estudio de la patogenicidad de aislados de fusarium spp

Centro de Biotecnología, Vol. 3 Nro. 1. 2014 61

ResumenLa presente investigación tuvo como objetivos evaluar la patogenicidad de aislados fúngicos del género Fusarium, causante de la marchitez vascular en Babaco (Vasconcellea heilbornii var. pentágona), en condiciones de invernadero. Para ello se estableció un diseño experimental completamente al azar con doce tratamientos y diez réplicas, resultantes de la inoculación de 11 aislados fúngicos y un control. Se utilizaron 300 plántulas de Babaco de tres meses de edad, sembradas en sustrato estéril. Se estudiaron tres métodos de inoculación (por inmersión de raíces, inyección de inóculo a nivel de cuello de la raíz e inoculación al sustrato). Para la evaluación de la patogenicidad se utilizó la escala de evaluación propuestas por Veintimilla (2000). Los resultados obtenidos muestran que tres de los 11 aislados fueron capaces de producir un alto grado de severidad de la enfermedad en el cultivo del Babaco (T3-Fox-CHA1- Fusarium oxysporum cepa 2T12JO1A, T4-Fox-COC1 Fusarium oxysporum Ppf6 y T11-Fox-REY1 Fusarium oxysporum cepa 2T12JO1A), con diferencias significativas al resto de los tratamientos evaluados en los tres métodos de inoculación, sin embargo, la inoculación por inmersión de las raíces mostró mayor grado de severidad. El re-aislamiento del agente causal en cada uno de los tratamientos corroboró los resultados obtenidos, determinándose en condiciones de laboratorio estructuras fúngicas pertenecientes a los aislados: T3-CHA1-Fox, T4-COC1-Fox y T11-REY1-Fox. Estos resultados son de vital importancia para la realización de ulteriores estudios de patogenicidad a nivel molecular y de interacción de los aislados empleados con posibles controladores biológicos.

Palabras claves: Babaco, Fusarium oxysporum, métodos de inoculación, pruebas de patogenicidad.

AbstractThe present study aims to evaluate the pathogenicity of fungal isolates of Fusarium, which causes vascular wilt in Babaco (Vasconcellea heilbornii var. Pentagonal), under greenhouse conditions. A completely randomized design with twelve treatments and ten replicas resulting from the inoculation of 11 fungal isolates and a control was established. Three hundred Babaco seedlings from three months old, grown in sterile substrate was used. Three methods of inoculation (root dip, injection inoculum at root collar level and inoculating the substrate) were studied. Assessment scale proposed by Veintemilla (2000) was used for evaluation of pathogenicity. The results show that three of the 11 isolates were able to produce a high degree of disease severity in growing Babaco (T3-Fox-CHA1- strain 2T12JO1A Fusarium oxysporum, T4-Fox-COC1 Fusarium oxysporum strain Ppf6 and T11-Fox-REY1 Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A), with statistical differences to all other treatments evaluated in three different inoculation methods, however the dip inoculation root showed higher degree of severity. The re-isolation of the fungus from the plants corroborated the results obtained, determining fungal structures belonging to isolates: T3-CHA1-Fox, T4-COC1-Fox y T11-REY1-Fox. These results are of vital importance for further study of pathogenicity at the molecular level and interaction of fungal isolates with potential biological controls.

Keywords: Babaco, Fusarium oxysprum, inoculation methods, pathogenicity test.

ESTUDIO DE LA PATOGENICIDAD DE AISLADOS DE FUSARIUM SPP., ASOCIADOS A LA MARCHITEZ VASCULAR DEL BABACO EN LOJA- ECUADOR

STUDY OF PATHOGENICITY OF FUSARIUM SPP. ISOLATES, ASSOCIATED WITH VASCULAR WILT BABACO IN LOJA-ECUADor

1 Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja. Ciudad Universitaria “La Argelia” - PBX: 072547252 - Casilla Letra “S”. Loja-Ecuador. [email protected]

2 Carrera de Ingeniería Agronómica. Universidad Nacional de Loja-Ecuador. 3 Centro de Biología Celular y Molecular. Universidad Técnica Particular de Loja-Ecuador aminael.

[email protected] Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja. Proyecto “Prometeo Viejos Sabios”.

