western blott

Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.1

WESTERN BLOT

Alumnos:

Arias Orozco Patricia E.

Rosario Amaris Guevara García

Jessica Wendolyn García Pérez

Acosta Dent Andrea

Ortiz Robles Cintia

Moreno Rodríguez Eduardo

Grupo:

4BM3

Asignatura:

Laboratorio de Biotecnología Molecular

Profesora:

Dra. Paola Berenice Zarate Segura.

Amaris

Rectángulo

Amaris

Caja de texto




PRÁCTICA NO. 11

Western Blot

1. OBJETIVOS:

1.1 Objetivo General

Conocerá y realizará la técnica de western blot para detección de proteína mediante la

reacción antígeno-anticuerpo.

1.2 Objetivos específicos

Conocer la metodología para realizar electroforesis en gel de poliacrilamida.

Aprender la metodología para realizar una transferencia a membrana de nitrocelulosa.

Aplicar la técnica de western blot para detectar proteínas (IgG humana).

2. INTRODUCCIÓN

2.1 Fundamento Western Blot

El western blot es una técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas basada en

la capacidad de unión a anticuerpos específicos. Luego de separar las proteínas en un gel

de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), las bandas de proteínas se transfieren a una membrana

de nitrocelulosa (electrotransferencia), las bandas individuales de proteína (proteína de

interés) se identifican al inundar la membrana de nitrocelulosa con anticuerpo policlonal o

monoclonal radiomarcado o unido a enzimas específicas para la proteína de interés.

Los complejos Ag-AB que se forman en la banda que contiene la proteína reconocida por

el anticuerpo pueden visualizarse de diversos modos. Si un anticuerpo radioactivo se unió

a la proteína de interés, es posible determinar su posición en la mancha (blot) exponiendo

una placa de rayos x a la membrana, un procedimiento que se conoce como

autorradiografía. Sin embargo, en los procedimientos de detección que más se usan suelen

emplearse anticuerpos unidos a enzima. Tras la unión del conjugado de enzima y

anticuerpo, la adición de un sustrato cromógeno que produce un producto de color

intenso y soluble origina la aparición de una banda de color en el sitio del antígeno blanco.

La técnica también puede identificar un anticuerpo específico en una mezcla. En este caso

los antígenos conocidos de peso molecular bien definido se separan mediante SDS-PAGE y

se transfieren a nitrocelulosa. Las bandas separadas de antígenos conocidos se prueban

luego con la muestra que se sospecha contiene anticuerpo específico para uno o más

antígenos. La reacción de un anticuerpo con una banda se detecta mediante el empleo de

un anticuerpo secundario radio marcado o ligado a enzima específica para la especia de

los anticuerpos en la muestra de estudio (figura 1.).




2.2 Purificación de proteína

Se debe tener en cuenta que nuestras proteínas de interés se encuentran en solución

acuosa de baja salinidad. Al incrementar la concentración de sales en la solución,

incorporando lentamente sulfato de amonio, (entre 20-95% de saturación), la proteína

comienza a tener intercambios iónicos con los iones de amonio y sulfato, sustituye los

sitios de intercambio que compartía con el agua y pasado un tiempo de esta manera, la

proteína disminuye su solubilidad y “precipita”.

Por lo general las moléculas de mayor peso molecular se precipitan primero. Esta nueva

solución se centrifuga y el precipitado que contiene las proteínas se recupera.

El éxito de la precipitación depende del tiempo de contacto y de la concentración de la

solución.

2.3 Diálisis

Consiste en tomar una alícuota del precipitado y dializar mediante el flujo selectivo de

materia de una zona de mayor concentración a otra de menor concentración con ayuda de

la presión osmótica, es decir, separando dos disoluciones de concentraciones diferentes

Figura 1. Mecanismo de acción molecular western blot




por una membrana semipermeable (una membrana que permite el paso selectivo de las

moléculas del disolvente, pero impide el paso de compuestos de mayor peso molecular).

De esta manera se puede concentrar un producto o separarlo de una mezcla de moléculas.

Es necesario realizar este paso a baja temperatura y en agitación constante, ya que la

diálisis es un proceso molecular que depende exclusivamente de los movimientos

aleatorios de las moléculas individuales.

2.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

La electroforesis es el fenómeno por el cual una molécula que posee carga neta se

desplaza en respuesta a la aplicación de un campo eléctrico. La velocidad de migración o

movilidad a través del campo eléctrico dependerá de varios factores como son: la

intensidad de dicho campo; la carga neta, tamaño y forma de las moléculas; así como la

fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio en el cual las moléculas se están

moviendo. La electroforesis es una herramienta analítica simple, rápida y muy sensible, lo

que la convierte en una técnica de gran utilidad para la separación y el estudio de

moléculas cargadas tales como proteínas y ácidos nucleicos.

Para la electroforesis de proteínas se utilizan los geles de poliacrilamida debido a su buena

resolución y gran versatilidad. Además, poseen una serie de ventajas tales como: ser

químicamente inertes, estables en un amplio rango de pH, temperatura, fuerza iónica y

fácil de generar mediante la polimerización de acrilamida.




El gel se prepara a partir del monómero de acrilamida (figura 2) que forma largas cadenas

lineales, con abundantes grupos polares que las hace solubles en medios acuosos.

La polimerización de la acrilamida se obtiene por la adición de catalizadores de la

polimerización que inician y aceleran el proceso de formación de un gel tridimensional.

