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COMPARACIÓN DE LA EVOLUCIÓN DE LA INFECCIÓN Y DE LOS PATRONES DE
EXCRECIÓN DE LA ENFERMEDAD PRODUCIDA POR UNA CEPA VIRULENTA DEL
VIRUS DE NEWCASTLE CON Y SIN REINFECCIONES EN POLLOS LEGHORN (Gallus
gallus) VACUNADOS CON LA CEPA LASOTA.
Ricardo Tascón Zapata
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS POSTGRADO
INTERFACULTADES MAESTRÍA EN MICROBIOLOGIA
Bogotá, Colombia
2016
COMPARACIÓN DE LA EVOLUCIÓN DE LA INFECCIÓN Y DE LOS PATRONES DE
EXCRECIÓN DE LA ENFERMEDAD PRODUCIDA POR UNA CEPA VIRULENTA DEL
VIRUS DE NEWCASTLE CON Y SIN REINFECCIONES EN POLLOS LEGHORN
(Gallus gallus) VACUNADOS CON LA CEPA LASOTA.
Ricardo Tascón Zapata
Tesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias-Microbiología
DIRECTOR:
OSCAR ROBIN M.V.Z Esp. MSc.
CODIRECTOR:
JAIME EDUARDO CASTELLANOS PhD.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS POSTGRADO
INTERFACULTADES MAESTRÍA EN MICROBIOLOGIA
Bogotá, Colombia
2016
Resumen
Se realizaron una serie ensayos en animales vacunados empleando una cepa de campo virulenta
del genotipo VIId. En estos ensayos, se hizo desafío con dosis que variaban en la cantidad de
dosis infectivas aplicadas; desde dosis muy bajas hasta dosis muy altas. Adicionalmente, se
hicieron ensayos de dosis única y otros en los que se aplicaron dosis repetitivas. De acuerdo a
lo observado, las dosis únicas moderadas y las dosis bajas y muy bajas aplicadas de forma
repetitiva y constante, pueden generar infecciones potencialmente importantes, las cuales llegan
a dar lugar mayores niveles virales en órganos incluyendo muchas veces órganos del sistema
linfoide los cuales, sobre todo el bazo, mostraron en algunos casos, cambios morfométricos
asociados a la infección. Adicionalmente, estos tipos de dosis, generaron niveles de excreción
viral muy elevados principalmente, por vía fecal. En contraste, el tratamiento con dosis elevadas
aplicadas de forma repetitiva no generó infecciones complicadas y los niveles virales alcanzados
en los órganos y en las excreciones, eran comparativamente bastante más bajos.
Palabras clave: Virus de Newcastle, Genotipo VIId, Excreción viral
IV
Contenido
Pág.
Resumen ......................................................................................................................... III
Lista de figuras .............................................................................................................. VI
Lista de tablas .............................................................................................................. VIII
Introducción .................................................................................................................... 1
1. Marco teórico ........................................................................................................... 4 1.1 Generalidades de la enfermedad ...................................................................... 4 1.1.1 Significancia de la enfermedad ............................................................... 4 1.1.2 Rango infectivo de la enfermedad .......................................................... 5 1.2 Clasificación ...................................................................................................... 6 1.3 Biología molecular del virus .............................................................................. 7 1.3.1 Estructura del virión y genoma ................................................................ 7 1.3.2 Patogenicidad ......................................................................................... 9 1.4 Respuesta inmune .......................................................................................... 11 1.4.1 Desarrollo de la respuesta..................................................................... 11 1.4.2 Inmunidad pasiva .................................................................................. 14 1.5 Persistencia y transmisión ............................................................................... 15 1.6 Vacunacion ..................................................................................................... 16 1.7 Patología y patogénesis de las cepas muy virulentas ..................................... 18 1.8 Variación genotípica del virus.......................................................................... 21 1.8.1 Genotipos identificados en Latinoamérica y Colombia .......................... 22
2. Metodología ............................................................................................................ 29
2.1 Organismos empleados .................................................................................. 29 2.1.1 Cepa del virus de Newcastle................................................................... 29 2.1.2 aves empleadas en el ensayo................................................................. 29 2.2 Locación y mantenimiento de las aves ............................................................ 29 2.3 Vacunación y Aplicación de desafíos.............................................................. 30 2.4 Ensayos in vivo................................................................................................ 30 2.5 Tratamientos ensayados ................................................................................. 30 2.6 Procedimiento de toma de muestras, registros y medidas durante los tratamientos ............................................................................................................. 32 2.7 Metodología Biología Molecular ...................................................................... 33 2.7.1 Preprocesamiento de las muestras ....................................................... 33 2.7.2 Extracción de RNA ................................................................................ 34 2.7.3 Secuenciación del fragmento del extremo 5’ del genoma de 0396-03 ... 35 2.7.4 Diseño de cebadores y sondas ............................................................. 36 2.7.5 PCR en tiempo real ............................................................................... 36 2.8 Análisis de las medidas morfométricas ........................................................... 37 2.8.1 Análisis de caso y estudio de medidas .................................................. 37 2.9 Análisis estadístico .......................................................................................... 37 2.9.1 Estadística descriptiva ........................................................................... 38 2.9.2 Pruebas de significancia estadística ...................................................... 38
3. Resultados .............................................................................................................. 39
3.1 Descripción de lesiones macroscópicas observadas ....................................... 39 3.1.1 Fase I .................................................................................................... 39 3.1.2 Fase 2 ................................................................................................... 46 3.1.3 Postratamiento ...................................................................................... 54
3.2 Medidas morfométricas ................................................................................... 58 3.2.1 Esquema de medidas morfométricas ..................................................... 58 3.2.2 Mediciones efectuadas .......................................................................... 58 3.2.3 Comportamiento de las mediciones morfométricas ............................... 60
3.3 Biología molecular ........................................................................................... 77 3.3.1 Diseño y construcción de la prueba de PCR en tiempo real .................. 77 3.3.2 Comportamiento de los niveles virales .................................................. 84
4. Discusión de resultados ...................................................................................... 101
4.1 Comportamiento control positivo .................................................................... 101 4.2 Sumario aves vacunadas................................................................................ 105 4.3 Variabilidad del virus, diferencia genética y dosis bajas................................. 106 4.4 Excreción, persistencia y variabilidad del virus .............................................. 108 4.5 Medidas morfométricas y valores de dosis infectivas .................................... 109 4.6 Modelo estadístico y medidas morfométricas ................................................ 110
5. Conclusiones y recomendaciones ...................................................................... 113
5.1 Conclusiones ................................................................................................. 113 5.2 Recomendaciones ......................................................................................... 114
Bibliografía .................................................................................................................. 117
Lista de figuras
Pág.
Figura 2-1. Diagrama del flujo de procedimientos seguidos en los distintos tratamientos trabajados durante la fase de ensayos……………………………………….. 29 Figura 2-2. Condiciones de temperatura empleadas en la prueba de PCR en tiempo real del gen L………………………………………………………………………... 40 Figura 3-1: Bazos y bolsas de Fabricio de aves del Tratamiento 1 a las 5 semanas, 1 día de edad………………………………………………………………………………………….. 43 Figura 3-2: Pulmón, tráquea-laringe y encéfalo de aves del Tratamiento 1 a las 5 semanas, 1 día de edad. . .............................................................................................. 43 Figura 3-3: Estado de las aves del Tratamiento 3 a las 5 semanas,4 días de edad.. .... 44 Figura 3-4: Bolsas de Fabricio y bazos de las aves del tratamiento 3 a la edad de 5 semanas, 1 día. . ........................................................................................................... 44 Figura 3-5: Timo de un ave del tratamiento 3 a la edad de 5 semanas, 1 día. . . 45 Figura 3-6: Tonsilas cecales e intestino grueso de un ave del Tratamiento 3 a la edad de 5 semanas, 1 día. . ........................................................................................................ 45 Figura 3-7: Placas de Peyer de aves del tratamiento 3 a la edad de 5 semanas, 1 día. 46 Figura 3-8: Bolsas de Fabricio de aves del Tratamiento 5 Fase 1 a la edad de 5 semanas, 4 días. ............................................................................................................ 49 Figura 3-9: Tonsila cecal e intestino grueso de un ave del Tratamiento 5 Fase 1 a la edad de 5 semanas, 4 días. . .................................................................................................. 54 Figura 3-10: Timo F de un ave del Tratamiento 4 Fase 2 a la edad de 5 semanas- 1 día………………………………………………………………………………………………. 50 Figura 3-11: Bazo de un Ave del Tratamiento 4 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día. 50 Figura 3-12. Bolsas de Fabricio de Aves del Tratamiento 4 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día. ............................................................................................................. 51 Figura 3-13. Tonsila cecal e intestino grueso de aves del Tratamiento 4 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día....................................................................................................... 51 Figura 3-14. Timo de un ave del Tratamiento 5 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día..51 Figura 3-15. Bolsas de Fabricio de Aves del Tratamiento 5 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día. . . ......................................................................................................... 54 Figura 3-16: Tonsila cecal e intestino grueso de aves del Tratamiento 5 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día ...................................................................................................... 54 Figura 3-17: Tonsila cecal e intestino grueso de aves del Tratamiento 6 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día. . ................................................................................................... 55 Figura 3-18: Encéfalo de un ave del Tratamiento 6 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día. . ............................................................................................................................... 56 Figura 3-19: Tráquea de ave del Tratamiento 6 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día……………………………………………………………………………………………… 56 Figura 3-20: Comparación del tamaño de la bolsa y el bazo en aves del Postratamiento…………………………………………………………………………………. 58
Figura 3-21: Peso corporal vs edad. El gráfico, se describe el comportamiento del peso corporal con respecto a la edad…………………………………………………………62 Figura 3-22: Comportamiento del Índice Bursal para cada uno de los tratamientos al transcurrir la edad……………………………………………………………………………….63 Figura 3-23: Comportamiento del peso del bazo para cada uno de los tratamientos Al transcurrir la edad…………………………………………………………………………….66 Figura 3-24: Árbol de secuencias construido empleando Clustal W. La cepa 0396-03, aparece agrupada con secuencias del Genotipo VIId……………………………………….80 Figura 3-25: Ensayo de PCR en tiempo real de muestras de diluciones de 0396-03......83 Figura 3-26: Relación lineal entre el logaritmo de la dosis infectiva y el valor de Ct........84
VIII
Lista de tablas
Pág. Tabla 2-1. Características de tratamientos y procedimientos de la prueba piloto………. 30 Tabla 2-2. Características de tratamientos y procedimientos de ensayos de la fase 1… 31 Tabla 2-3. Características de tratamientos y procedimientos de ensayos de la fase 2… 32 Tabla 2-4. Descripción de características y procedimientos usados en el Postensayo… 33 Tabla 2-5. Descripción de los productos para secuenciación del extremo 5’ del genoma de NDV0396-03…………………………………………………………………………………. 38 Tabla 2-6. Condiciones de reacción de la prueba de PCR en tiempo real de doble sonda del extremo 5’ del gen ...………………………………………………………... 39 Tabla 3-1: Lista de cebadores diseñados para secuenciar el extremo 5’ del genoma del virus De Newcastle………............................................................................. 78 Tabla 3-2. Lista de los cebadores y sondas Taqman de la prueba de PCR en tiempo real de doble sonda……………………………………………………………………………. 81 Tabla 3-3: Valores de Ct promedio de diluciones seriales de líquido alantoideo……….. 82 Tabla 3-4: Valores de dosis infectivas de las muestras para cada uno los tratamientos en la edad 4-5, 3 días posinfección. .................................................................................... 85 Tabla 3-5: Valores de dosis infectivas de las muestras para cada uno los tratamientos en la edad 5-1, 6 días posinfección. .................................................................................... 87 Tabla 3-6: Valores de dosis infectivas de las muestras para cada uno los tratamientos en la edad 5-4, 9 días posinfección. .................................................................................... 90 Tabla 3-7: Valores de dosis infectivas de las muestras para cada uno los tratamientos en la edad 6-0, 12 días posinfección ................................................................................... 93 Tabla 3-8: Sumario de los datos de dosis infectivas obtenidos para las muestras de hisopo traqueal y cloacal………….……………………………………………………………………..94 Tabla 3-9: Sumario de los datos de dosis infectivas obtenidos para las muestras de Bursa y Pool de Bazo-Timo……………………………………………………………………..95 Tabla 3-10: Sumario de los datos de dosis infectivas obtenidos para las muestras de Encéfalo y Pool de Tráquea-Pulmón…………………………………………………………..95 Tabla 3-11: Valores de dosis infectivas en el ensayo piloto ........................................... 99 Tabla 3-12:Valores de dosis infectivas en los tratamientos Del post ensayo……………. 101
1
Introducción La enfermedad de Newcastle es un padecimiento que ha afectado a la industria avícola en
múltiples países y a través del tiempo (1, 2), constituyéndose siempre en un problema serio y
prevalente en la medida que una región desarrollaba una industria avícola. Actualmente, la
enfermedad tiene su más alto impacto en regiones como Latinoamérica, Asia y África donde
constituye un problema importante que genera pérdidas económicas a la industria y que además
limita sus posibilidades de expansión y desarrollo (3, 4).
Las cepas virulentas de la enfermedad de Newcastle son capaces de generar procesos
infecciosos severos en poblaciones vacunadas llegándose a presentar mortalidades a veces muy
elevadas y pérdidas importantes a nivel productivo (5). Esta enfermedad, es producida por un
virus de ARN perteneciente a la familia de los paramixovirus, conocido científicamente como
paramixovirus aviar I ó APMV-I, el cual infecta numerosas especies de aves de múltiples géneros
(6).
Las cepas de este virus presentan diferencias importantes a nivel de la secuencia de muchos de
sus genes. Los cambios a nivel de secuencia en el sitio de clivaje de la proteína de fusión (AA
111-117), han mostrado ser una condición necesaria para el desarrollo de virulencia (7). Se han
documentado cambios a nivel de otros genes como los de la hemaglutinina (HN), la fosfoproteína
(P) y la replicasa viral (L) que también han mostrado tener importancia en el desarrollo de la
virulencia (8).
La respuesta humoral protectora contra el virus, está dirigida principalmente hacia sus proteínas
de superficie HN y F, que aparecen asociadas sobre la superficie de la cubierta membranal del
virus. A pesar de que estas proteínas presentan una variación apreciable a nivel de secuencia
nucleotídica y aminoacídica, se considera que todas las cepas hasta ahora encontradas,
pertenecen a un único serotipo (7, 9). Se ha descrito, sin embargo, el surgimiento de algunas
variaciones de epitopes que conducen a diferencias en los perfiles de afinidad y reconocimiento
en el caso de ciertas cepas por parte de algunos anticuerpos pertenecientes a paneles de
anticuerpos monoclonales desarrollados contra las proteínas de superficie del virus, aunque tales
variaciones no alcanzan aún a generar nuevos serotipos (10, 11, 12)
2
El hecho de que desde un comienzo las distintas cepas del virus aisladas en distintas regiones
épocas y especies de aves mostraran pertenecer a un único serotipo, impulsó la búsqueda e
implementación de vacunas vivas basadas en cepas atenuadas de baja virulencia, para el control
de la enfermedad en cepas heterogéneas. iniciando con cepas como Lasota y tiempo después,
ya en los 80s VGGA han sido tradicionalmente empleadas desde hace mucho tiempo como
vacunas vivas en poblaciones de aves comerciales para inmunizar y proteger a las aves contra
brotes de la enfermedad (2, 13).
Sin embargo, a pesar del uso de vacunas para la inmunización, es frecuente que, en dichas
poblaciones se presenten brotes muchas veces severos de infecciones de cepas virulentas del
virus de Newcastle que a veces conducen a mortalidades elevadas y grandes pérdidas
productivas.
Los ensayos de laboratorio de desafío con cepas virulentas del virus en aves vacunadas,
conducen a una enfermedad subclínica que cursa con síntomas apenas leves y que no muestra
ninguna mortalidad con un periodo relativamente corto de enfermedad y recuperación. si bien,
se observa en unos pocos estudios, algún grado de depleción de órganos del sistema inmune
generalmente moderados, estos son recuperados al menos parcialmente al pasar cierto tiempo
y a medida que se supera la infección (14, 15, 16, 17, 18).
El presente trabajo, intentó estudiar la posible contribución de ciertos factores en explicar por qué
en una población de aves, se pueden presentar infecciones con cepas virulentas del virus de
Newcastle con un grado de severidad marcado y la presencia de mortalidad a veces importante
a pesar de que dicha población haya sido vacunada contra la enfermedad.
Se hipotetizó que, durante el proceso infeccioso, las primeras aves enfermas comienzan a
excretar cantidades variables del virus conduciendo a la infección de nuevos animales con dosis
variadas del virus y eventualmente, a la generación de reinfecciones sucesivas con dosis
variadas de las aves ya enfermas, evitando así que aclaren la enfermedad y a su vez, alterando
y dificultando su capacidad de respuesta inmune, complicando la infección en el sistema orgánico
del ave. El presente trabajo hizo una exploración inicial de los efectos de la infección de aves vacunadas,
empleando la aplicación de dosis infectivas de cepa de campo virulenta de distinto rango
3
incluyendo dosis bajas, aplicadas ya sea en forma de dosis únicas o dosis repetitivas a modo de
reinfecciones. Los efectos más consistentes, se observaron a nivel de la excreción y la persistencia de la
enfermedad también, en los niveles virales alcanzados en órganos. Hubo, además, evidencia
sugerente pero no del todo concluyente, de alteraciones de órganos linfoides como la bursa y el
bazo posiblemente alterando y afectando la respuesta inmune.
4
1. Marco teórico
1.1 Generalidades de la enfermedad
1.1.1 Significancia de la enfermedad De acuerdo a cifras emitidas por el estudio “Análisis cuantitativo de los datos de Salud Animal
2006 – 2009”, publicado por el Banco Mundial en 2011, la enfermedad de Newcastle es la cuarta
enfermedad en importancia por detrás de la influenza de alta y baja patogenicidad y de la
bronquitis infecciosa aviar (19).
La enfermedad de Newcastle aparece como una enfermedad de control que se encuentra dentro
de la lista de enfermedades de reporte obligatorio de la OIE, lo cual hace que no pueda recibirse
ningún producto derivado de la industria avícola de una región a no ser que esté declarada libre
de la enfermedad (5, 6).
El impacto económico también se refleja en los países pobres en términos del encarecimiento de
los productos avícolas debido a los costos de las medidas de control que limitan la posibilidad de
tener una mejor alimentación de las personas de bajos recursos económicos.
La enfermedad, también puede potencialmente representar costos altos para aquellos países y
regiones declaradas libres de la enfermedad, donde debe hacerse una inversión cuantiosa en
medidas de bioseguridad y medidas de control incluyendo vacunación, además de contención y
erradicación de los rebrotes esporádicos de la enfermedad (2, 20)
En los países endémicos para la enfermedad esto impone limitaciones al desarrollo y crecimiento
de esta industria puesto que no es posible que las empresas de estos países puedan hacer
contratos de exportación o participar y beneficiarse de Tratados de Libre Comercio con
economías de alta demanda (21,22). Por el contrario, el país podría quedar expuesto a la
importación de productos de países desarrollados declarados libres y con los cuales se cerrasen
dichos tratados.
