Identificacin Vibrio Alginoyiticus Identificacin de bacilos Gram negativos curvos: familia VibrionaceaeIdentificacin de Vibrio alginoyiticusGonzlez, Mara CamilaEstudiante programa Microbiologa Industrial, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, Colombia

ResumenObjetivo: Realizar identificacin de la cepa entregada. Materiales y mtodos: Estudio analtico, a partir de cepa entregada en los laboratorios de la Pontificia Universidad Javeriana. Para la identificacin esta cepa se realiz la prueba de la cuerda, oxidasa, y diferentes pruebas bioqumicas tales como agar citrato Simmons, agar fenilalanina, prueba TSI, LIA, SIM, urea, VP,RM, caldo de nitratos, OF, agar TSA, caldo Moeller con Arginina 1%, caldo Moeller con lisina 1%, caldo Moeller con ornitina 1% y caldo Moeller sin aminocido (control). Caldo nutritivo sin NaCl, caldo nutritivo con NaCl 1%, caldo nutritivo con NaCl 6%. Resultados: Se identific que la cepa era perteneciente a Vibrio Alginoyiticus. Conclusiones: Palabras clave: Gram negativo, bacilos, familia Vibrionaceae, Vibrio alginoyiticus, identificacin. IntroduccinEl nombre Vibrionaceae fue originalmente propuesto por Veron en 1965, con el intento de agrupar un nmero de bacilos Gram-negativos no entricos y fermentadores, oxidasa positivos y mviles por medio de flagelos polares. Este agrupamiento, bsicamente fue dirigido con el fin de diferenciar estos microorganismos de la familia Enterobacteriaceae (1). La familia Vibrionaceae actualmente comprende cinco gneros validados en publicaciones: Moritella, Enterovibrio, Grimontia, Photobacterium y Vibrio. Los miembros de esta familia sintetizan tetrodotoxina, un antiguo alcaloide marino y poderosa neurotoxina que sirve de proteccin a los Tetraodontiformes, entre ellos al venenoso pez fugu. (2)Las especies del gnero Vibrio han tenido y siguen tenido inters. Vibrio cholerae es el agente etiolgico de clera asitico en humanos, una severa enfermedad diarreica que ha afectado al hombre a travs de cientos de aos. Esta bacteria fue descrita por primera vez y nominada por Pacini en 1854. Treinta y dos aos despus Robert Koch aisl el organismo, que l denomin Kommabacillus debido a la caracterstica curvada o apariencia en forma de coma de las clulas bacterianas en forma individual. (3)Materiales y mtodos.La prctica se llev a cabo entre los das 16 y 19 de Septiembre de 2014 en los laboratorios de la Pontificia Universidad Javeriana. La cepa se encontraba en agar TCBS y en agar TSA. Este es un Medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus y otras especies de Vibrio a partir de heces, agua y alimentos contaminados. En este medio, el extracto de levadura, la peptona de carne y la triptena aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. Es este, el medio selectivo ms adecuado para el aislamiento de las especies de Vibrio, e inhibidor para la mayora de las enterobacterias. Esta inhibicin se basa en las altas concentraciones de tiosulfato y citrato, la presencia de bilis y un pH fuertemente alcalino. La degradacin de la sacarosa es variable entre las especies de Vibrio y las colonias son verdes para las cepas que no la utilizan y amarillas para aquellas que producen cido a partir de este azcar. Esto es debido al viraje del color de los indicadores de pH azul de timol y azul de bromotimol, del color azul al amarillo en medio cido. Es importante tener en cuenta, que la proporcin de sacarosa en el medio est equilibrada de forma tal que no inhiba el crecimiento bacteriano por exceso de cido. El cloruro de sodio favorece el crecimiento de microorganismos. El tiosulfato de sodio aporta azufre y junto con el citrato frrico permiten la deteccin de produccin de cido sulfhdrico. Aumentando la concentracin de cloruro de sodio y disminuyendo la temperatura de incubacin, pueden aislarse especies marinas sin importancia sanitaria. (4).El agar TSA Es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto deMicroorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias. Tiene por base una fuente proteica (digeridos trpticos, digeridos proteicos de soja) con una pequea cantidad de hidratos de carbono naturales, cloruro sdico y 5% de sangre. (5)La prueba de la cuerda Se realiza para diferenciar el gnero Vibrio de los dems gneros pertenecientes a la familia Vibrionaceae como Plesiomonas y Aeromonas. La actividad ltica del cido desoxiclico sobre la pared de los Vibrios favorece la liberacin de ADN que al contacto con el cido