Normalmente, el proceso se inicia con la adición de persulfato amónico a una disolución

acuosa (tampón) de ambos monómeros (acrilamida + bisacrilamida), seguido de la adición

de TEMED (N,N,N’,N’-tetrametilendiamina) que actúa como propagador de la reacción de

polimerización a pH básico (el pH ácido retarda la polimerización)(figura 3). Por lo tanto,

ajustando las concentraciones de persulfato y TEMED puede controlarse la velocidad de

polimerización

El tamaño de poro de los geles de poliacrilamida viene determinado por la concentración

total de monómeros. La concentración de acrilamida (% T) representa el porcentaje en

peso del monómero total empleado (acrilamida + bisacrilamida; % p/v) y determina la

longitud promedio de la cadena del polímero. La concentración de bis-acrilamida (% C)

Figura 2. Estructura de la acrilamida, bisacrilamida y poliacrilamida

Figura 3. Reacción de polimerización de la acrilamida




representa el porcentaje de este monómero en el gel y determina el grado de

entrecruzamiento. Por lo tanto incrementando %T el tamaño de poro decrece (los geles

con %T inferiores a 2.5-3.0% son casi líquidos y los geles con un %T del 30% presentan un

reticulado tan denso que moléculas tan pequeñas como 2000-3000 Da difícilmente

pueden atravesarlos).

La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida puede llevarse a cabo en

condiciones nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE). En el caso del SDS- las

proteínas se solubilizan en un detergente (SDS), desnaturalizándolas y cargándolas con

carga negativa a lo largo de la cadena polipetídica (una molécula de SDS por cada dos

residuos de aminoácidos) (figura 4). Debido a que la cantidad de SDS que se une a las

proteínas es prácticamente proporcional a su tamaño, los complejos SDS-proteínas

presentan un valor carga/masa constante y por lo tanto se separan de acuerdo a su

tamaño cuando migran desde el cátodo al ánodo a una velocidad relacionada con su peso

molecular. Además del SDS, se emplean otros agentes desnaturalizantes como son un

agente reductor, generalmente el 2-mercaptoetanol que reduce los puentes disulfuro (Cys-

S-S-Cys) a grupos tioles (Cys-SH).

Concentración de acrilamida

(%T)

kDA

3-5 >100

5-12 20-150

10-15 10-80

>15 <15

Tabla 1. Relación del %T con los kDa de proteína.

Figura 4. Electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida. El tratamiento de las muestras con agentes

desnaturalizantes provoca la desnaturalización de las proteínas, pérdida de la estructura secundaria y la disociación de las

subunidades. Las proteínas quedan cargadas negativamente y migran del polo negativo al positivo durante la

electroforesis.




En resumen, la SDS-PAGE es la electroforesis más utilizada para el análisis de proteínas

debido a:

La gran mayoría de las proteínas son solubles en SDS.

Todos los complejos SDS-proteína tienen carga negativa y migran, por lo tanto,

en el mismo sentido.

Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migración

también lo es y las electroforesis son muy rápidas.

La separación depende de un parámetro físico-químico, como es la masa

molecular, que se puede calcular.

Los complejos SDS-proteína se tiñen fácilmente.

En esta práctica la electroforesis de proteínas se basa en un sistema discontinuo el cual se

tiene un gel concentrador y un gel separador, la diferencia entre estos dos es el pH y la

concentración de acrilamida. El fundamento de esta técnica es la siguiente: La movilidad de

una proteína en el gel concentrador es intermedia entre la movilidad de los iones cloruro

Cl- del gel y la movilidad del ión glicina Gly- del buffer. Por lo tanto, entre ambos frentes

existe una zona de baja conductividad y gran diferencia de voltaje, de forma que las

proteínas se concentran en una zona muy reducida entre ambos iones. Una vez en el gel

separador, el pH básico favorece la ionización de la glicina de forma que sus iones migran

a través de los polipéptidos concentrados, justo por detrás de los iones cloruro. A partir de

este momento las proteínas migran a través del gel separador en una zona de voltaje y pH

uniforme de forma que se separan en base a su tamaño (figura 5).

2.5 IgG

La inmunoglobulina G (IgG) es una de las cinco clases de anticuerpos humorales

producidos por el organismo. Es la inmunoglobulina más abundante de suero (600-1.800

Figura 5. Sistema discontinuo en gel de poliacrilamida

http://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpo




mg por 100 mL), constituye alrededor del 80% del total de las

inmunoglobulinas séricas. Es la inmunoglobulina más pequeña, con

un peso molecular de 150.000 Da así puede pasar fácilmente del

sistema circulatorio del cuerpo a los tejidos. La síntesis de IgG se

controla principalmente por el estímulo de los antígenos, al aparecer

una infección .Esta proteína especializada es sintetizada por el

organismo en respuesta a la invasión de bacterias, hongos y virus.

Existen 4 subclases de IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4).

IgG1, IgG3, IgG4 cruzan con facilidad la placenta y tienen un papel importante en la

protección del feto en desarrollo

IgG3 es el activador del complemento más eficaz, seguida por IgG1; IgG2 es menos

eficiente y la IgG1 no activa complemento en lo absoluto.

IgG1 e IgG3 se unen con gran afinidad a receptores en células fagocíticas, por

consiguiente media las opsonización.

2.6 Sangre

Las sustancias que se forman en el organismo deben ser transportadas de un lugar a otro.

Desde y hacia las células corporales. La homeostasis del ambiente interno depende de ello.

El principal medio de transporte es un líquido llamado sangre; el sistema transportador es

el sistema cardiovascular. Y el sistema complementario de transporte es el sistema

linfático.

La sangre no sólo está constituida por líquido, sino también por millones de células. La

parte líquida es el plasma (uno de los tres compartimiento líquidos del organismo), y las

células son los elementos figurados de la sangre.

La sangre tiene una temperatura de 38ºC, un pH entre 7,35 y 7,45, y corresponde al 8 %

del peso corporal.

