Resumen

Especímenes de Solea senegalensis enfermos fueron identificados en una piscifactoría del

sur de España, los cuales mostraron diversos síntomas tales como úlceras en la parte

superior del cuerpo y mayor producción de mucus epitelial. En el presente estudio de

llevó a cabo el aislamiento y caracterización del microrganismo responsable. Entre los

factores que se analizaron se encuentran la actividad hemolítica, dado que este factor de

virulencia es empleado de forma habitual en la industria piscícola de diversas regiones

como marcadores de cepas virulentas, y la capacidad para secretar quitinasa por parte del

microorganismo, dado que los crustáceos han sido demostrados con anterioridad como

importantes reservorios de organismos potencialmente patógenos. Además, dado el

creciente problema que supone para el medio ambiente el empleo de antimicrobianos y

agentes quimioterapéuticos, se analizó de la capacidad para producir compuestos

bioactivos por parte de Chlorella sp, ocho especies de macroalgas recolectadas en la

costa de Málaga y de ocho especies bacterianas. Los resultados obtenidos permitieron

confirmar la capacidad del aislado para degradar quitina, mientras que en el caso de la

actividad hemolítica, los resultados fueron negativos para las condiciones experimentales

del presente trabajo. Finalmente fueron obtenidos resultados bastante prometedores en el

caso de los probióticos, en los que cinco de las cepas analizadas dieron lugar a halos de

inhibición.

Summary

Solea senegalensis specimens were identified on a hatchery in southern Spain, which

showed various symptoms such as ulcers on the upper body and an increase in the

production of epithelial mucus. In the present study was carried out the isolation and

characterization of the microorganism responsible. Among the factors that were analyzed are

the hemolytic activity, since this virulence factor is used routinely in the aquaculture industry of

various regions as markers of virulent strains, and the ability to secrete chitinase, since the

crustaceans have been shown previously to be important reservoirs of potentially pathogenic

organisms. Moreover, given the growing problem posed to the environment the use of

antimicrobials and chemotherapeutic agents, we examined the ability to produce bioactive

compounds by Chlorella sp, eight species of seaweed harvested off the coast of Malaga and eight

bacterial species. The obtained results confirmed the ability to degrade chitin by the isolated,

whereas in the case of hemolytic activity, the results were negative for the experimental

conditions of this work. Finally, very promising results were obtained in the case of probiotics, in

which five of the strains resulted in inhibition halos.

Vibrio harveyi, una amenaza para las piscifactorías del sur de la

Península Ibérica: caracterización y estrategias para combatirlo C. Gallardo, D.L. Márquez, J. Almagro, L. Cerón, A. Cruz, F. Codes, D. López, A. Alves, N. Perea, R. Gómez, J. Moreno,

M. Fontiveros, I. Pla.

Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga 29071

INTRODUCCIÓN

El lenguado senegalés, Solea senegalensis, es un pez plano de la familia de los Soleidos,

en el orden de los pleuronectiformes, el cual se distribuye por la costa Oeste africana y la

costa europea del Atlántico y Mediterráneo Occidental. Se trata de una especie de alto

valor comercial que tradicionalmente se ha cultivado de forma extensiva en España y

Portugal (Dinis et al., 1999).

El principal factor que limita en la actualidad el engorde del lenguado es la

incidencia de patologías de origen bacteriano, la mayoría de las cuales son oportunistas y

afectan igualmente a otras especies cultivadas. El control de estas enfermedades

normalmente se ha llevado a cabo mediante tratamientos químicos, lo que ha causado la

aparición de resistencias a los fármacos y diversos problemas ambientales derivados de la

liberación de estas sustancias en el medio acuático. Recientemente se han realizado

estudios sobre vacunación en el lenguado senegalés (Arijo et al., 2005), sin embargo, la

vacunación solo ha sido capaz de proteger a los peces durante un corto periodo de

tiempo. Debido a esto, la actividad acuícola demanda otras alternativas que permitan el

control de enfermedades y que, a la vez, sean respetuosas con el medio ambiente (García

de la Banda et al. 2010). .

Vibrio harveyi es una de las especies más frecuentemente aisladas de Vibrios

marinos, la cual ha sido asociada a enormes pérdidas de larvas juveniles de Peneidos y

muchas enfermedades oportunistas de peces marinos. V. harveyi ha sido también

asociado con epidemias en granjas de Senegalese sole (Zorrilla et al. 2003).A pesar de su

rol como importantes patógenos de organismos marinos, los mecanismos de

patogenicidad de V. harveyi aun no han sido completamente elucidados. Diversas

investigaciones han demostrado que existen diferencias significativas entre diferentes

aislados de V. harveyi en términos de patogenicidad, y han revelado que las proteasas, las

fosfolipasas, las hemolisinas y/o otras exotoxinas pueden tener papeles importantes.

Evidencias experimentales sugieren que las hemolisinas podrían ser uno de los factores

de mayor importancia en el desarrollo de las enfermedades (Iida and Honda 1997;

Shinoda 1999; Zhang and Austin 2005).

Los copépodos, rotíferos y artemias son usados como importantes fuentes

nutricionales para el cultivo de muchos organismos acuáticos y existen antecedentes de la

asociación de estos organismos con Vibrio. Por ejemplo, Vibrio tiene una relación de

simbiosis con organismos quitinosos, como los copépodos y numerosos estudios han

correlacionado la concentración de copépodos con el número de V. parahaemolyticus y

V. cholerae en el agua de mar (Lipp et al. 2003). La asociación de Vibrio con estos

organismos puede tener como consecuencia la transmisión de estas bacterias a larvas que

son alimentadas con ellos; así mismo, la superficie de otros crustáceos tales como

Panaeus podría actuar como reservorio de patógenos oportunistas tales como Vibrio

harveyi. (Leyton et Riquelme 2008).

Un aspecto llamativo es que la mayoría de los vibrios patógenos son

resistentes a antibióticos como oxitetraciclina, norfloxacina y ciprofloxacina debido al

uso frecuente de éstos en los sistemas de cultivo. Por ejemplo, recientemente se ha

demostrado una amplia resistencia de vibrios a los antibióticos comúnmente usados en

cultivos de camarón (Molina et al. 2002).

Lo anterior plantea la urgente necesidad de buscar alternativas al uso de

antibióticos para el control de patógenos. Una posibilidad es el uso de vibrionaceas

nativas no patógenas como potenciales probióticos y/o simbiontes actuando como agentes

de biocontrol en organismos de cultivos y así disminuir el uso de antibióticos y reducir

las descargas de efluentes tóxico al medio ambientes (Jayasree et al. 2006, Riquelme et

al. 2001). La terapia mediante el empleo de probióticos ofrece una alternativa adecuada

para el control de los patógenos, superándose de este modo las consecuencias adversas de

los agentes quimioterapéuticos y antibióticos.