SENESCYT-Ecuador. [email protected]*Autor para correspondencia

Angel Robles Carrión1,Richard Gómez Criollo2,

Fabián Macas Rojas2,Aminael Sánchez

Rodríguez3 yRoldán Torres-Gutiérrez4*

Recibido: abril 14 de 2014 Aprobado: junio 25 de 2014

Centro de Biotecnología, Vol. 3 Nro. 1. 2014Robles et al. (2014); esTUDIo De lA PAToGeNICIDAD De AIslADos De FUsARIUm sPP., AsoCIADos A

lA mARCHITeZ VAsCUlAR Del bAbACo eN loJA- eCUADoR

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Centro de Biotecnología pp 61 – 72

IntroducciónEn la actualidad en el Ecuador la actividad agrícola tiene mucha importancia y trascendencia, se ha convertido en una actividad económica que se proyecta muy fuertemente, marcando índices y pautas en nuestra economía. En este contexto se ha tomado en cuenta el nuevo auge que existe en la producción de cultivos agrícolas exóticos y no tradicionales, uno de éstos es el babaco, considerado desde épocas pasadas como una fruta de óptimas características ya que posee ventajas como el no poseer semillas, tener una cáscara delgada y el agradable sabor de su pulpa (Uzcátegui, 2007). El Babaco es una especie partenocarpia, su propagación se la hace de manera asexual utilizando partes de las plantas como: brotes tiernos, estacas o por injertos, dando lugar a típicos problemas fitopatológicos y a la degeneración de la especie (Scheldeman, 2002; AAIC, 2003).

La producción de esta fruta ha decaído en los últimos años debido a la presencia de la Marchitez Vascular del Babaco (MVB), enfermedad causada por el hongo Fusarium oxysporum (reportada por primera vez por Ochoa y Fonseca 2000), Quillay (2011), menciona que la marchitez vascular puede causar pérdidas del 50 a 100% en la producción de plántulas y 50% en la producción de la fruta. Desafortunadamente no existen medidas de control para el manejo integrado de la MVB, por lo que, en los últimos años esta enfermedad se ha extendido por todas las zonas productoras del Babaco.

Algunas especies del género Fusarium son habitantes del suelo. Se reconocen por su impacto económico negativo en la agricultura mundial, ya que son agentes causales del marchitamiento vascular y pudrición basal de una gran variedad de plantas. F. oxysporum, cumple dos fases importantes: una saprofítica muy activa durante la que puede vivir en el suelo y en los residuos vegetales por espacio de 20 años y puede inhabilitar el uso del suelo para nuevas cosechas; y, una fase parasítica patógena de plantas (García, 2011; Gonzáles-Cárdenas 2005). Este hongo es, sin duda, una de las especies económicamente más

importantes de todo el género Fusarium (Leslie y Summerell 2006). Dadas sus características como saprófito o como patógeno especializado, este hongo puede asociarse con otros microorganismos y formar un sinergismo, por lo cual la determinación de patogenicidad es fundamental en la identificación de los microorganismos asociados con la MVB.

La patogenicidad ha sido definida como la capacidad relativa que tiene un microorganismo fitopatógeno para producir una enfermedad (Agrios, 2005). Cuando se piensa que un microorganismo puede ser la causa de una enfermedad cualesquiera y no existen estudios previos que los comprueben, por lo tanto hay que seguir la metodología de los postulados de Koch para verificar o no la hipótesis que el o los microorganismos son la causa para que se produzca la enfermedad, dichos postulados se los puede resumir así: 1) Hay una relación muy estrechamente entre la enfermedad con el microorganismo fitopatógeno, es decir el fitopatógeno debe estar asociado con la enfermedad en todas las plantas enfermas que se examinen. 2) Se debe aislarse y obtener un cultivo axénico del microorganismo en estudio y anotar sus características (morfológicas, culturales, bioquímicas entre otras). 3) El microorganismo en estudio y desarrollado en cultivo axénico debe ser inoculado en plantas sanas de la misma especie de donde se aisló. Las plantas inoculadas deber reproducir los mismos síntomas de la enfermedad. 4) El microorganismo fitopatógeno debe ser re-aislado otra vez en cultivos axénicos y sus características deberán ser exactamente igual a las del paso dos (Hernández, 2010). En este contexto, la presente investigación se orientó a evaluar la patogenicidad de once aislados Fusarium spp., posibles causantes de la Marchitez Vascular en Babaco (Vasconcellea x. heilbornii var. pentagona), a nivel de invernadero en la ciudad de Loja.