Las funciones de la sangre son:

1. Transporte: Capta las sustancias alimenticias y el oxígeno en los sistemas

digestivo y respiratorio, y los libera en las células de todo el cuerpo. Transporta el

CO2 de3sde las células hasta los pulmones para ser eliminado. Recoge los desechos

de las células y los deja en los órganos excretorios. Capta hormonas y las lleva a sus

órganos blancos. Transporta enzimas, amortiguadores y otras sustancias

bioquímicas.

http://es.wikipedia.org/wiki/Peso_molecular

http://es.wikipedia.org/wiki/Ant%C3%ADgeno

http://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna

http://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria

http://es.wikipedia.org/wiki/Hongo

http://es.wikipedia.org/wiki/Virus




2. Regulación: del pH mediante las sustancias amortiguadoras. Además regula la

temperatura corporal, ya que puede absorber grandes cantidades de calor sin que

aumente mucho su temperatura, y luego transferir eses calor absorbido desde el

interior del cuerpo hacia su superficie, en donde se disipa fácilmente. Mediante la

presión osmótica, regula el contenido de agua de las células, por interacción de los

iones y proteínas disueltos.

3. Protección: mediante la coagulación se evita la pérdida excesiva de sangre.

Mediante la fagocitosis y la producción de anticuerpos protege contra las

enfermedades.

Parte corpuscular

Glóbulos Rojos: (Eritrocitos o hematíes) Tienen como función transportar el oxígeno a los

tejidos eliminando el Anhídrido Carbónico. Proceden a la regulación del equilibrio acido /

base de la sangre. Están compuestos por el 65% de agua y el 35 % de sustancias sólidas

(95% de hemoglobinas y 5% de lípidos).

Poseen en su superficie el antígeno que determina el grupo sanguíneo llamado

aglutinina. Un mm cúbico de sangre contiene un número de glóbulos rojos que va de 4.2

a 6 millones.

Glóbulos Blancos: (Leucocitos) Tienen la función de defensa del organismo. Algunos

sirven para destruir las sustancias extrañas al organismo; otros sirven a la creación de

anticuerpos.

Se dividen en Granulocitos, Linfocitos y Monocitos.

Los valores normales van de 4.000 a 10.000 por mm cúbico de sangre.

Plaquetas: Son los elementos más pequeños de la sangre. En un mm cúbico hay cerca de

300.000 plaquetas. Tienen una vida muy corta, de 3 a 5 días y su función es importante en

la coagulación de la sangre.

Parte líquida

Plasma: Representa el componente líquido de la sangre gracias a la cual las células

sanguinas pueden circular. El plasma está formado principalmente por agua (90%) en la

cual se encuentran disueltas y circulan muchas sustancias como proteínas, azúcar, grasas,

sales minerales, hormonas, vitaminas, anticuerpos y factores de la coagulación.

Entre las sustancias más importantes que transporta el plasma se encuentran las

siguientes:




La Albúmina: Es una proteína que ayuda a mantener el agua del plasma en una proporción

equilibrada.

Las Globulinas: Son los anticuerpos encargados de la defensa de nuestro organismo frente

a las infecciones. Su disminución acarreará una bajada de defensas.

Factores de Coagulación: Son imprescindibles para evitar las hemorragias. La ausencia de

algún factor de coagulación puede ocasionar trastornos hemorrágicos ya que se dificulta la

formación del coágulo.

Otras proteínas transportan sustancias necesarias para el normal funcionamiento de las

células (grasas, azúcares, minerales, etc.).

El plasma se utiliza para elaborar concentrados específicos de proteínas, que constituyen el

tratamiento de varias enfermedades como la hemofilia y otros defectos de la coagulación,

inmunodeficiencias con riesgo de padecer múltiples infecciones graves, la trombosis y otras.

Plasma

Es un líquido acuoso, formado por:

91,5 % de agua

8,5 % de solutos 7 % son

proteínas

albúmina 54%

globulinas 38%

fibrinógeno 7 %

otras 1 %

1,5 % son otros

componentes

electrolitos

nutrientes

gases

enzimas,

hormonas,

amortiguadores

vitaminas

productos de desecho




3. DESARROLLO EXPERIMENTAL

Salting In

Diálisis

Se realizó extracción de sangre

Incubamos 10 min la muestra hasta la

aparición del coágulo, este se retiró

Centrifugamos 10 min

Recuperamos sobrenadante (suero)

Agitar granitos de sal hasta observar precipitación

Las muestras se colocaron en bolsitas de dialisis

Estas bolsas se dejaron sumergidas en agua

destilada con agitacion constante

cada dos horas se tenia que cambiar el agua

destilada con cuidado de no dejar las muestras por mucho tiempo sin agua

Despues de aproximadamente 8 horas,

se detuvo el proceso

Recuperar las muestras en tubos Eppendorf




Electroforesis

Western blot

Transferencia

En esta práctica se realizó una transferencia por peso (en vez de aplicar corriente

simplemente al sistema de la figura 7 se le aplicaron libros en la parte de arriba), pero

generalmente se realiza una electrotransferencia el cual se montaría de la siguiente

manera:

Se preparó en tubos falcon la solución para el gel concentrador y

gel separador

Gel separador 10mL

Solución de

acrilamida 3.3mL

Amortiguador pH

8.8 2.5mL

H20 4.16mL

Gel concentrador 5mL

Solución de acrilamida

0.65mL

Amortiguador pH 6.8

1.25mL

H20 3.05mL

A cada solución se le agrego el persulfato de amonio y TEMED para la preparación del gel y se montaron las placas donde se

vertió la solución preparada de acrilamida y se espero a que

polimerizara.