Otra alternativa para la obtención de agentes antimicrobianos naturales puede ser

el empleo de algas, cuya habilidad para producir metabolitos secundarios de potencial

interés ha sido extensamente documentada (Scheuer , 1990). Existen numerosos estudios

sobre compuestos derivados de macroalgas con un amplio rango de actividades, tales

como antibióticos, antivirales, antitumorales y antinflamatorios, y cuyas estructuras

químicas incluyen esteroles, isoprenoides y otras moléculas relacionadas. A pesar de ello,

los estudios sobre producción de biocidas se refieren normalmente a un limitado número

de especies. Por otro lado, diversas especies de microalgas tales como Nannochloropsis

oculata o Chlorella sp. también han mostrado producir sustancias antibacterianas.

OBJETIVOS

El objetivo de este trabajo fue la identificación y caracterización del agente causal de una

enfermedad. Por otro lado también se pretendió evaluar in vitro el potencial

antimicrobiano de distintas cepas de probióticos, macroalgas y microalgas como posibles

alternativas al empleo de antibióticos y quimioterapéuticos. Finalmente, en el presente

estudio también tiene como objetivo analizar la capacidad quitinasa del microrganismo,

lo cual permitiría elaborar estrategias para evitar futuras reapariciones de la enfermedad

como consecuencia de su permanencia en el entorno en asociación con organismos

quitinosos.

MATERIAL Y MÉTODOS

Sistema de cultivo

.

Los peces procedían de un piscifactoría donde también se cultivaban dorada (Spartus

aurata) y langostino (Penaeus sp.). Los especímenes se cultivan en tanques con agua de

mar y con aireación, en condiciones de salinidad y temperatura similares a las

encontradas en el litoral de donde se extrae el agua para el mantenimiento de los peces.

Síntomas de la enfermedad

En algunos de los tanques donde se cultivan los lenguados se observaron altas tasas de

mortalidad (superiores al 75%). Los peces, en un principio perdieron el apetito,

empezaron a nadar erráticamente y finalmente, en menos de 24 horas, aparecieron

muertos en los tanques. Algunos de ellos presentaron úlceras en la parte superior del

cuerpo que afectaban a todo el epitelio, quedando al descubierto el tejido muscular. En la

mayoría de los casos no se observaron síntomas externos, si acaso una mayor producción

de mucus epitelial.

Aislamiento de la bacteria

.

Las muestras fueron tomadas del hígado y del riñón de uno de los individuos muertos

como consecuencia de la enfermedad, para lo cual se empleó un asa de platino y se

sembró en medio solido TSA (Tryptic soy agar) al 2% de NaCl, y en medio líquido TSB

(Tryptic soy broth) 2% de NaCl, incubándose a 22ºC. Las muestras sembradas en medio

sólido se realizaron en duplicado para cada órgano.

Caracterización fenotípica

.

Los fenotipos de los aislados fueron analizados, de forma independiente para cada

órgano, mediante el uso de las siguientes pruebas: tinción gram (las gram positivas

aparecen con coloración azul/púrpura, mientras que las gran negativas rosáceo/rojizo),

citocromo-oxidasa (pone de manifiesto la presencia de la enzima citocromo-oxidasa en el

microorganismo, la cual oxida a la dimetil-parafenilen-diamina (reactivo incoloro), dando

un producto coloreado, de forma que la aparición de color azul oscuro indica la existencia

del enzima citocromooxidasa, siendo en tal caso positivo), motilidad, test O-F (pone de

manifiesto si la utilización de los hidratos de carbono por parte de un microorganismo se

realiza por vía oxidativa o por vía fermentativa, que a pH ácido presenta color amarillo

,considerado positivo para la fermentación de la glucosa, mientras que a pH básico

presenta color azul y a pH neutro verde), crecimiento en agar TCBS (medio selectivo

para el aislamiento de bacterias del género Vibrio; el resultado positivo se asocia con la

presencia de colonias de color amarillo, lo cual indica que la bacteria es capaz de

metabolizar la sacarosa), arginina dihidrolasa, descarboxilación de la lisina y la ornitina

(los aminoácidos al perder el grupo carboxilo convierten en aminas que incrementan el

pH del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira de amarillo a violeta, lo que

indica que el resultado es positivo), prueba Voges-Proskauer (su fundamento es ver si

fermenta la glucosa por la vía butanodioióica; si se observa coloración rosa-rojiza sería

positiva, y si se observa coloración amarilla sería negativa), test ONPG (prueba utilizada

para diferenciar los microorganismos fermentadores lentos de lactosa, de los no

fermentadores, de forma que el resultado positivo se manifiesta por colonias de color

amarillo), test del indol (mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un

cultivo bacteriano, la cual se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante

el enzima triptofanasa; si se observa un anillo de color rojo en la superficie del tubo será

positiva; en caso contrario si no se forma anillo sería negativa), producción de ácido a

partir de manitol (sirve para detectar si los microorganismos son capaces de fermentar el

manitol, liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de

fenol que cambiará a color amarillo), y las actividades enzimáticas extracelulares

caseinasa, gelatinasa, lipasa y lecitinasa (permiten poner de manifiesto tales actividades

enzimáticas; los microorganismos son sembrados con un isopo, y si forman un halo

opaco alrededor de las zonas de siembra, el resultado es positivo). Los tests fueron

llevados a cabo de acuerdo con la metodología descrita por Smibert and Krieg (1981).

Por otro lado, para determinar los requerimientos de sal, las bacterias fueron cultivadas

en medio TSA al 0%, 6% y 8% de sal. Finalmente, las bacterias fueron cultivadas en

medio TSA al 1,5% a 4ºC y 37ºC para determinar la temperatura óptima de crecimiento.

Cabe destacar que todas, excepto las pruebas de la caseinasa, gelatinasa, lipasa,

lecitinasa, el crecimiento en medio TSBS y los cultivos para el estudio de los

requerimientos de sal , son pruebas líquidas, las cuales se sembraron mediante el empleo

del asa de platino esterilizado mediante llama. Por último también hay que apuntar que la

siembra de las placas correspondientes a las pruebas de la caseinasa, gelatinasa, lipasa,

lecitinasa y el crecimiento en medio TSBS se llevó a cabo mediante el empleo de un

hisopo estéril, sembrando en círculo en el centro de la placa, mientras que las placas para

es estudio de los requerimientos de sal se sembraron en estrías empleando el asa de

platino.

