndel polisacáridoes menor.Es decir, el modelo

químicamenteestructuradopermitepredecirun máximo en la produccióndel polisacárido

dependiendodela concentracióninicial deamonio,aspectoobservadoexperimentalmente.

En la Figura ‘7.33 semuestra la evolución de oxígeno disuelto para estasmismas

condiciones.Como ya seha visto, la concentraciónde oxígenodisuelto encadamomento

está fúndamentalmente relacionada con la concentracióndel polisacárido,esto es,cuanto

mayor seala concentraciónde xantano,mayor serála viscosidady, como consecuencia,

menor la velocidadde transporte y concentración de oxígenodisuelto.

405

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

2.5

2,

4

‘4

=94

1,5

“o

0,5

o.,

Simulación con el modelo MQEconcentración inicial de amonioconsumode amonio.

para observar la Influencia de lasobre la evolución de biomasay

Clave Ce..,¡ C.c 70 pprfl

ZC,.c200ppm C,3 C,.

0.250ppm Cp —

4 C,¡.r 350 ppm

Figura 7.32.- Simulación con el modelo MQE para observar la influencia de laconcentración inicial de amonio sobre la evolución de azúcar yproducción de xantano.

406

Figura 7.31.-

t (h)

¡ • ¡45

40—

35—

30—

~25-c~J,. -

220-00

cf ‘5-

lo—

5—

o

2 —

1~

43

2.

20 40t(h) 60

80

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

25

20

‘5

Y

5

olOO

Figura 7.33.- Simulación con el modelo MQE para observar la influencia de laconcentracióninicial de amonio sobrela evolución de oxígenodisueltoy kLav.

Por tanto, sepuedeconcluir queel modelo químicamenteestructuradopermiteuna

adecuadaprediccióndel procesode producciónde xantano.De la misma maneraque ya

fue vistaparael modelo cinéticometabólico,el MQE permiteunaadecuadareproducción

de la evolución del consumode azúcar,producciónde xantanoy de la evolución del

oxígenodisuelto Se obtieneunasignificativa mejoraen la predicciónde la evolucióndel

sustratonitrogenado,graciasa la estructuraciónde estecompuestoen el crecimientodel

microorganismo.

Parecenecesario,por tanto, estructurarel metabolismo,tanto del sustratocarbonado

(en el modelo cinético metabólico)y comodel sustratonitrogenado(modelocinético de

célula), tanto en la parte correspondienteal crecimiento como en la produccióndel

productode interésindustrial,con el fin de predecirla influenciade cienoscambiosque,

de otra forma,no seriaposiblellevar a cabo.

2,5

t (h)

407

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

La principal mejoraque incluye el modelo cinético químicamenteestructuradoes

que al describir de forma más adecuadael crecimiento también lo hará para la

producción.Así, porejemplo, la variaciónde la concentracióninicial de amonio se verá

reflejadatantoenel crecimientocomoen la produccióndel polisacárido.La influenciade

estavariableen la producciónapareceen la Figura 7.34. En ella sepuedeobservarel

máximo en la producciónque prediceel MQE, con la variaciónde la concentraciónde

amonio enel medio.

La citada Figura representala comparaciónentre la concentraciónde xantano

alcanzadaa las 50 horas de fermentaciónque predice el MQE empleandoparámetros

particulares(línea 1), esdecirlos obtenidosparacadaexperimento,y sucomparacióncon

la prediccióndel mismo modelo pero con parámetrosgenerales,esdecir el modelo en

función de temperatura(línea2). En la Figura, tambiénaparece(indicadapor puntos) la

concentraciónde xantano experimentalobtenida con las diferentesconcentracionesde

nitrógenoa las 50 horasde fermentación.

Paralos tres casosseobservaun máximo en la producciónentrela concentraciónde

amonio de 200 y 250 p.p.m.. La principal diferencia entre ellas estriba en que la

reproduccióndel polisacáridocon los parámetrosparticularesproporcionaconcentraciones

de xantanoinferioresa los valoresexperimentales,mientrasque con la reproduccióncon

los datos particulares se consiguen concentracionesde xantano mayores que la

experimental,si bien hay que comentarque no son diferenciasmuy significativas, de

apenas1-1,5 g/L de diferencia.

408

ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado

16

14

12—

lo-.

ti

6—

4—

2—

o- ~

50 lOO 150 200 250 300 350 400 450 500

C~4 (p.p.nv)

Figura 7.34.-Prediccióncon el MQE de la concentraciónde xantanoalcanzadaa las 50horasde fermentacióncon diferentesconcentracionesinicialesde amonio.

Por tanto, el Modelo Químicamente Estructurado consigue la descripción

adecuadade los componentesdel sistemaobjetode estudioy permitepredecirla influencia

en el procesode variablescomo la temperaturay la concentracióninicial de la fuente

nitrogenada,algo que sin dudapuedeabrir el camino de facilitar la laboriosatareadel

cambiode escalaen los procesosllevadosa cabopormicroorganismos,e inclusoel diseño

de los mediosde producción.

&at&W’T paaTnoSpartCWfl

2 Siwu]ao¿T± t*nÚ~s ga1eI~

409

8.- RESUMENY CONCLUSIONES

Resumeny Conclusiones

8.- RESUMENY CONCLUSIONES

8.1-RESUMEN

En el presentetrabajode investigaciónseha llevadoa caboel desarrollode modelos

cinéticos de diferente grado de complejidadpara observarsu capacidadde describir la

influencia de ciertas variablesen un sistemamicrobiano,con el fin de obtenerun modelo

predictivo tantode la evolucióndel sistemaen sí, comode surespuestaa perturbacionesen

las condicionesde operacióndel proceso.Paraello, sehaaplicadola metodologíaempleada

por la IngenieríaQuimica en el campodel desarrolloy aplicaciónde los modeloscinéticos

de redescomplejasde reacciones.