Materiales y MétodosLa presente investigación se desarrolló en dos fases: la primera, se realizó en el invernadero (estructura de hormigón armado,

Robles et al. (2014); esTUDIo De lA PAToGeNICIDAD De AIslADos De FUsARIUm sPP., AsoCIADos A lA mARCHITeZ VAsCUlAR Del bAbACo eN loJA- eCUADoR



ventanales de vidrio y cubierta de fibra de vidrio) de la Universidad Nacional de Loja; la segunda fase se realizó en el laboratorio del Centro de Biotecnología.

Materiales biológicos

Se utilizaron once aislados Fusarium sp., provenientes de los cantones de Loja y Saraguro, caracterizados morfo-cultural y molecularmente por Armijos y Serrano, 2014 (Cuadro 1).

Material vegetal

Se utilizaron 300 plántulas de Babaco (Vasconcellea x. heilbornii var. pentagona) de 90 días después de la siembra (dds).

Diseño experiMental.Se utilizó el diseño experimental completamente al azar (DCA), con 12 tratamientos (Cuadro 2).

Cuadro 1. Aislados de Fusarium sp., asociados a la Marchitez Vascular del Babaco (Armijos y Salinas, 2014).

Código de Aislado

# Pares de Bases Accesión Versión Homología

(Blasn) Organismo

AML 1 510 bp FR822779 FR822779.1 99% Fusarium sp. LF236

AML 2 522 bp KC429789 KC429789.1 99% Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A

CHA 1 522 bp KC429789 KC429789.1 99% Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A

COC 1 538 bp EF495238 EF495238 99% Fusarium oxysporum strain Ppf6

COC 2 538 bp EF495238 EF495238.1 99% Fusarium oxysporum strain Ppf6

COC 3 522 bp KC429789 KC429789.1 99% Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A

ECM 1 557 bp KC428403 KC428403.1 99% Fusarium oxysporum isolate IBSD-F.O

ECM 2 546 bp JN400714 JN400714.1 99% Fusarium oxysporum f. sp. ciceris

QUI 1 539 bp EU910076 EU910076.1 98% Fusarium oxysporum f. sp. ciceris

QUI 2 522 bp KC429789 KC429789.1 99% Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A

REY 1 522 bp KC429789 KC429789.1 99% Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A

Leyenda: Amable María (AML), El Carmelo (ECM), Reymincha (REY), Chantaco (CHA), Cochapamba (COC) y Quisquinchir (QUI).

sieMbra y Desinfección De plantas De babaco.Se utilizaron 300 plántulas de Babaco (60 días después de la siembra [dds]). El sustrato para la siembra estuvo compuesto en una proporción 2-1-1 (turba-arena-tierra agrícola) y desinfectado en vapor húmedo a ± 200°C por dos horas. Antes de realizar el experimento a todas las plantas se las sometió a un periodo de aislamiento preventivo de 60

días, es decir se llevó un estricto control de plagas, enfermedades, fertilización y riego (Ver apéndice 1), para que las plántulas estén en óptimas condiciones y realizar los experimentos por cada uno de los tres métodos (Inmersión de raíces, inyección de 10 ml de solución fúngica a nivel del cuello de la raíz, e inoculación al sustrato con 100 ml de solución fúngica).



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Cuadro 2. Especificación de los tratamientos utilizados en el estudio de la patogenicidad de once aislados de Fusarium spp., asociados a la MVB.