De acuerdo a la situación observada y a los reportes de notificaciones de la enfermedad, En
nuestro país, desde noviembre de 2013 hasta la fecha vienen presentándose de manera
5
ininterrumpida episodios severos de la enfermedad que se equiparan en intensidad, con algo
menos de duración, a los ocurridos años atrás entre los períodos 2005 - 2006 y 2009 (19).
Según información de los productores, el país está atravesando actualmente por una alarmante
situación sanitaria respecto a la enfermedad producida por virus de Newcastle de alta
patogenicidad y se han reportado en departamentos como Santander y Antioquia, casos de
explotaciones comerciales con mortalidades de hasta 60%, siendo en algunos casos tan grave
el impacto, que los productores han decidido eliminar lotes con acompañamiento del ICA.
Además de esto, se ha reportado la presencia de virus en aves de traspatio en al menos 11
departamentos, mostrando una marcada y extensa presencia del virus en el momento actual
(23).
Uno de los factores que se señala, puede contribuir más en la dificultad de controlar la situación
y a que la infección persista y se siga propagando, parece ser el reporte tardío de los brotes,
generalmente en el momento cuando estos generan problemas y mortalidad o incluso en una
buena parte de los casos, el ocultamiento por parte de productores y técnicos sumados al
descuido en las medidas de bioseguridad de los brotes. (23).
Los factores que se piensa contribuyen a la persistencia de la situación actual tan complicada
incluyen la elevada presión de desafío de cepas virulentas en el campo y la presencia ubicua de
reservorios naturales como aves silvestres y transportadores mecánicos por ejemplo insectos
(19).
Así pues, actualmente en nuestro país la alta recurrencia del virus, está generando costos a nivel
de aplicación de medidas de control como planes de vacunación reforzados además de otras
medidas a lo que deben sumarse las pérdidas producidas por los casi constantes brotes
infecciosos de la enfermedad.
1.1.2 Rango infectivo de la enfermedad Las revisiones de investigaciones hechas en distintas especies de aves hasta finales de los 80,
habían mostrado que además de las especies domésticas de aves el virus de
Newcastle infectaba 241 especies de 27 de los 50 órdenes de aves. Desde ese entonces el
número de especies en las que se ha detectado el virus se ha ampliado de forma importante de
6
forma que se podría concluir que la gran mayoría sino todas las especies de aves, son
susceptibles a la infección por el virus de Newcastle (1, 2, 9, 24).
1.2 Clasificación El virus de la Enfermedad de Newcastle, pertenece al orden de los virus Mononegavirales (2). El
nombre de estos virus, deriva de las características que los definen (25, 26). Estos son virus cuyo
genoma es una molécula de ARN de cadena única y de sentido negativo lo que quiere decir que
la molécula de ARN en sí, no puede servir de molde para la síntesis de proteínas. La cadena que
se empaqueta en estos virus, corresponde a la secuencia complementaria (llamada negativa), a
la cadena cuya secuencia es codificante de las proteínas (llamada cadena positiva). Estas
características, determinan mucho de su biología.
El orden de los Mononegavirales está constituido por las familias paramyxoviridae, filoviridae y
rhabdoviridae (27). El virus de Newcastle pertenece a la familia paramyxoviridae. Recientemente
debido a sus diferencias, se decidió ubicarlo en un género nuevo aparte dentro de esta familia
llamado avulavirus (28, 29, 30).
Dentro del género avulavirus, se han identificado nueve serotipos distintos (I-IX) los cuales a su
vez corresponden a nueve especies del género denominadas APMV-1 a APMV9 (27).
Adicionalmente, otros cuatro serotipos putativos adicionales (10-13) (31) han sido identificados.
Entre todas estas especies, el virus de Newcastle (APMV-1), corresponde al serotipo I.
1.3 Biología molecular del virus
1.3.1 Estructura del virión y genoma El virus presenta una forma esferoide con un diámetro que va de 100 a500 nM (26). El virión
posee una envoltura membranal derivada de las membranas de las células que infecta (32).
Este presenta sobre la superficie membranal proyecciones a modo de pequeñas agujas o
espículas que son heterómeros de dos moléculas de glicoproteínas distintas que corresponden
7
a una molécula de la proteína de Fusión y a otra de Hemaglutinina; estas se encuentran
interactuando estrechamente dentro de la estructura de la espícula (7).
La porción correspondiente a la neuraminidasa de la proteína HN, previene que los viriones de
la progenie viral se queden adheridos a la superficie de la célula de la cual están siendo liberados
colaborando también a que los virus no queden atrapados que contiene receptores a los que el
virus se puede adherir (33).
La proteína trimerica F, permite la fusión del virus a la célula huésped. Esta es una proteína de
membrana integral tipo I, con el dominio transmembranal situado en el C-terminal (34)
La proteína F siempre es producida como una molécula precursora, F0. Este se produce y queda
expuesto sobre la superfie celular. Para ser funcional, el precursor debe ser clivado por una
proteasa extracelular, produciendo 2 unidades (F1-F2) para poder ejercer su función (35)
Para que el clivaje del precursor F0 sea completado, es necesario que se suministre una nueva
proteasa, específicamente una carboxipeptidasa, para remover los aminoácidos básicos (34).
Por debajo de la superficie de la capa lipídica, se encuentra una capa de proteína de matriz (M)
que interactúa con la cubierta membranal y con la nucleocápside conformada por la
nucleoproteína (NP) unida estrechamente a la cadena negativa de ARN genómico del virus;
conjugado a esta matriz, se encuentran algunas moléculas de fosfoproteína (P) y algunas
moléculas de la transcriptasa del virus o proteína L. el conjunto de todas estas macromoléculas
conforman lo que se conoce como el complejo activo, que ha demostrado ser necesario para la
replicación del virus (7).
En el genoma del virus, es una molécula de ARN de un poco más de 15000 bps de tamaño; este
posee dos secuencias terminales, una en el extremo 3´ aproximadamente de 50 bps conocida
como líder que es transcrita produciendo RNAs pequeños y otra más grande en el 5´conocida
como tráiler (36). Estas secuencias están involucradas en la regulación de la replicación,
transcripción y encapsidación de los RNAs genómicos y antigenómicos (34).
El genoma codifica para seis genes principales que en el orden de extremo 3´a 5´ de la molécula
codifica 3´NP-P-M-F-HN-L-5’. Estos seis genes codifican respectivamente la nucleoproteína
(NP), la fosfoproteína (P), la proteína de matriz (M), la proteína de fusión (F), la Hemaglutinina, y
la replicasa del virus (L) (26). El genoma presenta además regiones intergénicas cortas entre los
genes del genoma y que probablemente estén sirviendo de señales demarcatorias de los ARN
8
mensajeros de estas proteínas. Aparte de esto, el virus tiene secuencias consenso cortas de
inicio de la transcripción al comienzo de los marcos de los seis genes y señales consenso de
poliadenilación al final de los marcos de lectura de estos. (37)
Aparte de estas proteínas, el virus genera mediante un proceso postranscripcional conocido
como edición otras dos proteínas conocidas como V y W a partir del gen P (38). En este proceso,
moléculas de ARN mensajero del gen P experimentan la inserción en la posición 484 o bien de
una guanina o bien de dos guaninas lo que hace que el marco de lectura se corra:
Una posición dando lugar a la lectura de la proteína V o dos lugares dando lugar a la lectura del
gen W.
El gen V posee funciones de controlar la respuesta a interferón (39). La función del gen W no es
conocida (40).
El genoma produce además de los ocho ARN mensajeros, cadenas positivas que abarcan la
extensión del genoma completo del virus y que actúan como intermediarios imprescindibles en
la replicación de los ARNs genómicos que son sus cadenas complementarias (34).
1.3.2 Patogenicidad La virulencia de una cepa dada del virus de Newcastle varía de forma considerable incluso con
factores que no dependen del virus mismo. Por ejemplo, un virus puede ser virulento en pollos,
pero no serlo en patos o gansos (2)
Si bien la virulencia en pollos depende principalmente del virus, factores como la dosis, la ruta
de infección y la edad de las aves tienen influencia en la evolución de la enfermedad. En general,
entre más joven el animal, más aguda es la enfermedad (2). También la genética de las
variedades mejoradas incide (41).
Se han identificado toda una serie de factores que inciden en la patogenicidad del virus en la cual
están implicados varios genes del virus. El primer gen implicado en el desarrollo de virulencia es
el gen de la proteína F. esta proteína, posee un sitio de reconocimiento para proteasas entre los
aminoácidos 111-117. El clivaje realizado entre los residuos 116 y 117, es necesario para que la
proteína precursora pueda derivar en una proteína activa. Sin dicho clivaje, no sería posible la
entrada de los virus a las células (42, 43).
9
Usualmente todas las cepas incluyendo las de virulencia moderada, tienen una proteína F con
un sitio de clivaje que puede ser reconocido por proteasas como la tripsina, que se encuentra
presente en abundancia solo en ciertos tejidos como las mucosas del tracto respiratorio superior
y de las mucosa del tracto digestivo La modificación de secuencia de aminoácidos a nivel del
sitio de corte, permiten adquirir el reconocimiento por otras proteasas distintas cuya distribución
y abundancia en los distintos órganos puede ser amplia y abundante (42)
La comparación de secuencia de sitios de clivaje entre cepas virulentas y no virulentas mostró
que las cepas tenían una Arginina en la posición 116 mientras que las no virulentas tenían leucina
en la 117 y un aminoácido básico en la posición 113 en comparación a las virulentas que tenían
Fenilalanina en la posición 117 y con alta frecuencia aminoácidos básicos en las posiciones 115
y 112 y en los aminoácidos 113 y 116 (26, 44)
El mecanismo de desarrollo de virulencia visto en este caso, se parece mucho al reportado para
el virus de influenza. Si bien las proteasas responsables de potenciar el rango de tejidos que
pueden ser invadidos por el virus no han sido plenamente identificadas, se piensa que como en
el caso del virus de la influenza, estas pueden ser una o varias de las endoproteasas relacionadas
a subtilisina procesadoras de preproteínas entre las cuales la Furina es el principal candidato. (2,
45)
La observación de que ciertas mutaciones en la secuencia de nucleótidos pueden generar una
cepa de características más agresivas a partir de cepas no agresivas de baja virulencia, ha
mostrado que muchos brotes se han debido a cambios en secuencia de aislamientos de baja
virulencia en distintas especies de aves que pueden ser reportados como de baja virulencia. Así
pues, aun la presencia de cepas no virulentas circulando constituye un peligro potencial (46).
Estas diferencias en secuencia de la proteína F, también constituyen la base para pruebas de
PCR de diferenciación de cepas virulentas y no virulentas (26,47)
Estudios más recientes empleando genética reversa para la creación y análisis de mutantes en
otros genes distintos a F, ha mostrado la implicación de otros genes en la virulencia y
patogenicidad del virus de Newcastle.
Por ejemplo, al retirar sitios de glicosilación en la proteína HN, se observa una disminución
marcada en los índices de patogenicidad (48). Estos cambios podrían tener una influencia directa
en características de la misma enzima como su capacidad de hemaglutinación o su actividad de
10
neuraminidasa, ambas asociadas a la misma región de la proteína. (49) estos cambios, también
podrían tener que ver con la interacción con la proteína F.
Anteriormente se había observado que las cepas de muy baja virulencia de referencia,
generalmente tenían una proteína HN más larga en aproximadamente unos 45 aminoácidos.
Esta extensión debía ser clivada como lo es la proteína F, por proteasas. Sin embargo, las cepas
de virulencia media y alta, poseen proteínas en las cuales se ha perdido este segmento presente
en el otro tipo de cepas (50, 51)
Otra proteína del virus implicada en la virulencia y que ha sido estudiada también por genética
reversa, es la fosfoproteína (P). Los primeros estudios realizados mostraban que las proteínas
alternas obtenidas por edición V y W, estaban implicadas en la evasión de mecanismos de la
inmunidad innata como el interferón. Demostraron que sin estas proteínas el virus sucumbía a
los sistemas de defensa. Además, los estudios mostraron que al intercambiar secuencias de
estas proteínas de virus encontrados en un rango de especies dado, los virus combinados no
lograban producir una infección (52).
Lo anterior indicaba que las mutaciones en las secuencias de estas proteínas, eran necesarios
para adaptarse a un rango de hospederos.
Por último, otro estudio de genética reversa, pero esta vez enfocándose en el gen L de la
replicasa del virus, mostraron que este gen también se encuentra asociado a la virulencia y
patogenicidad del virus (8).
1.4 Respuesta inmune
1.4.1 Desarrollo de la respuesta Durante las primeras fases de la infección, el virus de Newcastle activa una serie de mecanismos
y respuestas primarias a nivel celular y molecular relacionados al desarrollo de la respuesta
inmune posterior (53, 54). La detección de procesos virales en los tejidos inicialmente infectados durante estas primeras
fases, conduce a que se active la producción de una serie de compuestos del sistema inmune
innato. Dentro de estos compuestos se encuentran los interferones de clase I, el interferón α y el
interferón β (55).
11
Estos interferones poseen una elevada capacidad para interferir en la replicación viral al activar
toda una cascada de genes conocidos como los genes de respuesta a interferón (IFNRs),
generando una contención inicial de la enfermedad (56,57). Una de las vías transcripcionalmente
activadas, es la vía PKR/eif2 (58) la función de esta vía, es detener la traducción de las proteínas
virales. (59) A su vez, también se observó una producción asociada de interferón de clase II, el interferón γ
el cual, es responsable de la activación de la respuesta celular (55). Junto con los interferones
de clase I, ellos estimulan la producción de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad
en la presentación de antígenos (53, 60, 61).
Se observa en estas primeras fases un incremento importante de leucocitos y fagocitos hacia los
sitios primarios de infección. El análisis transcripciónal mostró que la vía de activamiento
(signaling) de la extravasación de leucocitos mostró un aumento de la expresión (58). El efecto
neto de esta vía, es incrementar el reclutamiento de células inmunes a los sitios de infección y
replicación primarios del virus (62, 63).
Acorde a esto en estudios realizados en aves vacunadas se observó en las tráqueas y las
glándulas de Harden, que las poblaciones preexistentes de linfocitos y macrófagos se
incrementaban de una a tres veces, poco después de haber vacunado las aves, ya fuese con
cepas lentogénicas o mesogénicas (64,65). Muchos de los leucocitos en estos infiltrados expresaban MHC clase II (65). En los análisis de
expresión una de las vías más activas fue la vía i COS- i COSL (58). Esta vía tiene que ver con
la diferenciación de células T CD4 en células ayudadoras de tipo TH1 y TH2 (66, 67). La
activación de interferón α, favorecería la activación de la vía TH2, conduciendo al desarrollo de
una respuesta humoral.
Sin embargo, la activación de interferón γ, además de la presencia en los infiltrados de linfocitos
CD8 y macrófagos, conduce a que se desarrolle también una respuesta TH1 de tipo celular (60,
65).
Otros genes expresados en estos estudios, incluían genes de control de apoptosis y de defensa
ante el stress (68)
La respuesta humoral primaria que se genera luego de la inmunización, es detectada hacia el
cuarto día luego de la inmunización (69) las características de la respuesta humoral, dependerán
del tipo de inmunización; si la inmunización se hace por vía parental, los anticuerpos solo se
detectarán en el suero, pero no a nivel de las secreciones mucosas dejando los posibles sitios
de entrada primarios susceptibles a infección por el virus (70). En cambio, las inmunizaciones hechas por vía local contribuirán a la presencia de un buen título
de anticuerpos a nivel de las secreciones mucosas lo cual haría ineficiente la replicación viral
inicial y evitaría también que se presenten reinfecciones de forma fácil (71)
12
Aparte de la respuesta humoral se evidencia una respuesta celular sistémica alrededor de tres
días luego de la aplicación de la vacuna viva (55).
Con el fin de investigar el papel en la protección de la inmunidad celular y de la inmunidad
humoral se emplearon aproximaciones destruyendo uno de los dos componentes de la respuesta
adaptativa. En animales a los que se les extirpaba la bursa y se les irradiaba no se observaba la
generación de anticuerpos contra Newcastle o se observan niveles muy bajos luego de ser
vacunados. Al ser desafiados con virus virulento todos los animales sometidos a este tratamiento
murieron (72). En animales a los que se le extirpó el timo y luego se les irradió, desarrollaron niveles adecuados
de anticuerpos luego de ser vacunados. Estos animales fueron protegidos del desafío con cepa
virulenta (73). Para confirmar adicionalmente estos resultados se hicieron estudios empleando la
administración de ciclofosfamida in ovo lo cual conduce a la eliminación de las poblaciones de
células de linfocitos B del animal (74). Se seleccionó entonces a los animales que presentaban una respuesta importante de células T
pero no de células B. Estas aves fueron vacunadas y luego de un tiempo desafiadas con cepa
virulenta. Sólo las aves del control no tratado del ensayo y algunos animales que al parecer
regeneraron algo de su respuesta humoral de acuerdo a los títulos de anticuerpos encontrados
en ellos, lograron sobrevivir al desafío. En contraste, los animales que desarrollaron una
respuesta celular específica para Newcastle, pero que no desarrollaron ningún tipo de respuesta
humoral perecieron (74). Estos ensayos comprueban que la respuesta humoral al parecer es protectora por sí sola
mientras que la respuesta celular parece no serlo. En resumen, la inmunidad innata es necesaria parte de la protección. Está también es necesaria
para activar y configurar las posteriores respuestas adaptativas humoral y celular. Está también
podría ser potencialmente importante en moldear el estatus de las células blanco del virus,
haciéndolas menos propensas a los efectos de este La inmunidad humoral parece ejercer el mayor efecto protector. La inmunidad celular es activada
al principio de la infección. Esta vuelve a sufrir una reactivación fuerte a los siete días de acuerdo
al perfil de citoquinas en sangre periférica en aves vacunadas con Lasota (55).
Es probable que la inmunidad celular ayude a aclarar la enfermedad en las fases finales. Es
probable también que dependiendo de la cepa que infecta y de sus características, el papel de
la inmunidad celular pueda ser más importante. La inmunidad local es necesaria para disminuir la replicación viral inicial a nivel de mucosas. Se
ha demostrado que las aves tienen una vía de complemento clásica (75) así que el ligaje de
partículas virales por los anticuerpos puede ayudar a sus fagocitosis aclarando el virus a nivel
local. Esto ayudaría a disminuir su replicación inicial y también a disminuir su excreción y la
posibilidad de reinfección.
13
1.4.2 Inmunidad pasiva Al nacer el ave, esta recibe una reserva de anticuerpos de la Madre a través de la yema. Estos
son anticuerpos del tipo IgY, el análogo aviar de IgG de mamíferos.. Los niveles de anticuerpos
encontrados en los pollos al nacer, están directamente correlacionados con los títulos de estos
en la madre. El título de anticuerpos maternos, decae dos veces cada 4.5 días según lo que se
ha establecido. La inmunidad maternal brinda protección al ave en sus primeras semanas de
vida (2) Un ensayo en el cual a aves sin vacunar se les inocula suero inmune con una carga de
anticuerpos importante contra el virus de Newcastle, mostró que estas aves podían protegerse
de un desafío hecho al poco tiempo de haberles inoculado el suero, probando la efectividad de
la inmunidad pasiva (76). En este ensayo se aplicaron sueros bien sea contra las proteínas de superficie F y HN o contra
las proteínas internas M, N y NP del virus de Newcastle. Las que recibieron suero contra
proteínas de superficie no manifestaron ningún tipo de síntoma mientras que aquellas que
recibieron suero contra las proteínas internas se enfermaron de forma manifiesta (76). Adicionalmente, en pruebas empleando paneles de anticuerpos monoclonales dirigidos contra
las glicoproteínas de superficie del virus HN y F con capacidad para neutralizar al virus
reconociendo epitopes específicos sobre su superficie, han establecido que los anticuerpos
monoclonales dirigidos para la proteína F, inducen mayor neutralización que los que están
dirigidos contra la proteína HN. Esto implica que la respuesta contra F puede ser más protectora
que la respuesta contra HN. (77,52).