El sistemamicrobianoelegidoen estetrabajo,pararealizarel desarrolloy aplicación

de los modeloscinéticos,ha sido la Producciónde Xantano. La elecciónde este sistemade

producción sedebeaqueesun procesobienconocido,desdeel puntodevistametabólicoy

microbiológico,y hasido ampliamenteestudiadopor el equipode investigaciónen el que se

ha realizadoel presentetrabajo.El xantanoesun biopolisacáridoque seobtiene mediante

fermentaciónsumergida de sustratoscarbonadosen presenciade la bacteria aerobia

Xanthomonascampestrisy otra serie de nutrientes esencialespara el crecimiento del

microorganismo.El citado polisacáridoes ampliamenteutilizado en diferentestipos de

industrias(farmacéutica,alimentaria,textil, etc.) debidoa la propiedadque presentansus

4)’1

Resumeny Conclusiones

disoluciones,una elevadaviscosidaden un amplio intervalo de condiciones,incluso con

unabajaconcentraciónde polisacárido.

El fenómenode transferenciade oxígenocobraespecialimportanciaen estesistema

ya quela bacteriaes aerobiaestricta,esdecirprecisadel mismo parasubsistiry parallevar a

cabo la producción. La viscosidadgeneradaen el caldo durantela fermentación,por la

propiaproducción del polisacárido, dificulta enormementela transferenciade oxígeno al

microorganismo(Gómez,1995).

En trabajospreviosseoptimaronlas condicionesde operaciónnecesariasparaIJevar

a cabo la produccióndel polisacárido(preparacióndel inóculo, temperatura,perfil de

agitación,etc.), asícomo la composicióndel medioa emplearen el proceso(Santos,1993).

Asimismo, se ha observadola influencia de las citadas condicionesde operaciónen las

propiedadesdel producto obtenido (reología de sus disoluciones, peso molecular y

contenidosen acetatoy piruvato)(Casasy Col.. 1999).

En estetrabajo se han propuesto,como se ha comentadoanteriormente,modelos

cinéticosde diferentegrado de complejidad.El primer modelo propuestoesun modelo no

estructurado-nosegregado(MNE), esdecir, la poblaciónmicrobianase ha considerado

como un componenteo reactantemásdel sistema,que sedenomma“biomasa” sin teneren

cuenta las reaccionesque se producen en su interior tanto para el crecimiento del

microorganismocoito para la síntesisdel productode interés.En este modelo setienenen

cuentaobservacionesexperimentalestalescomo que el sustratonitrogenadoesel limitante

del crecimientoy que el xantano es un producto parcialmenteasociadoal proceso de

crecimiento.

El siguientepasoen la complicacióndel modelo es el planteamientode un Modelo

Cinético Metabólico,esdecir, la poblaciónmicrobianase sigueconsiderandode la misma

formaque en el casodel modelo no estructuradoy no setienenen cuentalas reaccionesque

sedan en el interior del microorganismoparala reproduccióndel mismo; sin embargo,las

reaccionesque tienenlugarparala obtencióndel productose han considerado,medianteun

esquemade reacciones con estequiometríadefinida. Se ha propuesto un esquemade

reacciónsimplificado, empleandoherramientasde IngenieríaQuímica, como el lumping o

agrupamientode compuestossimilaresen un únicocompuestotipo y la suposiciónde estado

412

Resumeny Conclusiones

pseudoestacionariopara componentescomo el ATP y los cofactores. Se proponen

relacionesestequiométricassimplificadasconsiderandoque el sustratocarbonadose emplea

para la síntesisde xantanoy parael mantenimientodel microorganismoen estadoviable,

principalmente

Las reaccionesquetienenlugardentrode los microorganismosparaque seproduzca

el crecimientoo reproducciónde los mismos,sehanconsideradoaisladamente,proponiendo

un Modelo Cinéticode Célula;esdecir, seha desarrolladoun modelo en el queno setiene

en cuentala parte correspondientea la producciónde xantano,sino únicamentela parte

correspondienteal crecimiento, considerandola biomasa microbiana constituida por

componentesintracelularescomo son proteínas y ácidos nucleicos (RNA y DNA),

proponiendoun esquemade reacciónsimplificado. Se consideraademásque partede las

proteínasque produce el microorganismovan a ser secretadasal medio, esto es son

proteínasextracelulares.

El último de los modelos que se ha desarrollado es del tipo denominado

QuímicamenteEstructurado,ya que consideratanto las reaccionesintracelularesque dan

lugaral crecimientocomoaquellasque tienencomo resultadola produccióndel compuesto

de interés.Por lo tanto,estemodeloestáformadopor la unión del modelode célulaparala

descripcióndel crecimientoy del modelo metabólicoparaladescripciónde la producción.

La aplicaciónde los citadosmodelosseha llevadoa cabomedianteajusteestadístico

de datos, obtenidos experimentalmenteen diferentes condiciones, al modelo cinético

planteadoen cadacaso,por lo que ha sido necesariotanto el desarrollode programasde

cálculooportunos,comola obtenciónde los datosexperimentales.

Los programasde cálculo aplicados han sido realizados en FORTRAN 77,

empleándosesiempreel algoritmo de regresiónno lineal de Marquardt (1963) tanto en

simple como en múltiple respuesta,acopladoa algoritmos de integración(Runge-Kuttay

Simpson),ya que en todos los casosse ha utilizado el métodointegral parallevar a caboel

cálculode los parámetroscinéticosde los diferentesmodelospropuestos.

El trabajo experimentalse ha realizadoen un bio-reactorcomercial de 1,5 L de

volumen útil tipo tanqueagitado y aireado.Las condicionesde operaciónempleadashan

413

Resumeny Conclusiones

sido las optimadaspreviamente,comoya se hacomentado:un caudalde airede 1 L/L¡min:

un pH inicial de 7, no siendocontroladodurantela fermentación;perfil de agitacióncon una

velocidaddc 210 r.p.m., variablea lo largo del tiempo (Santos1993, García-Ochoay col.,

1997). Como fuente de carbonoseha empleadosacarosaen concentraciónde 40 g/L y el

medio de producciónusadoha sido el propuestopor García-Ochoay col. (1992) como

óptimo para La producciónde xantano. Las variablesestudiadasen el trabajoexperimental

han sido la temperatura (25. 28, 31 y 34 oc) y la concentracióndel nutriente

nitrogenado(amonio: 65, 130, 257 y 475 p.p.m.) en el medio de producción,ya que en

estudiospreviossehaobservadoque ambasvariablesinfluyenen la evolucióndel sistema,

incluso con lapresenciade un máximoen la producciónde xantano.