Determinación del grado de virulencia

Para llevar a cabo la determinación del grado de virulencia de la cepa de V. harveyi

aislada se procedió a resuspender la bacteria en tampón fosfato salino a una

concentración de 108 UFC/mL. Se inoculó 0,1 mL de la suspensión inicial, por vía

intraperitoneal, a 10 lenguados, 0,1 mL de una dilución 1/10 a otros 10 individuos, y por

último 0,1 mL de una dilución 1/100 de la suspensión bacteriana a otros 10 lenguados.

Pasados 15 días se contabilizaron el número de individuos muertos y se les tomó

muestras de hígado, riñón y úlcera.

Análisis de la capacidad hemolítica de V. harveyi

.

Para estudiar la capacidad hemolítica se recurrió al cultivo en agar sangre, cuya

composición fue cloruro sódico al 1% p/v, agar al 1,5% p/v y sangre de carnero al 5%.

v/v. Así pues, se preparó agar en PBS con 1% de NACL, tras lo cual se esterilizó durante

45 minutos a 121 ºC. Por otro lado se centrifugaron 2,5 mL de sangre de ternero durante

10 min a 2000 g. El precipitado recuperado se añadió en condiciones de esterilidad a la

solución estéril, tras lo cual fue vertida en placas de petri.

Una vez solidificados los medios las bacterias se cultivaron en cada placa empleando

para ello hisopos estériles. Finalmente las placas se dejaron incubar 24 h a 22ºC. En el

caso de que el resultado de la prueba fuera positivo debería aparecer un halo transparente

alrededor de las colonias a consecuencia de la lisis de los hematíes.

Análisis de la capacidad quitinasa .

Para el estudio de la capacidad quitinasa, en primer lugar se procedió a la purificación de

la quitina de acuerdo con la metodología propuesta por Acosta et al. (1993), partiendo de

de exoesqueleto de gambas (Parapenaeus longirostris). Como paso previo al proceso de

purificación, el exoesqueleto fue calentado a ebullición durante 10 minutos para eliminar

los compuestos orgánicos solubles y las proteínas superficiales asociadas. El

procedimiento empleado para la purificación de la quitina implica constó de dos etapas:

la desmineralización y la desproteinización. Para llevar a cabo la desmineralización los exoesqueletos fueron incubados con

HCL 1N a temperatura ambiente y a una proporción solido-solvente de 1:15 (w/v) bajo

continua agitación durante 2 horas. Posteriormente fueron lavados repetidamente con

agua destilada para neutralizar el exceso de ácido, y filtrados. Por otro lado, para llevar a

cabo la desproteinización se incubaron en 15% NaOH a 65ºC durante 3 h y a una

proporción sólido solvente 1:10 (w/v), después de lo cual fueron lavados con agua

destilada. .

La fracción obtenida (quitina purificada) fue pulverizada empleando para ello

nitrógeno líquido, y resuspendida en agua destilada. Finalmente, tras una centrifugación a

3000 g durante 10 min, el sobrenadante fue retirado y el precipitado liofilizado. La

cantidad total de quitina pura fue de 88 mg de quitina pura por gramo de exoesqueleto.

Una vez purificada la quitina se procedió a la preparación de 100 mL del medio de

cultivo base de acuerdo con Furukawa et al. (1978), el cual se modificó con peptonas

(Tabla 2).

Los 0,3 g de quitina obtenidos fueron resuspendidos en 10 mL de medio base,

tomándose otros 10 mL para preparar el control negativo. El medio estaba compuesto de

sulfato amónico 1 g/L, dihidrofosfato potásico 0,2 g/L, monohidrofosfato potásico 1,6

g/L, sulfato magnésico heptahidratado 0,2 g/L, cloruro sódico 0,1 g/L, sulfato de hierro

heptahidratado 0,01 g/L, cloruro cálcico heptahidratado y peptonas 15 g/L. El preparado

que contenía la quitina fue tratado por ultrasonido a 10 m de amplitud, dos ciclos de 30 s

a 50 Hzs y un ciclo de 30 s a 80 Hzs, empleando para ello un sonicador UP200S

Ultrasonic Processor. Tras ello se les añadió el agar a los medios, se esterilizaron durante

15 min a 121 ºC y se vertieron en placa. Finalmente las bacterias fueron cultivadas en

césped sobre la placa empleando para ello un hisopo estéril, y realizando en cada placa un

orificio central, incubándose a 22ºC durante 72h.

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Las muestras de algas fueron recolectadas manualmente en el Faro de Calaburra

(36°30'23.03"N, 4°38'39.78"W) Málaga, España, durante el mes de abril de 2012,

habiéndose identificado ocho especies diferentes: Halopteris filicina, Cystorseira

tomerisufolia, Cladophora dalmática, Ulva rígida, Corallina officinalis, Osmundea

pinnatifida, Jania Rubens y Dictyota dichotoma.

Las algas fueron limpiadas de epifitos y conservadas en oscuridad durante 24 h. a

4ºC. El estudio de la capacidad de las algas recolectadas para inhibir la proliferación se

afrontó a través de dos estrategias: por un lado se analizó la capacidad de Dyctionta

dichotoma para inhibir la proliferación de V. harveyi en condiciones de co-cultivo, por

otro lado, la capacidad de la capacidad antimicrobiana del resto de las especies fue

evaluada in-vitro a través de la elaboración de extractos.

Estudio de co-cultivo: V. harveyi se resuspendió en solución salina a una concentración

aproximada 108 UFC/mL. Para la estimación de la concentración bacteriana se recurrió

al método de nefelometría de McFarland, de forma que tal densidad bacteriana se alcanzó

cuando la tonalidad del cultivo fue similar la tonalidad que se corresponde con un valor

de McFarland de 0,5. Seguidamente se añadió 0.2 mL de solución bacteriana a una

botella transparente con 200 mL de agua marina, al cual se le añadió posteriormente 4 g

de alga fresca. Por otro lado también se empleó otra botella transparente con 200 mL de

agua de mar la cual actuaría como control, añadiendo únicamente los 0,2 mL de solución

bacteriana.

La estimación de las bacterias cultivables se hizo mediante microtitulación en placa,

para lo cual se realizaron, tanto para la muestra control como para la muestra problema,

diluciones seriadas 1:10, desde -1 a -5, Una vez realizadas las diluciones, se dividieron

las placas en cuadrantes, y se colocaron en cada cuadrante 3 gotas de la misma dilución.

Este procedimiento se llevó a cabo por duplicado para cada muestra, dado que se

emplearon dos medios diferentes, TSBS (un medio selectivo para Vibrionaceas) y TSA

salino (un medio no selectivo para estimar las bacterias totales).

Finalmente tanto la muestra problema como la muestra control se dejaron

incubando durante 24-72 horas para realizar el recuento de colonias crecidas.

