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XXXVIII Congreso de la SMCS, AC ����������������� ������������������������������������

La Paz, B.C.S, México – 24 al 29 de noviembre de 2013 [email protected]

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DIRECTORIO

Sociedad Mexicana de la Ciencia del Suelo, A.C.

Dr. David Espinosa Victoria Presidente

Dr. Ricardo David Valdez Cepeda Vicepresidente

Dra. Catarina Loredo Osti Tesorera

Dra. Mariela Fuentes Ponce Editora Revista Terra Latinoamericana

COMITÉ ORGANIZADOR

Centro de Investigaciones Biológicas

del Noroeste S.C. Universidad Autónoma de Baja

California Sur

Dr. Sergio Hernández Vázquez M.C. Gustavo Rodolfo Cruz Chávez Director General Rector

Dr. Daniel B. Lluch Cota Dr. Dante Arturo Salgado González Director de Gestión Institucional Secretario Académico Dra. Elisa Serviere Zaragoza Dra. Alba Eritrea Gámez Vázquez

Directora del Programa de Posgrado Directora de Investigación y Posgrado Dr. Jaime Holguín Peña Dr. Sergio Zamora Salgado

Coordinador del Programa de Agricultura en Zonas Áridas

Jefe del Departamento Académico de Agronomía

Dr. Enrique Troyo Diéguez Dr. José G. Loya Ramírez Presidente del Comité Local Vicepresidente del Comité Local

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Volumen III �

Simposium Bioquímica de Suelos �

Simposium Manejo y Producción Orgánica

Simposium Ciclo del Carbono

Simposium Microbiología y Biotecnología de Suelos

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La Paz, B.C.S, México – 24 al 29 de noviembre de 2013 [email protected]

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ACTINOMICETOS DEL SUELO PARA EL CONTROL BIOLOGICO DEL HONGO FITOPATOGENO Fusarium Solani

Quiñones Aguilar, E. E.1*; Qui Zapata, J. A.1; Rincón Enríquez, G.1; Evangelista Martínez, Z.1; López Pérez, L.2; Palacios Arriaga, A. H.1

1Biotecnología Vegetal y Unidad Sureste, Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C. Guadalajara, Jalisco México.

2Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Tarímbaro, Michoacán, México.

*Correspondencia: [email protected]; Normalistas No. 800, Colonia Colinas de la Normal. Guadalajara, Jalisco

México. CP 44270. Tel. +52 (33) 33455200 Ext. 1703.

Resumen Los actinomicetos o actinobacterias son microorganismos de importancia en la industria y en la agricultura debido a la gran cantidad de compuestos antimicrobianos que producen, característica que los hace excelentes candidatos para su empleo como agentes de control biológico de microorganismos fitopatógenos. Fusarium solani es un hongo fitopatógeno que afecta a diversos cultivos de importancia agrícola como, chile, jitomate, papa, cacahuate, soya y frijol entre otros. El control de enfermedades que afectan a los cultivos de importancia económica requiere del empleo de una gran cantidad de pesticidas cuyo uso continuo conlleva hacia problemas tanto ambientales como de salud pública. Esta situación necesita del desarrollo de nuevas tecnologías que contribuyan al menor uso de agroquímicos para aumentar la producción agrícola y disminuir el impacto ambiental. Con base en lo anterior, el objetivo de este trabajo consistió en aislar, seleccionar y evaluar actinomicetos con potencial actividad antimicrobiana para el control de F. solani, el aislamiento de actinomicetos se realizó a partir de suelos agrícolas, obteniéndose más de 80 potenciales cepas morfológicamente diferentes, que se confrontaron contra F. solani. Se estableció un experimento in vitro, empleando un diseño completamente al azar con un total de 81 tratamientos y tres repeticiones por tratamiento. Como variable de respuesta se evaluó el área de inhibición del crecimiento de F. solani (AIFS) por efecto de las distintas cepas de actinomicetos. El análisis de varianza del AIFS mostró diferencias significativas entre los aislamientos evaluados, encontrándose que diversas cepas mostraron actividad inhibitoria, resultado que sugiere que es posible su uso como agentes para el control biológico de F. solani.