1.5 Persistencia y transmisión Un factor importante para la transmisión del virus, es su persistencia. Es probable que en los
virus que recirculan fuertemente en entornos de producción, evolucionen hacia persistir y
propagarse mejor en tal tipo de entornos. Las evidencias indican que luego de retirar las aves
infectadas se pueden detectar virus 16 días después en los galpones sobre todo en las camas
(78). Otros reportes, sin embargo, hablan de una persistencia en heces de ocho semanas o más
(5, 6)
Uno de los parámetros analizados en cuanto a tipificación de cepas es su termo-estabilidad
perfeccionándose incluso vacunas con alto grado de termo-estabilidad (79, 80). El virus es capaz
de soportar rangos de pH entre 2 y 12 (1). Es probable que la resistencia a distintas condiciones
esté relacionada y que tal resistencia se correlacione con su persistencia. Así, es probable que
14
la persistencia de las cepas varíe y deba de ser considerada en el momento de establecer
políticas de control.
Otras formas de persistir el virus, consisten en la recirculación del virus en especies no
domésticas de aves. Se ha postulado que algunas especies de aves silvestres son capaces de
persistir con una enfermedad y ser transportadores de la enfermedad incluso por meses (6, 9,
24, 81)
Respecto a las formas de transmisión del virus, el virus infecta las aves bien sea por inhalación
o por ingestión. En el caso de las cepas que generan síntomas respiratorios, se cree que los
aerosoles generados por la expulsión aérea de las aves infectadas directamente de sus tractos
respiratorios o por moco que se mezcla con el polvo del suelo o partículas de heces. Las
partículas cargadas con virus, pueden ser inhaladas o pueden lacerar las mucosas generando
infección. Sin embargo, la duración de tales partículas como vehículos infecciosos, depende de
muchos factores (2).
La otra vía, la constituyen las heces que en el caso de cepas que cursan sin síntomas
respiratorios, es su forma de transmisión. Las heces pueden ser ingeridas debido al
comportamiento de picoteo y por contaminación accidental de agua o alimentos.
1.6 Vacunación En buena parte del mundo incluido nuestro país, la base para controlar la enfermedad de
Newcastle, es la vacunación mediante el uso de vacunas vivas basadas en cepas lentogénicas
que producen una infección muy leve en las aves (82,83). En el país es común el empleo de
vacunas lentogénicas como Lasota y VGGA. Estas dos vacunas pertenecen al genotipo II y
poseen un alto nivel de homología entre sí defiriendo sin embargo en su tropismo. La cepa Lasota
tiene un tropismo respiratorio mientras que la cepa de VGGA, es una cepa que se replica mejor
a nivel entérico (13)
Este tipo de vacunas poseen la facilidad que ser aplicadas en el agua de bebida o por aspersión
dentro de los galpones de forma que se facilita su aplicación masiva (77). Estas vacunas logran
100% de protección contra la mortalidad producida por la enfermedad, cuando las dosis
aplicadas por animal son equivalentes a 104-105 dosis infectivas embrionarias (84). Sin embargo,
15
aún bajo estas circunstancias estas vacunas no evitan que los animales desafiados con cepas
muy virulentas se infecten, tengan replicación y excreción viral (85)
Un problema relacionado las anteriores generalmente asociado la vacunación, es el poder lograr
que el 85% de los animales de un galpón, alcancen la dosis infectiva de vacuna necesaria para
una buena protección durante las aplicaciones masivas (86)
Otras cepas de vacunas vivas usualmente empleadas incluyen cepas del genotipo I como la cepa
I2 y la cepa V4. Estas cepas poseen la característica de ser termo resistentes lo que facilita su
uso a nivel de campo en zonas apartadas dado que estas no requieren refrigeración (87).
Un tipo de vacunas también comúnmente empleadas son las vacunas inactivadas. Estas
vacunas tienden a generar títulos altos de anticuerpos si bien desarrollan una pobre respuesta
celular y permiten una excreción mucho mayor del virus frente a desafíos (88, 89)
Debido a la dificultad impuesta a la vacunación a edades tempranas por la inmunidad maternal
preexistente, se han adaptado estrategias empleando la aplicación de vacunas vivas a edades
tempranas en conjunto con la utilización de vacunas inactivadas (90). La vacuna viva, se usa para generar inmunidad local, aplicándose conjuntamente vacunas
inactivadas generalmente en emulsión. La cubierta aceitosa, las hace menos susceptibles a
neutralización por los anticuerpos de la inmunidad materna permitiendo generar una respuesta
humoral propia (91,92) esta estrategia también se ha empleado con vacunas recombinantes de
HVT facilitando que este tipo de vacunas logre un arranque más rápido de la inmunidad que el
obtenido cuando se aplica la vacuna recombinante sola (90)
Uno de los problemas que enfrentan las vacunas es el alcanzar los niveles de inmunidad
adecuada luego de la vacunación. Esto puede verse dificultado en situaciones de campo donde
existe presencia de otras enfermedades que pueden tener efectos inmunosupresores tales como
Gumboro, bronquitis, laringotraqueítis o mycoplasma. Estas pueden dificultar la efectividad de la
inmunización lograda por las vacunas (93) Debido a las diferencias entre las cepas de campo virulentas que generan los brotes y las cepas
de vacuna, se han realizado una serie ensayos con el fin de lograr a través de genética reversa
cepas de baja virulencia a partir de cepas virulentas encontradas en los brotes (94, 95). Un grupo
de vacuna que este tipo consiste en cepas virulentas a las que se les modifica el sitio de corte
de la proteína F junto con otra serie de modificaciones para convertirlas en cepas no virulentas
(96)
16
Otras vacunas de este tipo, reemplazan Los genes que las proteínas F y HN de la cepa Lasota
con genes de F y HN de la cepa virulenta. En esta estrategia también se cambia el sitio de corte
de la proteína F para atenuar la virulencia de la cepa obtenida (97). Los estudios realizados con ese tipo de cepas señalan que ellas disminuyen significativamente
la excreción viral que las cepas de campo homólogas en los desafíos (89, 94) En un ensayo reciente (85), se comparó la vacuna tradicional Lasota con una vacuna lograda por
genética reversa homóloga a la cepa desafío. Los desafíos, se hicieron con dosis muy elevadas
del virus de campo simulando la vacunación de los animales con dosis subóptimas de vacuna
como en teoría es frecuente que suceda en las vacunaciones de campo.
Los resultados mostraron que la vacunación a dosis subóptimas, las aves vacunadas con Lasota
presentaron niveles importantes de mortalidad como los observados en brotes de campo;
mientras que las aves vacunadas con dosis subóptimas de vacuna homóloga manifestaron
mortalidad, pero de forma reducida y excretaron mucha menor cantidad de virus (85). Otras estrategias innovadoras que se están desarrollando recientemente, se apuntan al uso de
sistemas de vacunación basados en nanopartículas. Esto permitiría proteger mejor el antígeno
logrando una mayor captación de este y una liberación controlada generando así una respuesta
más duradera (98, 99).
1.7 Patología y patogénesis de las cepas muy virulentas
El estudio de las patologías manifestadas por cepas del genotipo VIId, fueron caracterizadas
primero en una cepa proveniente de Vietnam conocida como la cepa Long Bien. Esta cepa tiene
un índice de patogenicidad intracerebral calculado de 1,88 (100). Al inspeccionar aves descargadas con esta cepa, se observó que apenas a los dos días,
presentaban bazos moteados. Ya para el tercer día los Bazos estaban uniformemente
agrandados y presentaba un moteo blanco multifocal (necrosis) tanto en la superficie como nivel
del corte transversal.
Se observaron hemorragias en el timo y el Proventrículo y edema y hemorragias en las Tonsilas
cecales y foco Necróticos en el intestino Histología Las observaciones se hicieron al 2o y 3er día. Las lesiones principales se dieron en los órganos
linfoides timo, bursa, bazo y los agregados linfoides del intestino especialmente, las Tonsilas
cecales. Las lesiones mostraron necrosis severa, depleción marcada de linfocitos e infiltración
cuantiosa de macrófagos. Se observaron también necrosis multifocal es en el páncreas y la
médula ósea
17
Inmunohistoquímica Empleando un marcaje específico para el virus se observó positividad en 23 de los 25 tejidos
analizados las detecciones más fuertes se presentaron en los órganos linfoides y en los
componentes linfoides asociados a múltiples órganos. En estos órganos, las señales más fuertes provinieron principalmente de linfocitos y macrófagos
en el caso particular del bazo, las señales estuvieron confinadas a las áreas dependientes de
macrófagos mientras que las áreas dependientes de linfocitos no manifestaron ninguna señal. En otro estudio (101), se compara el comportamiento infectivo de cepas del genotipo VIId (ICPI
1,88), con cepas muy virulentas de los genotipos más antiguos IX y IV (ICPI 1,9 y 2). Al analizar
la carga viral a las 12, 24, 36 y 72 horas luego de la infección, se observaron en el bazo, el timo
y la bolsa de la cepa de genotipo VIId, un aumento fuerte de la carga viral iniciado a las 24 horas
(104 copias) el cual se incrementó sin detenerse hasta las 72 horas (106 o más copias). En
contraste en las otras dos cepas la carga viral comenzó a elevarse a las 72 horas. Acorde con esto, la lesiones en los órganos linfoides fueron marcadas e incluyeron
agrandamiento y necrosis severa del bazo (bazos grandes, moteados), hemorragia fuerte del
timo y atrofia de la bursa.
Muerte celular Muchos estudios indican la posibilidad de que procesos apoptóticos, podrían ser activados en
órganos linfoides de aves infectadas con cepas muy virulentas del virus de Newcastle (102, 103).
Estos procesos serían mucho más marcados y de arranque más temprano en las cepas
modernas más virulentas.
En un estudio donde se comparó cepas muy virulentas como la cepa Long Bien (VIId) y la cepa
CA/2002 (Vc) con cepas de virulencia intermedia y no virulentas, usando pruebas
inmunohistoquímicas de órganos linfoides. En estas, se emplearon anticuerpos específicos
contra la forma activa de la caspasa 3, una de las caspasas efectoras cuya activación marca el
inicio de procesos apoptóticos (104).
Los resultados mostraron una cantidad de células positivas para la actividad de la caspasa 3, era
mucho mayor en los órganos linfoides de las cepas muy virulentas. Se observó además en estos
órganos muchas células positivas para la actividad de caspasa 3 pero no positivas para la
presencia del virus. Indicando que mecanismos indirectos generados por la infección podrían
estar causando apoptosis.
18
Estudios in vitro, han mostrado que el virus de Newcastle, es capaz de inducir apoptosis en
fibroblastos, células mononucleares y linfocitos indicando también, la existencia de un
mecanismo directo de generación de apoptosis (105, 106, 107).
Estudios de expresión genética Recientemente se ha emprendido una serie de estudios destinados a comparar y analizar los
perfiles de expresión genética generados en el ave, por la infección con cepas muy virulentas
incluyendo ensayos in vitro, generalmente hechos con esplenocitos y ensayos in vivo (101,108).
Estos ensayos han sido efectuados con cepas del genotipo VIId y con la cepa CA/2002 de
genotipo Vc.
Un ensayo in vivo con la cepa CA/2002, mostró una fuerte respuesta transcripciónal a nivel del
bazo a las 24 y 48 horas luego de la infección (109). Esta respuesta mostró un marcadísimo
incremento en la expresión de los interferones α y γ, la sintasa inducible de óxido nítrico, IL-6,
IL1β, IL-18, IL-8 y la proteína inflamatoria de macrófago (IMP-3) entre otros genes, todos ellos
indicando una fuerte respuesta inflamatoria además de un incremento y los niveles de óxido
nítrico.
Las mediciones de óxido nítrico realizadas en los animales confirmaron lo observado en los
resultados de expresión genética respecto de su incremento.
Estudios adicionales hechos con cepas del genotipo VIId, algunos de ellos comparándola con
cepas virulentas de genotipos antiguos, mostraron igualmente una marcada elevación de la
expresión de interferones e interleuquinas muy similar al observado en el estudio anterior, de
arranque muy temprano principalmente en bazo, pero también en una menor magnitud en el timo
(101, 110).
Este patrón no fue observado a estas etapas tan tempranas en los otros genotipos de cepas muy
virulentas. Las vías preferencialmente expresadas entre las dos cepas virulentas fueron entre
otras las vías de respuesta inflamatoria y de muerte celular cuya expresión era mucho más
marcada en la cepa de genotipo VIId.
Todos los datos anteriores, muestran claramente que es bastante posible que, en muchas de las
manifestaciones patológicas propias de estas cepas muy virulentas del virus de Newcastle, tenga
un papel muy importante el sistema inmune del ave y su respuesta temprana a la infección
19
explicando probablemente también, la presencia de mortalidad aun en fases muy iniciales de la
enfermedad.
1.8 Variación genotípica del virus En años recientes, se ha propuesto una clasificación de las distintas cepas y aislados del virus
de Newcastle (111). Uno de los criterios centrales de este esquema de clasificación, es el nivel
de diferencia existente entre las secuencias nucleotídicas del gen de la proteína de fusión de las
distintas cepas y aislados del virus de Newcastle. De acuerdo este criterio, las cepas son
clasificadas como genotipos.
El otro criterio central que es complementario con el anterior, es que dos cepas del virus son
clasificadas como genotipos diferentes si las secuencias nucleotídicas correspondientes a los
genes de la proteína de fusión de las dos cepas es mayor o igual que el 10%.
Adicionalmente, dentro de este esquema de clasificación, cuando ésta diferencia es algo mayor
que lo usual entre dos cepas del mismo genotipo, estas pueden ser consideradas subgenotipos
distintos pertenecientes al mismo genotipo.
En un principio, esta categoría de subgenotipos fue asociada únicamente con los genotipos que
presentaban más alta diversidad entre sus cepas, es decir, los genotipos I, II, V, VI y VII.
Actualmente, se ha identificado la existencia de subgenotipos asociados a otros genotipos.
Así pues, en esta clasificación existen dos categorías; la categoría mayor que es genotipo en la
categoría subordinada que es subgenotipo. También se debe decir, que entre más subgenotipos
tenga un genotipo, mayor y más robusta debe ser considerada su variación genética.
Originalmente, cuando se propuso la clasificación en el año 2012, el estudio de secuencias
condujo a establecer la existencia de quince genotipos distintos identificados donde se
encontraban clasificados los aislados de Newcastle de las distintas partes del mundo.
Actualmente, el número de distintos genotipos del virus de Newcastle conocidos es de 18.
También ha aumentado el número de subgenotipos identificados en muchos de estos 18
genotipos.
20
Los genotipos I, II, III, IV y IX, formando un agrupamiento de los aislamientos más antiguos
identificados. Dentro del genotipo II, se encuentran cepas de vacuna incluyendo, a la cepa Lasota
y la cepa VGGA al igual que en el genotipo I que también contiene cepas de vacuna.
Los genotipos V, VI, VII y VIII, conforman el grupo de cepas nuevas. Estas son cepas que
comenzaron a aparecer en los sesentas y años subsiguientes. Dentro de estos genotipos, todos
los aislados identificados hasta el momento corresponden a cepas virulentas.
En el genotipo VI se encuentran los virus provenientes de palomas. En este grupo, el genotipo
destaca VII por ser el responsable de muchos de los brotes recientes de la enfermedad en
distintas partes del mundo.
Los genotipos X, XII, XIII XIV y XV, son un grupo de genotipos separados que constituyen un
grupo con orígenes geográficos y comportamiento epidemiológico distintos. Aquí se ubican virus
de distintas regiones del mundo como Pakistán, Rusia, África y China. El genotipo XV, llama la
atención porque sus cepas eran previamente clasificadas como subgenotipos del genotipo VII.
Quizás, esto sea indicativo de que eventualmente en algunos casos la distancia genética entre
subgenotipos puede crecer hasta convertirlos en genotipos distintos.
Más recientemente, se han identificado tres nuevos genotipos del virus de Newcastle. Los
genotipos XVII y XVIII encontrados en África y el genotipo XVI encontrado en República
Dominicana (112)
1.8.1 Genotipos identificados en Latinoamérica y Colombia En Latinoamérica, se ha identificado la presencia de cinco de los genotipos del virus de
Newcastle. En República Dominicana, un estudio, detectó hace poco la presencia de un nuevo
genotipo del virus de Newcastle identificado como el genotipo XVI (112).
En este estudio, se hace referencia a tres aislados de República Dominicana; un aislado del año
1986 en pollos, y otros dos aislados del 2008 también en pollos. En este estudio se incluye
también, un aislado de 1947 de Querétaro México.
El estudio concluye que las diferencias genéticas encontradas con respecto a las distintas
secuencias del virus, indican que estos aislados constituyen un genotipo distinto denominado
Genotipo XVI.
21
Al correrse homologías de secuencia la homología de secuencia en los aislados pertenecientes
a la República Dominicana, fluctúa entre el 99% y el 97%. La homología entre la secuencia de
Querétaro México y el aislado de 1986 de República Dominicana, es de 93%. La homología con
los otros dos aislados de República dominicana, es de 90%. El nivel de diferencia entre la cepa
más antigua y las cepas más recientes, parece crecer con el tiempo.
Al correr el nivel de homología con respecto a la cepa de vacuna Lasota, el aislado de 1947,
presenta una homología del 88%, mientras que el aislado de 1986, presenta una homología del
84,5%. Los aislados del 2008, presentan una homología del 83% con respecto a la vacuna
Lasota. Nuevamente, la diferencia parece crecer a medida que los aislados se hacen más
recientes.
Si se considerase a la cepa de Querétaro como no ancestral (esta guarda una homología de 93%
con cepas del genotipo VIII también), se podría también considerar que los aislados de este
genotipo, podrían haber evolucionado independientemente probablemente a partir de una cepa
proveniente de alguna especie de ave silvestre endémica de la isla. Éste representaría un caso
semejante al del genotipo XI que incluye únicamente cepas endémicas de Madagascar (113).
En Centroamérica, se encuentra ampliamente distribuido el genotipo V. El genotipo V, representa
un grupo diverso de virus. Actualmente se han identificado tres subgenotipos denominados a, b
y c (114). Un nuevo subgenotipo del genotipo V, denominado subgenotipo d, fue encontrado en
Uganda África (113)
Además de infectar lotes de pollos, las cepas del Genotipo V, parecen infectar con facilidad otras
especies de aves incluyendo pavos y psitácidos (113). En un estudio, realizado por Susta et al
(112), se emplea en las filogenias aislamientos del año 1976 de especies de psitácidos en
Argentina y México. También se reportan, aislados brasileños de los años 70, correspondientes
a este genotipo en la base de datos del GenBank.
Adicionalmente, este genotipo, también es responsable por los brotes recurrentes que afectan
las poblaciones de cormoranes en Norteamérica. Hace algún tiempo, el laboratorio envío a
secuenciar un fragmento de 711bp del extremo 5’ del genoma del aislado OR-CHIA, una de las
primeras cepas virulentas reportadas en Colombia. La homología de secuencia ubica este
aislado como una cepa perteneciente al genotipo V (Laboratorio Animed, resultados no
publicados).