Estudio de los extractos: el análisis de la capacidad de los extractos de algas de inhibir

la proliferación de V. harveyi in-vitro se llevó a cabo de acuerdo con la metodología

propuesta por Gonzales del Val et al. (2001). Así pues, para la preparación de los

extractos de algas se procedió en primer lugar a su liofilización. Se procedió a la

obtención de extractos tanto hidrofóbicos como hidrofílicos.

Para la obtención de los extractos hidrofóbicos, 0,2 g de cada alga fueron

maceradas en 10 mL de acetona, hasta obtener una mezcla homogénea.

Posteriormente los extractos en acetona obtenidos fueron transferidos a discos de papel,

los cuales se dejaron secar para reducir el efecto tóxico del disolvente sobre las bacterias.

Finalmente los discos impregnados con los extractos se colocaron, dejando suficiente

espacio entre ellos, sobre placas de medio TSA salino en las que se habían sembrado las

bacterias en césped (4 discos por placa). Las placas se incubaron a 22 C durante 24 h,

dándose como resultado positivo la aparición de un halo de inhibición del crecimiento

bacteriano alrededor de los discos.

Para la obtención de los extractos hidrofílicos 0,2 g de cada alga fueron macerados

en 10 mL de solución salina hasta la obtención de una mezcla homogénea. En este caso

se recurrió a la inoculación por pocillos, para lo cual se realizaron cuatro orificios sobre

las placas de medio TSA salino en las que previamente se había sembrado V. harveyi en

césped, y se vertieron los extractos de las algas en los pocillos hasta rellenarlos. En todos

los casos las placas se dejaron incubar durante 24 horas a 22ºC.

Capacidad antimicrobiana de Chlorella

La microalga fue proporcionada por el Departamento de Ecología de la Universidad de

Málaga. Para analizar la capacidad de Chlorella para producir compuesto bioactivos que

pudieran inhibir la proliferación de V. harveyi se recurrió a la técnica de inoculación por

pocillos (Othman et al. 2010). Así, el primer paso fue estimación de la concentración de

Chlorella mediante el uso de una cámara de Neubauer, lo cual requirió que previamente

se diluyera 1:4 en lugol. El resultado de la valoración de la densidad celular del cultivo de

partida fue 5,04 · 107 células/mL.

Una vez estimada la concentración de Chlorella, el siguiente paso fue la preparación

de dos placas de medio TSA, sobre las que se sembró V. harveyi en césped.

Posteriormente a cada placa se le realizaron cuatro pocillos de 7 mm de diámetro

mediante el empleo de la punta de una pipeta Pasteur. Finalmente, se enrasaron los

pocillos de cada una de las placas, una con la solución de Chlorella sin romper y la otra

con la dilución de Chlorella tras ser lisada por ultrasonido a 10 m de amplitud 30 s a 50

hzs (sonicador UP200S Ultrasonic Processor). Ambas placas se incubaron durante 24

horas a 22ºC, dándose por resultado positivo la aparición de un halo de inhibición del

crecimiento de V. harveyi.

Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas

Las cepas potencialmente probióticas que se emplearon para realizar una selección según

su actividad antagonista frente a V. harveyi fueron: DCF 12.2.14/3 , DCF 12.1.14/3, DCF

12.10.14/3, DCF 12.4.14/3, DCF 12.9, P12.14/2, P15.14/3, Vibrio fisheri 14/3. Todas

ellas fueron proporcionadas por el Departamento de Microbiología de la Universidad de

Málaga.

Para llevar a cabo el estudio de la capacidad de los potenciales probióticos para

secretar compuestos bioactivos con actividad antimicrobiana se recurrió a la técnica de

inoculación por pocillos (Mette et al. 2004). Para ello inicialmente se procedió a inocular

en tubos de caldo de los cultivos primarios, dejándolos incubar durante 4 días. Una vez

obtenidos los cultivos se procedió a preparar las placas sobre las cuales se testarían los

probióticos. Para ello, en primer lugar se suspendió en 2 mL de solución salina un cultivo

de V. harveyi obtenido a partir de cultivo puro, hasta alcanzar un valor de 0,5 de turbidez

McFarland. A continuación, empleando un hisopo estéril se sembraron en césped placas

de agar TSAs para seguidamente practicar cuatro agujeros de 7 mm de diámetro en cada

una de ellas mediante el empleo de la boca de una pipeta Pasteur de vidrio. Finalmente en

los agujeros se depositaron las soluciones que contenían a los probióticos, realizando dos

réplicas de cada uno de ellos. Las placas se dejaron incubar durante 24 horas a 22ºC.

RESULTADOS

Caracterización fenotípica

Los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas llevadas a cabo para la

caracterización del microorganismo aparecen detallados en la tabla 3. A partir de ellos

fue posible concluir que tanto las bacterias aisladas del hígado como del riñón

pertenecían a la especie Vibrio harveyi.

Prueba Resultado

Tinción gram Gram negativas

Citocromo oxidasa Positivo Motilidad Positivo Test O/F Positivo Crecimiento en agar TCBS Positivo

Fermentación de la sacarosa Positivo Arginina dihidrolasa Negativo Descarboxilación de lisina Positivo Descarboxilación de ornitina Positivo Vogues-Proskauer Negativo Test ONPG Negativo Test del indol Positivo Test del manitol Positivo

Actividad caseinasa Positivo Actividad gelatinasa Positivo Actividad lipasa Positivo Actividad lecitinasa Positivo Crecimiento a 4 ºC No

crecimiento Crecimiento a 37 ºC Crecimiento Medio al 0% NaCl No

crecimiento

Medio al 6% NaCl Crecimiento Medio al 8% NaCl No

crecimiento

Tabla 3. Resultados de las pruebas bioquímicas

Determinación del grado de virulencia

Los resultados obtenidos tras la contabilización del número de individuos muertos a los

15 días de la inoculación de los individuos indicaron que, en el caso de la dilución

inicial, es decir, de 108

UFC/mL, la tasa de mortalidad fue del 90%, en el caso de los

individuos a los que se les inoculó 0,1 mL de dilución 1/10 la mortalidad fue del 60%,

mientras que a los que se les inoculó 0,1 mL de dilución 1/100 de la suspensión inicial la

tasa de mortalidad fue del 40%. De todos los individuos muertos, solo uno de los

especímenes de la dosis media y dos de la dosis baja presentaron úlceras en la piel.

En todos los casos se aislaron cultivos puros de V. harveyi, excepto en dos úlceras (una

de dosis media y otra de dosis baja), que no se aislaron microorganismo.

Para determinar el grado de virulencia del microorganismo representamos el

logaritmo de células inoculadas frente a la mortalidad (Figura 3). Una vez hallada la

ecuación de la recta fue posible calcular la el número de células correspondiente a una

mortalidad del 50%, obteniéndose un valor de DL50 de 1,4·104 UFC/g de pez.