Palabras clave: actinobacterias; control biológico; actividad antimicrobiana; antibiosis

Introducción Los actinomicetos, también conocidos como actinobacterias representan a un grupo ubicuo de microorganismos ampliamente distribuidos en los ecosistemas naturales en todo el mundo y particularmente importantes debido a su papel en el reciclaje de la materia orgánica, dicho grupo microbiano ha recibido considerable atención tanto de la industria como de los laboratorios académicos, debido a que son fuente importante de metabolitos secundarios bioactivos de utilidad para el hombre (Srinivasan et al., 1991). Un ejemplo son los antibióticos, sustancias de utilidad en medicina y en agricultura para el control de enfermedades ocasionadas por microorganismos patógenos. Diversos trabajos han mostrado la capacidad de los actinomicetos en el control de agentes microbianos causantes de enfermedades que afectan a especies vegetales de importancia

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económica (Zhao et al., 2012; Fróes et al., 2012). El género Fusarium abarca a un grupo importante de hongos fitopatógenos que afectan a diversos cultivos agrícolas siendo algunos de ellos agentes causales de enfermedades que traen como consecuencia grandes pérdidas económicas a los agricultores, como es el caso de Fusarium oxysporum, hongo que afecta al agave tequilero (Qui-Zapata et al., 2011) y al jitomate (Kistler, 1997) . El hongo fitopatógeno F. solani afecta a diversos cultivos agrícolas, citándose frijol, soya, jitomate, chile, cacahuate, papa, arroz, haba, maracuyá etc. Si bien este patógeno no es el principal responsable de las enfermedades más devastadoras que afectan a algunos de estos cultivos, su participación en algunos casos puede ser importante ya que suele encontrarse en asociación con otros hongos patógenos como parte de un complejo ocasionando marchitez y pudriciones de tallos y raíces. El uso de pesticidas para el control de enfermedades cada día es mayor, situación que provoca contaminación ambiental, es por eso que en la actualidad la producción de alimentos para consumo humano ha ido evolucionando hacia un sistema productivo con menor impacto sobre el ambiente, por medio del desarrollo de sistemas de cultivo sustentables cada vez menos dependientes del uso de agroquímicos para el control de las enfermedades que afectan a la producción agrícola. Las investigaciones sobre la utilización de organismos benéficos que protejan contra las enfermedades ha tenido un crecimiento acelerado en los últimos años, debido a las restricciones cada vez mayores que existen con respecto al uso de fungicidas químicos, cuya aplicación y fabricación generan contaminación. Es por ello que el control biológico de enfermedades de tipo fúngico empleando bacterias del suelo, puede ser una alternativa al uso de agroquímicos (Rahman et al., 2007; Li et al., 2008; Talubnak y Soytong, 2010). El suelo es fuente importante de microorganismos tanto patógenos como benéficos y bajo la premisa de que puede contener una gran cantidad de cepas de actinomicetos con actividad antimicrobiana contra fitopatógenos de diversos géneros, el presente trabajo tuvo como objetivo aislar y seleccionar actinomicetos con actividad inhibitoria del crecimiento de Fusarium solani in vitro.

Materiales y Métodos El estudio se realizó en el Laboratorio de la Unidad de Biotecnología Vegetal del centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del estado de Jalisco (CIATEJ). El hongo fitopatógeno Fusarium solani aislado de plantas enfermas de chile del estado de Guanajuato y patógeno de este hospedero fue proporcionado por el Dr. Raúl Rodriguez Guerra, Investigador en Biotecnología en el Instituto nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), campo Experimental Terán ubicado en Nuevo León México. Aislamiento y purificación de actinomicetos del suelo El aislamiento de actinomicetos se realizó a partir de tres suelos agrícolas, por medio de la técnica de diluciones decimales seriales y siembra en placa de agar. La primera dilución de cada muestra de suelo, se realizó con el equivalente a 10 g de suelo seco en 90 mL de agua destilada previamente esterilizada (dilución 10-1), posteriormente, en un tubo de vidrio conteniendo 9 mL de agua se adicionó 1 mL de la primera dilución y así sucesivamente hasta tener la dilución 10-5. Las diluciones 10-2 - 10-5, se sembraron en cajas Petri conteniendo como medios de aislamiento papa dextrosa agar (PDA-DIFCO) y agar nutritivo (AN-FLUKA) ambos a un pH de 8.5. El crecimiento de actinomicetos se empezó a detectar una semana después de la siembra, obteniéndose un total de 119 potenciales cepas, es decir aquellas colonias que presentaban una morfología típica de este grupo microbiano; colonias correosas, pulverulentas, con micelio muy fino y aferradas firmemente al medio de cultivo (Figura 1). La etapa de purificación consistió en hacer al menos tres resiembras de las colonias aisladas.

