vol. 15(27). producción de insulina a partir de organismos bacterianos (2008)

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Produccion de insulina a partir de organismos bacterianos:

Revision bibliognifica para la tecnica molecular

Viridiana Rosabelhi Soto

Javier Hernandez GuzYazmin Morales Herna

Onesimo Dios de la

Divisi6nAcademica de Ciencias Bio16Universidad JuarezAut6noma deTa

Km 0.5 carreteraVillahermosa-Cardenas entronque Bosques de Svrspbjr@hotmail.

Resumen

La diabetes millitus es una de las enfermedades con

mayor impacto en la sociedad. Esta problematica

provoca que las personas presenten la glucosa elevada

en la sangre (hiperglucemia) y otras alteraciones que

cambian el metabolismo. Las enzimas de restriccion se

utilizan para cortar de manera abierta un plasmido, por

10 que la misma enzima se utiliza para cortar el gen

deseado fuera del cromosoma; esta reaccion hace dos

cortes que emparej an y cuando se combina el gen y el

plasmido forman un enlace temporal. Otra enzima

denominada ADN ligasa se utiliza para crear un sella

permanente. De esta manera se induce a las bacteriasque tomen los plasmidos mientras que estas mismas se

desarrollan y se multiplican en el medio, generando la

insulina demanera natural a partir de bacterias.

Introducclon

La diabetes mellitus es una de las enfermedades con

mayor impacto sociosanitario, no solo por su elevada

frecuencia, sino por las consecuencias de las

complicaciones cronic as que comporta esta

enfermedad. Esta se caracteriza por tener una

insuficiente produccion de insulina por celulas

denominadas beta del pancreas, esta problematica

provoca que las personas presenten una elevacion de la

glucosa en la sangre, la cual es llamada hiperglucemia y

otras alteraciones que cambian el metabolismo

(Santisteban-Segundo, 1999; Bosch et al., 2002).

En el caso de los individuos geneticamente

predispuestos, la obesidad y el sedentarismo conducen

a la resistencia a la insulina, estado que precede

diabetes y ademas, se suele acompafiar de otros fac

de riesgos cardiovasculares como la dislipidemia

hipertension y factores protromboticos y

alteraciones como la debilidad, suefio, delga

obesidad, infarto, ceguera 0 insuficiencia renal (B

et al., 2002; Hryciw et al., 2004).

En 1978, se logro la clonacion en dond

produjeron una gran cantidad de copias identica

bacterias capaces de producir la insulina, para que

utilizada por las personas con la enfermedad d

diabetes, sin embargo, no fue hasta 1982 que se

comercializar la insulina producida por las bacthacia la disposicion de los enfermos (Caputo e

2005; Bericevik et al., 2002).

Debido a que la Biotecnologia, con la ayuda

Ingenieria genetica ha logrado extraer la insulina

son capaces de producir las bacterias y otras esp

complejas como los porcinos y los vacunos mucha

las personas hoy dia tiene la capacidad de presentar

vida con mayor normalidad (Muniappan y Oz

2007; Erb, 1980).

Por toda la importancia que tiene esta enferm

ante la poblacion actual y por el avance d

manipulacion genetica a nivel molecular

microorganismos bacterianos, se pretende logr

insercion de un ADN recombinante a otro organi

para lograr que produzca una nueva proteina, para

esta sea fabric ada naturalmente por las personas.



P ro d uc cio n d e in su lin a a p artir d e o rg an is mo s b ac te ria no s: R ev is io n b ib lio gra fic a p ara la te cn ic « m ole cu la r.

Metodologia

Tecnica general

Se utilizan enzimas especiales para insertar genes

humanos en el ADN de las bacterias. Los geneshumanos hacen que las bacterias e1aboren un nuevo

material, que no eran capaces de producir con

anterioridad. En condiciones adecuadas, los

microbios se multiplican rapidamente, de modo que

se puede generar una gran cantidad de la nueva

sustancia en un corto periodo de tiempo. De esta

manera, los genes que controlan la producci6n de

insulina humana, se pueden colocar en una celula

bacteriana, con el fin de que los microbios e1aboren la

insulina humana. Despues, esta sustancia es extraida

del cultivo de bacterias y preparada para su uso porparte de los enfermos que la precis en (Finochieto et

al.,2008)

Metoda recombinante para la produccion deinsulina

Primeramente, se clonan los genes con la f J -

galactosidasa en el plasmido pBR322 (Figura 1). La

recombinaci6n de los plasmidos son amplificados en

E. coli. Se lleva a cabo una transformaci6n de la

bacteria, en dos nuc1e6tidos diferentes, luego la

reacci6n entre la proteina fJ-gal y el gen de la insulinacon la metionina hace que el complejo protei co

cambie, expulsando de esta manera la molecula de la

metionina y produciendo al final la insulina con

menos aminoacidos que al inicio del proceso por el

metoda de la recombinaci6n (Ladisch y Kohlmann,

1992).