Una vez preparados los geles, estos se meten en la

cámara de electroforesis, se conecta y se deja correr

durante 1h aprox




Bloqueo de membrana

Figura 6. Electrotransferencia, en la práctica en vez de aplicar el ánodo y cátodo simplemente se aplicaron

libros en la parte superior y de esta manera se llevó a cabo una transferencia por peso.




Unión a anticuerpo y revelado

3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La cantidad de proteínas presentes en el suero de

sangre humana son muchas y variadas las

proteínas que se pueden encontrar en el suero

humano son las siguientes con su correspondiente

peso molecular.

MOLECULA % en el

suero PESO (Da)

IgA 170000-720000

IgM 5 al 10% 950000

IgG 150000

IgE 190000

IgD 185000

Fibrógeno 340000

Albumina 69000

Como se observa la IgG es la proteína con menor peso molecular, el peso de las IgG según

el marcador de peso molecular corresponde a las señaladas por las flecha roja en la

imagen superior, por lo que podemos decir que si obtuvimos una buena cantidad de IgG y

otras proteínas , sin embargo considerando la gran cantidad de proteínas y que son de

Retiramso solución de bloqueo y se hicieron 3

lavados con PBS (agitación continua)

Se incubó la memebrana con el conjugado de

anticuerpo -peroxidasa 1h a temperatura

ambiente

Lavar con PBS 3 veces

Se incubó la membrana en la solución de

cromógeno/sustrato hasta que aparecieran

las bandas

Se enjuaga la membrana H2O MQ y dejar secar

M 1 2 3 4 5




peso molecular más altos estos debieron haber formado varias bandas a lo largo del gel

las, más de las que se observan, por lo que se puede decir que quedaron aglomeradas en

la parte superior del gel, provocando incluso como se observa en el carril 5 una

aglomeración muy grande, esto ocurrió ya que falto tiempo de corrimiento del gel. Otro

aspecto importante es que se cargaron 10чL de muestra lo cual por la cantidad de

proteína que se aglomerada podemos decir que fue mucha muestra y pudimos haber

cargado solamente unos 5чL de muestra de esta manera también hubiéramos podido

observar menos aglomeración, bandas más nítidas y precisas. Para poder saber con certeza

que cantidad de muestra cargar se debe hacer primero una cuantificación de proteínas,

para esto se pueden aplicar el método de Bradford, Lowry, ABS a 280nm y muchos otros

más que también ya vienen en kits.

Una vez corrido el gel este se transfirió a una membrana de nitrocelulosa por peso, lo que

esperábamos era que las proteínas corridas en el gel junto al marcador se transfirieran a la

membrana, estas al quedar en la superficie tendrán más contacto con el conjugado, se

añade el conjugado Ac-Enzima y luego el substrato/cromógeno el cual nos daría el

revelado de las bandas individuales de IgG.

Para identificar a IgG se utilizó el conjugado

proteína A PEROXIDASA [P-8651 SIGMA]

obtenida de Staphylococcus aureus, la cual se

utiliza en aplicaciones para Elisa directo, usando

IgG humana, la especificidad de los enlaces es

IgG solo de mamíferos, excepto rata, cabra y

oveja.

Se observa en la imagen de la de la membrana

que si hubo transferencia ya que el marcador se

ve a simple vista aunque al revelar no se notó

nada, esto pudo haber sido por los reactivos (tal

vez ya no servían) o por la leche, pero al teñir

con rojo de ponceau si se notaron las bandas

donde hubo unión a IgG ya que las bandas se

veían definidas (tenues), todas a la misma altura.

Esto nos confirma que si hubo transferencia,

bloqueo de la membrana ya que no hubo

uniones inespecíficas (no se observaron otras bandas) y que si se realizó la unión

Ag-Ac.

Preguntas de la Discusión

¿Qué es y para que se utilizó el Rojo de Ponceau?




Conocido también como Ácido Carmínico, se utiliza mezclado con ácido acético (0.1% Rojo

Ponceau, 5% ácido acético) para visualizar proteínas sobre membranas de nitrocelulosa. Es

un colorante muy usado, ya que luego puede decolorarse con facilidad con ácido

acético y metanol, y las proteínas pueden ser visualizas posteriormente con un anticuerpo

(Western blot). Aunque tiene menor sensibilidad de detección

que otros colorantes permanentes como el Azul de

Comassie o la plata, es un método que permite una detección

rápida.

Desventajas

Débil unión al soporte, de baja sensibilidad total de la

banda de proteínas

Límite de detección: 250ng

Bajo contrate, bandas rojas difíciles de fotografiar

Tiempo de tinción aproximadamente 5 minutos

Las bandas tienden a desaparecer después de unas horas.

¿Cómo reacciona el 4-cloro, 1-naftol?

En presencia de HRP y de peróxido de hidrógeno el cloronaftol reacciona forman un

precipitado azul-negro. La reacción es fácilmente controlable, aunque es relativamente

insensible y difícil de fotografiar.

¿Por qué utlizar membranas de nitrocelulosa y cual es el tamaño del poro?

Membrana de nitrocelulosa pura contiene la mayor capacidad de enlace posible.

Compatibles con diversos procedimientos de detección, como procedimientos isotópicos y

colorimétricos o quimioluminiscentes o fluorescencia. La membrana no requiere estar

impregnada con metanol y por lo tanto es selectiva para proteínas hidrófilas. Antes de la

transferencia, la membrana se humedece con agua y luego con el buffer de transferencia.

Tamaño de poro de 0,2 μm que garantiza una elevada retención de proteínas

pequeñas de peso inferior a 20 kD, reduciendo el paso de la muestra sin enlace.

¿Por qué utilizamos Proteína-A Peroxidasa P-8651 SIGMA?