N° Descripción Código Tratamiento1 Testigo ------------------- T0

2 Fusarium sp. (aislado Amable María) F-AML1 T1

3 Fusarium oxysporum (aislado Amable María) FOX-AML2 T2

4 Fusarium oxysporum (aislado Chantaco) FOX-CHA1 T3

5 Fusarium oxysporum (aislado Cochapamba) FOX-COC1 T4



8 Fusarium oxysporum (aislado El Carmelo) FOX-ECM1 T7

9 Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (aislado El Carmelo) FOX-ECM2 T8

10 Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (aislado Quisquinchir) FOX-QUI1 T9

11 Fusarium oxysporum (aislado Quisquinchir) FOX-QUI2 T10

12 Fusarium oxysporum (aislado Reymincha) FOX-REY1 T11

MétoDo De inoculación De plantas De babaco por inMersión De raíces.Se realizó un pre-inóculo en 10 cm3 de medio de cultivo Caldo-Papa-Dextrosa (CPD) en tubo de ensayo de 20 cm3, en donde se inocularon los 11 aislados de Fusarium sp., los cuales se incubaron por 5 días a ±30°C y a 300 rpm en una incubadora tipo Shaker. Pasado el tiempo se transfirió todo el contenido del tubo de ensayo a un matraz de 500 cm3 que contenía el medio de cultivo CPD y se las incubó igual que el paso anterior. Transcurrido el tiempo se filtró 2 ml de cada uno de los inóculos en tubos eppendoff con el objetivo de realizar el conteo de la cantidad de conidios de cada uno de las muestras en la cámara de Neubauer. Para ello se utilizó la siguiente fórmula propuesta por Rojas-Triviño (2011):

CC=∑n (5 X 10 000)

CC = Concentración en la cámara

∑n = Sumatoria de células en los cinco cuadrantes

(5 X 10 000) = Constante

Seguidamente se ajustaron todas las concentraciones en una proporción de 1 X 106 por ml-1 UFC (Unidades Formadoras

de Colonias), aplicando la siguiente fórmula propuesta por Castellanos et. al. (2011)

V_incial X C_inicial= V_final X C_final

Vinicial = Volumen inicial del inóculo que deseamos preparar

Cinicial= Concentración inicial del inóculo

Vfinal = Volumen final del inoculo que deseamos preparar

Cfinal = Concentración final deseada del inoculo (1 X 106)

Una vez montado el ensayo en el invernadero se procedió a realizar la inoculación de la siguiente forma: Se extrajo todas las plántulas por tratamiento del sustrato tratando de hacer el menor daño posible; con agua común se lavaron las raíces, se procedieron a realizar pequeños daños con la ayuda de tijeras a las raíces para crear la vía de ingreso de cada una de los aislados de Fusarium, seguidamente las cinco plántulas se sumergieron por 5 minutos en la solución fúngica de 400 ml, ajustada a una concentración de esporas de 1 X 106. Este paso se realizó para los 11 aislados de Fusarium sp., posteriormente se procedieron a sembrar las cinco plántulas inoculadas en el mismo sustrato y maceta de la que se extrajo (Ver apéndice 2).




Se inocularon un total de 60 plantas de Babaco (5 plántulas de Babaco por cada cepa de Fusarium sp.), las plántulas del tratamiento testigo (T0) se inocularon con agua destilada estéril, esto se realizó bajo un Diseño Completamente al Azar con 5 repeticiones (Ver cuadro 2 y 3), todas las unidades experimentales se regaron con 400 ml de agua estéril al momento de la inoculación y posterior a esta, al calendario previamente establecido; bajo condiciones de invernadero.

MétoDo De inoculación De plantas De babaco con 10 Ml De solución fúngica a nivel Del cuello De la raíz.Para el desarrollo de este método de inoculación se siguió exactamente la misma metodología del primer método de inoculación en lo referente a: preparación del sustrato, cuarentena e inóculo – inoculación (preparación del medio, siembra del patógeno en medio líquido, pre-inóculo e inoculo final). En cambio el proceso de inoculación se describe a continuación:

Con la ayuda de una jeringuilla se inóculo 10 ml de la suspensión fúngica en el cuello de la raíz. La suspensión se ajustó a 1 X 106 UFC X ml-1 de cada uno de los aislados de Fusarium sp., esto se realizó con cada plántula, de cada tratamiento, con sus 5 repeticiones y

de acuerdo los 12 tratamientos en total se inocularon 60 plántulas de Babaco.