El mecanismo de la separaci6n de la insulina es a

traves del sistema RP-HPLC (Reversed-Phase High

Performance Liquid Chromatography) por sus siglas en

ingles, la cual es utilizada para separar la insulina deotras especies, basada en una gran variedad de

diferentes aminoacidos y gracias ala hidrofobicidad de

la insulina relacionada con otros componentes. La

tendencia de las proteinas debe ser generalmente con

las proteinas mas grandes que se encuentren en una fase

estacionaria, en la cual tienen una gran limitaci6n del

soporte de alcalinidad.

. .

"TO. TGAI

53 NUCLEO'IIDES

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Figura 1. Producci6n de la insulina a traves de la bac

Escherichia coli.

Resultados

Para lograr el correcto funcionamiento se nec

llevar a cabo ciertos pasos: primero, el gen del in

debe ser identificado, por ejemplo, el gen de la insu

tendria que ser aislado de las celulas bacterianas.

plasmido es una secuencia circular, double-strande

ADN, que las replica en bacterias y que son parte

cromosoma bacteriano. El gen se inserta en elplasm

en donde es tomada por una bacteria. Las bacteria

30




reproducen y comienzan a generar 1aproteina deseada

(Shehata, 2008).

T RA NS FE RE NC IA Y C LO N AC li6 N D EL G E N iD E L A IN SU LIN A

,Como se transfiere el gen de la insulina? ~

• L D S .P . Jasrn.loos.so.n cfrculos p.eq.ueRo.sde .l l D . N q.ue@sa encuentran caulas bactannas, separado del

cromosom a bacteri anD

Intervenclcn de Is enzlrna de restr lcclon y la ADN' rt dinsercl6ndel ADNc . - . ! ! L . c rrserra c

,/ ,• EI plasmido que contleneel gen humane esta . ''V' '

ahora listo para sar msndo an un organlsmo vivo ~

. .(;~y, Plasmidc~ recomblnante

. ll D N p la sr ni do

CLONACION DEL GEN DELAINSUUNA HUMANA,

• EI p lasmtdo entra enla celula bacterlana y se

reproduce. OJandcla celula bactertena se divide,

el p lasrn ldo sa comparte fuera entre las dos celulas

~s y el plasmldo continua reproeuclendcse

• De esta manera un don de celulas ldanticas sa

form a y 51el gen hum ana se Incorporo, codlfi ca

para Is lnsul lna de la hormone, entonces tal clan

puede proporcionar una fuente segura de insul ina

Figura 2. Ilustraci6n que demuestra como la insulina

humana se puede producirpor las bacterias, usando elADN

recombinante (Fuente: Thinkquest, 2008 modificado).

Figura 3. Micrografia electr6nica de una celula de E. coli

donde se realiza la ruptura del ADN. Una porci6n de la

molecula deADN se enlaza a partir de 4.6 millones de pares

de bases, codificando aproximadamente 4100 genes. Los

circulos pequefios son los plasmidos.

(Fuente: Thinkquest, 2008 modificado).

Pldsmidos bacterianos (Kimball, 2004)

Las enzimas de restricci6n fueron descubiertas

1968, las cua1es son parte importantes durant

proceso de producci6n de insu1ina. En 1anatura1ez

enzimas de restricci6n cortan en una secuencianuc1e6tidos, Hamada "vista de restricci6n", 1a cu

presenta con 4-8 nuc1e6tidos largos. La secuencia

cadena de ADN que se presenta en las bacteria

comp1ementa con un grupo metilico (-CH3) en d

1a adenina y 1a citosina evita que 1a enzima

restricci6n actue de manera adecuada. E1ADN qu

algun momenta es extemo, tal como un fago (un vi

una bacteria) es dividido en secciones a traves

enzima de restricci6n. Aunque no todas las bact

cuentan con las enzimas de restricci6n hay e

actua1idad un gran numero de estas enzimas que sdescubierto y que son igua1de efectivas (Arakaki e

2008).