El Modelo CinéticoNo Estructuradopropuestoestáformado por un sistemade

ecuacionesdiferencialescon cuatro componentesclave o respuestas(biomasa,sustrato

carbonado,productoy oxígenodisuelto) y sieteparámetros(ecuaciones[4.13] a [4.18]).

Se llevó a caboel ajustede Los datosexperimentoa experimentocon estemodelo,

obteniéndosevaloresde los parámetrosparacadauno de dichosexperimentos.Los citados

valores son capacesde describir de forma satisfactoriala evolución de la biomasa,el

sustratocarbonadoy el productoen todos los casos,pero la descripciónde la evoluciónde

oxigeno disuelto y la prediccióndel consumodel sustratonitrogenadoobtenidosno son

aceptables.La simplicidadde estemodelo hacequepresentevariasdeficiencias,ya que con

él no esposibleteneren cuentalas influenciasen la producciónde xantanoni del oxigeno

disuelto,ni de la cantidadde sustratonitrogenadosuministradoal sistemay, además,los

parámetrosobtenidosmedianteestemodelo no son relacionablescon la temperatura.Por

tanto, estemodelo sencillo pareceútil únicamentepara la descripciónde experimentos

aislados.

El Modelo Cinético Metabólico desarrolladopretendesubsanarlas deficiencias

observadasen el ModeloNo Estructurado.Paraello, ha sido necesarioel planteamientode

un esquemade reacciónsimplificado del metabolismodel sustratocarbonadoconsiderando

las rutasmetabólicaspor las quetranscurreel proceso.Es decir, en estemodeloserealizala

estructuracióndel metabolismodel sustratocarbonadoen unaseriede reacciones,el sustrato

nitrogenadono seestructuray, al igual que en el modelo anterior,no esconsideradocomo

respuestaen el esquemade reacción. El modelo consta de relacionesestequiométricas

414

Resumeny Conclusiones

definidasque consideranla producciónde xantano(ecuación[5.1]), el catabolismototal de

la glucosa(ecuación[5.5]), la fosforilaciónoxidativa (ecuación[5.6]) y la energíanecesaria

para el mantenimiento del microorganismo en estado viable (ecuación [5.7]). Para

compuestoscomo ATP y Cofactoresserealizala suposiciónde estadopseudoestacionario,

ya que no hansido medidos.

El modelo metabólicoescapazde describir la evoluciónde todos los componentes

ajustados(biomasa,sustratocarbonado,xantanoy oxígenodisuelto)de forma satisfactoria;

sin embargo,la predicciónde la evolucióndel sustratonitrogenadono esbuena,debido a

que se empleanlas mismasecuacionesparaladescripcióndel crecimientoque en el modelo

anterior, como ya se ha comentado. En cuantoa la influencia de las variablesen los

parámetros,con este modelo ha sido posible proponer expresionesen función de la

temperaturade los parámetrospresentesen la parteque sehabíadesarrollado.Asimismo,

estemodeloes capazde predecirla influenciaen laproduccióny en el consumodel sustrato

carbonadode cambiosen la transferenciade oxígeno(variacionesen la agitacióno en el

caudalde aire suministrado)en el sistema,ya que en las citadasrelacionesestequiométricas

apareceel oxígenocomo un reactantemásy ésteestá incluido en las ecuacionescinéticas

propuestas.ya que se consideracomo nutrientelimitante del proceso.La influenciade la

concentracióninicial de sustratonitrogenadoen la producciónno se puedetener en cuenta

con estemodelo ya quedescribeel crecimientode formamuy simplificada.

Parael planteamientodel Modelo Cinético de Célula fue necesarioel desarrollode

metodologíadebidoa queen la literaturano seencontraronantecedentesde modelosde este

tipo para el sistemadeproducciónde xantano;y aunqueexistenpara otros sistemas,los

parámetrosno secalculanpor ajustede datosexperimentales.

En primer lugar, parala aplicaciónde modeloscinéticosde célula, esnecesarioel

análisisde componentesintracelulares,para lo que fue precisoel desarrollode métodos

de análisis de los citados componentes.Este fue un punto esencialen la realizacióndel

presentetrabajo,debido a la dificultad de realizar el análisis de estoscompuestospor las

técnicasbioquímicasconvencionales,al menosparabacterias.El métodoadoptadoen este

trabajo paratal análisis fue la Citometria de Flujo. Estatécnicade fluorescencia está

siendoempleadacadavez más en Microbiologíadebido a la gran cantidadde información

que permiteobtenersobre un cultivo microbiano(parámetrosestructuralesy funcionales),415

Resumeny Conclusiones

con una elevadaprecisión y rapidez. En este sentido,es necesariorealizar un especial

esfuerzopara la conversiónde los datos obtenidospor estatécnica(datos cualitativos o

semicuantitativos)en datos cuantitativos (necesariospara la aplicación de los modelos

cinéticos), obteniendocurvas patrón, empleandootra técnica de fluorescenciapara el

calibrado:Espectrofluorimetria.En el presentetrabajose ha desarrolladoun procedimiento

parael análisiscuantitativode proteínasintracelulares,RNA y DNA, mediantetinción con

fluoróforos específicos(Isotiocianatode Fluoresceínae loduro de Propidio) y su posterior

análisisen el citómetrode flujo.