desoxiclico forma una suspensin adherente o mucoide. (6) En la prueba oxidasa El dehidrocloruro de tetrametil-parafenilendiamina al 1% se emplea para la determinacin de la citocromo oxidasa. Este reactivo acta como aceptor artificial de electrones sustituyendo al oxgeno. En su estado reducido es incoloro pero en la presencia de la citocromo oxidasa del microorganismo y el oxgeno atmosfrico se oxida formando el azul de indofenol (7)Agar Citrato Simmons, el cual es un medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias en base a la capacidad de las mismas de usar citrato como nica fuente de carbono y energa El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxilico. El desdoblamiento del citrato genera progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonaros y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa. (8). Agar Fenilalanina, Medio de cultivo utilizado para diferenciar Morganella morganii biogrupo 1 y 2, Proteus spp. y Providencia spp., de la mayora de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae, en base a la presencia de la enzima fenilalanina deaminasa. En el medio de cultivo, el extracto de levadura aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. El aminocido fenilalanina sufre la desaminacin oxidativa catalizada por la enzima fenilalanina deaminasa, para producir cido fenilpirvico y amonaco. La presencia del cido fenilpirvico se demuestra con el agregado de cloruro frrico en medio cido, con el cual se forma un quelato de color verdoso entre el cido fenil pirvico y los iones Fe3+.Se debe incubar de 18 a 24 horas a 35-37 C, en aerobiosis. Luego, se debe realizar el revelado agregando unas gotas de una solucin acuosa de cloruro frrico al 10% y se debe leer en los primeros 5 minutos. (9). TSI (Triple Sugar Iron), es un Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro Sus resultados pueden ser los siguientes:1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azcares.4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico. (10)LIA (Lisina Hierro Agar), el cual es un Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de cido sulfhdrico. En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 horas de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierro. (11). SIM, Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo.El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehdo del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2. Se debe incubar durante 24 horas, a 35-37 C, en aerobiosis.Luego de esto, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich Si hay cepas mviles se produce turbidez en el medio que extiende la lnea de siembra. Cepas inmviles el crecimiento solo se observa en la lnea de siembra. Cepas H2S positivas, el medio se ennegrece a lo largo de la lnea de siembra o completamente. Cepas H2S el medio no cambia de color. Cepas indol positivas, desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovacs o de Erlich. Cepas indol negativas, no hay cambio de color. (12)Urea, Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad uresica. En el medio de cultivo, la triptena y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. (13). VP (Voges Proskauer) y RM (Rojo de Metilo), En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable. La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a travs de distintas vas metablicas. Segn la va utilizada, se originarn productos finales cidos, o productos finales neutros.Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podra ser reconocida por la adicin de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos cidos, y por la adicin de alfa naftol e hidrxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros.Voges y Proskauer, describieron una coloracin rojiza que apareca despus de adicionar hidrxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloracin se debe a la oxidacin del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo Para revelas estas pruebas se debe, para RM, aadir unas gotas de solucin de rojo de metilo al 0,04% y observar sin agitar. Para VP, se debe aadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etlico absoluto y 0.2 ml de hidrxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio. (14). Caldo de nitratos, es un "Medio desarrollado por Casellas, para estudiar simultneamente la reaccin de oxidacin o fermentacin de glucosa y la reduccin de nitratos a nitritos, por bacilos Gram negativos de fcil