22
Al parecer, el Genotipo V, ha hecho presencia en todo el continente incluyendo Colombia. Dado
su habilidad para infectar otras especies, es de esperar que puedan generarse brotes en distintas
partes con cepas de este genotipo y también, que siga variando.
En Suramérica, más concretamente en Argentina, se ha reportado una cepa del virus de
Newcastle en la colección de secuencias del GenBank, cuya homología de secuencia, la ubica
dentro del genotipo VIII. En el caso de Perú, se ha detectado la presencia del genotipo XII. Este
genotipo, guarda algo de similitud con los genotipos VI y VII (115)
El Genotipo XII, se había descrito con anterioridad únicamente en China. El aislado inicial
encontrado en Perú en el 2008, posee una homología de secuencia con la vacuna Lasota de
83%.
En una investigación posterior, se secuenció el genoma y se hizo caracterización patológica de
un aislado más reciente del año 2011. Este aislado fue obtenido de un criadero de pavos reales
en Lima (116). La secuencia de este aislamiento, presenta el nivel de homología de secuencia
más alto con el aislado anterior del 2008 (98,7%). Esto sugiere que el aislamiento del 2011,
proviene de infecciones con cepas que se originaron a partir del aislado del 2008.
El aislamiento del 2011, posee una homología de secuencia de 82% con la vacuna. Así pues,
nuevamente se observa en los aislamientos más recientes, una posible tendencia al incremento
en el nivel de diferencia con respecto a la vacuna y también, a diferenciase adicionalmente de
los aislamientos iniciales.
En Colombia y Venezuela, se ha detectado la presencia de aislados pertenecientes al genotipo
VII incluyendo la cepa empleada en este estudio. Este es el genotipo que más predomina en los
aislados recientes obtenidos a partir de brotes del virus sucedido en los diferentes continentes
(111).
Al igual que con las cepas de otros genotipos, las cepas del Genotipo VII, se encuentran
presentes en otras especies de aves. En el caso del subgenotipo VIId, uno de los más
frecuentemente aislados en brotes recientes en aves comerciales, se ha detectado también con
frecuencia su presencia en pavos, patos domésticos, gansos y otras especies silvestres de
anátidos (113).
23
En el caso de nuevos subgenotipos VIIg y VIIi descritos recientemente (117), se han obtenido´
aislamientos en una amplia gama de especies incluyendo pavos, canarios Halcones, búhos,
codornices, loros y faisanes (117)
En algunas partes de Asia estos dos nuevos subgenotipos, han desplazado a otros subgenotipos
más frecuentes como VIId (117). Estos subgenotipos, muestran, además un buen nivel de
diferenciación genética con respecto a los otros subgenotipos del genotipo VII. Las diferencias a
nivel de secuencia parecen generar una variación muy particular que introduce alteraciones en
el virus que aparte de conducir a hacerlo más agresivo y competitivo, también parecen restringir
y dificultar la capacidad de control de la infección por las vacunas usualmente empleadas (117)
En resumen, el virus de Newcastle muestra una tendencia sostenida a adquirir y generar mayor
variación sobre todo en los genotipos surgidos y detectados de forma más reciente. En esta
tendencia posiblemente contribuya también la habilidad que tienen muchos de los genotipos y
subgenotipos del virus, de adaptarse y llegar a replicarse en especies de aves adicionales lo
cual, también contribuye a su permanecía y persistencia.
En investigaciones recientes basadas en el estudio de las variaciones y diferencias en las
secuencias genómicas del virus de Newcastle y de sus proteínas, apoyan la existencia de una
tendencia sostenida en la variación y diferenciación del virus, sobre todo, a nivel de sus proteínas
de superficie como F y HN. Estas muestran también la existencia de procesos depuradores a
nivel de otras proteínas, posiblemente asociados a la presión vacunal (118, 119).
Otra conclusión interesante de estos estudios, es que las cepas que, por decirlo de alguna forma,
poseen el rasgo o propiedad de ser virulentas parecen tender a generar de forma sostenida
mayor variabilidad que las cepas no virulentas. (118, 119).
Variación antigénica entre el genotipo II y el genotipo VIId En estudios con paneles de anticuerpos monoclonales, se ha descubierto que existen diferencias
a nivel antigénico entre cepas del virus de Newcastle (120,121).
En un estudio realizado en Israel (121), empleando paneles de anticuerpos monoclonales,
dirigidos a las proteínas M, F y HN del virus de Newcastle, se exploraron las diferencias
antigénicas a nivel de epitopes reconocidos similares entre una cepa de vacuna del genotipo II
empleada en Israel y cepas de campo responsables de brotes en aves comerciales.
Este estudio mostró que había epitopes reconocidos en la cepa de vacuna de genotipo II que no
eran reconocidos en las cepas de campo. El número de epitopes no reconocido, variaba entre
24
las cepas de campo. En algunos casos, este número llegaba a ser de 18 epitopes implicando un
nivel de diferencia antigénica elevado.
Igualmente se estableció en este estudio que las diferencias de reconocimiento de epitopes entre
las cepas de campo y la cepa de vacuna se concentraba principalmente en las proteínas F y HN,
es decir, las proteínas de superficie del virus indicando la acción de procesos selectivos sobre
estas diferencias antigénicas.
En un estudio reciente publicado en 2017 (122), se efectuaron una serie de ensayos de
reactividad cruzada entre la vacuna de genotipo II, la cepa Lasota y un virus de Newcastle del
genotipo VIId, la cepa SG10. Estos ensayos se hicieron empleando sueros hiperinmunes para la
cepa SG10 y para la cepa Lasota.
Los títulos de inhibición cruzada mostrados por los sueros hiperinmunes fueron claramente más
altos para cepa homóloga que para la cepa heteróloga.
El suero hiperinmune específico para la cepa Lasota, mostraba un título de inhibición de la
hemaglutinación entre 2 y 3 veces menor para la cepa de genotipo VIId SG10, que para la cepa
Lasota misma. Así mismo, el suero Hiperinmune especificó para la cepa de genotipo VIId,
presentaba un título de inhibición de la hemaglutinación 3 veces menor para la cepa Lasota que
el título mostrado para sí misma.
Los ensayos que el virus-neutralización, mostraron un valor R de reactividad cruzada de 0,23, lo
cual indica que estas dos cepas se relacionan antigénicamente de forma distante.
En esta escala de valores, un Valor de R mayor a 0,7, indica que las dos muestras son
antigénicamente idénticas; si este Valor se ubica entre 0,7 y 0,33, indica que están
antigénicamente emparentadas; un Valor de R entre 0,32 y 0,11, indican una afiliación distante
antigénicamente hablando; Valor de R menores a 0,11, indican que se trata de dos serotipos
distintos (123).
Este estudio también analizó los títulos de anticuerpos presentes en suero que son necesarios
para neutralizar la excreción viral de la cepa de genotipo VIId SG10, en animales vacunados bien
sea con una cepa no virulenta del genotipo VIId aSG10, derivada de la cepa virulenta empleando
genética reversa (122) o vacunados con la cepa de genotipo II, Lasota.
Los títulos de anticuerpos de logaritmo distinto, fueron obtenidos ensayando distintas
concentraciones de la dosis de la vacuna aplicada. Los animales fueron luego desafiados bien
sea por vía de gota intranasal o por vía de inyección intramuscular.
25
Los resultados mostraron que los títulos necesarios para evitar la excreción viral en las vías de
desafío nasal/intramuscular, fueron para la vacuna homóloga (aSG10) de 5 Log2/7Log2 y para
la vacuna heteróloga (Lasota) de 7Log2/8Log2.
26
2. Metodología
2.1 Organismos empleados
2.1.1 Cepa del virus de Newcastle La cepa 0396-03, fue aislada a partir del macerado del pool de tejidos de tráquea pulmón y
encéfalo de un caso correspondiente a un brote del virus de Newcastle presentado en el
departamento de Cundinamarca en el año 2003.
En ese entonces, el filtrado de macerado de tejidos, fue inoculado en huevos embrionados SPF
y se colectó el líquido alantoideo del primer pasaje. Este era claramente positivo para el virus de
Newcastle por pruebas específicas de hemaglutinación, inhibición de la hemaglutinación y PCR.
El líquido alantoideo obtenido, fue alicuotado y conservado a -80°C.
Previo a la realización de los ensayos experimentales in vivo correspondientes a este trabajo, el
líquido alantoideo inicialmente colectado fue nuevamente refrescado inoculándolo nuevamente
en huevos embrionados SPF. Este fue colectado a partir del primer pasaje, siendo claramente
positivo para el virus de Newcastle por las pruebas antes descritas. El líquido alantoideo
obtenido, fue alicuotado y conservado a -80 °C.
Antes de los ensayos, se hizo el cálculo del índice de patogenicidad intracerebral de líquido
alantoideo de la cepa 0396-03, empleando pollitos de un día de edad nacidos a partir de huevos
SPF incubados. El índice de patogenicidad intracerebral calculado fue de 1,58.
Con el fin de obtener el título de dosis infectivas de líquido alantoideo de la cepa 0396-03, se
procedió a infectar con diluciones seriales del líquido alantoideo (10-1-10-6) grupos de cinco aves,
animales machos de la línea Hy-Line de origen comercial, de seis semanas de edad. A cada
dilución, le correspondía un grupo de cinco aves.
Mediante el empleo del esquema correspondiente al test de Reed & Muench (25), se determinó
que el líquido alantoideo de la cepa 0396-03, posee un título de dosis infectivas de 105,4/0,05 ml.
2.1.2 Aves empleadas en los ensayos Se emplearon siempre aves comerciales, animales machos de la línea de ponedoras livianas Hy-
Line para todos los ensayos in vivo realizados.
En las líneas de ponedoras como La Hy-Line, sólo son útiles para producción las hembras. Estas
son seleccionadas poco después de nacer los pollitos mientras que los machos nacidos son
descartados. Por lo tanto, los machos son fácilmente obtenibles para propósitos de ensayos.
Adicionalmente al ser aves de constitución liviana, estas no tienden a desarrollar problemas de
ascitis con la altura, lo cual las hace ideales para ensayos en sitios como Bogotá.
27
2.2 Locación y mantenimiento de las aves Las aves fueron creadas y posteriormente mantenidas durante el transcurso de los ensayos en
las unidades de ensayos in vivo del laboratorio Animed, ubicado en la ciudad de Bogotá.
Las dos unidades para ensayos in vivo, cuentan con sistemas de suministro de aire filtrado de
categoría 100 y presión positiva. Estas están dotadas con cabinas fabricadas con
especificaciones para la cría y mantenimiento de aves durante la realización de ensayos
experimentales.
Estas cabinas proveen calefacción con regulación de la temperatura, ventilación, bebederos de
agua, depósitos para suministro del alimento y facilidad para lavado y disposición de desechos.
Previo a la realización de ensayos, estas eran extensivamente desinfectadas y se les hacía
control microbiológico de esterilidad.
Las aves empleadas en los ensayos, eran recibidas al día de edad y se les realizaba test de
Cervantes para constatar la calidad física y microbiológica de los animales recibidos. También
se efectuaba muestreo de órganos a partir de los pollitos (tráquea, pulmón, encéfalo, bolsa de
Fabricio y Tonsila cecal). A partir de estas muestras se efectuaban pruebas de PCR para
Newcastle, Gumboro y Bronquitis infecciosa, para verificar que las aves recibidas estuviesen
negativas para estos agentes. Estas mismas pruebas, fueron corridas cuando las aves tenían 3
semanas de edad (21 días), previo al inicio de los ensayos.
Las aves tuvieron un período inicial de crecimiento hasta las 3 semanas de edad previo a iniciar
los ensayos con el fin de evitar la interferencia de la inmunidad maternal en los ensayos. Durante
el período inicial de crecimiento y en el transcurso de la realización de los ensayos, las aves
fueron mantenidas en las cabinas suministrándoseles agua para beber y comida de forma
constante.
Con el fin de mantener condiciones de higiene y evitar la acumulación de amoniaco, cada tres
días las aves eran retiradas y se limpiaba cuidadosamente las cabinas de heces y otros
desechos. Esta rutina se realizó siempre tanto durante el periodo inicial de crecimiento, como
durante la realización de los ensayos experimentales.
2.3 Vacunación y aplicación de desafíos
Como parte integral del propósito del trabajo y del diseño de los ensayos, en muchos de los
tratamientos las aves eran vacunadas. La vacunación se realizó empleándose siempre vacuna
viva del virus de Newcastle de la cepa Lasota liofilizada.
Siguiendo las instrucciones del fabricante, la vacuna liofilizada era primero resuspendida en un
volumen inicial de aproximadamente 2 mls del diluyente y posteriormente dispensada y
homogenizada en un volumen final de 60 mls.
La vacunación fue efectuada aplicando a cada ave 30 μl de la vacuna diluida por vía óculo-nasal
siguiendo las instrucciones del fabricante (Merial). En todos los ensayos, las aves fueron
28
vacunadas a las 3 semanas (21 días) de edad, luego de completarse el período inicial de
crecimiento.
Según los registros del ICA del tiempo en que los ensayos in vivo fueron realizados, la vacuna
garantiza un título de al menos 106,0 dosis infectivas embrionarias por cada dosis aplicada.
Coincidiendo con esto, como parte de un estudio realizado en el ICA de evaluación el nivel de
protección frente a la cepa de campo OR Chía del virus de Newcastle alcanzado por las vacunas
vivas de la cepa Lasota comercialmente disponibles en Colombia (124), se determinó el número
de dosis infectivas embrionarias 50% por mililitro, empleando huevos SPF embrionados.
Los títulos obtenidos para las distintas vacunas comerciales de la cepa Lasota oscilaron entre
107,1 y 108,3 DIE/ml, con un título promedio de 107,6 DIE/ml. Al igual que en el presente trabajo,
las aves fueron vacunadas aplicando 30 μl que la vacuna diluida por vía óculo-nasal.
Si la dosis de vacuna aplicada por dosis de 30 μl fuese de 106,0 dosis infectivas embrionarias, la
vacuna empleada tendría un título semejante al valor promedio reportado en el estudio de
vacunas comerciales vivas disponibles tipo Lasota, de 107,5 DIE/ml aproximadamente. Cabe
señalar que el rango de dosis suministradas a los animales empleando las vacunas comerciales
disponibles, generó una protección muy eficiente de las aves frente al desafío, según el estudio.
En cuanto a los inóculos infectivos, estos se preparaban a partir de alícuotas de líquido alantoideo
de la cepa de desafío NDV0396-03, las diluciones correspondientes a los distintos niveles de
dosis infectivas ensayadas, se prepararon empleando caldo Triptosa-Fosfato para realizar las
diluciones del líquido alantoideo.
Estas se prepararon de modo que las dosis requeridas correspondiesen a un volumen de 30 μl.
Para cada nueva tanda de inoculación, se empleaba siempre una alícuota de líquido alantoideo
fresca. Los 30 μl correspondientes a la dosis, eran igualmente aplicados por vía óculo-nasal.
2.4 Ensayos in vivo Poco después de la llegada a las unidades, las aves fueron distribuidas de forma azarosa en las
cabinas. Previamente, a cada cabina se le había asignado un tratamiento particular. Los
tratamientos de la prueba piloto y los tratamientos 5 y 2 de la Fase 2, tenían una réplica, mientras
que el resto de tratamientos ensayados, dos réplicas. Cada réplica, contaba con 25 aves.
Las aves de los tratamientos 1 (control negativo) y 2 (control de vacuna), que no eran desafiados
con cepa de campo, fueron mantenidos en cabinas de la unidad 1. Los otros tratamientos que sí
sufrían desafío con cepa de campo, fueron mantenidos en las cabinas de la unidad 2.
Con el fin de identificar las aves de cada tratamiento, se les colocaban brazaletes de color
distinto. Los brazaletes poseían, además, un número que permitía individualizar cada ave. En
aquellos tratamientos con dos réplicas, a cada réplica le correspondía un rango de números
distinto permitiendo así distinguir las aves de cada réplica.
En la gráfica 2-1, se puede observar un bosquejo general del flujo de procedimientos seguido
durante los distintos tratamientos realizados. En este esquema, también se distinguen los
29
diferentes períodos de ensayos realizados: la prueba piloto, los tratamientos de la fase 1 y 2 y el
Postensayo.
Figura 2-1. Diagrama del flujo de procedimientos seguidos en los distintos tratamientos
trabajados durante la fase de ensayos. Se pueden observar los distintos períodos de ensayo.
30
2.5 Tratamientos ensayados Previo a los tratamientos formalmente ensayados, Se hizo un ensayo piloto con el fin de hacer
una exploración inicial del efecto de emplear un régimen de infección con dosis bajas que además
incluía reinfecciones.
Como lo muestra la tabla 2-1, se emplearon tres grupos de aves: un grupo control negativo, un
grupo control positivo, pero en el que se usa la aplicación de una dosis infectiva baja en aves no
protegidas (no vacunadas) y, por último, un grupo con aves vacunadas sometido a reinfecciones
periódicas con dosis bajas.
También como lo muestra la tabla, el ensayo fue terminado cuando las aves tenían una edad de
5 semanas – 4 días de edad.
Tabla 2-1. Esquema que describe las características y procedimientos usados en la prueba piloto.
Los tratamientos formales ensayados, fueron distribuidos en dos fases. La tabla 2.2 muestra que
se ensayaron en la fase 1 los siguientes tratamientos:
Tratamiento 1: Este corresponde al control negativo del ensayo. Las aves no fueron ni vacunadas
ni desafiadas de forma que fuesen completamente negativas a Newcastle. Este tratamiento,
contó con dos réplicas.
31
Tratamiento 3: corresponde al control positivo del ensayo. Estas son aves no protegidas (no
vacunadas) a las cuales se les inocula con una dosis estándar de 10.000 dosis infectivas de la
cepa de campo virulenta NDV 039-03 a la edad de 4-2. Este tratamiento contó con dos réplicas
Tratamiento 5: Este es el tratamiento con reinfecciones a dosis elevadas. Las aves primero son
vacunadas a las 3 semanas. Posteriormente, a la edad de 4-2 se les administra una dosis inicial
equivalente a 10.000 dosis infectivas del virus de campo NDV 0396-03. Esta es seguida por 3
reinfecciones adicionales de 10.000 dosis infectivas, aplicadas a las edades 4 semanas - 5 días,
5 semanas – 1 día y 5 semanas – 4 días Este tratamiento contó con dos réplicas.
Tabla 2-2. Esquema que describe las características de los tratamientos y procedimientos
usados en los ensayos de la fase 1.
Como lo muestra la tabla 2-3, en la fase 2 los tratamientos ensayados fueron los siguientes:
Tratamiento 2: Este es el control de vacuna en el cual, las aves son vacunadas a las 3 semanas
de edad. En este tratamiento, no se administraron dosis del virus de campo. Este tratamiento
contó con una réplica. Al final del ensayo a las 6 semanas de edad, las aves restantes no fueron
sacrificadas. En vez, estas fueron empleadas en el Postensayo.
Tratamiento 4: en este ensayo, se inocula las aves con una dosis única de nivel moderado del
virus de la cepa de campo NDV 0396-03. En este, las aves fueron vacunadas a las tres semanas
de edad y luego a la edad de 4 semanas - 2 días, se les administró una única dosis de virus de
campo equivalente a 150-200 dosis infectivas. Este tratamiento contó con dos réplicas.