Una vez obtenidos datos experimentalesde la evolución de los componentes

intracelulares,es necesariala aplicación de un método para la propuestade modelos

cinéticosde estetipo. Primero debehacerseuna propuestade un esquemade reacción

simplificadodel metabolismomicrobiano(Figura6.1). En este esquemaseproponeque el

sustrato nitrogenadova a ser empleadopor el microorganismopara la formación de

aminoácidosno formadoresde bases,esdecir los que formaránproteinas,dentrode éstas

hay que distinguir aquellas que constituyenla propia biomasa (proteínaintracelular) y

aquellas que serán secretadasal exterior (proteína extracelular). Además, el sustrato

nitrogenadoseráempleadoparala formaciónde aminoácidosformadoresde bases,es decir,

aquellosqueevolucionaránhaciaRNA y DNA.

A partir del esquemaanteriorsehanrealizadodiferentessimplificacionesempleando

¡a hipótesisde estadopseudoestacionarioparadiferentescompuestos,como aminoácidos

formadoresde baseso para RNA mensajero,obteniéndose dos esquemasde reacción

simplificados(MCC-1 y MCC-2).

Unavezplanteadoslos posiblesesquemasde reacción,es necesarioconocerqué tipo

de ecuacionescinéticasson las más apropiadasen cadacaso. El método empleadopara

determinarqué expresionescinéticaspueden ser utilizadas ha sido el método de las

velocidadesde reacción (García-Ochoa y Romero, 1993), en el que se pueden aislar las

citadasexpresionescinéticassiempreque el número de componentesclave del sistema

coincida con el número de relacionesindependientes,es decir, que la matriz de los

coeficientesestequiométricossea cuadrada.En todos los casos,se probaron ecuaciones

tanto tipo potencial de primer y segundoorden como tipo hiperbólico o Monod. Los

resultadosde aplicar el método de velocidadesde reacciónsobrelas dos simplificaciones

416

Resumeny Conclusiones

propuestasllevaron a plantearuna cinéticade primerordenparalavelocidadde reacciónde

aminoácidosformadoresde bases,y cinéticasde segundoordene hiperbólicasparael resto

de las velocidadesde reacción.

La combinación de los dos esquemasde reacción junto con las diferentes

posibilidadesde las ecuacionescinéticas lleva a plantearhasta ocho modeloscinéticos

distintos,asíque sehacenecesarioemplearcriterios dediscriminaciónentreellos. Se han

utilizado criteriosestadísticosy físicos(García-Ochoay col., 1 989ay 1 990a).Los primeros

criterios aplicadosfueron los estadísticoscon el fin de observarla bondaddel ajuste.Los

valoresde la t de Studentde cadauno de los parámetrosobtenidos,así como la F de Fischer

y el valor de la sumade residuosal cuadrado(SRC)obtenidodel ajustede los experimentos

con cada modelo, permitió discriminar cuatro de los ocho modelos propuestos.A

continuaciónseaplicaroncriteriosfisicos, comoel estudiode la evolucióndel valor de los

parámetrosobtenidoscon las variables estudiadas.Aunque todos presentabantendencias

claras,hay dos modelosque parecendar un mejor resultado,concretamentetino de ellos

cuyos parámetrospuedenser puestosen función de la temperaturade acuerdoa las

expresionesdadasporlas ecuaciones[6.42] a[6.45].

El modelo propuestoescapazde reproducirlos datosde componentesintracelulares

obtenidos experimentalmente,en las diferentes condiciones, de forma plenamente

satisfactoria.No obstante,hay dos experimentosen los que los resultadosdeben ser

mejorable,parael experimentorealizadocon 65 p.p.m. de amonio inicial y el realizadocon

475 p.p.m. de estecompuesto.En amboscasos,los resultadosobtenidosno sontan buenos

comoen el restode experimentos.Porello, se introdujeroncambiosen cadacasoconel fin

de superarlas deficienciaspresentadas.En el casodel experimentocon mayor cantidadde

amonio (475 p.p.m.) se observaun efecto de inhibición por estesustrato,por lo que se

incluyó un término capazde predecirloen el modelo planteadoparateneren cuentatal

efecto, y con ello mejorar la reproducciónde los datosexperimentales(ecuación[6.50]).

Para el experimentorealizadocon la concentraciónmás baja de amonio (65 p.p.m.), fue

necesariocambiar la estequiometriaen la producciónde proteínas,pues al realizar el

balancede nitrógenose habíaobservado que “faltaba” nitrógeno,lo que hizo suponerque

el microorganismo estaría produciendo componentes con otra composición en

nitrógeno(ecuación[6.47]).

4/7

Resumeny Conclusiones

Este modelo cinéticode célulapresentauna evolucióncoherentede los parámetros

con las variablesestudiadas.Con la concentraciónde nitrógeno,la tendenciade todos los

parámetroses a un valor constante,con la temperaturapuedenserajustadosa diferentes

funciones,por tantosepuedeobtenerun modelode célulaen funciónde la temperatura.

Una vez obtenido el modelo de célula, se desarrollóel Modelo Químicamente

Estructurado,en el seque unen los últimos dos modeloscomentados:modelo metabólico

y modelo de célula. En estemodelo, tanto el sustratocarbonadocomoel nitrogenadose

estructuranen las diferentesetapasdel metabolismodel microorganismoobjetode estudio.

A] hacerla comparaciónde las reproduccionesde los datos experimentalesobtenidasa

partir de el modelo químicamenteestructuradocon el modelo metabólico,se observaque el

primero predice menos concentraciónde biomasa y de xantano. Para mejorar estos

resultadosse incluyó un término de hidratosde carbonoen la biomasa(ecuación[7.35]),

con ello se consiguetanto la mejoraen la reproducciónde biomasacomo de xantanoy, en

consecuencia,de consumode sacarosay de oxígenodisuelto.

El modelo final, Modelo QuímicamenteEstructurado,es capaz de predecir la

influencia de las mismasvariables que el modelo cinético metabólicopero con la clara

mejorade la influenciade la concentracióninicial de sustratonitrogenado,amonio.

Con ello, es posibletenerun modelo cinético que expliquela influencia, tanto en

crecimientocomo en producción,de variables como la temperaturao cambios en la

composicióndel medio, sobrelaevoluciónde los principalescomponentesdel sistema,algo

sin precedentesen la literatura.