La proteína A es un polipéptido de 42000 Daltons constituyente habitual de la pared

celular de Staphilococcus aureus. Se ha estudiado con gran detalle la interacción entre la

proteína A y los anticuerpos: la proteína A tiene cuatro potenciales lugares de unión a los

anticuerpos, sin embargo sólo se puede usar uno a la vez. Sin embargo la proteína A es

claramente bifuncional permitiendo la formación de complejos multiméricos. En las

moléculas de anticuerpo la región de unión a la proteína A se encuentra en las regiones

constantes segunda y tercera de la cadena pesada. Por ello, cualquier anticuerpo tiene al




menos dos lugares de unión a la proteína A, y esto es una organización ideal para la

formación de complejos multiméricos.

La afinidad de la proteína A depende de las regiones Fc del anticuerpo, dependientes de la

subclase. La proteína A tiene alta afinidad por los anticuerpos humanos, de burro, conejo,

perro, cerdo y cobaya, menor afinidad pero aún útil por ratón, vaca o caballo, y es baja y

por ello poco útil para detectar anticuerpos de oveja, cabra, rata o gallina. En este último

caso se suele emplear un anticuerpo puente de una especie por la que tenga alta afinidad.

Hay tres propiedades de la proteína A que la hacen muy útil en los estudios

inmunocitoquímicos:

1. Debido a que la región de unión con el anticuerpo reside en la región Fc, la unión a

proteína A no cambia la capacidad del anticuerpo de unirse a su antígeno.

2. Incluso una proteína A desnaturalizada renaturaliza fácil y rápidamente

recuperando su capacidad de unión.

3. Aunque la afinidad de la proteína A por el anticuerpo es elevada la unión antígeno-

anticuerpo se puede romper con facilidad reduciendo el pH.

La proteína A se ha empleado en gran cantidad de métodos inmunoquímicos, acoplada a

isótopos radiactivos (detección en Western blot), a marcadores fluorescentes, oro coloidal,

etc..., unida a resinas en la confección de lechos cromatográficos para la purificación de

anticuerpos.

En la actualidad la proteína A se purifica tanto de fuentes naturales (S. aureus) como a

partir de sistemas de sobreexpresión de proteínas recombinantes.

Fuente: Staphylococcus aureus

Propiedades:

Forma: Polvo liofilizado

Aplicaciones: Elisa directo, usando IgG humana

Temperatura de almacenamiento: -20 °C

Especificidad: Enlaces a IgG solo de mamíferos, excepto rata, cabra y oveja.

Forma Física: Polvo liofilizado incluido con citrato de sodio como buffer. Proteína

determinada por absorbancia a 205 nm.

Seguridad: Uso de gafas, guantes y filtro respirador

¿Cuál es la función de B MERCAPTOETANOL?

Se utiliza en la electroforesis SDS-PAGE, se trata de un tipo de electroforesis

desnaturalizante en la que las muestras se desnaturalizan por calor en presencia de




agentes desnaturalizantes (beta-mercaptoetanol, que destruye los puentes disulfuro, SDS

que desnaturaliza y recubre a la proteína), y se separan como cadenas polipeptídicas

aisladas.

Algunas proteínas pueden ser desnaturalizadas por 2-mercaptoetanol por medio de su

habilidad para separar puentes disulfuro:

cysS-Scys + 2 HOCH2CH2SH → 2 cysSH + HOCH2CH2S-SCH2CH2OH

Por medio de la ruptura de los puentes S-S, la estructura terciaria así como la estructura

cuaternaria de algunas proteínas se pueden ver disruptas. Si una proteína consta de varias

cadenas polipeptídicas distintas unidas mediante puentes disulfuro, la acción del 2-

mercaptoetanol separará las cadenas polipeptídicas distintas. Por ello, el 2-mercaptoetanol

se emplea profusamente para analizar el estado de oligomerización de las proteínas.

El 2-mercaptoetanol se puede reemplazar por ditiotreitol (DTT) o el menos oloroso tris(2-

carboxietil)fosfina (TCEP) en aplicaciones biológicas.

4 CONCLUSIONES

Para la purificación de las proteínas del suero obtenido primero se hizo la

precipitación por el método de salting in, luego una separación de las

proteínas de la sal añadida por medio de una diálisis el cual es un proceso

molecular que depende exclusivamente de los movimientos aleatorios de

las moléculas individuales

Se llevó a cabo una electroforesis de proteínas en un gel de poliacrilamida

en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE).

La cantidad de muestra que se agrega a los pozos debe ser de acuerdo a la

cantidad de proteínas que tenemos de muestra, en este caso se cargaron

10чL los cuales al correr el gel podemos decir que fue demasiado y con 5чL

hubiera bastado. Aunque es recomendable hacer una previa cuantificación

de proteína.

La transferencia del gel a la membrana de nitrocelulosa fue por peso, la

banda del marcador fue visible desde un principio lo que nos decía que si

hubo transferencia. Al revelar con el sustrato/cromógeno no se identificaron

http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Disulfide-bond-cleavage-by-2-mercaptoethanol-2D-skeletal.svg









bandas (pudieron haber sido los reactivos), pero al teñir con rojo de

ponceau si obtuvimos bandas individuales correspondientes a IgG

5 BIBLIOGRAFÍA Y REFERENCIAS

Kindt, J. Thomas, Goldsby, A. Richard, Inmunología de Kuby, 6ta. Edición, Editorial McGraw

Hill, México 2007, páginas 551.

Berg Jeremy Mark, BIOQUIMICA, Edit. Reverte, Primera Edición, España 2008, Págs.

consultadas: 68 -78.