Las enzimas de restricci6n se uti1izan para cort

plasmido abierto, 1amisma enzima se uti1iza para c

e1 gen deseado fuera del cromosoma. Esto hace

cortes que emparej an y cuando se combina e1gen

plasmido forman un enlace temporal, posteriorm

este es sellado con e1ADN 1igasa(Moks et al., 1987

MOLECULAA

' $ ' ~, G -B -A- T -'C -!C ~ J '

MOLECULAB

'~J;'-I IHHII~f -C-C-3 'i ri ,i ,i Ii ,iI ,Ij ,I ,I ;I ,I

J- C-C-T-A-G-IG-5' 3- C-C-'f-a:-IHi ,-5"

As im il ac io n de cada una can Ia

en do nu d es a d e res tri c d o n, B aF in d el

~?~C-C~T-IH; :

IG -i- T- C-C ~.- acJ lam ien to

.~::

.~ G ~G -8- if-C -C ~S ella c on la AD N (~ i~l igasa

i i i i I '. . . . '. .-C"-Tl~!!-~ . G - 1 1 - 8 - T - C - C ~

j ' •••• ' •

! I • I •• ADN R ECOMB IN ANT E. ... .. .. . € -C -T -A - 1l -6 -

Figura 4. El funcionamiento de una enzima derestricci6

sitio de restricci6n es GGATCC (Kimball,

modificado ).




= l a sm t d o

~.y - y - Y ' P '

I n c om p at i b i I i d a d

+I n c om p at i b i I i d ad

+

Figura 5. Interacci6n de la enzima de restricci6n con elADN

en un plasmido. El sitio de restricci6n es GAATTC (Fuente:

Thinkquest, 2008 modificado).

En la actualidad, los cientificos producen un ADN

recombinante a gran escala, en donde millones de

plasmidos se mezc1an con millones de genes, millones

de enzimas de restricci6n realizan una gran cantidad de

c0rt:es, los plasmidos atan a los genes multiples,

haciendo de esta tecnica muy compleja (Muniappan y

Ozcan, 2007).

Los plasmidos que comienzan el procedimiento se

llaman vectores reproductivos que es una molecula que

puede llevar el ADN extemo a una celula y replegarlaen esta misma. Este plasmido tambien inc1uye un gen

que le confiere resistencia a la ampicilina y un segundo

gen denominado lacZ. El sito de restricci6n en donde la

enzima de restricci6n realiza un corte se localiza en el

gen lacZ, si el ADN extemo se inserta en el gen lacZ

donde la enzima de restricci6n realiz6 su corte, el gen

lacZ da como terminado su funci6n. Las enzimas de

restricci6n se mezc1an con los plasmidos y se agregan

los genes deseados, es decir, aquellos genes que se

desean combinar con los plasmidos. En dond

inducen a las bacterias que interactuen con

plasmidos, al interactuar, las bacterias cambian

color. Despues de la interacci6n de las bacterias co

plasmidos, estos se multiplican en un medio

ampicilina (Ladisch y Colhmann, 1992).

Si un grupo de bacterias toma un plasmido

tiene el gen intacto de lacZ, significa que ese plasm

no es recombinante, en donde tomara un color azu

Mientras que las bacterias que no tomaron ni

plasmido no tendran la capacidad crecer dentro

ampicilina, por 10que solamente aquellas bacterias

~omaron el plasmido creceran y aquellas que te

msertado el gen de lacZ tendran una aparie

blanquecina (Ladisch y Kohlmann, 1992).

Para realizar los marcadores de forma radiacti

con un marcador fluorescente en el A

desnaturalizado de las bacterias se puede efectuar

variaciones de temperatura 0 con productos quim

Cuando estas son marcadas, la cadena complement

~el ~DN de la bacteria se enlaza con el gen

msulma. De esta manera sabemos cual es la bac

que tiene el gen deseado de la insulina, en donde

misma puede colocarse como medio de cultivo para

se pueda duplicar el gen de la insulina, tambie

conocida como la tecnica de hiperhibridaci6n del a

nuc1eico (Ladisch y Kolhmann, 1980).

Conclusion

La tecnica de recombinaci6n de ADN de los plasm

bacterianos es parte de una de las tecnologias

ingenieria genetica con grandes aplicaciones de in

cientifico y econ6mico. Estas aplicaciones tiene

amplio espectro de beneficios, no solo para lamed

sino tambien para la industria farmaceutica

fabricaci6n en masa de gran cantidad de produ

derivados de la producci6n de proteinas. En gengracias a las actuales tecnicas para la manipulaci6n

ADN es posible producir en gran cantidad insu

geneticamente compatible con el paciente.

practicamente identica a la producida de ma

natural en el organismo humano y por 10

completamente util y aprovechable para aqu

personas que no pueden producir la insu

denominados personas diabeticas. La producci6n

insulina mediante los procesos anteriorme

32




expuestos abre las puertas a una nueva industria de

producci6n en masa que beneficia a millones de

personas enTabasco y de todo elmundo.

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