desarrollo. En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de carne aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, la glucosa es la fuente de energa y el azul de bromotimol es el indicador de pH. El nitrato de potasio es el sustrato de la enzima nitrato reductasa. Algunas bacterias pueden fermentar anaerbicamente la glucosa, otras la oxidan y algunas pueden metabolizarla por ambos mtodos, mientras que otras son incapaces de usarla. Asimismo, las bacterias muestran diferencias en los ciclos utilizados para esos procesos finales. Estas diferencias ayudan a la identificacin bacteriana. La hidrlisis de la glucosa acidifica el medio, haciendo virar el azul de bromotimol de verde a amarillo. Si este viraje ocurre solo en la parte superior del tubo, indica oxidacin de la glucosa; si todo el medio vira al amarillo, hay reaccin fermentativa, y si no vira o adquiere un color azulado, se presume que la bacteria no utiliza glucosa. En este medio, adems, puede detectarse la movilidad observando si el crecimiento se aleja de la lnea de puncin, enturbiando el medio.La reduccin del nitrato a nitrito o gas nitrgeno por medio de la enzima nitrato reductasa, es un proceso de oxidacin por el cual el nitrato proporciona oxgeno para ser usado como aceptor de electrones. El nitrito presente en el medio puede detectarse con el reactivo de Griess. Si se observan burbujas en el medio, stas son de gas nitrgeno, ya que el nitrito intermediario inhibe las decarboxilaciones (15)Prueba OF (oxido fermentacin), Es una prueba que indica del tipo de metabolismo energtico: respiratorio (O) o fermentador (F). Se suele utilizar glucosa como sustrato. Se detecta la acumulacin decidos con un indicador cido-base (azul de bromotimol). La bacteria se inocula con el hilo recto (por picadura) y se incuba en condiciones deaerobiosis(sin parafina) y deanaerobiosis(con parafina, tubo cerrado), simultneamente. Las bacterias querespiran aerobiamentecrecen en la superficie del medio del tubo abierto. Transforman la glucosa en CO2, la superficie del medio se ver ligeramente amarilla (por la formacin de cido carbnico originado al reaccionar el CO2con el agua del medio). En el tubo cerrado el cultivo se mantiene azul-verdoso. Lasbacterias fermentadorasproducen cidos a partir de la glucosa. Viran el cultivo del tubo cerrado a amarillo; en el tubo abierto se inicia el viraje en el fondo, pero transcurridas 24 horas los cidos pueden difundir por todo el medio virndolo a amarillo. (16) En esta prueba se utilizan 2 tubos, uno de ellos con aproximadamente 1mL de aceite o parafina estril, este se llama tubo cerrado. El otro tubo se llama tubo abierto. Moeller Medio Decarboxilasa es un Medio base, que al ser suplementado con lisina, arginina u ornitina, es til para la diferenciacin de bacilos Gram negativos, basndose en la produccin de lisina decarboxilasa, argina dehidrolasa y ornitina decarboxilasa respectivamente. Estas pruebas, junto a otros test bioqumicos, permiten diferenciar a las Enterobacterias y otros bacilos Gram negativos tales como Aeromonas, Plesiomonas y Vibrio spp. En el medio base de Moeller, la peptona y el extracto de carne suministran la fuente de carbono y nitrgeno necesarias para el crecimiento bacteriano. El piridoxal acta como coenzima en la decarboxilacin de los aminocidos. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable. El prpura de bromocresol y el rojo de cresol son indicadores del pH.Los aminocidos lisina, ornitina y arginina, se agregan al medio basal, en concentracin final al 1%(L-aminocidos), o al 2% (DL-aminocidos) para detectar la produccin de enzimas especficas para estos sustratos.Cuando el medio se inocula con una bacteria capaz de fermentar glucosa, se produce cido que disminuye el pH y cambia el color del medio del prpura al amarillo. La condicin cida estimula la actividad decarboxilasa. Si el organismo produce la enzima apropiada, es degradado el aminocido a su correspondiente amina. Por decarboxilacin de lisina, se produce cadaverina, mientras que la decarboxilacin de ornitina forma putrescina. La arginina es hidrolizada a ornitina y luego es decarboxilada a putrescina.La presencia de estas aminas, eleva el pH del medio, cambiando el color del indicador del amarillo al prpura o violeta.Si el organismo en estudio, no produce la enzima decarboxilasa o dehidrolasa, el medio permanece cido (amarillo) por fermentacin de la glucosa Agregar a todos los tubos, 1 ml de aceite mineral. (17). ResultadosEn