Tobin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide

gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA

1979;76(9):4350-4354.

http://www.icp.ucr.ac.cr/nuevo/pdf/electroforesis.pdf http://www.westernblotting.org/

6. ANEXO (DISCUSIÓN DEL ARTÍCULO)

Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:

Procedure and some applications

La técnica de electroforesis produce réplicas de las proteínas separadas en geles de

poliacrilamida con una alta fidelidad.

En términos generales, las membranas de nitrocelulosa se han utiliza para retener

las proteínas de la solución diluida para su posterior determinación cuantitativa.

Se demostró que las proteínas inmovilizadas en membranas de nitrocelulosa

se pueden utilizar para detectar lo respectivos anticuerpos.

Con anticuerpos marcados radiactivamente o conjugado con peroxidasa-

el método es suficientemente sensible para detectar pequeñas cantidades de

antígeno separados por electroforesis, y este simple procedimiento también se

puede utilizar para mostrar el resultado de la presencia de pequeñas cantidades de

de anticuerpos en un suero de título bajo.

Debido a que el antígeno se inmoviliza en una membrana, el anticuerpo no es

necesario para formar un precipitado con el antígeno. La técnica por lo tanto tiene

el potencial para el análisis de las proteínas inmunoelectroforético mediante el uso

de unión de fragmentos Fab o unión de los anticuerpos contra un factor

determinante, como los anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas.

Esto no se podía hacer por las técnicas inmunoelectroforéticas.

http://www.icp.ucr.ac.cr/nuevo/pdf/electroforesis.pdf

http://www.westernblotting.org/




El procedimiento descrito también tiene potencial como una herramienta para

detección sueros patológicos que contienen autoanticuerpos

La identificación precisa de los componentes inmunogénicos puede ser una

herramienta de diagnóstico útil para diversas condiciones patológicas.

Otra ventaja de la inmovilización de proteínas de nitrocelulosa es la facilidad de

procesamiento para la autorradiografía.

Técnicas convencionales, decoloración y secado de geles de poliacrilamida

toma muchas horas, y las condiciones exactas de secado son extremadamente

crítica. Cuando las proteínas son transferidos a un soporte de nitrocelulosa, la

electroforesis toma una hora, las manchas y decoloración menos de 10 minutos, y

el secado de un adicional de 5 min. Así pues, esto es a la vez más rápido y más

simple que los procedimientos convencionales, y lo elimina el procedimiento

tedioso y peligroso de remojar los geles en diphenyloxazol.

La técnica ha sido desarrollada para detectar anticuerpos específicos contra las

proteínas ribosomales. Sin embargo, es aplicable a cualquier procedimiento

analítico en función de la formación de ligando proteínas-complejos.

Interacciones que posiblemente se puede analizar de esta forma incluyen a

hormonas

receptor, el receptor de AMP cíclico, proteína e interacciones de ácido nucleico.

El ligando también puede ser una proteína. Las enzimas separadas en geles de

poliacrilamida también podría ser convenientemente localizadas en transferencias

mediante ensayos in situ.

Un requisito indispensable para estas aplicaciones es que la proteína no es dañada

por la adsorción proceso y que los sitios de unión siendo accesibles al ligandos y

sustratos.




Chiron RIBA HCV 3.0 SIA

Prueba para Hepatitis C

1. Introducción

El HCV es un virus de RNA de simple cadena positiva, de unos 9,500 nucleótidos,

que nunca pasa en su ciclo celular por fase de DNA. Se le considera el único

representando del género Hepacivirus, perteneciente a la familia de los Flaviviridae.

Es un virus con envoltura glucolipídica. Su genoma contiene una única pauta de

lectura abierta (ORF) que codifica para una poliproteína precursora flaqueada pro

dos regiones no codificantes en ambos extremos 5’ y 3’.

CARACTERISTICAS DEL GENOMA

El genoma del VHC está compuesto por una única cadena lineal de ARN de polaridad

positiva, no segmentado. Consiste en:

una región 5' UT o NCR (región no codificadora) de aproximadamente 340

nucleótidos

una región codificadora de proteína, de 9400 nucleótidos, que codifica

presumiblemente un precursor polipeptídico de aproximadamente 3000

aminoácidos

una pequeña región 3'UT (región no codificadora) de aproximadamente 50

nucleótidos.

Este genoma de ARN tiene una alta tasa de sustitución de bases (2x10-3) por año. Esto

resulta en una gran diversidad genética entre las diferentes cepas y dentro de la misma

cepa, a lo largo del tiempo, pudiendo agrupar a los VHC en tipos. Hasta el momento han

sido identificados cerca de 10 variantes, diagnosticadas con test inmunoenzimáticos y por

técnicas de biología molecular (reacción en cadena de la polimerasa -PCR).

CARACTERISTICAS DE LAS PROTEINAS VIRALES

Las poliproteínas codificadas de aproximadamente 3000 aminoácidos son en 7 proteínas:

Una proteína de la nucleocápside de 190 aminoácidos;

Dos proteínas de la envoltura de 190 y 370 aminoácidos, respectivamente.

Las 4 proteínas restantes son proteínas no estructurales:

Una proteína llamada NS2 de 250 aminoácidos con función de unión a membrana

La proteína NS3 de 500aa con funciones de proteasa-helicasa

La proteína NS4 de 460aa con función de unión a membrana

La proteína NS5 de 1050aa con probable función de polimerasa

Se han identificado regiones hipervariables en todos los genes que codifican proteínas

virales, pero los más variables son los que codifican para las proteínas de la envoltura.




Figura 7. Debido a la estructura viral, el virus es genéticamente inestable y muta

muy rápido. Esto quiere decir que se vuelve resistente a los agentes antivirales lo

cual hace su tratamiento más difícil.