MétoDo De inoculación De plantas De babaco con 100 Ml De solución fúngica al sustrato.Igualmente se siguió la misma metodología del primer método de inoculación en lo referente a: preparación del sustrato, cuarentena e inóculo – inoculación (preparación del medio, siembra del patógeno en medio líquido, pre-inóculo e inoculo final). En cambio el proceso de inoculación se describe a continuación:

A cada unidad experimental se inoculó 100 ml de solución fúngica ajustada a 1 X 106 UFC X ml-1 del aislado de Fusarium sp., paro lo cual se utilizó un vaso milimetrado de 250 ml de capacidad. La inoculación se realizó a cada planta de cada uno de los tratamientos, con 5 repeticiones. En total se inocularon por este método 60 plántulas de Babaco.

cinética Del progreso De la enferMeDaD Mvb MeDiante los Diferentes MétoDos De inoculación.Se evaluó el nivel de patogenicidad de los once aislados de Fusarium sp., para ello se utilizó la escala de evaluación externa propuestas por Ventimilla (2000) y citado por Cueva (2007) (Cuadro 3). Esta escala se utilizó para los tres métodos de inoculación, desde

Cuadro 3: Escala de evaluación de severidad externa para plantas de Babaco, Loja, junio del 2013.

Nivel Síntomas

0 Planta sana1 Clorosis inicial de las primeras hojas bajeras.

2 Clorosis intensa de aproximadamente el 50 % del follaje. Defoliación mo-derada.

3 Clorosis total del follaje. Defoliación severa. Bandas oliváceas longitudina-les y deprimidas en el tallo.

4 Plantas completamente defoliadas. Necrosis descendente desde el ápice del tallo (muerte de la planta).

Fuente: Cueva 2007

el segundo día después de la inoculación (ddi) hasta los 40 ddi. Se evaluaron los 12 tratamientos y las 5 repeticiones.

coMprobación De los postulaDos De Koch. Después de los 40 días de evaluación, se seleccionaron las mejores muestras y se



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Cuadro 4: Escala de evaluación de severidad interna en la raíz de Babaco, Loja, junio del 2013.

trasladaron al Laboratorio de Microbiología del Centro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Loja, donde se realizó el aislamiento, cultivo puro y descripción del microorganismo, para comprobar si éste corresponde al aislado de Fusarium sp., previamente inoculado de acuerdo a cada uno de los tratamientos y así determinar el causante de la sintomatología presentada en el Babaco. El aislamiento del hongo del tejido vegetal se realizó por siembra directa en medio de cultivo PDA, según la metodología

propuesta por Ochoa y Fonseca (2000) y Leslie y Summerell (2006). Esta evaluación se la realizó con la escala de severidad interna se la realizó cuando se extrajo la planta para trasladarla al laboratorio para la comprobación de los postulados de Koch. Esto se realizó visualmente, realizando un corte transversal del cuello de la raíz para observar si existía una decoloración y la necrosis de la misma y asignarle un grado según la escala descrita a continuación (Cuadro 4) (Cueva, 2007).

Grado Descripción

0 Raíces sanas, ausencia de lesiones. Sistema vascular sano sin coloración.

1 Lesiones leves en la corteza de la raíz y/o raicillas

1a Lesiones pronunciadas en la corteza de la raíz/raicillas y cuello de la planta patrón.

2 Colonización vascular limitada a la raíz.

3 Colonización vascular significativa de la raíz que progresa hasta el cuello del patrón.

4 Colonización vascular de la raíz, cuello y parte del tallo del patrón.

5 Colonización vascular abundante de toda la planta, incluyendo el injerto.

Análisis de resultadosLos datos obtenidos con el uso de las escalas de evaluación de la severidad interna y externa, no representan el real grado de severidad de la enfermedad, para lo cual, todos los datos de las evaluaciones fueron transformados mediante el uso de la siguiente formula citada por Vázquez (2008):

Dónde:

S = Severidad o grado de Ataque de la enfermedad

∑ (a x b) = Sumatoria del número de plantas u órganos enfermos o infectados según el grado de afectación (0, 1, 2, 3, 4, 5)

n = Número de plantas evaluadas

k = Valor o grado mayor de la escala (en este caso 5).

Con los datos trasformados de la severidad interna y externa, se realizaron curvas de la cinética de la enfermedad de cada tratamiento y de los tres métodos de inoculación, para esto se utilizó el programa Microsoft Office Excel 2010.