4/8 —

Resumeny Conclusiones

8.2.-CONCLUSIONES

El Modelo Cinético No Estructuradoes capazde predecir la evolución del

sistemaen experimentosaislados.El experimentorealizadoen las condiciones

óptimas(T~ 280C; CNÚO,257g/L; N~2lO r.p.m., variable) se puededescribir

con el siguienteconjuntode ecuaciones:

dCx = 0435 ~ ±cw,[ Cx FC½o+607Cidi 6,073

dCN _ 1 dC

¿It 6,07 ¿It

dcx 1 J(7y

di 0,139 di

dCP=0o147.c .c’

di ~ X

dCo2 k(C~ Co~~ ~ ji —2,02.1< c~

1.1 .- El Modelo No Estructuradoes capazde describir adecuadamentela

evolución del sustratocarbonado,del productoy de la biomasaen cada

experimento. Sin embargo,no es capaz de describir adecuadamentela

evolución del oxígeno disuelto, ni la evolución del sustratonitrogenado

duranteel proceso.

1.2- Los parámetrosobtenidos con el Modelo No Estructurado para

diversos experimentosno son relacionables con la temperatura,ni con

ningunaotravariable.

1.3.- El ModeloNo Estructuradono escapazde predecirla influenciaen la

evolución de los componentesdel sistema (sustrato carbonado,xantano,

biomasa)de cambiosen variablesque afectana la velocidadde transferencia

de oxígeno,como la agitacióny el caudalde aire suministrados.

419

Resumeny Conclusiones

2.- El Modelo Cinético Metabólico es capazde predecirrazonablementebien la

evolución de los componentesdel sistema y está formado por el siguiente

conjuntode ecuacionesdiferenciales:

±CNjJ.CX ¿1—C~0 +Y~\ •C~0 )

dCÑ 5,94r180.{~

di 923,2

1

yUs

dC~

¿It

dC~

dr

dC~ —923,2

¿It

1

12

k4 C~>,

K4 +C<2,,

CY.[1—358Q358t47 j}]}

l+4Y,~

3,587$

dC0,

¿It

0,3 dC~923,2 de

r,=k

—0,5

~ k’—~ ~, ~ 9~ 3,58+4.Y~>j

1 k<C0 (6 1+tYrp•C~ 41—358.1

12 K4 ±C02 y’y 3~58+4.Y1~~))

- yox

dCxdi

C

“? =1,2~ATPP

2.1.- El modelo metabólicopredicede forma adecuadala evoluciónde la

biomasa,el sustratocarbonado,el productoy el oxígenodisueltoen todos los

experimentosrealizados.Sin embargo,no escapazde predecirla evolución

de la concentracióndel sustratonitrogenadoen los diferentesexperimentos.

2.2,- Los parámetrosobtenidos del ajuste al modelo metabólico de

experimentos realizados a diferentes temperaturas son relacionables,

habiéndoseobtenidolas siguientesexpresionesde los mismosen función de

la citadavariable:

dC~ k,<

420

Resumeny Conclusiones

k<”7)={ 0,94 (T- 1945) f1-exp(/,399(T-34,24))]}2

k’<’T) = —2,913+2,0481

Y,~>< (T) = (0,597.(T -24,35)11- exp(—0205-(T -37,16))]»

Y~ftT)=0,340+(—6,1.]0<T

2.3.- El modelo metabólico es capaz de predecir de forma adecuadala

influencia de la temperaturaen el consumo de sustrato, producciónde

xantanoy evolucióndel oxigenodisuelto en el sistema.En la Figura 8.1 se

muestrala influenciade estavariable sobrela produccióndel polisacárido

que prediceel modeloa las 60 horasde fermentación.Seobservaun máximo

aproximadamentea 280C, coincidentecon el observadoexperimentalmente

(Santos,1993; García-Ochoay col., 1997).

30-

20—

lo-

o.

Figura 8.1.- Evolución de la concentración de xantano alcanzada a las 60horasde fermentacióncon diferentestemperaturasde operación.

2.4.- El modelo metabólicoes capazde predecir la influenciade cambios

en las variablesque afectana la transferenciade oxigeno(agitacióny caudal

de aire) en la evolución del sustratocarbonadoy del producto.A modo de

ejemplo se muestra en la Figura 8.2 (a, b y c) la evolución de la

concentraciónde xantanoalcanzadaa las 60 h de fermentacióncon diferentes

valores de porcentajede saturacióndel oxígeno disuelto, de kLav y con

diferentescaudalesde oxígeno,respectivamente.

25 30 35

421

30

>0.4

lo—

10—

a

lO YO

l’¡ ~(h•)

c

00 03 [0 lO 20

0<LiJnin>

Figura 8.2.- Evoluciónde la concentraciónde xantanoalcanzadaa las 60 horasdefermentación con diferentes condiciones que afectan a laconcentraciónde oxígenodisuelto en el caldo.

a) Variacióndel % de oxigenodisueltob) Variaciónde kLavc) Variación del caudal

Resumeny Conclusiones

b

422

Resumeny Conclusiones

3.- La citometriade flujo esunatécnicaexcelenteparael seguimientoy análisisde

componentesintracelulares,tales como DNA, RNA y proteínas,durante una

fermentación.

3.1.- Se puedeafirmar que no esadecuadorealizaranálisisde componentes

intracelularesmediantetécnicasbioquímicasconvencionalescon bacterias

dadala escasareproducibilidadde los ensayos.Esto se debea tres aspectos

fundamentales:

a) La etapade roturade las célulasescrítica, puesno es posiblesabersi

se rompentodaslas células cuyo componenteintracelularse analiza.

Los datosvendránsiemprereferidosa la cantidadde biomasaque se

emplea,por lo que serála primerafrentede error.

b) La etapade extraccióny purificación del componentetambiénes

delicada, debido a las sucesivascentrifugacionesque se deben

realizarpara el análisis. Durante estasoperacionesse puede perder

partedel componenteintracelular.

c) La labilidad de algunoscomponentesprovocaquecuandoserompela

célula,y sucontenidoformapartedel homogeneizado,algunosde los

componentesse degradancon sumafacilidad,como porejemploes el

casodel RNA.

