Ingeniería Genética de la producción de etanol en

Escherichia coli

•Se insertaron los genes de las enzimas esenciales de la vía fermentativa de Zymomonas mobilis para producir etanol en E. coli.

Zymomonas mobilis

• Bacilo gram negativo

• Microaerofílica a anaerobia

• Metabolismo fermentativo obligado con producción de etanol

• Vía de Entner-Douduoroff

Durante la glucólisis, las células convierten azúcares simples, como glucosa, en piruvato, con producción neta de ATP y NADH

• Los m.o. son muy diversos en la gama de productos de fermentación.

• Entre los que se incluyen ácidos orgánicos, (lactato, acetato, succinato, etc) y otros como etanol, butanol, acetona.

• La diversidad de los productos de fermentación tiene gran utilidad taxonómica.

• Aplicaciones biotecnológicas

OBJETIVOS

Clonar y expresar las enzimas piruvato descarboxilasa y alcohol deshidrogenes de Zymomonas mobilis en E.coli TC4, bajo el control de un único promotor, generando un operon artificial, para la producción de EtOH

MATERIALES Y MÉTODOS

• E. coli TC4 (LB + glu) Plásmido pLOI276 (piruvato descarboxilasa) Plásmido pLOI284 (alcohol deshidrogenasa) Plásmido pLOI295 (ambas enzimas)A550nm___________1DO – 0.25mg/ml

• Métodos genéticos: transformación, selección de transformantes, etc, articulo anterior

• Actividad enzimática. uM/mg prot/minCélulas- disrupción celular- inactivación de otras enz. de E.coli que reducen NAD+, por calor- medición de proteínas totales.Control Z mobilis

• Análisis de los productos de fermentación.HPLC. HPX-87H

RESULTADOS

FIG. 2. Comparison of plasmid-free strain TC4 and strain TC4 carrying plasmids encoding alcohol dehydrogenase and pyruvatedecarboxylase on solid medium. All plates were incubated under aerobic conditions. Panels A, B, and C show petri plates in which strain TC4(prototrophic for relevant markers) and plasmid-containing derivatives were streaked in the same orientation for comparison. The lowerstreak in each of these three panels is plasmid-free strain TC4, the left streak is strain TC4(pLOI276), the right streak is strain TC4(pLOI284),and the upper streak is strain TC4(pLOI295). The plate in panel A was incubated for 2 h at 37°C. The acetaldehyde produced by alcoholdehydrogenase reacted with pararosaniline to produce the diffusible red pigment observed in this alcohol dehydrogenase indicator plate (5).The plates in panels B, C, and D were incubated overnight at 37°C. The plate in panel B contains Luria broth without added glucose. Theplates in panels C and D contain Luria broth containing 2% glucose. Panel D is a photograph of transformants which grew in Luria broth withglucose as progeny of a ligation during the construction of pLOI295. The large white colonies (two of which are marked by arrows) weresubsequently found to contain plasmid pLOI295.

• Los productos de fermentación fueron analizados por HPLC y los picos observados identificados utilizando estándares de las sustancias puras.

• Cultivos en caldo Luria al 10 % de glucosa - anaerobiosis

Fermentación de la glucosa por las cepas recombinantes

• E. coli TC4 → succinato (1,5 mM), lactato (18 mM) y acetato (7 mM) principalmente

• Expresión operon pet en condiciones de anaerobiosis → etanol, 750 mM

• TC4 (pLOI284) - gen adh – perfil similar al de TC4

• TC4 (pLOI276) - gen pdc – se observa un pico correspondiente al etanol, 18 mM (piruvato decarboxilasa Z. mobilis + alcohol deshidrogenasa E. coli)

• E. coli con operon pet → ↑ alcohol deshidrogenasa y ↑ piruvato decarboxilasa dominan la oxidación de NADH en cepa pLOI295.

• Km piruvato decarboxilasa de Z. mobilis: 0,4 mM

• Km lactato deshidrogenasa: 10-1000 mM

El piruvato se desvía hacia la producción de etanol y la fermentación de E.coli se hace

equivalente a la de S. cerevisiae y Z. mobilis.

• Desviación del flujo de piruvato hacia la producción de etanol afecta rendimiento celular y pH del medio.

Crecimiento

• TC4 y TC4 pLOI284 (alcohol deshidrogenasa II):

• *0,25 mg proteina celular/ mL• *pH 4,4

• TC4 pLOI276 (piruvato decarboxilasa):• *mg proteina celular/ mL se

duplica• *pH 4,5

• TC4 operon pet:• *250 mg proteina celular/ mL• *pH 4,7

• Producción de ácidos orgánicos acidifica el medio limitando el crecimiento en todos los casos.

• A partir de una densidad de 2,5 mg de proteína celular/mL, Mg2+ se vuelve limitante

Discusión

• Reemplazo de enzimas nativas de E. coli para la fermentación por aquellas de Z. mobilis sin reducir la tasa de crecimiento → productos de fermentación producidos son relativamente inocuos para E. coli.

• Útil en la producción de productos metabólicos específicos a partir de sustratos no convencionales o por transferencia de vías metabólicas a partir de otros m.o.