Análisis de la capacidad hemolítica

Los resultados obtenidos fueron negativos tanto tras la inoculación durante 24 h a 22ºC

como tras la incubación adicional que se realizó a durante otras 24 h a 37ºC.

Figura 3. Representación del logaritmo de células inoculadas

frente al porcentaje de mortalidad.

Análisis de la capacidad quitinasa .

El resultado obtenido del ensayo realizado para contrastar la capacidad de V. harveyi para

degradar quitina fue positivo, apreciándose a las 72 horas de incubación un halo

marcadamente transparente en la placa, principalmente alrededor del orificio realizado

en el centro de la misma, lo cual es una manifestación de la degradación de las partículas

de quitina (Figura 1).

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Estudio de co-cultivo de Dyctionta dichotoma

Los resultados obtenidos en la titulación a tiempo 0 de las bacterias llevada a cabo tras la

incubación durante 24 horas en medio TSA salino mostraron valores muy similares tanto

para la muestra problema como a la muestra control, obteniéndose densidades de 1'68 ·

105 UFC/mL y 2´54 · 10

5 UFC/mL respectivamente. En el caso de las placas en medio

TSBS sobre las que se sembraron las muestras a tiempo 0, no mostraron crecimiento

significativo a las 24 horas, con lo cual se las dejó incubando durante 24 hora más,

después de lo cual si se apreció crecimiento. Los resultados de la titulación fueron 2'98 ·

107 UFC/mL para la muestra problema y 2'53 · 105 UFC/mL para la muestra control.

Para analizar la evolución de la densidad celular de Vibrionaceas cultivables tanto en la

muestra problema como en la muestra control, se volvió a llevar a cabo la titulación en

medio TSBS tras la incubación de los co-cultivos 72 horas (Figura 2).

Los valores obtenidos fueron de 1,75 · 105 UFC/mL en el caso de la muestra

control y 4,33 · 106 UFC/mL para la muestra problema.

Figura 1. Resultados del ensayo de capacidad quitinasa. (A) Placa de medio básico enriquecida con quitina a tiempo 0.

(B) Placa de medio básico enriquecido con quitina a las 72 horas de incubación en la cual es posible distinguir regiones en las

que los gránulos de quitina han sido disueltos principalmente entorno a la región central.

Estudio de los extractos de macroalgas

Los resultados obtenidos correspondientes a la capacidad tanto de la fracción hidrofóbica

como a la fracción hidrofílica par a inhibir la proliferación de Vibrio harveyi fueron

negativos en todos los casos, no apareciendo halos de inhibición para ninguna los

extractos de algas testados.

Capacidad antimicrobiana de Chlorella

En cuanto a los ensayos de inhibición de proliferación de V. harveyi llevados a

cabo mediante la técnica de inoculación por pocillos, no se apreciaron halos de inhibición

ni en el caso de la incubación de las células de Chlorella intactas ni en el caso de los

extractos celulares tras 24 horas.

Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas

Tras 24 horas de incubación, cuatro de las cepas seleccionadas para llevar a cabo el

ensayo de inhibición de la proliferación resultaron positivas en cuanto a su capacidad

para interferir con el crecimiento de V. harveyi, dando lugar a halos de inhibición.

Concretamente las cepas fueron DFC 12.2, DCF 12.4, DCF 12.9 y DCF 12.10 (Figura 2).

Concentración

(Log UFC/mL)

Figura 2. Evolución de la densidad bacteriana a lo largo del tiempo en la muestra problema y la muestra

control.

DISCUSIÓN

La cepa aisladas a partir de los lenguados enfermos en este estudio fue identificada y

caracterizada como Vibrio harveyi, el cual ha sido descrito como el responsable de

enormes pérdidas en Penaeidos, habiendo también sido asociado a mortalidades de

doradas de individuos cultivados en piscifactorías (Austin and Zhang 2006)

De acuerdo con el resultado obtenido del valor de DL50 la cepa aislada en los

organismos de la piscifactoría puede considerarse como muy virulenta. Dado que

prácticamente todas las muestras tomadas de los organismos muertos fue aislado V.

harveyi en cultivo puro (salvo en dos muestras correspondientes a ulceras, en las cuales

no se aisló ningún microorganismo), es posible considerar, de acuerdo con los postulados

de Koch, que V. harveyi es el agente causal de la enfermedad. El hecho de que solo

algunos ejemplares, y solo en dosis bajas, presenten úlceras, puede ser debido a que,

dado que se trata de una cepa muy virulenta, la mayoría de los organismos mueren antes

de que de tiempo a manifestarse dicho síntoma causado por el estado patológico, por lo

que únicamente en organismos a los que se les inocula el microorganismo en dosis bajas,

y en los que la enfermedad se desarrolla a una velocidad menor, aparecen úlceras

superficiales.

La virulencia de la cepa aislada se corresponde con su capacidad de swarming, lo cual se

ajusta a la hipótesis propuesta por Zorrilla et al (2003), de acuerdo con la cual la

capacidad de swarming puede ser un marcador diferencial entre las cepas virulentas y las

no virulentas.

Las hemolisinas son ciertamente la toxina más producidas entre los Vibrios

patógenos, ejerciendo diversos roles en el proceso infectivo (Zhang y Austin 2000). La

hemolisina de V. harveyi (VHH) es un miembro de la ampliamente distribuida familia de

Diámetro (cm)

Figura 2. Media de los diámetros de los halos. Desviaciones estándar

como barras (n=2)

hemolisinas termoestables, y parece ser suficiente para la actividad hemolítica en

algunas, pero no en todas, las cepas de V. harveyi (Rattanama et al., 2012). De

confirmarse, los resultados obtenidos en este trabajo podrían tener una enorme

importancia en la práctica, dado que una de las estrategias empleadas frecuentemente en

la identificación de cepas patógenas de V. harveyi es llevar a cabo PCRs para el gen vhh

(Parvathi et al. 2009), con lo que sería necesario impulsar el desarrollo de estrategias

alternativas, dado que, de acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, la

actividad hemolítica no es un requisito necesario para considerar a una cepa como

altamente patógena. Sin embargo, la expresión de los genes VHH pueden ser

dependientes de la densidad de V. harveyi u otros factores ambientales (Parvathi et al.,

2009), con lo que no es posible confirmar que en la cepa estudiada los genes de la

hemolisina estén ausentes.

Otro factor que podría haber determinado que el resultado obtenido fuese negativo

es la especie de la cual se obtuvieron los eritrocitos, dado que la susceptibilidad a la lisis

varía enormemente entre unas especies y otras, siendo particularmente susceptibles los

eritrocitos de salmón y de conejo (Zhang and Austin, 2000). Por todo ello, a pesar de que

los resultados indican que la cepa de V. harveyi aislada es incapaz de secretar

hemolisinas, estudios adicionales son necesarios para confirmarlo.