Tratamiento 5: En este ensayo se aplica una dosis inicial de nivel moderado y otras tres
reinfecciones del mismo nivel. Las aves fueron vacunadas a las 3 semanas de edad. Luego de
lo cual, se les administró una dosis inicial de virus de campo equivalente a 150-200 dosis
32
infectivas. Posteriormente, se les administraron 3 dosis equivalentes a las edades de 4semanas
– 5 días, 5 semanas – 1 día y 5 semanas – 4 días. Este tratamiento contó con una réplica.
Tratamiento 6: Este es el ensayo en el que se aplica una dosis inicial y dosis posteriores de
reinfecciones de nivel muy bajo. Las aves fueron en principio vacunadas a las 3 semanas de
edad. Posteriormente, se les administró una primera dosis del virus de campo NDV 0396-03 a la
edad de 4 semanas – 2 días equivalente a 1,5-2 dosis infectivas. Luego de esto, se les
administraron tres dosis adicionales equivalentes a las edades de 4 semanas – 5 días, 5 semanas
– 1 día y 5 semanas – 4 días. Este tratamiento contó con dos réplicas.
Al final del ensayo a las 6 semanas de edad, las aves restantes no fueron sacrificadas. En vez,
estas fueron empleadas en el Postensayo.
Tabla 2-3. Esquema que describe las características de los tratamientos y procedimientos
usados en los ensayos de la fase 2.
Como una extensión de los ensayos de la fase 2, se decidió realizar un Postensayo adicional con
las aves sobrantes a las 6 semanas de edad de los tratamientos, 2 y 6 de la fase 2. El propósito
de este ensayo fue observar el efecto de incrementar la frecuencia de las reinfecciones, cuando
la dosis infectiva aplicada, era de nivel muy bajo dado que el efecto de dosis de este nivel
33
aplicadas de forma espaciada, había tenido un efecto más bien incipiente. En la tabla 2-4, se
describe un esquema del Postensayo.
En este Postensayo, las aves fueron inoculadas diariamente. Cada día, se aplicaban a las aves
2 dosis equivalentes a 1,5-2 dosis infectivas; la primera se aplicaba en la mañana y la segunda
en la tarde-noche
Este régimen, se suministró a las aves entre las 6 semanas – 1 día de edad y 7 semanas – 2
días de edad. Las aves se sacrificaron a la edad de 7 semanas – 5 días de edad.
Se hizo necropsia de las aves y se anotaron las observaciones de signos clínicos y lesiones
macroscópicas. También, se tomaron muestras para molecular. No se realizó toma de medidas
morfométricas.
Tabla 2-4. Esquema que describe las características y procedimientos usados en el Postensayo.
2.6 Procedimiento de toma de muestras, registros y medidas durante los tratamientos Los registros, las medidas morfométricas y la toma de muestras, se hicieron a la edad de 3
semanas previo a la aplicación de la vacuna; en la edad de 4 semanas – 2 días previo a la
aplicación de la dosis inicial de virus de campo NDV 0396-03 y también, poco antes del
procedimiento de aplicación de las reinfecciones con virus de campo efectuadas a las edades de
4 semanas – 5 días, 5 semanas -1 día, 5 semanas – 4 días. Ya en. Un último muestreo se realizó
al final de los ensayos a la edad de seis semanas.
En este procedimiento, los animales primero eran pesados. Se registraba también el peso del
alimento para medir su consumo.
Posteriormente, se procedía escoger cuatro animales de cada tratamiento procurando incluir
aquellas aves en las que se veían signos claros de enfermedad o decaimiento. Estos animales
34
eran sacrificados por el método de electrocución y se cortaba la yugular de cada uno de los
animales para ayudar eliminar la sangre de las aves sacrificadas previo a la necropsia.
los tratamientos eran trabajados de a uno por vez. El grupo de 4 aves correspondiente a cada
una de las réplicas de un tratamiento, eran trabajados por separado. Luego de acabar las aves
correspondientes a las réplicas de un tratamiento, se proseguía con el siguiente tratamiento de
forma sucesiva hasta acabar todos los tratamientos. Las necropsias se iniciaban siempre con los
tratamientos en la unidad 1 donde se ubicaban las aves no sometidas a desafío con virus de
campo y posteriormente se hacia el procesamiento de las aves en la unidad 2, donde se ubicaban
las aves de los tratamientos con aves desafiadas.
Al inicio del procedimiento el interior de las aves de un grupo era abierto y se retiraban la bursa
y el bazo correspondiente a cada uno de los animales. Se procedía entonces a tomar las medidas
de diámetro y peso de estos órganos. Estos datos eran entonces registrados forma individual
identificándolos bajo el número del brazalete perteneciente a cada una de las aves sacrificadas.
Posterior a esto, se procedía a describir y registrar en el grupo de aves sacrificadas de cada
réplica, los signos clínicos y las lesiones macroscópicas presentes en distintos órganos
asociados al sistema inmune, el sistema respiratorio, el encéfalo y también el registro de otras
manifestaciones surgidas que pudieren haber sido notadas.
Estos datos de signos clínicos y lesiones macroscópicas, no fueron anotados de forma individual;
en vez, estos fueron anotados de forma colectiva para el grupo de aves de la réplica. Cada signo
o lesión, era registrado como la cantidad de aves del total muestreado que manifestaba dicho
signo o lesión.
Durante los procesos de necropsia realizados, se procedía a tomar muestras de hisopos Cloacal
y traqueal a cada grupo de aves. El pool de hisopos de cada grupo era colocado en tubos
conteniendo aproximadamente 3 mls de solución salina isotónica. Igualmente, se hacía muestreo
de tejidos para ser empleados posteriormente en los procedimientos de biología molecular. Estas
muestras eran colectadas en bolsas para muestreo por separado.
Los muestreos colectados, incluían hisopos de tráquea y cloaca al igual que muestras de tejidos
que comprendían encéfalo, pool de tráquea-pulmón, pool de bazo-timo y bursa.
35
Los muestreos eran pooles de las muestras del conjunto de animales sacrificados para cada
réplica de cada tratamiento de cada uno de los órganos o mezclas de órganos anteriormente
descritas. Estos incluían también, los pooles de los hisopos de tráquea y de cloaca. Los tubos
conteniendo pooles de hisopos y las bolsas conteniendo el conjunto de órganos y pooles de
órganos pertenecientes a cada grupo de aves, eran rotuladas indicando tratamiento /réplica y
luego eran almacenadas a -80°C hasta el momento de su procesamiento.
Ya con posterioridad, los registros de las medidas de peso corporal y de los pesos y tamaños de
la bursa y el bazo, eran empleados para obtener las medidas derivadas de índice bursal y la
relación de tamaños de bursa/bazo correspondiente a cada uno los animales en cada replica y
tratamiento.
En el caso de la prueba piloto, se hizo solo anotacion ocasional de lesiones y signos y solo se
tomó muestreos para molecular al final del ensayo (5 semanas – 4 días de edad). El muestreo
realizado no incluyó toma de hisopos de tráquea y cloaca. Aparte de esto, se tomaron algunas
fotos de signos clínicos observados en aves del muestreo final. No se hizo toma de medidas
morfométricas, ni registro detallado de signos clínicos y lesiones macroscópicas durante o al final
del ensayo.
En el caso del Postensayo, solo se hizo necropsia al final del ensayo a la edad de 7 semanas –
5 días. Se anotaron algunas observaciones de signos clínicos y lesiones macroscópicas y se
tomaron muestreos para molecular de órganos e hisopos de tráquea y cloaca. Durante el
procedimiento efectuado, no se realizó toma medidas morfométricas.
2.7 Metodología Biología Molecular 2.7.1 Preprocesamiento de las muestras Se manejaron básicamente tres tipos de muestra para procesamiento por las técnicas de biología
molecular. Pool de hisopo de tráquea, de hisopo de cloaca y tejidos colectados. Para tener una
muestra de mejor calidad con poca cantidad de material genético de pollo y otros distintos al del
virus y para minimizar la coextracción de inhibidores de PCR que pudieran afectar las medidas
de valores de Ct, fue necesario realizar procesamientos específicos, previo a realizar la
extracción de RNA para cada tipo de muestra.
36
El procesamiento previo de la muestra de hisopo de tráquea, consistió básicamente en descartar
los hisopos. Para esto, el tubo conteniendo el pool de hisopos de tráquea correspondiente a las
muestras de un tratamiento, era agitado con vortex vigorosamente por alrededor de un minuto
luego de lo cual, se procedía a retirar cuidadosamente los hisopos escurriendo los contra las
paredes del tubo para luego desecharlos.
En el caso de la muestra de hisopo de cloaca, el tubo conteniendo el pool de hisopos
correspondientes a las muestras de un tratamiento era agitado con vortex vigorosamente por
alrededor de un minuto luego de lo cual, los hisopos eran retirados, escurriéndolos contra los
bordes antes de descartarlos.
Posteriormente, las muestras se volvían a agitar con vortex brevemente y se tomaban 4 alícuotas
de la suspensión líquida de heces. Dos de estas alícuotas, se guardaban como muestra respaldo
y las otras dos se centrifugaban a 4000 rpm a 4 °C durante 12 minutos.
Luego de centrifugadas las alícuotas, se retiraba él sobrenadante a tubos nuevos. La extracción
de RNA se realizaba entonces, a partir de este líquido limpio de detritos de heces minimizando
así, el peligro de coextracción de inhibidores de PCR.
En el caso de las muestras de tejidos de distintos tipos muestreadas durante los ensayos, eran
inicialmente maceradas en un mortero de forma intensa y con abundante arena sin líquido con
el fin de maximizar la ruptura y homogenización del tejido.
Posteriormente, se añadía una cantidad suficiente mas no exagerada de caldo triptosa fosfato.
Luego de volver a homogenizar bien la muestra, ésta se dispensaba en tubos para centrífuga de
15 ml.
La muestra de tejido, se agitaba con vortex intensamente por alrededor de un minuto.
posteriormente, estas eran puestas a centrifugar a 4000 rpm por 12 minutos. Se tomaban con
cuidado dos alícuotas de sobrenadante del macerado de tejido centrifugado. Este centrifugado
libre de detritos de tejido era la muestra de partida usada en extracciones de RNA. Se tomaban
siempre dos alícuotas de sobrenadante.
Luego de esto, el macerado en los tubos de 15 ml era sacudido fuertemente hasta volver a quedar
homogenizado y se procedía a tomar dos alícuotas para guardarlas como muestras de respaldo,
junto con una alícuota del sobrenadante a -80°C. el resto del macerado, era descartado.
37
2.7.2 Extracción de RNA Los procedimientos de extracción, se realizaron usando el kit RNAeasy de Qiagen. Se
introdujeron algunas variaciones luego descritas, al protocolo indicado por el fabricante tanto en
las extracciones de muestras de hisopo, como las extracciones de muestra de tejido.
Las extracciones de RNA de muestras de líquido alantoideo, se realizaron empleando alícuotas
de 200 µl. Estas extracciones se realizaron siguiendo el protocolo descrito por el fabricante del
Kit.
Extracción de RNA de hisopos El procedimiento empleado para la extracción de RNA de hisopos se hacía a partir de un volumen
de 350 µl. Se añadían 200 µl de Buffer de lisis del kit RLT y 20 µl de Proteinasa K. las muestras
se incubaban a 45º C por 15 minutos.
Se centrifugaba a 14.000 rpm por 1 minuto y se tomaba el sobrenadante a un tubo nuevo; se
añadían 600 µl más de buffer RLT y 1,25 µl de RNA carrier (Qiagen) y luego se mezclaban con
vortex.
Se añadían 600 µl de etanol y se mezclaban. Posteriormente, se seguía el protocolo de ligaje del
RNA a columna y lavados indicados en el manual por el fabricante.
Extracción de RNA de tejidos
El procedimiento empleado para la extracción de RNA de tejidos se hacía a partir de un volumen
de 250 µl de líquido del centrifugado. Se añadían 125 µl de Buffer de lisis del kit RLT y 20 µl de
Proteinasa K. las muestras se incubaban a 45º C por 15 minutos.
Se centrifugaba a 14.000 rpm por 1 minuto y se tomaba el sobrenadante a un tubo nuevo; se
añadían 600 µl más de buffer RLT y luego se mezclaba con vortex.
Se añadían 400 µl de etanol y se mezclaba. Posteriormente, se seguía el protocolo de ligaje de
RNA a columna, lavados y elución indicados en el manual por el fabricante.
De cada muestra, se realizaron siempre dos extracciones. El volumen final de cada
extracción de RNA, era de 50 µl .
38
2.7.3 Secuenciación del fragmento del extremo 5’ del genoma de 0396-03
Con el fin de obtener la secuencia del extremo 5’ del genoma de la cepa de campo 0396-03, se
realizó en principio una extracción del RNA de líquido alantoideo de huevos embrionados
inoculados con el aislado de esta cepa.
Las reacciones de PCR convencional para la obtención de fragmentos amplificados de la región
5’ del genoma a partir de la extracción de RNA de líquido alantoideo, se hicieron empleando el
Kit de One-step RT-PCR AgPath de Ambion y cebadores diseñados para la amplificación de
fragmentos de distinto tamaño de esta región. Los nombres y las secuencias de los cebadores
diseñados para este procedimiento, aparecen enlistadas en la tabla 3-8, en la sección de
resultados de bilogía molecular (Página 78). Las reacciones de PCR se corrieron en un
termociclador de PCR convencional de Biorad.
Tabla 2-5. Descripción de los productos de PCR convencional para secuenciación del extremo
5’ del genoma de NDV0396-03. Se muestran los cebadores empleados, la talla de los productos
y su localización en el fragmento total secuenciado.
Localización fragmento Cebador Forward Cebador Reverse Tamaño fragmento
1-711 FWNC1-17/1 RVNC711/1 711 pares de bases
1-485 FWNC1-17/1 RVNC444-468/2 468 pares de bases
485-711 FWNC446-464 RVNC711/1 265 pares de bases
Los productos de PCR obtenidos correspondían básicamente a tres fragmentos: el fragmento
total de 711 pares de bases y dos fragmentos de tamaño medio de 468 y 265 pares de bases
respectivamente. Estos fueron corridos en electroforesis de gel de agarosa. Una vez terminada
la electroforesis, los geles eran colocados en el transiluminador UV para identificar y corroborar
las bandas de los productos correspondientes.
Las bandas correspondientes a los distintos productos de PCR, fueron cortadas del gel. El DNA
de las bandas de los amplificados contenidos en los trozos de geles cortados, fue extraído
empleando el kit Qiaquick Gel Extraction Kit de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante.
39
Posteriormente, las extracciones de los productos de PCR, fueron enviadas junto con alícuotas
de los cebadores correspondientes a cada producto a MACROGEN donde se realizaron las
reacciones de secuenciación de los productos.
A partir de las secuencias traslapantes de los distintos fragmentos amplificados enviados a
secuenciar, se obtuvo una secuencia depurada única correspondiente a un fragmento del
extremo 5’ del genoma de la cepa.
2.7.4 Diseño de cebadores y sondas Los cebadores y sondas empleados en este estudio, fueron diseñados empleando el programa
en línea para diseño de oligonucleótidos Primer3. El análisis de autodímeros y heterodímeros y
el cálculo del Tm teórico de los cebadores y sondas evaluados en el diseño de las pruebas de
PCR, se hizo empleando la suite de programas en línea para análisis de oligonucleótidos de IDT,
OligoAnalyzer.
2.7.5 PCR en tiempo real Las pruebas de PCR en tiempo real para la obtención de los valores de Ct a partir de las
extracciones de RNA de las muestras de los distintos ensayos, fueron realizadas utilizando el kit
AgPath de Ambion, siguiendo las instrucciones del fabricante. El volumen final de reacción
empleado fue de 25 µl.
Tabla 2-6. Condiciones de reacción de la prueba de PCR en tiempo real de doble sonda del
extremo 5’ del gen L. Se observan las condiciones de volumen y concentración de reactivos por
reacción de PCR.
Reactivos/ Concentración Stock Volumen Añadido por Reacción de PCR
Concentración final por Reacción
Agua 3,3 µl -
Master Mix 2X 12,5 µl 1X
Cebador Forward: 15 picamoles/ µl 1,0 µl 15 picamoles/ reacción
Cebador Reverse: 15 picamoles/ µl 1,0 µl 15 picamoles/ reacción
Sonda Forward: 5 picamoles/ µl 0,6 µl 3 picamoles/ reacción
Sonda Reverse: 5 picamoles/ µl 0,6 µl 3 picamoles/ reacción
Muestra RNA 5,0 µl -
Mix Enzimas 25X 1,0 µl 1X
Volumen Final/Reacción 25,0 µl
40
En estas pruebas, se emplearon las dos sondas y los cebadores de la prueba de doble sonda
para el gen L de NDV diseñada para este estudio. Las secuencias de las sondas y cebadores
diseñados, aparecen en la tabla 3-9 de resultados en la sección de biología molecular (página
81). Las pruebas fueron corridas en un termociclador de PCR en tiempo real SmarCycler II de
Cepheid. Las condiciones de tiempo temperatura empleadas, se muestran en la figura 2-2.
Figura 2-2. Condiciones de temperatura empleadas en la prueba de PCR en tiempo real del gen
L. Se describen Las temperaturas y los tiempos en cada una de las fases de la reacción.
2.8 Análisis de las medidas morfométricas
2.8.1 Análisis de caso y estudio de medidas Para entender el comportamiento de las medidas morfométricas, se utilizaron dos tipos de
aproximaciones. La primera aproximación, consistió en observar y analizar el conjunto de
medidas morfométricas correspondientes a tratamientos y edades específicos.
Durante este procedimiento se intentó en las instancias particulares analizadas, observar el
comportamiento de medidas morfométricas primarias como peso de la bursa o tamaño del bazo,
41
así como el de las medidas derivadas de índice bursal y relación de tamaños de bursa/bazo ya
preestablecidas.
2.9 Análisis estadístico En el análisis inicial de las medidas morfométricas, se emplearon procedimientos de estadísticas
descriptivas. Estos procedimientos estadísticos fueron hechos usando tanto el software R como
el software SPSS.
Las pruebas de significancia estadística de comparación entre tratamientos de las medidas
morfométricas, se hicieron empleando el software SPSS.
2.9.1 Estadística descriptiva Para el análisis de las medidas morfométricas, se emplearon gráficos de diagramas de caja
basados en la mediana y la distribución del rango de datos.
2.9.2 Pruebas de significancia estadística
La significancia de las diferencias en los valores de índice Bursal y de peso del bazo de los
distintos tratamientos ensayados se analizaron empleando tres pruebas estadísticas distintas. Se empleó el Anova como prueba paramétrica y se emplearon la prueba de Kruskal-Wallis y la
prueba de la mediana como pruebas no paramétricas.
Las pruebas se emplearon para el análisis de los tratamientos analizando cada edad por
separado.
42
3. Resultados
3.1 Descripción de lesiones macroscópicas observadas
3.1.1 Fase I
Tratamiento 1 En este tratamiento las aves no recibieron dosis alguna del virus de Newcastle. A estos animales no se les
suministró dosis de vacuna de la cepa Lasota; igualmente, tampoco se les aplicaron dosis de la cepa de
campo virulenta NDV 0396-03 empleada en este estudio para los desafíos. Por consiguiente, estas aves
no fueron ni vacunadas ni desafiadas. Este grupo de animales corresponde al control negativo del ensayo.