3,2.- La espectrofluorimetriapermiteobtenerbuenosresultadoscuantitativos

de la concentraciónde los componentes intracelulares. La espectro-

fluorimetria es una técnica de fluorescencia que emplea fluoróforos

específicos para cada componente (isotiocianato de fluoresceínapara

proteínasy ioduro de propidio paraácidosnucleicos).Paradiferenciarentre

ambosesnecesariodigerir con RiNAasaparaanalizarDNA y con DNAasa

parael análisisde RNA.

423

Resumeny Conclusiones

a) El protocolode preparaciónde las muestrasen estatécnicano incluye

la rotura celular y, por tanto, tampoco la extracción de los

componentes.con lo que la espectrofluorimetríapermitesolventarlos

problemasencontradoscon las técnicasbioquímicasconvencionales.

b) La espectrofluorimetríapermitela obtenciónde curvasde calibrado

para relacionarla concentracióndel componentey la intensidadde

fluorescencia a una cierta longitud de onda que presenta el

componente a analizar. En este trabajo, para Xanrhomonas

campestris,se han determinadolas siguientes:

C,%0 (g ¡ L) = 1,9310’ LPT ED (Xex%5364xernL623)

C~Jg/L)rz3,68.104 ,rpE ED (xexc=494~xeIflI=520)

C%1(g/L) = 3,46• ~1< . FD (xexc=494; xenh=52o)

3.3.- La citometríade flujo esuna técnicamuy adecuadaparael análisisde

componentesintracelularesduranteun procesocon microorganismos.ya que:

a) El protocolode preparaciónde las muestrases idéntico al realizado

parael análisisporespectrofluorimetria.

b) Se puedenobtenerdatoscuantitativosmediantecitometríade flujo

graciasa las curvasde calibradoparacadacomponente,obtenidas

con el apoyo de la espectrofluorimetría.En este trabajo, para

Xanthomonascampestris.se hanobtenidolas siguientes:

Cm0 (g / L) = (0,25 IP—5,95) ED NC (Xe~c%536;>5=623)

C\ÁRV] (g ¡ L) = 0,11 ED NC (Xex~=494; xern=520)

La gran cantidadde parámetrosanalizablespor citometriade flujo hacende

esta técnica una herramientamuy importante para obtener información

cuantitativa, rápida y fiable de la concentración de componentes

intracelulares,como son: viabilidad celular, tamañoy complejidadde las

células,pH intracelular,actividadmetabólica,contajedel númerode células,

entreotras.

424

Resumeny Conclusiones

4.- En el Capítulo 6 de la presenteMemoria se ha propuesto un método para

desarrollarun modelocinéticode célulabasadoen las siguientesetapas:

a) Proponerun esquemasimplificado de reacciónutilizando lumping de

especiesquímicasy la observaciónde la evolución de los componentes

del sistema.

b) Utilizar el método de las velocidadesde reacciónparaprobar distintas

ecuacionescinéticaspara las reaccionesque figuran en el esquemade

reaccion.

c) Ajustar los datos experimentalespor una regresiónen multi-respuestay

aplicarcriteriosde discriminaciónentremodelos,de carácterestadísticoy

fisico.

El método de las velocidadesde reacciónpermite la individualización (simple

respuesta)de las reaccionescorrespondientesa cada componente,facilitando

muchoel desarrollode modeloscomplejosparamicroorganismos.Permitetambién

obtenerparámetrosiniciales,paracadauna de las ecuacionescinéticasplanteadas,

facilitandoasí el ajusteposterioren múltiple respuesta.

t- El Modelo Cinético de Célula desarrolladoescapazde predecirla evolución

de los componentesintracelularesdel microorganismo,estoesdel DNA, RNA y de

las proteínasintracelulares,que constituyen la biomasa. Está formado por el

siguienteconjuntode ecuacionesdiferenciales:

dC~ = dCp~ + ¿ICDNI

¿It ¿It ¿It ¿It

¿ICR\04

¿It

dCDNA

didCPR¡ ¿ICPRE

¿It ¿It

dCNII4~ = 18(—1,4. —2,75• —2,75 )¿It 136,5 103,5 478,6 491,7

425

Resumen>Conclusiones

Siendo:

rJ=lqC\ C~

/?4.C C.2 .5 ‘ Y

(‘m =k C~

5.1.- El modelo de célulapredicede forma adecuadala evoluciónde la los

componentesque constituyen la biomasa, siendo capaz de predecir la

evolución de la concentracióndel sustrato nitrogenado en los diferentes

experimentosajustadosde formasatisfactoria.

52.- Los parámetros obtenidos del ajuste al modelo de célula de

experimentosrealizados a diferentes temperaturasson relacionablescon

dichavariable,habiéndoseobtenidolas siguientesexpresiones:

1c1(T)= 1,49 —0,0361

k3<’T) = 0,150

k5(T) =0,198

-ykJTt { 0,041 (T-21)11- expj0,352(7’- 35,08))J¡

El modelo de célula es capaz, por tanto, de predecir la influencia de la

temperaturaen laevoluciónde los componentesintracelulares.

5.3.- Los parámetros obtenidos del ajuste al modelo de célula de

experimentosrealizadosa diferentesconcentracionesde nitrógenopresentan

un valor constantecon estavariable.Estoeraprevisibledadaslas cinéticasen

función de la concentraciónde amonio que se pueden observar en Las

ecuacionesdel modelo. El amonio presentaun efecto inhibitorio para el

crecimientoen concentracióninicial de 475 p.p.m., por lo que se debe de

introducir un término de inhibición en el modelo propuestoparadescribirel

sistemabajoestasituación,de forma:

426

Resumeny Conclusiones

=(r1 —CPRE )—k1 •(CN —C~9¿It

El modelo de célula es capaz, por tanto, de predecir la influencia de la

concentraciónde amonioen la evoluciónde los componentesintracelulares.