Bien es conocida la capacidad de V. harveyi para establecer relaciones simbióticas

con organismos como el calamar (Eupyrmna scoloper) o los camarones (Penaeus

mergulensis) (Leyton y Riquelme 2008). Éstos y otros organismos quitinosos pueden

actuar como reservorio del patógeno, dando como resultado la aparición de episodios de

mortalidad repentina en organismos como el lenguado causados por la actividad de estos

patógenos oportunistas. Por esta razón, la confirmación de la capacidad de la cepa de V.

harveyi aislada puede ser determinante a la hora de prevenir futuras reapariciones de la

enfermedad. La importancia de los organismos con exoesqueleto como potenciales

reservorios de cepas patógenas viene apoyada por la caracterización en V. harveyi de más

de 10 enzimas diferentes con actividad quitinasa (Suginta et al. 2004). Por todo ello, una

de las estrategias que podrían adoptarse en las piscifactorías para prevenir la posible

aparición de nuevos brotes epidémicos es no emplear como fuente nutricional copépodos,

rotíferos o artemias, los cuales son comúnmente utilizados, ya que la asociación de

vibrios patógenos con estos organismos puede tener como consecuencia la transmisión de

estas bacterias a larvas que son alimentadas con ellos. Así mismo, debe evitarse el

contacto directo entre los lenguados y cualquier tipo de organismo quitinoso en las

piscifactorías.

Otro de los objetivos principales de este trabajo fue evaluar y comparar la habilidad

de diversos organismos para producir compuestos bioactivos frente a V. harveyi. En el

caso de las macroalgas, en estudios previos había sido detectada actividad antimicrobiana

de extractos de algunas de las especies testadas en este trabajo, como es el caso de

Halopteris filicina (Kolanjinathan et al. 2009, Taskin et al. 2007), Cystoseira

tomerisufolia (Abourriche et al. 2007), Ulva rigida (Tuney et al. 2006), Corallina

officinalis (Taskin et al. 2007), Osmundea pinnatifida (Rhimou et al. 2010, Afzal Rizvi

2010), Dictyota dichotoma (Christobel et al. 2011) o Jania Rubens (Taskin et al. 2007).

Sin embargo, en ninguno de dichos trabajos se comprobó la actividad de dichos

microorganismos frente a V. harveyi.

De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo, ninguno de las especies

analizadas presenta compuestos con actividad antimicrobiana frente a V. harveyi, dado

que ni la exposición a los extractos de etanol y a los extractos en solución salida dieron

lugar a halos de inhibición. A pesar de ello son necesarios ensayos adicionales para

confirmar la ausencia de compuestos antimicrobianos en los extractos de las macroalgas

analizadas, ya que Choudhry et al. (20005) demostraron que aunque algunas cepas no son

sensibles a los extractos de algas, fracciones purificadas de tales extractos si pueden

mostrar actividad, lo cual puede ser debido a que la actividad antibacteriana se encuentre

enmascarada por la presencia de algunos compuestos inhibidores en los extractos, como

los observados por Sastry y Rao (1994). Así mismo, los métodos de extracción

empleados también pueden determinar el grado de susceptibilidad de V. harveyi, debido a

lo cual en futuras investigaciones sería necesario realizar los extractos con otros

disolventes tales como metanol, cloroformo o diclorometano. Otro factor que podría

determinar el resultado negativo obtenido es el haber mantenido las algas durante 24

horas a 4ºC en una botella de agua de mar, de forma que la situación de estrés ocasionada

podría haber afectado negativamente a la presencia de compuestos con actividad

antimicrobiana. Por esta razón sería necesario repetir el ensayo empleando especímenes

recién recolectados, para de este modo confirmar el resultado.

Además del análisis de la actividad antimicrobiana de los extractos de algas,

también se analizó la capacidad de Dyctiota dichotomade reducir el número de bacterias

al ser incubadas en co-cultivo. De entre todas las especies se eligió D. dichotoma debido

a que anteriormente había sido confirmada la capacidad antimicrobiana de dicha especie

sobre ciertas especies bacterianas por Salvador et al. (2007). De acuerdo con los

resultados, no es posible rechazar la hipótesis de que Dyctiota dichotoma actúe

reduciendo el número de bacterias, puesto que en los co-cultivos se registró un descenso

del 85,47% en el número de vibrios presentes en el medio (pasando de 2,98 · 107 a 4,33 ·

106), frente al descenso del 30% registrado en el control (desde 2,53 · 10

5 a 1,75 · 10

5).

Hasta la fecha han sido identificado hasta 12 compuestos volátiles de diversa naturaleza

en D. dichotoma mediante GC/MS, entre los que se encuentran hidrocarburos (n-

pentadecano), terpenos (beta-cubebeno, beta-ionone, dactilol y pachidictol A) o aldehidos

(miristaldehido, hexadecanal y (z)-13-hoxadecenal) , destacando de entre todos ellos el

pachidictol A, que constituye el 39,54% de los aceites esenciales (Demirel et al. 2009).

Sin embargo, es necesario llevar a cabo ensayos adicionales para confirmar la capacidad

de esta microalga para disminuir la concentración de V. harveyi del medio, ya que los

resultados de la titulación indicaron que junto con las algas se produjo la incorporación al

medio de cultivo de vibrios exógenos , algunos de los cuales podrían corresponder a V.

alginolíticus (cuya susceptibilidad frente a D. dichotoma ya ha sido confirmada por

estudios anteriores) , con lo que los resultados obtenidos corresponderían a un falso

positivo debido al afecto del alga sobre éste último, y no sobre V. harveyi. Así mismo,

sería necesario llevar a cabo un mayor número de réplicas para poder confirmar que los

resultados obtenidos son estadísticamente significativos. Por último, como en el caso de

los extractos, el mantener al macroalga durante 24 horas a 4ºC podría haber afectado a la

producción de antimicrobianos, por lo que sería recomendable repetir los ensayos

empleando especímenes frescos.

Los cultivos de fitoplancton son ampliamente empleados en la industria de la

acuicultura con una gran variedad de propósitos, denominándose "aguas verdes", debido

a los elevados niveles de especies fitoplanctónicas como Chlorella sp. que contienen

(Sharif y Eguchi 2011). En el presente trabajo se evaluó la capacidad de una cepa de

Chlorella sp. para inhibir la proliferación de V. harveyi, para lo cual se emplearon tanto

cultivos del microalga como extractos de la misma.