Los grupos de aves pertenecientes a las dos réplicas de este tratamiento, fueron mantenidas en las
cabinas de la unidad 1, separados de los grupos de aves desafiadas que fueron mantenidos en la unidad
2.
En este, al igual que en el resto de tratamientos ensayados, se realizaron los muestreos para biología
molecular, el registro de lesiones y signos clínicos y la toma de las medidas morfométricas a las 3 semanas
de edad, 4 semanas, 5 días de edad, 5 semanas 1 día de edad, 5 semanas 4 días de edad y el muestreo
final de terminación del ensayo a las 6 semanas de edad tal como estaba programado (ver metodología).
Los resultados de lesiones y signos clínicos reportados para este tratamiento, aparecen descritos en las
tablas del anexo 1. De acuerdo a estos registros, no se encontraron lesiones o signos clínicos ni a nivel
del timo ni de la bolsa de Fabricio las bolsas siempre conservaron un tamaño entre 2 y 3 veces el tamaño
del bazo (Figura 3-1), es decir, una proporción entre 2:1 y 3:1.
En cuanto al bazo, en todas las muestras individuales recolectadas durante los muestreos no se reportó
la presencia de lesiones o signos clínicos a nivel de este órgano, a excepción de una única ave de la
réplica 2 en el muestreo correspondiente a las 5 semanas, 1 día de edad. Esta ave, se reportó con bazo
aumentado de tamaño. Es necesario, sin embargo, tener en cuenta también los resultados de medidas
morfométricas (ver resultados de morfometría).
No se reportó la presencia de lesiones o signos clínicos en los órganos (laringe, tráquea y pulmón) del
sistema respiratorio en ninguna de las muestras individuales recolectadas durante la serie de muestreos.
Únicamente, se reportó presencia ocasional de moco. De igual forma, tampoco se reportaron lesiones ni
signos clínicos a nivel del encéfalo (Figura 3-2).
Sin embargo, en las aves de este tratamiento hubo reporte de forma consistente de presencia de
reactividad en las tonsilas cecales en las distintas muestras individuales recolectadas a lo largo de los
muestreos. Este signo, estaba también acompañado ocasionalmente, de reactividad del tejido rectal. La
reactividad observada, puede tener distintos orígenes y su causa no fue especificada del todo con claridad
(ver discusión de resultados).
43
Figura 3-1: Bazos y bolsas de Fabricio de aves del control negativo a las 5 semanas, 1 día de
edad. Se observa una apariencia y tamaño de los órganos normal. Las bolsas exhiben una
apariencia sin signos. Figura 3-2: Pulmón, tráquea-laringe y encéfalo de aves del Tratamiento 1 a las 5 semanas, 1 día
de edad. Se observan órganos de apariencia normal sin signos. En el borde del pulmón, se
observa un coagulo debido quizás al procedimiento de necropsia Tratamiento 3 En este tratamiento las aves no reciben la dosis de vacuna habitual a la 3ª semana de edad ni
en ningún otro momento. Al alcanzar la edad cuatro semanas, dos días estas aves sin vacunar,
reciben una dosis única equivalente a 10.000 dosis infectivas (dosis de desafío estándar) de la
cepa de campo NDV 0396-03. Este grupo de aves sin vacunar desafiadas con una dosis elevada
del virus de campo virulento, constituye el control positivo de los ensayos in vivo. Este tratamiento
contó con 2 réplicas
44
Figura 3-3: Estado de las aves del Tratamiento 3 a las 5 semanas,1 día de edad. Los animales
se ven en mal estado general con debilidad y postración. Figura 3-4: Bolsas de Fabricio y bazos de las aves del tratamiento 3 a la edad de 5 semanas, 1
día. Las bolsas muestran un tamaño equivalente al del bazo. Están reducidas y atróficas. Abajo,
se muestra una foto de aves infectadas con la cepa Gainesville del virus de Gumboro y un control
no infectado como referencia comparativa
45
Figura 3-5 Timo de un ave del tratamiento 3 a la edad de 5 semanas, 1 día (foto superior). Como
referencia comparativa, en la parte de abajo se observa una foto de la comparación de ave con
timo atrofiado y timo normal. El timo del ave del grupo control positivo aparece claramente
atrofiado y con hemorragias.
Figura 3-6: Tonsilas cecales e intestino grueso de un ave del Tratamiento 3 a la edad de 5
semanas, 1 día. Las tonsilas cecales, muestran o una elevada reactividad o necrosis. El tejido
rectal muestra una elevada reactividad al igual que el resto del intestino grueso.
46
Figura 3-7: Placas de Peyer de aves del tratamiento 3 a la edad de 5 semanas, 1 día. La Placa
del lado izquierdo, se observa necrótica, mientras que las dos placas restantes aparecen
reactivas. En las tablas del anexo1, aparece el registro de las lesiones y signos clínicos hallados en el grupo
control positivo en la serie de muestreos llevados a cabo a lo largo de las distintas edades. Los
resultados muestran desarrollo y presencia de lesiones severas a nivel de todos los órganos en
los sistemas muestreados.
Las lesiones y signos también reflejan un cuadro más agudo de arranque muy temprano en
comparación con otros tratamientos, sobre todo, en órganos del sistema inmune principalmente
a nivel del bazo. Los signos y lesiones subsiguientes, muestran que este cuadro inicial
desemboca de forma aguda en el deterioro y atrofia marcada del timo y de la bolsa de Fabricio.
Se observa también efectos muy marcados en el bazo al igual que en otros componentes del
sistema inmune periférico como las tonsilas cecales, el tejido rectal (muchas veces generalizado
a todo el intestino grueso) y las placas de Peyer.
Los signos iniciales a la edad de 4 semanas, 5 días, 3 días posinfección, incluyen necrosis
multifocal del bazo. En los animales de la réplica 2, se menciona que los bazos lucen de igual
tamaño que las bolsas de Fabricio implicando un aumento de proporción del bazo frente a la
bolsa. Esta apreciación inicial, es corroborada de forma inequívoca por los resultados
morfométricos (ver más adelante).
Se reportaron también animales con disminución de tamaño del timo y de la bolsa de Fabricio,
así como presencia de hemorragia a nivel de las bolsas de Fabricio. En otros órganos del sistema
inmune periférico se observa desde este primer muestreo, reactividad clara en las tonsilas
cecales y el tejido rectal de todos los animales.
47
En los dos muestreos subsiguientes a las 5 semanas, 1 día de edad y a las 5 semanas, 4 días
de edad (6 y 9 días pos infección respectivamente), se reporta en todos los animales
muestreados, atrofia total de la bolsa de Fabricio y del timo. En la figura 3-5 se puede veren la
foto inferior derecha, la constitución y el aspecto del timo del ave control normal, en el cual los
lóbulos que componen el timo son robustos y bien definidos.
En contraste, se observa que en el timo del animal del grupo control positivo de 5 semanas, 1
día de edad y en el timo del animal de referencia infectado con virus de anemia aviar, estos
lóbulos, prácticamente han desaparecido dejando solo tejido conectivo. El animal del control
positivo muestra, además, signos de hemorragia en dicho órgano.
En la figura 3-5, se observa en la foto inferior el aspecto de las bolsas de Fabricio y su proporción
con el bazo en un patrón de aves normales comparado con aves inoculadas con la cepa
Gainesville del virus de Gumboro que aquí sirve como referencia comparativa (124).
En la foto superior, en las bolsas de animales de 5 semanas, 1 día de edad del grupo control
positivo, se observa claramente que estas se encuentran muy reducidas, con un tamaño
equivalente o incluso algo inferior al de los bazos, asemejándose a las bolsas del patrón de aves
infectadas con el virus de Gumboro. Esto es adicionalmente corroborado por los datos
morfométricos. A su vez, las bolsas abiertas, muestran folias depletadas y adelgazadas, con
perdida marcada en su volumen y también en número. Los signos reportados incluyen también,
presencia de hemorragia en las bolsas de Fabricio de algunos animales.
En este tratamiento, se describe igualmente alteraciones en el tamaño del bazo. En cuanto al
resto de órganos del sistema inmune periférico, las tonsilas cecales, el tejido rectal y las placas
de Peyer aumentaron su reactividad llegando en muchos casos observarse necrosis clara en
dichos órganos. Hacia el final, el nivel de reactividad pareció disminuir, quizás, debido al daño
extensivo causado al tejido linfoide en estos órganos.
En la figura 3-6, se puede observar en un ave del grupo control positivo de 5 semanas, 1 día de
edad, que existe una alta reactividad general que abarca el recto, el intestino grueso y las tonsilas
cecales, en las cuales se describe necrosis. En la figura 3-7, las palcas de Peyer de animales del
control positivo se ven enrojecidas y reactivas al igual que el tejido circundante del íleo. La placa
observada en la primera ave de izquierda a derecha aparece necrótica. Como es de esperarse hubo lesiones y signos en el tracto respiratorio, aunque más que nada
estos se presentaron a nivel sobre todo del tracto respiratorio superior (laringe y tráquea). La
presencia de laringitis fue reportada desde el primer muestreo a la edad de 4 semanas, 5 días
hasta el último muestreo de este grupo a las 5 semanas, 4 días de edad (3 a 9 días posinfección).
También se reportó traqueítis en las aves de los dos primeros muestreos a las 4 semanas, 5 días
y 5 semanas, 1 día de edad y un ave con tapón traqueal en el último muestreo.
En el caso del encéfalo se reportó congestión del órgano. Apenas hubo congestión en un animal
del muestreo inicial a las 4 semanas, 5 días de edad. En los dos muestreos subsiguientes a las
48
5 semanas, 1 día y 5 semanas, 4 días de edad, se registró congestión en aproximadamente la
mitad de los animales muestreados. Un signo característico de este tratamiento fue la presencia de hemorragia en el proventrículo.
Esta fue observada en todos los animales hasta la mitad del ensayo. En los muestreos
posteriores solo algunos animales lo manifestaron.
Hubo, por último, dos signos característicos en este tratamiento. El primer signo, fue una pérdida
de peso acentuada de los animales. Esta pérdida, no era aún evidente en el muestreo a las 4
semanas, 5 días de edad, 3 días luego de la infección; pero para los muestreos subsiguientes,
este signo se hizo presente en todas las aves muestreadas llegando a presentarse una pérdida
de peso considerable en estos animales.
El otro signo característico de este tratamiento, luego de efectuada la infección de los animales,
fue la muerte. Entre los 3 y 5 días posinfección, luego del primer muestreo, habían muerto 4
animales. Entre los días 6 y 7 días posinfección murieron 7 animales en total. Para el día 8, previo
al último muestreo efectuado a los 9 días posinfección, murieron otros 4 animales. Para el último
muestreo a las 5 semanas, 4 días de edad, 9 días posinfección, quedaban solo 5 aves. Estas
fueron sacrificadas como parte de este último muestreo luego del cual, la población de aves del
grupo control positivo había desaparecido completamente.
Tratamiento 5 Fase 1
En este tratamiento los animales son inicialmente vacunados a las 3 semanas de edad.
Posteriormente, a las 4 semanas, 2 días de edad, se les aplica una dosis inicial de virus de campo
virulento equivalente a 10.000 dosis infectivas aplicándose luego, cada que pasan tres días, una
dosis similar hasta completar cuatro dosis aplicadas en total. Los signos y lesiones en este tratamiento se limitan en cuanto al sistema inmune a la bolsa de
Fabricio y a órganos del sistema inmune periférico como las tonsilas cecales y el tejido rectal. En el caso de la bolsa de Fabricio los signos que se describen son principalmente edema y
ocasionalmente hemorragia. La cantidad de animales con edema se incrementa más en los
muestreos finales realizados a las 5 semanas, 4 días y 6 semanas de edad.
En todos los muestreos, las tonsilas cecales aparecen reactivas en prácticamente todas las aves,
el tejido rectal se hace reactivo luego de la infección con virus de campo, y el número de aves
con reactividad incrementa hacia el último muestreo. En el último muestreo a las 6 semanas de
edad, donde los otros signos se han incrementado, aparece un ave con esplenomegalia. En cuanto al sistema respiratorio nuevamente los signos se incrementaron en los muestreos
finales donde aparecieron también, aves con encéfalo congestionado. Llama la atención que se vean signos clínicos manifiestos en este tratamiento, ya que los niveles
alcanzados de virus se mantienen bajos. (Ver más adelante)
49
Se debe considerar entonces que las lesiones también son al menos en algunos casos,
producidas por la acción del sistema inmune quizás debido a las dosificaciones repetitivas. Si
bien la respuesta inmune detiene el avance del virus también parece contribuir a generar signos. Sin embargo, también se debe señalar que en este tratamiento los niveles virales se incrementan
hacia los dos últimos muestreos (ver más adelante), contribuyendo también a la mayor aparición
de signos. Figura 3-8: Bolsas de Fabricio de aves del Tratamiento 5 Fase 1 a la edad de 5 semanas, 4 días,
9 días posinfección (30.000 dosis acumuladas). Yendo de izquierda a derecha, la primera Bolsa
de Fabricio en el extremo izquierdo y la última al extremo derecho, se observan edematosas; la
bolsa en el segundo lugar, se observa hemorrágica, mientras que la tercera bolsa presenta una
apariencia normal.
Figura 3-9: Tonsila cecal e intestino grueso de un ave del Tratamiento 5 Fase 1 a la edad de 5
semanas, 4 días. Tanto las tonsilas cecales, como el tejido rectal, se encuentran claramente
reactivos
50
3.1.2 Fase 2 Tratamiento 4 Figura 3-10: Timo de un ave del Tratamiento 4 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día. El timo se observa con disminución de volumen y tamaño de los lóbulos.
Figura 3-11: Bazo de un Ave del Tratamiento 4 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día. Se observan múltiples puntos blancos compatibles con necrosis multifocal. También se observa una lesión a nivel superficial.
51
Figura 3-12. Bolsas de Fabricio de Aves del Tratamiento 4 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1
día. Se pueden ver las parejas muestreadas de bolsas de Fabricio/bazo. De izquierda a derecha,
se ve que la primera y última parejas, presentan bolsas de Fabricio disminuidas de tamaño
mostrando relación 1:1 con los bazos. Igualmente, desde la segunda pareja se observa bazos
agrandados con respecto a las bolsas, siendo más evidente en la segunda y última parejas. En
la parte inferior las bolsas abiertas muestran congestión.
Figura 3-13. Tonsila cecal e intestino grueso de aves del Tratamiento 4 Fase 2 a la edad de 5
semanas, 1 día. Tanto las tonsilas cecales, como el tejido rectal, se encuentran claramente
reactivos. En la segunda ave de izquierda a derecha, se observa una reactividad que se extiende
hacia el íleo. En esta ave también tanto el intestino como el íleo, aparecen ensanchados y los
ciegos se observan más distendidos.
52
En el tratamiento 4 de la fase 2, las aves previamente vacunadas son inoculadas con una dosis
única de nivel moderado- bajo.
En este tratamiento, las aves son vacunadas inicialmente a las 3 semanas de edad.
Posteriormente a las 4 semanas, 2 días de edad, se les aplica a las aves una única dosis de virus
de campo, equivalente a 150 – 200 dosis infectivas. Como se puede observar en las tablas correspondientes del Anexo I, en este tratamiento se
observa una cantidad importante de signos en el bazo. Principalmente, en los muestreos
correspondientes a las 5 semanas 1 día y 5 semanas, 4 días de edad (6 y 9 días posinfección).
Se observa al igual que en el tratamiento 3, necrosis multifocal del bazo en una de las aves de 5
semanas 1 día de edad. Se observa también esplenomegalia y bazos que no parecen guardar
una relación 1:2 con las bolsas de Fabricio, como se puede ver en la figura 3-12. Así mismo, las bolsas de Fabricio aparecen del tamaño disminuido y congestionadas como se
puede constatar en la figura 3-12. Es frecuente que las bolsas de Fabricio presenten edemas.
Por otra parte, también se reporta timos de tamaño disminuido. A lo largo de todos los muestreos a partir de los 6 días posinfección, correspondiente al muestreo
efectuado a las 5 semanas, 1 día de edad, Las tonsilas cecales y el tejido rectal, se muestran
reactivos. También, en muchos de los animales las tonsilas cecales aparecen necróticas.
Igualmente, las placas de Peyer se presentan activas en algunos animales. Se observa en los últimos muestreos algunas aves con encéfalos congestionados. Los signos en
órganos respiratorios se encuentran presentes a lo largo de todos los muestreos, aunque no de
forma ubicua. Las aves en los últimos muestreos de este tratamiento presentaron peritonitis, al igual que
episodios de diarrea. Estos signos solo fueron observados en este tratamiento y en el
postratamiento. Este signo podría deberse a una infección asociada por bacterias, aunque no se
puede descartar que sea debido al virus o a la acción conjunta de ambos tipos de agentes.
Tratamiento 5 Fase 2 En el tratamiento 5 de la fase 2, las aves previamente vacunadas son infectadas de manera
repetitiva con dosis moderadas a bajos del virus de campo. En este tratamiento las aves son inicialmente vacunadas a las 3 semanas de edad.
Posteriormente, a las 4 semanas, 2 días de edad, las aves son inoculadas con una dosis
moderada de virus de campo, equivalente a 150-200 dosis infectivas luego de lo cual, se aplica
una dosis similar cada 3 días hasta completar 4 dosis en total.
53
En este tratamiento los signos consistentes en órganos como la bolsa de Fabricio, el timo y el
bazo solo se observan en el muestreo correspondiente a las 5 semanas, 1 día de edad, 6 días
posinfección. También se observan algunos en el muestreo de 5 semanas, 4 días de edad.
Se observa disminución del tamaño del timo, bolsas de Fabricio edematosas y heterogeneidad
en el tamaño de las bolsas. También aparece esplenomegalia en dos de los animales. En cuanto a los otros órganos periféricos del sistema inmune se observa reactividad en las
tonsilas cecales y en algunos casos necrosis sobre todo en los dos últimos muestreos. También
se observa reactividad de las tonsilas en el muestreo pos vacunación.
Como se puede observar en las tablas del anexo 1, los signos respiratorios en este tratamiento
se presentaron en el muestreo luego de la vacunación, previo al inicio de infecciones donde los
4 animales muestreados presentaron laringitis. Esto sería concordante con una reacción debida
a la vacuna.
En los muestreos subsiguientes, estos signos se presentaron en la mitad de las aves
muestreadas. El signo más usual, fue laringitis, aunque también se observó traqueítis y contenido
mucoso en unas pocas aves Solo se reportó un ave en todos los muestreos con signos de
encéfalo congestionado 9 días posinfección luego de haberse aplicado 400-600 dosis del virus
de campo. No se observaron otros signos adicionales.
Figura 3-14. Timo de un ave del Tratamiento 5 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día. En esta
ave, se observa disminución en el tamaño de los lóbulos del timo.
54
Figura 3-15. Bolsas de Fabricio de Aves del Tratamiento 5 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1
día 3 días luego de la 1a reinfección. Se pueden ver las parejas muestreadas Bolsa de
Fabricio/Bazo. Mirando de izquierda a derecha, la 1a bolsa en el extremo izquierdo, se ve
reducida de tamaño con relación de tamaño menor a 1:1 con el bazo, el cual a su vez luce muy
agrandado. La 3a bolsa también, luce algo disminuida y su bazo algo aumentado. La 2a bolsa
aparece notoriamente grande en comparación con las otras. En la parte inferior, las bolsas
abiertas muestran congestión.