el medio TCBS las colonias tenan un aspecto amarillo, de gran tamao, regulares y elevadas. En el medio TSA las colonias presentaban colonias elevadas, claras y de forma regular y elevada. Al Gram se observaron bacilos Gram negativos. La prueba de la cuerda de hizo tomando una de las colonias en agar TSA. 1. Prueba de la cuerda: Positivo2. Prueba oxidasa: Positivo3. Citrato de Simons : Negativo4. Prueba fenilalanina: Negativo5. TSI: K/A. El microorganismo fermenta la glucosa, no se presenta H2S6. TSI + NaCl 3%: A/A7. LIA: Positivo8. SIM: Negativo9. Produccin de Indol: Negativo10. VP: Negativo11. RM: Negativo12. Caldo de nitratos: Positivo13. Caldo Moeller con Arginina 1%: Negativo14. Caldo Moeller con Lisina 1%: Positivo15. Caldo Moeller con ornitina 1%: Negativo16. Crecimiento en caldo nutritivo sin NaCl: +++17. Crecimiento en caldo nutritivo NaCl 1%: +++18. Crecimiento en caldo nutritivo NaCl 3%:++19. Crecimiento en caldo nutritivo NaCl 6%: ++20. Prueba glucosa OF: Positivo21. Prueba sacarosa OF: Positivo22. Prueba lactosa OF: Negativo23. Movilidad: Positivo24. Produccin de H2S: NegativoBasndonos en los resultados obtenidos, se puede decir que la cepa entregada pertenece a V. alginoyiticus.DiscusinComparando los datos obtenidos con la tabla que se encuentra en la gua Identificacin de bacilos Gram negativos curvos: Familia Vibrionaceae y Campylobacteriaceae se pueden confirmar los datos que indican que el microorganismo entregado en la cepa es V. alginoyiticus. Los nicos resultados que varan son la prueba de RM e Indol, ya que en la prctica estas pruebas dieron resultado negativo y en la literatura se indica que estos pueden variar, lo cual no invalida los resultados ya mencionados de la prctica. Referencias bibliogrficasCurso Bacteriologa 001343. (s.f.). Identificacion de bacilos Gram negativos curvos: Familia vibrionaceae y campylobacteriaceae. Colombia. (1) (3)Martinko, J., & Madigan, M. (2005). Vibrionaceae. Recuperado el 25 de Septiembre de 2014, de Wikipedia La enciclopedia libre: http://es.wikipedia.org/wiki/Vibrionaceae (2)Britania. (s.f.). TCBS Medio. Recuperado el 25 de Septiembre de 2014, de Britanialab: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tcbsmedio.htm (4)TSA AGAR. (s.f.). Recuperado el 15 de Septiembre de 2014, de La anuncia taikerketa: http://www.laanunciataikerketa.com/trabajos/fregasuelos/medios.pdf (5)Montao Valencia, L. (30 de Diciembre de 2010). Instructivo en el diagnostico bacteriolgico de Vibrio cholerae pandmico para los laboratorios de salud pblica departamentales y distritales. Recuperado el 25 de Septiembre de 2014, de Instituto Nacional de Salud: http://www.ins.gov.co/temas-de interes/SiteAssets/Paginas/colera/Instructivo%20diagnostico%20Colera.pdf (6) (7)Britania. (s.f.). Simmons Citrato Agar. Recuperado el 14 de Septiembre de 2014, de Britanialab: http://www.britanialab.com/productos/328_hoja_tecnica_es.pdf (8)Britania. (s.f.). Fenilalanina Agar. Recuperado el 14 de Septiembre de 2014, de Britanialab: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/fenilalaninagar.htm (9)Britania. (s.f.). TSI Agar. Recuperado el 14 de Septiembre de 2014, de Britanialab: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tsiagar.htm (10)Britania. (s.f.). Lisina Hierro Agar. Recuperado el 15 de Septiembre de 2014, de Britanialab: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lisinahierroagar.htm (11)Britania. (s.f.). SIM Medio. Recuperado el 15 de Septiembre de 2014, de Britanialab: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simedio.htm (12)Britania. (s.f.). Christensen Medio (Urea Agar Base). Recuperado el 15 de Septiembre de 2014, de Britanialab: http://www.britanialab.com/productos/291_hoja_tecnica_es.pdf (13)Britania. (s.f.). MR-VP Medio. Recuperado el 15 de Septiembre de 2014, de Britanialab: http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/mr-vpmedio.htm (14)Britania. (s.f.). Glucosa Nitrato Agar . Recuperado el 15 de Septiembre de 2014, de Britanialab: http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/gluconitragar.htm (15)Prueba O-F, Oxido fermentativa o de Hugh - Leifson. (s.f.). Recuperado el 15 de Septiembre de 2014, de Ugr: http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-v/pb-v-3-of.htm (16)Britania. (s.f.). Moeller Medi Decarboxilasa Base. Recuperado el 15 de Septiembre de 2014, de Britanialab: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/moellermediodecbase.htm (17)