Los resultados obtenidos en placa indicaron que la cepa empleada, bajo las

condiciones de cultivo utilizadas, no produce sustancias con capacidad antimicrobiana

capaces de inhibir la proliferación e V. harveyi, dado que no se apreciaron halos de

inhibición tras 24 h de incubación. A pesar de ello, no es posible rechazar que Chlorella

sp. pueda ejercer un efecto positivo al ser añadidas a los tanques de acuicultura cuando es

empleado como "aguas verdes", dado que su influencia puede no venir determinada por

la producción de agentes antimicrobianos, sino por la liberación de otros compuestos

tales como dipéptidos cíclicos que actúen mimetizando a los AHC, afectando así a los

comportamientos regulados por quorum sensing de la bacteria, o través de la preferencia

de asimilación y competición por los nutrientes (Teplitski et al. 2004).

El empleo de probióticos ofrece una alternativa adecuada para el control de

patógenos en instalaciones acuícolas, salvando las consecuencias adversas resultantes del

empleo de agentes antibióticos y quimioterapéuticos. La actividad inhibitoria frente a los

patógenos o la competición por los nutrientes es un criterio importante para seleccionar

una cepa probiótica candidata (Balcázar et al. 2006). En el presente estudio 4 de las 8

cepas testadas exhibieron capacidad de síntesis de compuesto bioactivos antagonistas

frente a V. harveyi, dando lugar a halos de inhibición frente a los patógenos al ser testadas

mediante el método de inoculación por pocillos. El efecto antagonista de los probióticos

puede ser atribuido a la producción de compuestos bioactivos, los cuales difunden a

través del agar inhibiendo el crecimiento de V. harveyi. De entre todas las cepas testadas,

DCF 12.10 se postula como la más prometedora, dado que fue la que dio lugar a un

mayor halo de inhibición. Sin embargo, a pesar de los positivos resultados obtenidos, son

necesarios estudios adicionales para contrastar la utilidad in vivo de las cepas productoras

de sustancias bioactivas, dado que en ocasiones los probiontes han demostrado actuar

como patógenos frente al organismo hospedador (Mette et al. 2004). Así mismo es

necesario llevar a cabo estudios de la utilidad de tales microorganismos in-vivo, dado que

la producción de compuestos bioactivos con actividad antagonista frente a Vibrio harveyi

no es suficiente para confirmar su utilidad como probiótico, siendo necesario analizar,

entre otros factores, su capacidad para colonizar el tracto gastrointestinal del hospedador.

Por otro lado, identificar los mecanismos de acción a través de los que las cepas

potencialmente probióticas ejercen su acción también sería de gran utilidad a la hora de

desarrollar estrategias más eficientes de control de la enfermedad, dado que a pesar de

que en la última década han sido publicado un gran número de estudios sobre probióticos,

las limitaciones metodológicas y éticas de los estudios en animales han dificultado su

comprensión. En cuanto a las cepas que no han dado lugar a halos de inhibición, no es

posible desechar su posible utilidad como organismos probióticos, dado que su efecto

beneficioso puede venir dado por otros mecanismos, como son la competición por los

nutrientes o la estimulación del sistema inmunitario. Por último, el que no hayamos

observado inhibición en algunos de las cepas empleadas puede ser debido a que la masa

bacteriana inoculada en los pocillos no era idéntica en todos los casos, de modo que es

posible que la cantidad sembrada no fuera suficiente como para poder generar un halo de

inhibición.

CONCLUSIÓN

A pesar del elevado grado de virulencia mostrado por la cepa de V. harveyi aislada en

este trabajo, los resultados indican que el aislado no presenta actividad hemolítica. En el

caso de la capacidad quitinasa, los resultados obtenidos han permitido confirmar que el

aislado tiene capacidad de degradar este polisacárido.

Por su parte, en los estudios llevados a cabo para la identificación de estrategias

alternativas para la lucha contra el patógeno, es de destacar que el empleo de organismos

probióticos se ha mostrado como la estrategia más eficiente para combatir los brotes de

Vibrio harveyi ya existentes, habiéndose mostrado la cepa DFC 12.10 como la aspirante

más prometedora. La microalga Chlorella a la proliferación del microorganismo, ni en el

caso del co-cultivo del alga viva ni al ser sonicada. Finalmente, los resultados obtenidos a

partir de los ensayos llevados a cabo con los extractos de macroalgas han indicado que

ninguna de las siete especies analizadas produce compuestos bioactivos frente a

V. harveyi, al menos bajo las condiciones empleadas, mientras que el co-cultivo con

Dyctiota dichotoma si se ha revelado como una estrategia potencialmente eficaz.

BIBLIOGRAFÍA

Acosta, N.; Jiménez, C.; Boraut, V. and Heras, A. (1993). Extraction and characterization from

crustaceans of chitin. Biomass and Bioenergy Vol. 5, No. 2, pp. 145-153.

Arijo, S., Rico R.,Chabrillon M., Díaz-Rosales P.,Martínez-Manzanares E., Balebona m.C., Magariños

B.,Toranzo A.E., Moriñigo M.A. Effectiveness of a divalent vaccine for sole, Solea senegalensis

(Kaup), against Vibrio harveyi and Photobacterium damselae subsp piscicida. J. Fish Dis.

(2005)28: 33-38.

Austin, B. and Zhang, X-H (2006). Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates

and invertebrates. Letters in Applied Microbiology ISSN 0266-8254.

Balcázar J.L., de Blas .I, Ruiz-Zarzuela I., Cunningham D., Vendrell D. & Múzquiz J.L. (2006) The role

of probiotics in aquaculture. Vet Microbiol 114, 173–186.

Choudhury,S.; Sree, A.; Mukherjee, S.C.; Pattnaik, P. and Bapuji. (2005). Antibacterial activity of

organic extracts of selected marine algae and mangroves against fish pathogens. Asian

Fisheries Sci., 18: 287-296.

Das, S. and Anand E. (2010).Extraction of Chitin from Trash Crabs (Podophthalmus vigil).Current

Research Journal of Biological Sciences 2(1): 72-75.

Demirel, Z.; Yilmaz-Koz, F.; Karabay-Yavasoglu, U.N.; Ozdemir, G. and Sukatar, T. (2009).

Antimicrobial and antioxidant activity of brown algae from the Aegean Sea. J. Serb. Chem. Soc.

74 (6) 619–628 UDC 582.272+551.468(262.4):615.28–188:JSCS–3860 :665.52/54

Dinis, M. T.; L. Ribeiro; F. Soares y C. Sarasquete. A review on the cultivation potential of Solea

senegalensis in Spain and Portugal. Aquaculture (1995), 176: 27-38.

Eguchi Y., Kubo N., Matsunaga H., Igarashi M., Utsumi R. Development of an Antivirulence Drug

against Streptococcus mutans: Repression of Biofilm Formation, Acid Tolerance, and

Completence by a Histidine Kinase Inhibitor, Walkmycin C. (2011) Antimicrob. Agents

Chemother 55(4): 1475.