Figura 3-16: Tonsila cecal e intestino grueso de aves del Tratamiento 5 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día. En esta ave, se observa reactividad a nivel de las tonsilas y del tejido rectal.
55
Tratamiento 6 En este tratamiento las aves vacunadas son sometidas a infecciones repetitivas con dosis
infectivas, muy bajas de virus de campo virulento. Inicialmente las aves son vacunadas al cumplir 3 semanas de edad. Posteriormente a las 4
semanas, 2 días de edad, se les aplica a las aves una dosis de virus de campo equivalente a
loas 1,5 -2 dosis infectivas. Luego de esto, las aves son inoculadas cada 3 días con una dosis
similar hasta completar cuatro dosis aplicadas. En el muestreo posvacunación previo a los desafíos, se reportó congestión en la bolsa de una
de las aves muestreadas. En los muestreos realizados a las edades de cinco semanas, 1 día y
cinco semanas, 4 días se reportan algunas aves con edema en la bolsa de Fabricio. También,
se observó disminución en el tamaño del timo en un par de animales. Se reportó esplenomegalia en un par de aves del muestreo posvacunación y en otra ave
muestreada a la edad de 5 semanas, 1 día, 3 días luego de la primera reinfección. Los signos en otros órganos del sistema inmune periférico, muestran la presencia de reactividad
en las tonsilas cecales durante todos los muestreos incluyendo el muestreo posvacunación
previo a los desafíos. En los últimos muestreos a las edades de 5 semanas 1 día y 5 semanas 4
días, se reportan 2 animales que presentan necrosis en las tonsilas. Los signos en los órganos del sistema respiratorio observados fueron laringitis y traqueítis, los
cuales si bien se presentan a lo largo de todos los muestreos son mucho más marcados en el
muestreo posvacunación inicial y en el muestreo correspondiente a la edad de 5 semanas 1 día,
coincidiendo con el aumento de niveles virales (ver más adelante). Adicionalmente, se observó
congestión del encéfalo en 2 animales con congestión del encéfalo en este muestreo y 1 animal
en el correspondiente a la edad de 5 semanas, 4 días.
Figura 3-17: Tonsila cecal e intestino grueso de aves del Tratamiento 6 Fase 2 a la edad de 5
semanas, 1 día, 3 días luego de la 1a reinfección. De izquierda a derecha, en la 1a muestra se
observa reactividad apreciable solo en el tejido rectal mientras que, en la 2a se observa mayor
reactividad en las tonsilas.
56
Figura 3-18: Encéfalo de un ave del Tratamiento 6 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día, 3 días
luego de la 1a reinfección. Se describieron algunas aves con encéfalo congestionado. Figura 3-19: Tráquea de un ave del Tratamiento 6 Fase 2 a la edad de 5 semanas, 1 día 3 días
luego de la 1a reinfección. Se observan petequias multifocales en la tráquea y la laringe de esta
ave.
57
3.1.3 Postratamiento
Como ya se mencionó antes, en el postratamiento se incluyeron algunas aves del tratamiento 2
es decir aves vacunadas no desafiadas y las aves restantes del tratamiento 6 réplicas 1 Y 2.
Todos los animales tenían una edad de 6-2 al momento de iniciar el postratamiento.
A las aves se les suministraba dos dosis diarias equivalentes a 1,5-2 dosis infectivas; una de las
dosis era suministrada en la mañana y la otra hacia el final de la tarde.
Este régimen de dosis fue suministrado hasta la edad de 7-2 y las aves fueron sacrificadas y se
efectuó la necropsia respectiva a la edad de 7-5 (un solo muestreo).
Tratamiento 2
En el sistema linfoide central, la bolsa de Fabricio se reportó disminuida de tamaño en 3 de las 4
aves muestreadas y hemorrágica en una de estas. Adicionalmente, el bazo presenta igual
tamaño que las bolsas (relación de tamaño 1:1), en 3 de los 4 animales. El timo aparecía
disminuido de tamaño en 1 de las 4 aves.
En otros componentes del sistema linfoide periférico, se observó reactividad en la Tonsila cecal
en todos los animales muestreados, así como reactividad en la cloaca en 1 de las 4 aves y placa
de Peyer activa en 1 de estos 4 animales.
En cuanto al sistema respiratorio, se presentó laringitis en 2 de 4 animales muestreados y tráquea
con contenido mucoso abundante en todos los animales.
El encéfalo se mostró congestionado en 2 de los 4 animales. Adicionalmente, 2 de las 4 aves presentaron peritonitis.
58
Tratamiento 6 Replica 1 En los órganos del sistema linfoide central, las bolsas de Fabricio mostraron tamaños
desuniformes y en 2 de los 4 animales muestreados esta presentó una disminución del tamaño
significativa y una relación de tamaño 1:1 con el bazo. En todos los animales las bolsas de
Fabricio aparecían edematosas y en 1 de los 4 animales, la bolsa aparecía hemorrágica. El timo,
mostró disminución de tamaño en 2 de los 4 animales.
En cuanto a componentes el sistema linfoide periférico se observó reactividad en la Tonsila cecal
en 3 de los 4 animales muestreados. 1 de las 4 aves, mostró necrosis en las tonsilas cecales. Se
registró peritonitis en 2 de los 4 animales muestreados.
En el sistema respiratorio, 2 de los 4 animales muestreados presentaron laringitis y hubo
presencia de contenido mucoso abundante en todos los animales.
Como síntomas adicionales, se observó un animal con el proventrículo ligeramente hemorrágico.
No se detectaron lesiones ni problemas a nivel del encéfalo.
Figura 3-20: Comparación de los pares bazo-bolsa de Fabricio de dos aves del postratamiento
de 7 semanas, 5 días de edad. Al comparar las bolsas de Fabricio, se observa que la bolsa de
Fabricio de la derecha, presenta una disminución en tamaño y volumen importante. Esta luce
achatada y hundida, mostrando una proporción de tamaño 1:1 con el bazo. Igualmente, se ven
muchos vasos sanguíneos superficiales marcados indicando congestión. Ambos bazos, lucen
grandes, con una relación de tamaño menor a 1:2 con respecto a la bolsa de la izquierda. Las
muestras pertenecen a la réplica 1 del tratamiento 6.
59
Replica 2 En el sistema linfoide central, se observaron bolsas de Fabricio disminuidas de tamaño (relación
1:1 con el bazo) en 2 de los 4 animales muestreados. En tres de estos animales la bolsa aparecía
edematosa.
Se observó timo de tamaño disminuido en 2 de los 4 animales. Se reportó también
esplenomegalia en uno de los animales muestreados. Igualmente, se reportaron dos animales
con peritonitis.
En el caso del sistema respiratorio, 2 de los 4 animales muestreados, presentaron
laringotraqueítis. Igualmente, hubo presencia contenido mucoso abundante en 3 de los 4
animales.
2 de los 4 animales presentaron encéfalo congestionado. En el procedimiento de necropsia no
se hizo inspección de tonsilas cecales y placas de Peyer a los animales.
60
3.2 Medidas morfométricas
3.2.1 Esquema de medidas morfométricas El esquema de medidas morfométricas empleado en este trabajo es similar al esquema que se
emplea en ensayos in vivo donde se hace desafío con agentes inmunosupresores tales como el
virus de la enfermedad de Gumboro.
En este tipo de esquema aparte de las medidas morfométricas generales, se hace énfasis en
medidas específicas de órganos del sistema inmune principalmente, la bolsa de Fabricio y el
bazo. Dentro de dicho esquema se incluyen también relaciones las cuales son derivadas a partir
de los valores de las mediciones tomadas para los parámetros primarios.
Los agentes inmunosupresores como el virus de la enfermedad de Gumboro, tienden a alterar
los valores registrados para las medidas morfométricas de los órganos inmunes como la bursa y
el bazo, así como los de los valores de las relaciones entre éstos.
3.2.2 Mediciones efectuadas Parámetros morfométricos primarios Las mediciones primarias tomadas a los animales muestreados durante los ensayos incluyeron
edad del ave, peso del ave, tamaño de la bolsa de Fabricio, peso de la bolsa de Fabricio, tamaño
del bazo y peso del bazo. Estas medidas fueron registradas aparte para cada tratamiento y para
cada edad específica.
Mediciones de relación Las mediciones de relación, son derivadas a partir de los valores de los parámetros primarios.
Inicialmente, se incluyeron dos medidas derivadas; el índice bursal y la relación entre el tamaño
de la bolsa de Fabricio y el tamaño del bazo.
Índice bursal El índice bursal es una medición de que proporción representa el peso de la bolsa de Fabricio
del peso total del ave. La fórmula del índice bursal es:
Peso de la bolsa X1000 Peso total del ave
61
En el caso del índice bursal, los valores bajos se presentarían cuando el animal sigue creciendo
mas no así su bursa la cual probablemente o bien haya detenido su crecimiento o haya perdido
algo del peso ganado.
Por consiguiente, la presencia de índices bursales de valor bajo indica que se debe considerar
que está ocurriendo un proceso que conduce a una detención del crecimiento bursal y/o al
deterioro y pérdida del tejido bursal y de las poblaciones de linfocitos presentes en la bursa lo
cual, a su vez estaría asociado con fenómenos de inmunosupresión.
Entre más bajos sean los valores registrados para el índice bursal en los animales en un
muestreo, se podría considerar más grave el proceso de inmunosupresión e inmunodepleción
que está experimentando la población de animales.
Muchas veces también, la presencia de valores muy elevados de la bolsa podría ser indicio de
algún tipo de problemas. Por ejemplo, si un valor elevado del índice bursal está acompañado de
un incremento fuerte en el tamaño de la bolsa, se podría pensar que el órgano pudiese estar
experimentando un proceso inflamatorio.
Se debe tener cierta precaución en sacar conclusiones basándose únicamente en el índice
bursal. Las dos mediciones en las que se basa el índice bursal, el peso del ave y el peso de la
bursa, poseen una variación importante que debe ser tenida en cuenta al momento de sacar
conclusiones.
Relación de Tamaño de Bursa/Tamaño de Bazo Generalmente al comparar visualmente la bursa y el bazo en animales normales, se observa que
el tamaño de la bursa es claramente mayor que el tamaño del bazo. Usualmente, el bazo da la
impresión visual de tener un tamaño que oscila alrededor de algo más de un tercio y la mitad del
tamaño de la bursa. El índice matemático medido, es igual a: diámetro de la bursa/diámetro del
bazo. Se toman los diámetros del eje más largo de los órganos para este propósito.
Cuando cualitativamente, la bursa guarda una relación menor de 2:1 en tamaño con el bazo o su
tamaño es igual o algo menor al tamaño del bazo (relación 1:1). Esto puede ser un indicativo de
que o bien la bolsa ha estado presentando procesos de disminución de su masa y tamaño o bien
que el bazo ha sufrido un proceso importante de incremento de su masa y volumen o que ambos
procesos pueden haber estado sucediendo. Estos son signos clínicos de alteración patológica
de dichos órganos y de la función del sistema inmune.
62
En cuanto a su forma, la bursa tiene una apariencia más esférica pero achatada mientras que el
bazo, posee una forma algo más ovoide.
3.2.3 Comportamiento de las mediciones morfométricas Peso corporal
En la Figura 3-2 se muestra cómo se comportó el peso corporal de las aves empleadas en los
ensayos a través de las distintas edades. Se observó una variabilidad del peso corporal
relativamente constante y un crecimiento sostenido.
Las cajas en las edades consecutivas 4-2, 4-5 y 5-1 lucen discretamente separadas ubicándose
cada una en un rango de pesos propio el cual es superior al de la edad anterior. Los bigotes, sin
embargo, muestran que existe un traslape en los rangos de peso de los animales entre estas
distintas edades.
Figura 3-21: Peso corporal vs edad. En este gráfico, se describe el comportamiento del peso
corporal para cada edad, del conjunto de aves empleadas en los tratamientos. En la edad de 5
semanas, 1 día (5-1), se observa la mediana sesgada hacia la parte inferior de la caja. A las 5
semanas, 1 día y 5 semanas, 4 días de edad, se observan pesos corporales muy bajos
representados por los puntos en la parte inferior debajo de las cajas. Estos corresponden a aves
del tratamiento 3, el grupo control positivo. Estas aves en vez de ganar peso, presentaron una
pérdida considerable del peso corporal ganado.
63
Esta separación discreta y creciente de las cajas indica una tasa de crecimiento sostenida de los
animales en este rango de edades. En comparación, las cajas de las edades 5-1 y 5-4, parecen
mostrar un cierto grado de traslape. Esto indicaría tal vez, una ligera desaceleración de la tasa
de crecimiento.
En las edades 5-1 y 5-4, se observan puntos en la parte inferior de las cajas que representan
aves con muy bajo peso las cuales pertenecen al tratamiento 3 o control positivo. En este
tratamiento, las aves mostraron una caída del peso muy importante. En la edad 5-1, la mediana
se ubica hacia la parte inferior de la caja lo que posiblemente mostraría que aparte de las aves
del tratamiento 3, hubo una disminución en el crecimiento de animales en otros tratamientos.
Índice Bursal En la figura 3-22 se observa el comportamiento de los valores del índice bursal en los distintos
tratamientos observándose los cambios experimentados a través de las distintas edades.
Cómo se puede observar en el gráfico, la mayoría de las mediciones del índice bursal realizadas
durante los muestreos en las distintas edades se mantiene oscilando en un rango de valores
entre 6,25-6,5 y 3,8 con un valor medio de 5.
Este es el rango en el que caen la gran mayoría de valores de índice bursal registrados durante
todos los ensayos y por tanto, podría considerarse, quizás con pocas excepciones como el rango
de valores asociado animales en una condición normal.
Figura 3-22: Comportamiento del Índice Bursal para cada uno de los tratamientos al transcurrir la edad.
64
En la edad 4-2, la mayoría de las medianas de los distintos tratamientos se ubicar alrededor del
valor medio de 5; sin embargo, las cajas que representan los distintos tratamientos muestran
algunas cajas con poca extensión y otras con una extensión mayor.
Esto habla de diferencias importantes en el nivel de variabilidad entre los tratamientos a esta
edad. También hablan de que previo al desafío, las aves presentaban una variación
relativamente considerable en el índice bursal.
En la edad 4semanas, 5 días (4-5), todas las cajas correspondientes a los distintos tratamientos
se ubican dentro del rango de valores normales antes mencionado. Los valores medios de la
mayoría tratamientos siguen ubicándose alrededor del Valor de 5.
En comparación con la edad 4 semanas, 2 días (4-2), la extensión de la mayoría de las cajas
luce más moderada presentándose por tanto una disminución de la variabilidad y mayor
estabilidad del Valor del índice bursal. Se presenta un valor de alrededor de 3 en el grupo control
positivo, el tratamiento 3.
En la edad de 5 semanas, 1 día (5-1), mientras que el comportamiento de muchos de los
tratamientos permanece relativamente estable, otros tratamientos muestran cambios en su
comportamiento.
En el tratamiento 3, los valores de índice bursal sufren una caída drástica y sus valores se ubican
en un rango estrecho de valores bajos entre 1,6 y 2,6.
En el tratamiento 4, se observa también una caída importante de los valores de índice bursal.
Muchos de los datos, se ubican abajo del límite inferior del rango de valores más frecuente o
normal. La caja luce más extendida y estirada hacia abajo y la mediana tiene un valor cercano a
3,75 es decir, el límite inferior del rango frecuente. El bigote inferior muestra que hay valores
extremos en el rango del control positivo.
En el tratamiento 5 fase 2, el comportamiento de las mediciones también sufre un cambio notable,
aunque menor que el de los tratamientos 3 y 4. En la edad anterior de 4 semanas,2 días (4-2),
65
la caja que representa el tratamiento 5, posee una extensión muy reducida y la mediana se ubica
casi sobre el valor medio de 5.
En comparación, la caja de este mismo tratamiento a la edad de 5-1, aumenta considerablemente
su extensión y se estira hacia abajo sobrepasando el valor inferior de 3,75 del rango de valores
más frecuente. La mediana del tratamiento, se ubica prácticamente sobre este Valor inferior
manifestando por tanto una caída en el valor del índice bursal.
En la edad de 5 semanas, 4días (5-4), el índice bursal de los animales del tratamiento 3,
permanece en un rango estrecho de valores muy bajos, incluso, aún más bajo al observado en
la edad 5-1 entre 0,9 y 2.
En el caso el tratamiento 4, la variación del rango de valores aumenta. La caja que representa el
tratamiento se estira adicionalmente hacia arriba y la media aumenta su valor ubicándose
aproximadamente en un valor de 4,2. Sin embargo, persiste la presencia de animales con valores
de índice bursal bajos en esta edad.
Peso del Bazo La figura 3-23 permite analizar como fue el comportamiento del peso del bazo para cada uno de
los tratamientos en cada una de las respectivas edades de muestreo permitiendo describir, qué
cambios experimentó este parámetro y las tendencias que mostraron los diferentes tratamientos.
En la edad 4 semanas, 2 días, previa al desafío, se observó una ligera diferencia entre los
tratamientos 1, 3 y 5 de la fase 1 y los tratamientos 2, 4, 5 y 6 de la fase 2. Las cajas que
representan los tratamientos de la fase 1, se encuentran ligeramente más abajo con un valor de
la mediana algo por encima de 0,5. Las cajas que representan los tratamientos de la fase 2,
muestran una mediana un poco por encima de 0,75.
La variabilidad mostrada por los tratamientos de la fase 2 es también mayor en esta edad. Las
cajas que representan los tratamientos 2 y 4, presentan una extensión algo más grande y el
tratamiento 4, muestra un valor elevado atípico.
66
Las cajas que representan tratamientos 5 y 6 se ven compactadas, con una Extensión muy
reducida. Sin embargo, la caja del tratamiento 5, muestra un Valor atípico alrededor de 1 y la
caja del tratamiento 6 presenta tres valores atípicos. Uno de ellos alrededor de 1,2.
Figura 3-23: Comportamiento del peso del bazo para cada uno de los tratamientos al transcurrir
la edad.
En resumen, los tratamientos de la fase 1 muestran un comportamiento más homogéneo y un
rango de pesos del bazo algo menor. En comparación, el rango de peso del bazo en los
tratamientos de la fase 2, se mostró algo más elevado. El comportamiento de los valores de peso
del bazo, tuvo mayor variación en la fase 2 que en la fase 1.
En la edad de 4semanas, 5 días (4-5), el comportamiento del peso del bazo del tratamiento 3
experimentó un cambio dramático. Su mediana pasó de tener un valor de alrededor de 0,5, a
tener un valor de alrededor de 1,75. La extensión de la caja que representa este tratamiento
aumentó significativamente llegando abarcar valores por encima de 2.
En cuanto a los otros tratamientos, el tratamiento 4 presenta un rango de pesos de bazo y una
mediana un poco mayor que 1, mostrando valores algo más elevados que los otros tratamientos.
67
El resto de tratamientos se ve que los de la fase 1, se equipararon con los de la fase 2. Estos se
encuentran todos distribuidos más o menos en un rango de valores entre algo menos que 0,75 y
más que 1. Las variabilidades también lucen algo más homogéneas. el tratamiento 5 de la fase
2, presenta algunos valores más elevados.