Asimismo con los datos transformados y registrados de las diversas evaluaciones de los tres métodos de evaluación bajo un diseño completamente al azar (DCA), se procedió a realizar el análisis estadístico correspondiente, antes de realizar el análisis de la varianza todos los datos obtenidos tenían que cumplir con las siguientes condiciones necesarias para proceder a su análisis: aleatorización, independencia de




errores experimentales, homogeneidad de varianza y normalidad de datos (Sigarroa, 2006).

Los datos de las evaluaciones de los doce tratamientos y de las cinco repeticiones después de la transformación de la severidad están dados en porcentajes, para lo cual se transformaron utilizando la siguiente formula (Sigarroa, 2006):

x = dato de la investigación

0,5 = coeficiente para la trasformación cuando existen ceros.

Seguidamente se procedió a realizar el análisis de la varianza (ANOVA) y se realizó las pruebas de separación de medias de Tukey al 5%, para ello se utilizó el software STATGRAPHICS Centurión versión 15.2.14 (Armijos y Salinas, 2014).

Los análisis de la severidad externa e interna se realizaron según los datos reportados a los 40 días después de la inoculación.

ResultadosDurante el transcurso de la cuarentena se identificaron que algunas plántulas presentaban sintomatología de enfermedades causadas por hongos y por virus, por lo cual se procedió a separarlas para evitar la propagación hacia las demás. Las enfermedades detectadas no constaron dentro de nuestro marco de investigación, por lo cual no se las caracterizaron, simplemente se realizó la exclusión de las plántulas infectadas. En la presente investigación se seleccionaron plántulas que no tuvieran sintomatología de enfermedades fitopatológicas, con un solo tallo, bien formadas y con un promedio de 8 a 12 hojas.

Método de inoculación de plantas de Babaco por inmersión de raíces

Los mejores resultados estadísticos para la severidad externa, corresponden a los aislados FOX-CHA1, FOX-COC1 y FOX-REY1, como se muestra en la Figura 1. Los 3 aislados antes indicados han expresado el 100 % de severidad, es decir la planta de Babaco llegó a un estado de necrosamiento total causando la muerte en ellas.

Figura 1: Curva de severidad de los 11 aislados de Fusarium sp., asociados a la MVB y nivel de significancia por tratamiento según la prueba de TukeyHSD,

Leyenda: Fusarium sp. Amable María (FOX-AML1), Fusarium oxysporum Amable María (FOX-AML2), Fusarium oxysporum Chantaco (CHA1), Fusarium oxysporum Cochapamba (COC1, COC2 Y COC3), Fusarium oxysporum El Carmelo (ECM1 Y ACM2), Fusarium oxysporum Quisquinchir (QUI1 Y QUI2) y Fusarium oxysporum Reymincha (REY1). Medias

con letras desiguales difieren estadísticamente para p< 0.05 según la prueba de Tukey HSD.



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Figura 2: Curva de severidad de los 11 aislados de Fusarium sp., asociados a la MVB y nivel de significancia por tratamiento según la prueba de TukeyHSD.

Figura 3: Curva de severidad de los 11 aislados de Fusarium sp., asociados a la MVB y nivel de significancia por tratamiento según la prueba de TukeyHSD





MétoDo De inoculación De plantas De babaco con 10 Ml De solución fúngica a nivel Del cuello De la raíz.

con respecto a los tratamientos restantes, considerándolos estadísticamente como los mejores aislados, al igual que en el método de inoculación antes descrito.

MétoDo De inoculación De plantas De babaco con 100 Ml De solución fúngica al sustrato Al igual que en los dos métodos de inoculación anterior, los mejores aislados luego de las pruebas estadísticas, fueron

los tratamientos T3 (FOX-CHA1), T4 (FOX-COC1) y T11 (FOX-REY1), como se puede ver en la Figura 3, los cuales presentaron mayor severidad de la enfermedad de la MVB.