Figura 8. Ciclo de replicación del virus dentro de la célula




Para el diagnóstico del virus se realizan dos tipos de pruebas se utilizan en el diagnóstico y

tratamiento de la infección por VHC: las pruebas serológicas que detectan

anticuerpo específico contra los virus de la hepatitis C (anti-VHC) y

pruebas moleculares para la detección de ácido nucleico viral.

Pruebas moleculares

Algunas de las técnicas moleculares más usadas se presentan en la siguiente tabla:

Pruebas serológicas:

Las pruebas que detectan anti-HCV se utilizan para detección y diagnóstico del virus. Se

puede detectar en el suero o plasma usando inmunoensayos. Para el diagnóstico de

Hepatitis C en un principio se evidenciaban la presencia de anticuerpos para tres antígenos

virales: C-100 (proteína codificada por región no estructural 3 y 4), C-22 (proteína

estructural del Core) y 33C (proteína no estructural de la región NS3). Hoy en día ya se

utilizan otros antígenos recombinantes y algunas de las siguientes pruebas:




Abbott HCV EIA 2.0:

Es un inmunoensayo que antígenos recombinantes (HC-34(E.Coli), HC-31 (E. Coli NS3

proteína no estructural y NS4) y c100-3 (levadura NS3/NS4 con SOD) que se adhieren a

los anticuerpos que se encuentran en las muestras infectadas.

ORTHO_HCV Version 3.0 ELISA

Se utilizan micropocillos que contienen antígenos recombinados del virus de la hepatitis.

La tecnología de Elisa utiliza el principio que los antígenos o anticuerpos que produce el

virus se pueden detectar por el antígeno o anticuerpo complementario que está ligado a

una enzima capaz de reaccionar con un substrato cromógeno. Los antígenos

recombinantes q se utilizan en esta prueba son c22-3, c200 y la NS5.

VITROS_ Anti-HCV assay

Es un inmunoensayo de diagnóstico in vitro para la detección cualitativa de anticuerpos de

inmunoglobulina G al virus de la hepatitis C (anti-VHC) en suero y plasma.

La especificidad de estos inmunoensayos es del 99%. Falsos positivos se dan generalmente

cuando las pruebas se hacen en poblaciones donde el virus se encuentra en menor




cantidad. Falsos negativos pueden ocurrir cuando hay enfermedades contra el sistema

inmune como el VIH, trasplante de órganos o en pacientes con hemodiálisis.

Para la confirmación de estos resultados con inmunoensayos se puede utilizar la “The

recombinant immunoblot assay, Chiron RIBA HCV 3.0 SIA” (utilizado en clase).

CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA

Ensayo en tira inmunoabsorbente (SIA) para la detección de anticuerpos frente al virus de

la hepatitis C (anti-HCV) en suero o plasma humano.

La detección de anti-HCV mediante la metodología del SIA se basa en las técnicas de

absorción Western y de puntos, en las que inmunógenos específicos (es decir,

poliproteínas antigénicas) codificados por el genoma del HCV son inmovilizados sobre una

membrana como soporte. La visualización de la reactividad de los anti-HCV de las

muestras con las proteínas individuales codificadas por el HCV se logra utilizando un

conjugado enzimático de anti-IgG humana de cabra, marcada con peróxidasa.

Los dos antígenos recombinantes (c33c y NS5) y dos de los péptidos sintéticos (c100p y 5-

1-1p) proceden de regiones putativas no estructurales del virus, mientras que el tercer

péptido (c22p) corresponde a la proteína putativa de la nucleocápside (núcleo) viral. Dado

que los antígenos recombinantes c33c y NS5 del HCV se producen como proteínas

individuales de fusión con superóxido dismutasa humana (SODh), también se ha incluido

SODh recombinante como banda de control en la tira. La banda de control SODh permite

la detección de anticuerpos frente a SODh que no son específicos para las porciones

codificadas de los antígenos recombinantes del HCV. El antígeno c33c del HCV se produce

en bacterias (E. Coli) genéticamente manipuladas, mientras que el antígeno NS5 y el SODh

del HCV se producen en levadura (S. Cerevisae) manipulada genéticamente. Esta

combinación de antígenos tiene mayor especificidad y sensibilidad de reconocimiento.

A)




Las bandas en las tiras están ordenadas de la siguiente manera:

Banda 2 contiene dos péptidos sintéticos 5-1-1(p) and c100 (p), para la región del NS4 del

genoma del virus.

Banda 3 contiene el antígeno recombinante c33-c de la región NS3 del virus.

Banda 4 contiene c22 (p) de la región del core del HCV.

Banda 5 contiene la región NS5 región del genoma del virus.

Figura 9. DEL KIT A) Genoma del HCV y proteínas recombinantes, B) Las regiones donde se ubican los

antígenos recombinantes y péptidos sintéticos a lo largo del genoma del virus.

B)

Figura 10. Tira que se utiliza para la prueba y el antígeno o péptido inmovilizado en cada banda




La prueba se basa en tres etapas en donde se utilizan los antígenos recombinantes y los

péptidos sintéticos inmovilizados como bandas individuales como se muestra en la figura

anterior.

2. OBJETIVOS

Objetivo general:

Aplicar el kit para la prueba del virus de la hepatitis C a las muestras traídas a clase

y ver si son positivas o negativas.

Objetivos específicos:

Conocer en que consiste el ensayo en tira inmunoabsorbente.

Identificar los antígenos recombinantes y péptidos sintéticos que usa la prueba

para el reconocimiento del virus.

Aplicar la metodología a las muestras y comprobar si son positivas o negativas.