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Figura 1. Colonias de actinomicetos aislados a partir de suelos agrícolas

Confrontación in vitro de los actinomicetos aislados contra Fusarium solani La actividad inhibitoria de los actinomicetos contra Fusarium solani, se determinó in vitro por medio de un experimento de confrontación directa. Se emplearon 80 cepas aisladas (ABV01-ABV80) ya que se descartaron todas aquellas que se consideraban repetidas o que durante las etapas de purificación presentaron morfología típica de bacterias unicelulares o de hongos filamentosos. El experimento permaneció durante diez días en incubación a 26°C y este se evalúo cuando las placas conteniendo al patógeno (control) presentaban un crecimiento radial cubriendo completamente al medio de cultivo. Determinación del área de inhibición de Fusarium Solani La variable de respuesta evaluada fue el área de inhibición de F. solani (AIFS) por efecto de los distintos actinomicetos, ésta se determinó por medio de mediciones del área de crecimiento o de inhibición del patógeno directamente en la base de las cajas de cultivo, empleando un vernier digital y realizando cálculos básicos (Figura 2). Con los datos obtenidos, se estimaron los porcentajes de inhibición con respecto al crecimiento radial total del fitopatógeno control (F. Solani en solitario). Diseño experimental y análisis estadístico El experimento se estableció mediante un diseño completamente al azar con 81 tratamientos (cada cepa de actinomiceto confrontada con F. solani) y un tratamiento testigo comprendiendo únicamente al hongo fitopatógeno. Cada tratamiento fue repetido tres veces. Con los datos obtenidos del AIFS se realizó un análisis de varianza y una prueba de comparación múltiple de medias Tukey a un nivel de significancia de P�0.05 mediante el software estadístico Statgraphics (2005). Figura 2. Representación gráfica para la cuantificación del área de inhibición in vitro de actinomicetos sobre el hongo fitopatógeno F. solani (Fs). El inoculo de Fs se colocó en el centro de la caja Petri, en cada extremo de los cuatro lados se coloco la colonia de un actinomiceto (A). El 100% de inhibición representa no crecimiento de Fs en un cuarto de la caja Petri.

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Resultados y Discusión Actividad inhibitoria de actinomicetos sobre Fusarium solani. Fusarium solani es un hongo fitopatógeno que afecta a diversas especies vegetales, entre ellos chile, jitomate, papa, cacahuate, frijol y soya, entre otros. En la Figura 2 se muestran las cepas aisladas que presentaron algún grado de inhibición del crecimiento de F. solani. El análisis de varianza del AIFS mostró diferencias significativas (Tukey, P�0.05) entre los aislamientos evaluados, encontrándose que diversas cepas mostraron actividad inhibitoria, siendo total en algunos casos ya que no permitieron el crecimiento del patógeno. De los 80 aislamientos probados, 52 presentaron inhibición del hongo fitopatógeno. En rojo se muestran las cepas que mejor funcionaron y corresponden a los aislamientos ABV49, ABV65, ABV37 y ABV45 respectivamente. Las imágenes de la Figura 4 ilustran el efecto inhibitorio de los aislamientos ABV45 (A) y ABV65 (B). Cabe mencionar que aunque estas cepas fueron las mejores de acuerdo al análisis estadístico (grupo a), al menos 49 cepas presentaron inhibición por arriba del 50%. Estos resultados muestran que la búsqueda de microorganismos del suelo con actividad antimicrobiana contra fitopatógenos originarios del suelo, como el caso de los hongos del genero Fusarium, puede ser una alternativa viable para la elaboración de formulaciones que puedan ser empleadas como agentes de control biológico de enfermedades que afectan a diversos cultivos de importancia económica en agricultura. Los actinomicetos, también conocidos como actinobacterias son un grupo microbiano bastante interesante desde diversos enfoques ya que pueden ser empleados en medicina, industria y agricultura, ante esto es importante resaltar que la mayoría de los antibióticos conocidos han sido aislados a partir de actinomicetos (Madigan et al., 2009), característica que los hace candidatos para ser empleados como agentes de biocontrol de microorganismos fitopatógenos tanto hongos como bacterias, ya que además de antibióticos pueden presentar otros mecanismos de acción, incluso algunas cepas han sido evaluadas como promotores de crecimiento vegetal, colocándose algunas como rizobacterias de tipo PGPR (del inglés, Plant Growth Promoting Rhizobacteria) (Franco-Correa, 2009). Existen diversos trabajos que muestran control biológico de fitopatógenos mediante actinomicetos, por ejemplo Zhao et al. (2012) mostraron que una cepa del actinomiceto identificado como Streptomyces bikiniensis, controló al hongo fitopatógeno Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum, agente causal de la marchitez del pepino, por medio de mecanismos tanto directos como indirectos, inhibiendo la germinación de conidios, destruyendo paredes celulares del hongo, además de inducir resistencia de la planta a la enfermedad. Por otro lado Fróes et al. (2012), aislaron y seleccionaron cepas quitinolíticas de Streptomyces con capacidad para inhibir in vitro el crecimiento de Sclerotinia sclerotiorum por medio de la producción de cuatro enzimas hidrolíticas implicadas en la degradación de la pared celular del hongo, colocando a la cepa de Streoptomyces sp 80 como un agente prometedor de biocontrol de S. sclerotiorum, hongo cosmopolita que ataca a cultivos de importancia económica como soya, frijol, lechuga, tomate y coliflor.