García de la Banda I., Lobo C., León-Rubio J.M., Tapia-Paniagua S., Balebona M.C., Moriñigo M.A.,

Moreno-Ventas X., Lucas L.M., Linares F., Arce F., Arijo S. 2010. Influence of two closely related

probiotics on juvenile Senegalese sole (Solea senegalensis, Kaup 1858) performance and

protection against Photobacterium damselae subsp. piscicida.Aquaculture, (2010) 306: 281-288.

González, A.; Platas, G.; Basilio, A.; Cabello, A.; Gorrochategui, J.; Suay, I.; Vicente, F.; Portillo, E.;

Jimémez, M.; Reina, G. and Peláez, F.(2001).Screening of antimicrobial activities in red , green

and brown macroalgae from Gran Canaria (Canary Islands, Spain). Int. Microbiol.4:35-40.

Henke, J. and Bassier, J. (2004). Three parallel quorum-sensing systems regulate gene

expression in Vibrio harveyi. J. bacteriol. 186(20):6902.

Herrán, F.; Alberto, J.; Sotomayor, L.G.; Rosas,L.A.; González J.K. Bacterias degradadoras de quitina

aisladas de suelos salinos en el Municipio de El Fuerte, Sinaloa.

Jayasree L., JanakiramP., Madhav R.Characterization of Vibrio spp. associated with diseased

shrimp from culture Ponds of Andhra Pradesh (India). Journal of the World Aquaculture Society

(2006) 37(4): 523-532.

Kjartansson, G.T.; Zivannpvic, S.; Kistbergsson, K. and Weiss, J.(2006). Sonication-assisted

extraction of chitin from shells of fresh water prawn (Macrobranchium rosenbergii). J.

Agric.Food Chem. 54,3317-3323.

Leyton1, Y.; Riquelme, C. (2008) Vibrios in the marine coastal systems. Revista de Biología Marina

y Oceanografía 43(3): 441-456.Lida T., Honda T. Hemolysins produced by vibrios. J. Toxicol. Toxin

Rev. (1997) 16:215-227.

Lipp. E.K., Rivera I.N.G., Gil A.I., Espeland E.M., Choopun N., Louis V.R. Direct detection of Vibrio

cholerae and ctxA in Peruvian coastal water and plankton by PCR. Applied and Environmental

Microbiology (2003) 69: 3676-3680.

Mette, H., Oivind, B., Ana, R., Janne, N., Jette, M., Sigmund J., Haze, D., Peter, A., et al. (2004) Selection

and identification of autochthonous potential probiotic bacteria from turbot larvae

(Scophthalmus maximus) rearing units. Syst Appl Microbiol 27, 360–371.

Molina-Aja A., Garcia-Gasca A., Abreu-GroboisA., Bolan- MejiaC., Roque A., Gomez-Gil B. Proceedings

of the National and antibiotic resistance of Vibrio strains isolated from cultured penaeid

shrimp. FEMS Microbiology Letters(2002) 213: 627-631. 7-12.

Othman M., Loh H.S., Wiart C., Khoo T.J., Lim K.H. and Ting K.N. (2011). Optimal methods for evaluating antimicrobial activities from plant extracts. Journal of Microbiological Methods. 84(2), 161-166

Rattanama, P.; Thompson, J. ; Kongkerd, N.; Srinitiwarawong, K. ;Vuddhakul, V.; Mekalanos, J. J.

(2012).Sigma E Regulators Control Hemolytic Activity and Virulence in a Shrimp Pathogenic

Vibrio harveyi. PLOS one

Rico, R.M.; Tapia-Paniagua, S.; Martínez-Manzanares, E.; Balebona, M.C. and Moriñigo, M.A.

Characterization of Vibrio harveyi strains recovered from diseased farmed Senegalese sole

(Solea senegalensis). Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072

752 Journal.

Riquelme CE., JorqueraM.A., Rojas A.I, Avendaño R.E., Reyes N. Addition of inhibitor-producing

bacteria tomass cultures of Argopecten purpuratus larvae (Lamarck,1819). Aquaculture

(2001)192: 111-119.

Saeed M.O. Association of Vibrio harveyi with mortalitie in culture marine fish in Kuwait.

Aquaculture 136 (1995) 21-29.

Shinoda S. Protein toxins produced by pathogenic vibrios. J. Nat. Toxins (1999) 8:259-269.

Sharifah E.N., M. Eguchi M. The phytoplankton Nannochloropsis oculata enhances the ability of Roseobacter clade bacteria to inhibit the growth of fish pathogen Vibrio anguillarum. PLoS One, 6 (2011), p. e26756

Sivaram V., Babu M.M., Immanuel G., Marugadass S., Citarasu T., Marian M.P. Growth and inmune

response of juvenile greasy groupers (Epinephelus tauvina) fed with herbal antibacterial

active principle supplemented diets against Vibrio harveyi infections. Aquaculture 237 (2004)

9-20.

Souza C.P., Burbano-Rosero E.M., Almeida B.C., Martins G.G., Albertini L.S., Rivera I.N.G. Culture

medium for isolating chitinolytic bacteria from seawater and plankton. Word J Microbiol

Biotechnol (2009) 25:2079 2082.

Teng, S.; Schaffer J.; C Tu, K.; Mehta P.; Lu W.; Bassler, B. ; and Wingreen, N. (2011). Active regulation

of receptor ratios controls integration of quorum-sensing signals in Vibrio harveyi. Molecular

Systems Biology 7:491.

Teplitski, M. ; Chen, H. ; Rajamani, S. ; Gao, M. ; Merighi, M. ; Sayre, R.T. ; Robinson, J.B. ; Rolfe, B.G. ;

Bauer. W.D.(2004). Chlamydomonas reinhardtii secretes compounds that mimic bacterial

signals and interference with quorum sensing regulation in bacteria .Plant Physiol., 134 (2004),

pp. 137–146.

Tüney I., Çadirci B.H., Ünal D., Sukatar A. Antimicrobial Activities of the Extracts of Marine Algae

from the Coast of Urla (Izmir, Turkey). Turk J Biol, 30(2006) 171-175.

Zhang X-H., Austin B.Haemolysins in Vibrio species. J. Appl. Microbiol. (2005) 98:1011-1019.

Zhang W-H. and Austin B. Pathogenicity of Vibio harveyi salmonids. Journal of Fish Diseases 2000,

23, 93-102.

Zorrilla I., Arijo S., Chabrillón M., Díaz P., Martínez-Manzanares E., Balebona M.C., Moriñigo M.A.

Vibrio species isolated from deseased farm sole, Solea senegalensis (Kaup), and evaluation of

the potencial virulence role of their extracellular products. J.Fish Dis., (2003) 26: 103-108.