3. DESARROLLO EXPERIMENTAL

Antes de comenzar la metodología preparar:

1. Componentes a temperatura ambiente (15 a 30 °C)

2. Mezclar reactivos suavemente (evitar formación de espuma)

3. Preparar solución tampón

Primera etapa:

• Incubación de las tiras con las muestras y controles: Los anticuerpo específicos se fiajran en las bandas correpondientes de antígeno y/o peptidos sinteticos de la tira

Segunda etapa

• Incubación con el conjugado: El conjugado se fija a la banda de IgG humana del complejo Ag-Ac.

Tercera etapa

• Detección enzimática por agua oxigeanda y 4-cloro 1-naftol: reacción enzimática con un produco de color azul-negro en cada banda donde fijación especifica a cada uno de los antigenos recombinanates y/o péptidos recombinantes.




Colocar una tira en cada tubo ( un tubo por muestra y por

cada control)

Identificar las muestras y controles con el numero

correspondiente a cada tira.

Añadir 1mL de diluyente a cada tubo (la tira debe estar

cubierta)

Añadir 240чL de la muestra o del control

Tapar e invertir para mezclar Colocar los tubos en un

oscilador (16 a 20 ciclos por minuto) de 4 a 4:30h

Decantar todo el liquido Añadir 1mL de diluyente a

cada tubo y volver a colocar en el oscilador de 30 a 35 min.

Decantar todo el liquido

Añadir 1mL de solucion de tampon de lavado en cada

tubo, luego verter el liquido y las tiras en los reipientes de lavado con 10mL de solución

tampón

Agragar 30mL adicionales de solución tampon. Con un

volumen total de 60mL. Luego decantar el liquido. Repetir

esto dos a tres veces.

Añadir 1mL de conjugado por cada tira al recipiente. Incubar

en agitador de 9 a 11min. (preparar sustrato)

Una vez termianda la incubación decantar el

conjugado, lavar las tiras con 30mL de soluciión tampón,

decantar y repetir dos veces.

Añadir 1mL de sustrato por tira en el recipiente. Incubar

de 15 a 20 min. Luego lavar las tiras con 60mL de H2= MQ,

repetir uan vez mas.

Transferir las tiras a papel absorebente y retirar exceso

de agua, dejar secar en la obscuridad 30min,

temperatura ambiente, interprtar tiras.




4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Según los controles que manejamos y las muestras, estas concuerdan con los controles

positivos, por lo que las muestras indican positivo para el virus de hepatitis ya que hubo

reacción en cada una de las bandas lo cual nos indica que hubo unión Ag-Ac del virus con

cada antígeno y péptido específico para el virus.

Este tipo de ensayo se pude utilizar como prueba confirmatoria de otros ensayos (ELISA) y

también poder diferenciar entre positivos y falsos positivos. La combinación de antígenos

recombinantes y péptidos inmovilizados en cada tira los cuales son específicos para cierta

región en el genoma del virus la hacen una prueba de alta especificidad y sensibilidad al

diagnóstico del virus.

Otra ventaja que presenta esta prueba es que es posible volverla automatizada, así se evita

la el análisis subjetivo, esto se puede observar en el artículo presentado por el JOURNAL

OF CLINICAL MICROBIOLOGY, de Feb. 1998, p. 387–390 Vol. 36, No. 2 titulado: Automated

RIBA Hepatitis C Virus (HCV) Strip Immunoblot Assay for Reproducible HCV Diagnosis

Donde se utiliza un procesador que mide la intensidad de las bandas de control, antígeno

y péptidos, lo que hace el sistema es iluminar cada banda y medir la luz reflejada de

manera diferencial con el fondo blanco. Un algoritmo interpola valores relativos de

intensidad para cada banda las cuales tienen asignadas valores de referencia. Con esto si

en alguna tira tenemos duda ya que las bandas puede que se vean muy tenues con esto

podemos comprobar si el paciente es positivo o no (como en la tabla presentada abajo).




5. CONCLUSIONES

El ensayo en tira inmunoabsorbente consiste en que en las tiras se encuentran

inmovilizados antígenos recombinantes y péptidos sintéticos, los cuales

representan cada banda, estos en presencia del virus darán una reacción Ag-AC.

Seguido de esto se agrega el conjugado de IgG con peróxidasa para llevar a cabo

una reacción enzimática de color azul-negro en donde haya habido unión.

Los antígenos recombinantes y péptidos sintéticos son: c100, c33-c, c22 (p), región

NS5 del genoma del virus.

Las muestras alas que se les aplico el procedimiento dieron iguales a las tiras de los

controles positivos lo que quiere decir que las muestras dan positivo al virus de

hepatitis C.

6. REFERENCIAS

P. MARTIN,1* F. FABRIZI,1 V. DIXIT,1 S. QUAN,2 M. BREZINA,1 E. KAUFMAN2, K.

SRA,2 R. DINELLO,2 A. POLITO,2 AND G. GITNICK1 Automated RIBA Hepatitis C

Virus (HCV) Strip Immunoblot Assay for Reproducible HCV Diagnosis, JOURNAL OF

CLINICAL MICROBIOLOGY, 0095-1137/98/$04.0010, Feb. 1998, p. 387–390

Theodore Sy, M. Mazen Jamal, Epidemiology of Hepatitis C Virus (HCV) Infection,

International Journal of Medical Sciences, ISSN 1449-1907 www.medsci.org 2006

3(2):41-46, 2006

Marc G. Ghany,1 Doris B. Strader,2 David L. Thomas,3 and Leonard B. Seeff4,

Diagnosis, Management, and Treatment of Hepatitis C: An Update, AASLD PRACTICE

GUIDELINES, HEPATOLOGY, April 2009

Figura 11. Tabal de comparación entre la prueba manual y en la que se aplica el procesador.

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