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Ingeniería Genética de la producción de etanol en
Escherichia coli
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•Se insertaron los genes de las enzimas esenciales de la vía fermentativa de Zymomonas mobilis para producir etanol en E. coli.
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Zymomonas mobilis
• Bacilo gram negativo
• Microaerofílica a anaerobia
• Metabolismo fermentativo obligado con producción de etanol
• Vía de Entner-Douduoroff
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Durante la glucólisis, las células convierten azúcares simples, como glucosa, en piruvato, con producción neta de ATP y NADH
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• Los m.o. son muy diversos en la gama de productos de fermentación.
• Entre los que se incluyen ácidos orgánicos, (lactato, acetato, succinato, etc) y otros como etanol, butanol, acetona.
• La diversidad de los productos de fermentación tiene gran utilidad taxonómica.
• Aplicaciones biotecnológicas
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OBJETIVOS
Clonar y expresar las enzimas piruvato descarboxilasa y alcohol deshidrogenes de Zymomonas mobilis en E.coli TC4, bajo el control de un único promotor, generando un operon artificial, para la producción de EtOH
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MATERIALES Y MÉTODOS
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• E. coli TC4 (LB + glu) Plásmido pLOI276 (piruvato descarboxilasa) Plásmido pLOI284 (alcohol deshidrogenasa) Plásmido pLOI295 (ambas enzimas)A550nm___________1DO – 0.25mg/ml
• Métodos genéticos: transformación, selección de transformantes, etc, articulo anterior
• Actividad enzimática. uM/mg prot/minCélulas- disrupción celular- inactivación de otras enz. de E.coli que reducen NAD+, por calor- medición de proteínas totales.Control Z mobilis
• Análisis de los productos de fermentación.HPLC. HPX-87H
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RESULTADOS
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FIG. 2. Comparison of plasmid-free strain TC4 and strain TC4 carrying plasmids encoding alcohol dehydrogenase and pyruvatedecarboxylase on solid medium. All plates were incubated under aerobic conditions. Panels A, B, and C show petri plates in which strain TC4(prototrophic for relevant markers) and plasmid-containing derivatives were streaked in the same orientation for comparison. The lowerstreak in each of these three panels is plasmid-free strain TC4, the left streak is strain TC4(pLOI276), the right streak is strain TC4(pLOI284),and the upper streak is strain TC4(pLOI295). The plate in panel A was incubated for 2 h at 37°C. The acetaldehyde produced by alcoholdehydrogenase reacted with pararosaniline to produce the diffusible red pigment observed in this alcohol dehydrogenase indicator plate (5).The plates in panels B, C, and D were incubated overnight at 37°C. The plate in panel B contains Luria broth without added glucose. Theplates in panels C and D contain Luria broth containing 2% glucose. Panel D is a photograph of transformants which grew in Luria broth withglucose as progeny of a ligation during the construction of pLOI295. The large white colonies (two of which are marked by arrows) weresubsequently found to contain plasmid pLOI295.
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• Los productos de fermentación fueron analizados por HPLC y los picos observados identificados utilizando estándares de las sustancias puras.
• Cultivos en caldo Luria al 10 % de glucosa - anaerobiosis
Fermentación de la glucosa por las cepas recombinantes
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• E. coli TC4 → succinato (1,5 mM), lactato (18 mM) y acetato (7 mM) principalmente
• Expresión operon pet en condiciones de anaerobiosis → etanol, 750 mM
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• TC4 (pLOI284) - gen adh – perfil similar al de TC4
• TC4 (pLOI276) - gen pdc – se observa un pico correspondiente al etanol, 18 mM (piruvato decarboxilasa Z. mobilis + alcohol deshidrogenasa E. coli)
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• E. coli con operon pet → ↑ alcohol deshidrogenasa y ↑ piruvato decarboxilasa dominan la oxidación de NADH en cepa pLOI295.
• Km piruvato decarboxilasa de Z. mobilis: 0,4 mM
• Km lactato deshidrogenasa: 10-1000 mM
El piruvato se desvía hacia la producción de etanol y la fermentación de E.coli se hace
equivalente a la de S. cerevisiae y Z. mobilis.
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• Desviación del flujo de piruvato hacia la producción de etanol afecta rendimiento celular y pH del medio.
Crecimiento
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• TC4 y TC4 pLOI284 (alcohol deshidrogenasa II):
• *0,25 mg proteina celular/ mL• *pH 4,4
• TC4 pLOI276 (piruvato decarboxilasa):• *mg proteina celular/ mL se
duplica• *pH 4,5
• TC4 operon pet:• *250 mg proteina celular/ mL• *pH 4,7
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• Producción de ácidos orgánicos acidifica el medio limitando el crecimiento en todos los casos.
• A partir de una densidad de 2,5 mg de proteína celular/mL, Mg2+ se vuelve limitante
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Discusión
• Reemplazo de enzimas nativas de E. coli para la fermentación por aquellas de Z. mobilis sin reducir la tasa de crecimiento → productos de fermentación producidos son relativamente inocuos para E. coli.
• Útil en la producción de productos metabólicos específicos a partir de sustratos no convencionales o por transferencia de vías metabólicas a partir de otros m.o.