6.- El Modelo Cinético QuímicamenteEstructuradoes capazde predecir la

evoluciónde los componentesdel sistema,tanto los correspondientesal crecimiento

como a la produccióndel polisacárido.Se ha obtenidoporunión de los dos modelos

anteriores,dondese han realizadodiversasmodificaciones,quedandoel modelo

completoformadoporlas siguientesecuaciones:

dC~ _ tIC RVA tIC DAOA dCppj— +- +

¿Ir ¿It di’ dtdCRVÁ

=

¿It

¿ICDVÁ=

¿IttIC _ ¿IC

PRI¿It —r,— -

¿ItdC

/% it2,75 —2,75 ‘ )

¿It 136,5 103,5 478,6 491,7

F Vil¿IC~180J 5,94 ¿ICp _ 1 k4C0, C’í 358 ( 1±4Ym

¿It —b 923,2 ¿Ir 12 K4±C02 [‘ 3,58+4Y~~)jJ

—0,933( )—0,5( )—1,08( )—1,12•(136,5 103,5 491,87 486,7

¿It K4 ±CQ y3,58+4Y~~~)

¿ICx¿IC0, — _ 0,3 • dC~ ~o,s1c4C0 .Q +k~a< (C * —CQ ‘~--

dr 923,2 ¿Ir + CQ ~ ¿It

k~CK O2CI 1±41%,

~±C 3,58±4.YÁTPJ0,

1 k4C0, ~1—3S8( 1±4Yrp2 = 12K4±C0, 37 . ‘~ 3,58±4Y4~

427

Res¿uneny Conclusiones

= ~ 2

y, ~34•41p1>

Siendo:

r1=k,C C~

r3=k3 C ,~,

r2m =k, C

— N

y el valor de los parámetros:

k1<’T) = 1,49—0,0367’

k, (7’) = 0,150

<(7’) = 0,198

k,1~(T)= 0,00108—0,00003T

k2(TH( 0,041(7’- 21)[1-exp(0,352(T-35,08))]»

k(T~ / 0,94 (7’ -19,45) [1- exp(/,399 (7’- 34,24))ff

kYT) = —2,913±2,0487’

>lw (T) = (0,597(7’ -24,35)11- exp(—0,205 (7’ -37,16 ))]}2

6.1.- El modelo químicamenteestructuradopredice de forma adecuadala

evolución de los componentesintracelulares:DNA, RNA y proteínasen

todos los experimentosrealizados.Esto es evidentepuesestemodelo incluye

las expresionesdel modelo de célula, con lo que también será capaz de

predecirla influenciade la temperaturay de la concentraciónde amonioen la

evoluciónde estoscomponentes.

En la partecorrespondientea la producción,y dado que sehan tomado las

expresionesdel modelo cinético metabólico, el modelo químicamente

estructurado,prediceadecuadamenteen el consumode sustrato,producción

de xantanoy evolucióndel oxígenodisueltoen el sistema.

428

Resumeny Conclusiones

Con estemodelo se considerala evolución de otro componenteintracelular

no consideradoen el modelo cinético de célula. Este componentese ha

denominadohidratosde carbono,y el parámetrode la reacciónde formación

de este compuesto,kHG, puede ser expresadotambién en función de la

temperatura.

6.2.- El modelo químicamenteestructurado predicede forma adecuadala

evolucióndel sustratocarbonado,el productoy el oxigenodisuelto en todos

los experimentosrealizados, siendo capaz de predecir la influencia de

cambiosen las variablesque afectana la transferenciade oxígeno(agitación,

kLav y caudalde aire)en la evolución del sustratocarbonadoy del producto.

Lo mismo queocurreconel modelometabólico(ver Figura8.2).

6.3.- El modelo químicamenteestructuradotambiéntomaen consideraciónla

influenciade cambiosen la composicióndel medio, comopor ejemploen la

concentraciónde nitrógeno, sobrela produccióndel polisacárido.Se puede

observarun máximo de producciónen tomo a las 200 y 250 p.p.m. de

concentracióninicial de amonio indicado en la Figura 8.3. Esta figura está

realizadatomandola concentraciónde xantanoalcanzadaa las 60 horasde

fermentación.Estainfluencia,de nuevo,fue detectadaexperimentalmenteen

un trabajoprevio(Santos,1993; García-Ochoay col., 1997).

30-

25—

20—

5—

‘o—

y—

o.O 00 200 300 400

9.~~,pm>

Figura 8.3.- Evolución de la concentración de xantano alcanzada a las 60 horasde fermentacióncon diferentesconcentracionesinicialesde amonio.

429

9.- NOMENCLA TURA

Nomenclatura

9.- NOMENCLATURA

A : Absorbancia(u.a.).Compartimentoen los modelosde Bijkerk y Hall (1977)(1991ay 1991b).

B : Constantede Blackman(1905).Compartimentodel modelode Bijkerk y Hall (1977).

C : Concentración(kg/m3).

Vectordecompuestosen el estudioestequiométrico

• Concentracióndel compuestoj (mol j/L) (kgj/mfl.

• Parámetrosde la ecuaciónde Ratkowskyy col. (1983).,C2

C2,

Cm

CMiF

d

D

y deNielseny col.

• Parámetrosdel modelode Matsumuray col. (1981).

Parámetrodel modelode Waymany Tseng(1976)(kg~/m3).

• Concentraciónde oxigenoen el momentoen quese inicia la aireación(04).

• Citometríade Flujo.

• Diámetrode lahifa (m).

• Compartimentodel modelode Ramkrishnay col. (1967).

431

Nomenclatura

e : Númerototal de elementoshifalespor volumende reactor(U’).

E : Enzimade la ruta

F : Parámetroestadístico,F de Fischer.

ED : Factorde Dilución.

O : Compartimentode los modelosde Ramkrisnay col. (1967); Hardery Róels(1982) yNielsenycol.(1991ay1991b).

IF : Intensidadde Fluorescencia(unidadarbitraria).