En la Figura 2, identificamos los tratamientos T3 (FOX-CHA1) y T4 (FOX-COC1) y el T11 (FOX-REY1) con mayor severidad, presentando una diferencia bien marcada




coMprobación De los postulaDos De Koch.Mediante los postulados de Koch, se comprobó que el microorganismo re-aislado de las plantas de Babaco después del periodo de evaluación, correspondía al aislado inoculado, esto se lo evidenció para cada uno de los 11 aislados dentro de los tres métodos utilizados para la inoculación.

evaluación De la severiDaD interna por inMersión De raíces.Los mejores resultados estadísticos corresponden a los aislados FOX-CHA1, FOX-COC1 y FOX-REY1, como se observa en la Figura 4, donde se representa la severidad interna identificada en cada uno de los tratamientos.

Figura 5: Gráfico de medias de tratamientos para la severidad interna, según el método de inyección de una solución conidial en el cuello de la raíz.

Figura 5: Gráfico de medias de tratamientos para la severidad interna, según el método de inyección de una solución conidial en el cuello de la raíz.





evaluación De la severiDaD interna por inyección De 10 Ml De solución fúngica a nivel Del cuello De la raíz.En la Figura 5, se puede observar los resultados de las pruebas estadísticas, las

cuales arrojaron que los mejores aislados para la severidad interna de acuerdo al método de inoculación son FOX-CHA1 y FOX-COC1, y FOX-REY1, los cuales expresaron mayor severidad de la MVB en plantas de Babaco.



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Figura 6: Gráfico de medias de tratamientos para la severidad interna, según el método de inoculación al sustrato.



evaluación De la severiDaD interna por inoculación al sustrato con 100 Ml De solución fúngica.Al igual que en los dos métodos de inoculación anterior, los mejores aislados luego de las pruebas estadísticas, corresponden a FOX-

CHA1, FOX-REY1 y FOX-COC1, como se observa en la Figura 6.

DiscusiónDurante la cuarentena se identificaron plántulas que a pesar de estar sometidas a estrictos controles fitosanitarios, manifestaban la presencia de enfermedades patógenas, tales como: decaimiento de las plantas, aclaramiento de nervaduras y deformación de hojas. Esto debido a que Babaco es una especie que se propaga asexualmente utilizando brotes tiernos o estacas, lo que predispone a esta especie a problemas fitopatológicos (Scheldeman, 2002; AAIC, 2003).

Al haber elegido un sustrato con proporción 2-1-1 (turba-arena-tierra agrícola) permitió que el sistema radicular de las plantas de Babaco tuviera un buen desarrollo, esto debido a las propiedades físicas en cuanto a porosidad, drenaje y retención de agua (Iskánder, 2010).

Para la desinfección del sustrato se pueden utilizar métodos físicos, químicos y biológicos, en el caso de los métodos químicos no son recomendables para trabajar en investigaciones como la nuestra, ya que los residuos del mismo

afectarían el desarrollo del organismo inoculado Fusarium sp. De igual manera con el método biológico se afectaría al patógeno inoculado Fusarium sp., con el microorganismo antagónico utilizado en la desinfección del sustrato. Por tales razones utilizamos el método físico, que consiste en la desinfección de sustrato por vapor de agua (Carrasco y Riquelme, 2006), debido a que al someter al sustrato a vapor de agua a una temperatura de 200°C se elimina todo tipo de patógenos y semillas de otras especies. Dejando listo el sustrato para realizar las pruebas de patogenicidad con Fusarium sp.

La inoculación artificial del patógeno coincidió con los signos y síntomas de Marchitez Vascular en plantas de Babaco según las descripciones realizadas por Agrios (2005), quien señala que todos los Marchitamientos Vasculares presentan características en común; la planta infectada pierde turgencia, se debilitan, adquiere una tonalidad que va del verde claro al amarillo verdoso, decaen y finalmente se marchita y muere. Como se puede ver en las figuras 1, 2 y 3, el tiempo en el que se expresaron los primeros signos de la MVB




varió de acuerdo al método de inoculación. En el método de inmersión de raíces, se observó los signos de la enfermedad en menor tiempo, debido a que en la inoculación hubo contacto directo de Fusarium con el sistema radicular de la planta, además de las heridas causadas por la manipulación de las raíces. Caso que coincide con lo mencionado por Agrios (2005), que menciona que los patógenos se desarrollan muy bien en tejidos lacerados o destruidos antes de llegar a los tejidos sanos.