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Porcentaje de inhibición de crecimiento fúngico de Fsolani

Figura 3. Actividad inhibitoria de aislamientos de actinomicetos sobre el crecimiento de Fusarium solani bajo condiciones in vitro. Letras distintas indican diferencias significativas de acuerdo a la prueba Tukey (P�0.05).

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Figura 4. Actividad inhibitoria de los aislamiento ABV65 (A) y ABV45 (B) de actinomicetos sobre el crecimiento de Fusarium solani (Fs) en condiciones in vitro.

Conclusiones Los resultados indican el posible uso de algunas cepas de actinomicetos (ABV65, ABV45) como agentes de control biológico de F. solani. Por lo que una segunda parte de este trabajo consiste en la evaluación del control del fitopatógeno en planta bajo distintos tratamientos y la identificación de las cepas más eficientes.

Agradecimientos Este trabajo se realizó con el apoyo del proyecto AGS-2011-03-181930 del FOMIX-Gobierno del estado de Aguascalientes-CONACYT.

Bibliografía Franco-Correa, M. 2009. Utilización de los actinomicetos en procesos de biofertilización. Rev. Peru. Biol. 16: 239–242. Fróes A, A. Macrae, J. Rosa et al., “Selection of a Streptomyces strain able to produce cell wall degrading enzymes and

active against Sclerotinina sclerotiorum,” Journal of Microbiology, vol. 50, no. 5, pp. 798–806, 2012. Kistler HC (1997) Genetic diversity in the plant-pathogenic fungus Fusarium oxysporum. Phytopatology 87:474-479. Li JG, Jiang ZQ, Xu LP, Sun FF & Guo JH (2008). Characterization of chitinase secreted by Bacillus cereus strain CH2 and

evaluation of its efficacy against Verticillium cereus wilt of eggplant. Biocontrol 53: 931-944 Madigan M.T., Martinko, J.M. y Parker, J. (2009). Brock: Biology of the microorganisms. 12th ed. Prentice-Hall International

Inc., New Jersey. Qui-Zapata J., G. Rincón-Enríquez, J. M. Rodríguez-Domínguez, A. Gutiérrez-Mora, P. Dupré y A. G. García-Vera. 2011.

Pruebas de patogenicidad in vitro e in planta de cepas patogénicas de Fusarium oxysporum asociadas a la marchitez del agave (Agave tequilana Weber var. azul) (Presentación Oral). In: XIII Congreso Internacional /XXXVIII Congreso Nacional de Fitopatología. Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C. 24-28 de Julio del 2011, Tlaxcala, Tlaxcala, México.

Rahman MA, Kadir J, Mahmud TMM, Rahman A and Begum MM. 2007. Screening of antagonistic bacteria for biocontrol activities on Colleotrichum gloesporioides in papaya. Asian J. Plant Sci. 6:12-20.Srinivasan, M. C., Laxman, R. S., and

Srinivasan, M. C., Laxman, R. S., and Deshpande, M. V. (1991). Physiology and nutritional aspects of actinomycetes: An overview , World J. Microbiol. Biotechnol. 7(2), 171–184.

Statgraphics. 2005. StatGraphics centurion: ver. XV (User manual). StatPoint, Inc. USA. Talubnak C and Soytong K 2010. Biological control of vanilla anthracnose using Emericella nidulans. J. Agr. Tech. 6: 47-55. Zhao SH, Du CM, Tian CY (2012) Suppression of Fusarium oxysporum and induced resistance of plants involved in the

biocontrol

(A) (B)

Fs Fs