K : Parámetrodelmodelode Hinshelwood(1946), (m3/kg~).• Compartimentodel modelode Williams (1967)y del modelode Hardery

Réels(1982).

• Parámetrodel modeloreológicode Casson(>4”2~ ‘~2m~’)

• Parámetrorepresentativode la inhibición enel modelocinéticode célula(m’.W’ kgj).

: Parámetrorepresentativode la inhibición porsustratoen el modelodeWaymany Tseng(1976),(m311’kgj)

• Constantecinéticade la reaccióni (unidadesdependientesde la funcióncomposición(h’) o ( m311’kgj ).

Constantede saturaciónde la expresiónde Monoddebidoal compuestolimitantej (kg i/m3).

• Constantecinéticade la reaccióni (It’) (m~h’kg’).

1<,, : Constantede saturacióndel compuestoj en la reaccióni (kg i/mt.

kLav Coeficientevolumétricodetransportede oxígeno(<‘) (~-~)

k0, ,k02 Factorespreexponencialesen la ecuaciónde Esenery col. (1983).

Factorespreexponencialesen la ecuaciónde Shuy Yang(1991).

Parámetroecuaciónde Monod(1949,1950)(kg5/m3).

1hgu : Unidadde crecimientohifal referidaa la longitud de la hifa (mlpuntas).

M : Masamediadel elementohifal (g).

m¡igu Unidadde crecimientohifal referidaa la masade la hifa (glpuntas).

Consumode oxígenodebidoal mantenimientocelular(kmol O=Ikg~h).

Consumode sustratocarbonadodebidoal mantenimiento(kgs/kgx.h).

432

Nomenclatura

N : Velocidadde agitación(r.p.m.).

n : Constantede la ecuaciónde Luedeking-Piret(1959)referidoa la producciónasociadaal crecimiento(kgp/kgx).Númeromediodepuntasdel elementohifal.

NA : Velocidadde transferenciade oxígeno(mol 02’h).

NC : Númerode Células.Númerode componentesclave.

Pl : Controladorproporcional-integral.

PID : Controladorproporcional-integral-diferencial

Q : Caudal(cm3/min) (m’/h).

Velocidadespecíficade formacióndel compuestoi (modelode Ponsy col,1989).

q02 : Consumode oxígenodebidoa los microorganismos(kmol O2/kg~h).

1 : Parámetroestadístico,coeficientede correlaciónlineal.

Re : Númerode Reynols(pNT2/~f).

5 : Sustrato.

Sc : Númerode Schmidt(,u/pDL)

SRC : Sumade los residuosal cuadrado.

Tiempo(h).Parámetroestadístico,t de Student.

T : Temperatura(0C).

tlat : Tiempode latencia(h).

Parámetrosdelmodelo de Ratkowskyy col.(1983)(0C).

V : Volumen(L).

Caudalde aire aportadoal fermentador,(IN/l/min) (m3/m3/h).

We : Númerode Weber(pN2T3/a)

433

Ao,nenclatu,a

YE : Extractode levadura.

Y,j : Rendimientomacroscópicodel compuestojen el compuestoi (kgj/kg i).

Y0= : Consumode oxígenodebidoal crecimientode la biomasa(kg~/kmol0=).

: Rendimientomacroscópicodel sustrato.5. respectoal productosintetizado,P, (kg~/kg5).

Rendimientomacroscópicodel sustrato,5, respectoa la biomasasintetizada,X. (kg~/kgj.

Letras Griegas

u : Parámetrode la ecuaciónde Luedeking-Piretmodificada,relativoalconsumode sustratodebidoal mantenimientoy a la producciónnoasociadaal crecimiento(kg~/kg~ h).

3 : Parámetrode la ecuaciónde Luedeking-Piretmodificada,relativaalconsumode sustratodebidoal crecimientodel microorganismoy a laproducciónasociadaal mismo(kg5/kg~).

Y • Coeficienteestequiométricodel compuestoi.

A : Incremento.

2. : Longitud de onda.

Velocidadespecíficade crecimiento(It’).

Viscosidadrelativaal modelode Casson(Pas).

Viscosidadefectivarelativaal modelode Ostwald-deWaele(Pas)

Velocidadespecíficamáximade crecimiento( m3 kgsh’).

p : Densidaddel líquido (kg/mt.

a . Tensiónsuperficial(Km ).

-y

Tensióntangencial(Nm2) (kg/ms).

• Tensióncríticade flujo (Km2) (kg/ms2).

434

Vomenclauua

Subíndices

b

c

O

cnt

DNA

ef

exp

g

m

max

mm

>4

N,A

N,DNA:

N,RNA:

N,T

O,

P

PR

PRE

PRI

PRT

Referidoabiomasa.

Referidoacatabolismo(modelode Ponsy col., 1989).

Condicionesiniciales.

Referidoal valor crítico.

Referidoal DNA.

Eficazo medio.

Experimental.

Referidoa glucosa(modelode Ponsy col., 1989).

• Referidoacondicionesmáximas.• Referidoa mantenimiento(modelode Ponsy col., 1989).

• Referidoal valor o a las condicionesmáximas.

• Referidoal valor mínimo.

Referidoal sustratonitrogenado,amonio.

Referidoal nitrógenoen amonio.

Referidoal nitrógenoen DNA.

Referidoal nitrógenoen RNA.

Referidoalnitrógenototal.

Referidoal oxígeno.

Referidoal producto,xantano.

Referidoa Proteinas.

Referidoaproteínaextracelular.

Referidoa proteína intracelular.

Referidoaproteínatotal.

435

jVomencíaturo

Referido a los cofactores<modelode Ponsy col., 1989).

Referidoal RNA.

Referidoal sustratocarbonado,sacarosa.

Referidoal valor teórico.

• Referidoa la biomasa.Referidoa xantano(modelode Ponsy col., 1989).

Superindices

A

CN4F

E

*

Referidoa absorbancia.

Referidoa Citometríade Flujo.

Referido a Fluorimetría.

Valor de saturacion.

R

RNA:

s

Teor

x

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