Ochoa y Fonseca (2000), mencionan que Fusarium oxysporum es el causante de la Marchitez Vascular del Babaco, sin embargo en el proyecto se puede apreciar que únicamente 3 de los 11 tratamientos utilizados son los causantes de la Marchitez Vascular del Babaco (T3 FOX-CHA1Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A, T4 FOX-COC1 Fusarium oxysporum strain Ppf6 Y T11 FOX-REY1 Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A), mientras que los otros tratamientos causan un daño fisiológico pero no llegan a causar la marchitez o muerte de la planta.

Mediante los postulados de Koch, se llegó a determinar que los signos y la sintomatología expresada por las plantas inoculadas corresponden a la expresión patógena de los aislados inoculados. Por lo tanto se comprueba la patogenicidad de los 11 tratamientos.

Según la evaluación de la severidad, en el caso de los tres métodos de inoculación, los tratamientos T3 (FOX-CHA1) Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A, T4 (FOX-COC1) Fusarium oxysporum strain Ppf6 Y T11 (FOX-REY1) Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A, expresaron la mayor severidad externa e interna (figuras de la 1 a la 9). En el método de inmersión de raíces y de inyección a nivel del cuello de la raíz, estos tratamientos a los cuarenta días de la inoculación causaron la muerte total de la planta. A diferencia del método de inoculación al sustrato en el que estos tratamientos no causaron la muerte de la planta pero de igual manera resultaron ser los tratamientos más severos, esto se debe a que en la inoculación no se provocó ninguna herida artificial a la

planta, por lo tanto el microorganismo no tuvo una vía de ingreso para causar el mayor daño en el tiempo de evaluación (Agrios, 2007).

Hay que destacar que tanto el tratamiento T3 (FOX-CHA1) Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A, T4 (FOX-COC1) Fusarium oxysporum strain Ppf6 Y T11 (FOX-REY1) Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A corresponden a aislados de Fusarium oxysporum, aunque esto no quiere decir que este es el causante de la Marchitez Vascular del Babaco, debido a que los demás aislados también correspondían a Fusarium oxysporum (a excepción del tratamiento T1 F-AML1 q fue un aislado de Fusarium sp.) y estos no produjeron la enfermedad pero si se observó amarillamiento de hojas bajeras de las plantas de Babaco inoculadas. Se deben seguir realizando investigaciones con Fusarium oxysporum, para determinar por qué no todas las cepas de este microorganismo llegan a causar la marchitez vascular en Babaco.

ConclusionesEl sustrato compuesto por turba, arena y tierra en una proporción de 2:1:1 y previamente esterilizado a vapor de agua, fue ideal para realizar las pruebas de patogenicidad.

Dentro de los 60 días de cuarentena, se puede determinar con que planta se puede trabajar, en este caso de Babaco, ya que este tiempo es suficiente para evidenciar plantas con cualquier sintomatología de alguna enfermedad.

Para que existe ataque de Fusarium sp. a plantas de Babaco, debe haber una herida o daño en las raíces o cuello de las plantas, para que pueda expresarse directamente.

El mejor método de inoculación, es el método por inmersión de raíces, ya que se da un contacto directo del microorganismo patógeno con el hospedero (planta), llegando a infectar de una manera directa a la planta. Los tratamientos que tuvieron mayor severidad de la enfermedad de la MVB son T3 FOX-CHA1, T4 FOX-COC1 Y T11 FOX-REY1.



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Se considera un periodo de 40 días para la evaluación de la enfermedad de la Marchitez Vascular del Babaco, ya que en este tiempo se llega a estabilizar la severidad de la enfermedad causada por Fusarium sp. Los Postulados de Koch, han permitido determinar con certeza que las sintomatologías observadas corresponden al patógeno inoculado

AgradecimientosLos autores agradecen a la Universidad Nacional de Loja y al Consejo de Universidades Flamencas (VLIR) de Bélgica por el financiamiento otorgado para la realización del presente estudio. A Kléver Iván Granda Mora, Roldan Torres Gutiérrez y Masao Nishikawa por el aporte a la realización de las investigaciones.

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estudio de la patogenicidad de aislados de fusarium spp

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