En la edad de 5 semanas, 1 día (5-1), los valores de peso del bazo del tratamiento 3
experimentaron una caída abrupta igual de dramática que el aumento experimentado en la edad
anterior. El valor de su mediana ahora se ubica un poco más arriba de 0,5 su variación también
disminuyó ostensiblemente.
También se observa, que el tratamiento 4 experimentó un aumento considerable en los valores
de peso del bazo pasando de tener una mediana con un valor un poco mayor a 1 en la edad de
4 semanas, 5días (4-5), a tener un valor cercano a 1,5 con valores de peso del bazo que llegan
a 1,8. Se presenta también una variación importante en el peso del bazo con un rango de valores
que van desde un poco menos de 1 hasta 1,8.
El tratamiento 5 de la fase 2, presenta un incremento relativamente importante del peso del bazo,
aunque no tan marcado como los tratamientos 3 y 4. El valor de la mediana pasa de ser de un
poco menos de 1 a 1,25. Igualmente, se presenta un valor elevado de 1,8.
Los tratamientos 2 y 6 de la fase 2 y el tratamiento 5 de la fase 1, tienen todos, una mediana de
1. La caja que representa el tratamiento 5 presenta una mayor extensión que la de los
tratamientos de la fase 2, representando por tanto más variación en su rango de valores.
Sin embargo, los tratamientos 2 y 6. Presentan valores atípicos elevados de 1,6 y 1,8
respectivamente. El tratamiento 6, también presenta dos valores inferiores un poco fuera de
rango. El animal que representa el Valor elevado de 1,8 del tratamiento 6, también presenta una
bursa atípica de medidas considerables con un peso de 4,9 y un tamaño de 2,7.
El tratamiento 1, presenta un valor de la mediana relativamente igual al de la edad anterior pero
una variabilidad más restringida y valores un poco más altos.
68
En la edad 5 semanas, 4 días (5-4), el tratamiento 3, el grupo control positivo, muestra una
mediana con un valor de 0,5 pero a diferencia de la edad anterior, la extensión de la caja que
representa a este tratamiento, se extiende hasta llegar a 1 incluyendo también un valor de
alrededor de 1,2. Así, a pesar de la tremenda infección algunos animales han logrado recuperar
algo de peso del bazo.
En el caso del tratamiento 4, este experimentó una ligera reducción en el valor de la mediana y
un mayor agrupamiento de los datos, aunque su rango de valores, sigue siendo superior al de
los otros tratamientos. El gráfico indica que, en este tratamiento, se presentan algunos valores
extremos iguales o algo mayores de 2.
El tratamiento 5 de la fase 2, experimentó algo de disminución del peso del bazo. Éste volvió a
retornar a una situación muy similar a la que presentaba en la edad de 4 semanas, 5 días (4-5).
Los tratamientos 1 y 5 de la fase 1 y 6 de la fase 2, muestran una elevación ligera del peso del
bazo y su mediana muestra un valor similar si bien, el tratamiento 6 muestra menos variación
que los tratamientos 1 y 5.
El tratamiento 2, presenta un aumento un poco mayor del peso del bazo que los tratamientos 1,
5 y 6 antes descritos y un aumento en su rango de variación. En este tratamiento se presenta un
valor atípico de alrededor de 1,9.
En resumen, cambios considerables en el peso del bazo parecen presentar cierta asociación con
situaciones en donde el organismo y el sistema inmune se encuentran comprometidos como es
el caso del tratamiento 3.
El tratamiento 4, presentó un cambio considerable si bien no tan marcado como el tratamiento 3.
En su caso, en principio el peso se incrementó de una forma algo brusca manteniéndose luego
cierta tendencia a presentar valores elevados en los muestreos subsiguientes.
También el tratamiento 5 de la fase 2, mostró un cambio relativamente importante, aunque de
menor magnitud que los dos tratamientos antes mencionados. En su caso, el peso mostró un
patrón oscilatorio.
69
El peso del bazo, en los animales parece incrementarse gradualmente conforme transcurre la
edad. Sin embargo, en algunas circunstancias éste puede mostrar cambios abruptos o
tendencias distintas.
El comportamiento de los tratamientos de la fase 1 pareció más estable que el de los tratamientos
de la fase 2 a excepción, del control positivo, el tratamiento 3 cuyos valores presentaron cambios
muy marcados y de distinto sentido.
Los tratamientos de la fase 2 mostraron más inestabilidad presentando una mayor cantidad de
valores atípicos.
Análisis estadístico De acuerdo a lo que se observó en exploración inicial, se decidió realizar una exploración
adicional más profunda empleando análisis estadísticos para los valores del índice bursal y del
peso del bazo. En los gráficos de boxplot de estas dos medidas, se observó un comportamiento
heterogéneo del conjunto de tratamientos el cual era muy particular para cada una de las distintas
edades. Se decidió entonces que lo más conveniente era examinar el conjunto de tratamientos para cada
edad por separado- Para realizar los análisis se emplearon tres pruebas estadísticas distintas,
una prueba paramétrica el Anova y otras dos pruebas no paramétricas: el test de Kruskal-Wallis
y la prueba de la mediana. los datos de los análisis estadísticos del índice bursal se encuentran recopilados en el Anexo 3.
Igualmente, los datos de los análisis estadísticos del peso del bazo se encuentran consignados
en el Anexo 4.
Se debe tener en cuenta con qué fin de poder efectuar las pruebas con los datos, muchas veces
fue necesario renombrar el tratamiento 5 de la fase 2 como tratamiento 7, cada vez que se miren
los datos de los análisis, esto debe ser tenido en cuenta.
Índice Bursal A la edad de 4 semanas, 2 días (4-2), ninguna de las pruebas estadísticas empleadas mostró
diferencias significativas entre los tratamientos con respecto a los valores del índice bursal. El
índice bursal, mostró un comportamiento homogéneo en esta edad.
70
Edades 4-5 5-1 y 5-4. Las tres pruebas estadísticas empleadas coincidieron en mostrar diferencias significativas de los
valores del índice bursal en estas edades, si bien, en unos pocos casos, el valor de significancia
para una prueba particular estuvo en o apenas por encima del límite de significancia. En todas estas edades las diferencias significativas pueden ser atribuidas a las diferencias y los
valores índice bursal presentadas por el tratamiento 3 el cual, es el control positivo del ensayo.
Los valores de índice bursal de este tratamiento, fueron significativamente más bajos que los
valores en los otros tratamientos. La caída en los valores del índice bursal del tratamiento 3, fue menos evidente a la edad de 4
semanas, 5 días (4-5), esto se refleja en que el nivel de significancia de pruebas como la Anova
y el test de Kruskal-Wallis, estuvieron en o apenas por encima del límite de significancia. En las edades de 5 semanas, 1 día (5-1) y 5 semanas, 4 días (4-5), los valores de los índices de
significancia fueron mucho más claros y otros valores como la media en el caso del test de Anova
o el rango promedio en el test de Kruskal-Wallis, evidenciaron una disminución en el valor del
índice bursal en el tratamiento 3 con respecto a los otros tratamientos bastante pronunciada.
Demostrando así una caída marcada y sostenida del valor del índice bursal en este tratamiento. En cuanto a los tratamientos distintos al control positivo, el tratamiento 4 fue el que mostro
alteraciones más marcadas en los valores del índice bursal. A la edad de 5 semanas, 1 día (5-
1), el tratamiento 4 manifestó un valor de índice bursal claramente más bajo que el tratamiento 1
(control negativo) y el resto de tratamientos de aves vacunadas. Esto se puede constatar en el
gráfico de medias de la prueba de Anova donde el valor de la media del tratamiento 4 es
claramente inferior al resto de tratamientos a excepción del control positivo. Igualmente, el valor
de rango promedio del test de Kruskal-Wallis del tratamiento 4 presenta un valor claramente por
debajo del resto de tratamientos de aves vacunadas y del control negativo. El cuadro de distribución de valores por encima y por debajo del valor de la mediana de la prueba
de la mediana, muestra que el tratamiento 4 a la edad de 5 semanas, 1día (5-1), presenta
prácticamente todos los valores ubicados por debajo de la mediana; el cuadro de mínimos y
máximos de la prueba de Anova muestra valores mínimos muy bajos del índice bursal de 2, 2,2
y 2,7 a las edades de 5-1 5-4 y 6-0 respectivamente. Igualmente, los valores de desviación estándar de la prueba de Anova para este tratamiento
mostraron siempre valores elevados por encima de 1 desde la edad 5-1 en adelante, indicando
que hubo un nivel elevado de heterogeneidad en los valores de índice bursal de los individuos
desde esta edad, igualmente el tratamiento 5 de la fase 2 presentó una desviación estándar
notoriamente elevada de 3 a la edad de 5-1, el cuadro de máximos y mínimos de la prueba de
Anova mostró un valor mínimo de 3,5 y un valor máximo de 9,6 a esta edad.
71
Edad 6-0
A la edad de 6-0 hubo discrepancias en torno a la significancia de las diferencias en el valor de
índice bursal, la prueba paramétrica de Anova no encontró significativas las diferencias de índice
bursal entre los tratamientos a esta edad, sin embargo, en gráficos de medias de esta prueba
muestra que los valores de tratamientos de la fase 1 (1 y 5) se encuentran claramente en un nivel
más elevado; mientras que los valores de los tratamientos de la fase 2 (4 y 5 fase 2) presentan
valores inferiores. El test de Kruskal-Wallis señala como significativas las diferencias indicando que el tratamiento
5 de la fase 1 presenta un valor significativamente más elevado de índice bursal con respecto
sobre todo a los tratamientos de la fase 2. Esta diferencia se ve también en la prueba de la mediana, la cual encuentra significativas las
diferencias en el valor de índice bursal entre los tratamientos a esta edad. El cuadro de valores
por encima y por debajo de la mediana muestra que los valores de los tratamientos de la fase 2
se encuentran todos por debajo de la mediana, mientras que los valores del tratamiento 5 se
encuentran todos por encima de la mediana, esto indica que a esta edad los valores de índice
bursal evolucionaron de forma distinta en los tratamientos de las dos fases.
Peso del Bazo Edad 4-2 El peso del Bazo mostró diferencias significativas entre los tratamientos tanto para la prueba de
Anova como para las pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis y de la mediana. En el gráfico
de medias de la prueba de Anova se observó que los tratamientos 2, 4 y 5 fase 2 de la fase 2,
sobre todo el tratamiento 4, presentaron pesos de bazo consistentemente más grandes que los
tratamientos 1, 3 y 5 de la fase 1. Esto se puede constatar también en el cuadro de valores de rango promedio de la prueba de
Kruskal-Wallis, donde los tratamientos de la fase 1 presentan valores de rango promedio de nivel
bajo mientras que los tratamientos de la fase 2 presentan valores en un rango claramente más
alto. Igualmente, en la prueba de la mediana el cuadro de valores por encima y por debajo de la
mediana muestra que prácticamente todos los valores de los tratamientos de la fase 1 se ubican
por debajo de la mediana. Edad 4-5 El peso del bazo mostró diferencias significativas entre tratamientos tanto para la prueba de
Anova como para las pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis y la prueba de la mediana a
esta edad. En la prueba de Anova el grafico de las medias muestra un valor medio
extremadamente elevado para el tratamiento 3 (control positivo), indicando un incremento muy
marcado del peso del bazo.
72
Igualmente, en el cuadro de rangos promedio de la prueba de Kruskal-Wallis se observa un valor
muy elevado del tratamiento 3 en comparación con los otros tratamientos y en la prueba de la
mediana el cuadro de valores por encima y por debajo de la mediana muestra que los valores
del tratamiento 3 se encuentran todos por encima de la mediana.
Respecto de los otros tratamientos, el tratamiento 4 presentó un valor de rango promedio en la
prueba de Kruskal-Wallis más alto que el resto de los tratamientos, exceptuando el tratamiento
3. Igualmente, en la prueba de la mediana la gran mayoría de los pesos se encuentran por encima
de la mediana en este tratamiento, indicando que predominan los pesos altos. Edad 5-1 El peso del bazo mostró diferencias significativas entre tratamientos tanto para la prueba de
Anova como para las pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis y de la mediana. En el gráfico
de medias de la prueba de Anova se observa un valor medio bastante reducido para el
tratamiento 3, evidenciando una caída fuerte en el peso del bazo. Los tratamientos 4 y 5 de la fase 2 registran valores medios elevados del peso del bazo, aunque
estos valores, aparentemente no marcan una diferencia significativa con respecto a los otros
tratamientos. El cuadro de rango promedio muestra un valor para el tratamiento 3 control positivo
extremadamente bajo coincidiendo con lo observado en la prueba de Anova; este aparece
subrayado, mostrando el valor como significativamente diferente. Los rangos promedio del tratamiento 4 y tratamiento 5 de la fase 2, presentan valores por encima
de los otros tratamientos mostrando que los bazos mantienen un peso elevado; en la prueba de
la mediana los valores del tratamiento 3 aparecen todos por debajo del valor de la mediana, el
tratamiento 4 y el tratamiento 5 de la fase 2 presentan la mayoría de los valores por encima de
la mediana, mostrando que predominan pesos elevados en estos tratamientos a esta edad. Edad 5-4 El Peso del bazo, mostró diferencias significativas entre los tratamientos tanto para la prueba
Anova, como para las pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis y de la mediana. Nuevamente,
el grafico de medias de la prueba de Anova muestra un valor muy bajo del peso del bazo con
respecto a los otros tratamientos, para el tratamiento 3.
Se observa, sin embargo, en comparación a la edad anterior un aumento en la desviación
estándar y en el cuadro de valores máximos y mínimos se observa una diferencia más grande
indicando quizás una recuperación ligera del peso del bazo. El cuadro de rango promedio de la prueba de Kruskal-Wallis presenta un valor muy bajo para el
tratamiento 3, lo cual coincide con lo encontrado en la prueba Anova; este aparece subrayado
resaltando el valor como significativamente diferente. Como es de esperarse, el cuadro de
73
valores de la prueba de la mediana muestra que los valores de este tratamiento se encuentran
todos por debajo del valor de la mediana. El tratamiento 4, sigue presentando valores elevados como se observa en el gráfico de las
medias de la prueba de Anova y en el cuadro de rangos promedios de la prueba de Kruskal-
Wallis. Nuevamente el cuadro de valores por encima y por debajo de la mediana presenta la
mayoría de los valores por encima de la mediana, indicando el predominio de pesos más altos
del bazo en este tratamiento. Curiosamente, el tratamiento 2, el control de vacunas presenta un
aumento en los valores de peso del bazo como se evidencia en el gráfico de medias de la prueba
de Anova y el cuadro de rangos promedios de la prueba de Kruskal-Wallis. Edad 6-0 Las diferencias en el peso del bazo entre tratamientos, no aparecen significativas a esta edad ni
para la prueba de Anova ni para las dos pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis y de la
mediana, si bien, las pruebas de Anova y Kruskal-Wallis dan un valor de significancia más
cercano a que las diferencias sean significativas que la prueba de la mediana. Al observar el grafico de las medias de Anova no se ven mayores diferencias entre los valores
de las medias y lo mismo sucede al observar el cuadro de valores máximos y mínimos. El cuadro
de valores de rango promedio en la prueba de Kruskal-Wallis, muestra valores bajos para los
tratamientos 5 de la fase 1 y 5 de la fase 2, aunque igual, estas diferencias no alcanzan a ser
significativas. En la prueba de la mediana las diferencias en este valor para estos tratamientos son aún menos
significativas.
En conclusión, los análisis estadísticos mostraron que antes del inicio del desafío el peso del
bazo fue consistentemente más alto de arranque en los tratamientos de la fase 2 que en los
tratamientos de la fase 1. Ya en las edades posdesafío, el peso del bazo del tratamiento 3 (control
positivo) mostro en inicio un valor significativamente más elevado del peso del bazo que del resto
de tratamientos evidenciando un aumento marcado en el peso de este órgano. Posteriormente, en las edades 5-1 y 5-4 el tratamiento 3 (control positivo), mostró un peso del
bazo significativamente bajo con respecto a los otros tratamientos indicando que hubo una caída
importante del peso del bazo a estas edades. A la edad de 5-4 aumentó, el coeficiente de varianza en este tratamiento y creció el rango de
valores máximos y mínimos quizás mostrando una ligera recuperación del bazo en algunos
animales. el tratamiento 4 demostró pesos consistentemente elevados en el bazo, sobre todo, a la edad de
5-1 y 5-4 si bien, dicha diferencia tal vez no pareciese significativa, si mostró una tendencia
constante. También se observó pesos relativamente elevados en el tratamiento 5 de la fase 2 a
la edad de 5-1 aunque nuevamente, la diferencia con respecto a los otros tratamientos tal vez no
pareciese ser significativa.
74
POSANÁLISIS ESTADÍSTICO Debido la incertidumbre generada en torno a la importancia de las diferencias existentes en
cuanto a valores del índice Bursal y del peso del bazo sobre todo entre el tratamiento 4 y los
otros tratamientos de aves vacunadas, se decidió correr un análisis parcial adicional empleando
las tres pruebas estadísticas, pero excluyendo esta vez, al tratamiento 3 (el control positivo). Se
corrieron entonces las pruebas para índice Bursal y peso del Bazo para las edades 4-5 y 5-1.
Los resultados de este posanálisis, aparecen descritos en el Anexo 5, donde se muestran los
gráficos y tablas del análisis paramétrico de Anova y de las pruebas no paramétricas de Kruskal-
Wallis y de la prueba de la mediana en este análisis donde se excluye el control positivo. ÍNDICE BURSAL Edad 4-5 Tanto los resultados de la prueba de Anova, como los resultados de las pruebas no
paramétrica de Kruskal-Wallis y de la mediana mostraron que no fueron significativas las
diferencias existentes en los valores de índice Bursal entre los distintos tratamientos
incluidos a esta edad. El gráfico de medias de la prueba de Anova, muestra valores de índice Bursal elevados
para todos los tratamientos siendo este, algo más elevado para el tratamiento 1 y para el
tratamiento 4. El cuadro de rangos promedio de la prueba de Kruskal-Wallis también muestran valores
algo más elevados para el tratamiento 1 y el tratamiento 4. El cuadro de valores por encima y por debajo de la mediana de la prueba de la mediana
muestra que los tratamientos con mayor cantidad de valores por encima de la mediana,
son el tratamiento 1 el tratamiento 4. Edad 5-1
De acuerdo los resultados obtenidos las diferencias existentes en los valores de índice
Bursal entre los distintos tratamientos fueron significativas tanto por la prueba de Anova
como para las pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis y de la mediana. El gráfico de medias de la prueba de Anova muestra que el valor medio del índice Bursal
del tratamiento 4 es diferencialmente más bajo que el del resto de tratamientos, siendo
este valor significativamente inferior. El cuadro de rangos promedio de la prueba de Kruskal-Wallis muestra que el tratamiento
4, tiene un valor claramente más bajo que el resto de tratamientos; este valor aparece
Subrayado, indicando que este valor fue significativamente inferior en relación a los otros
tratamientos.
75
El cuadro de valores por encima y por debajo de la mediana de la prueba de la mediana,
muestra que en el tratamiento 4, la gran mayoría de los valores se encuentra por debajo
de la mediana. se observa también una buena cantidad de valores por debajo de la
mediana en el tratamiento 1 (control negativo) y el tratamiento 5 de la fase 2, coincidiendo
con valores relativamente bajos del rango promedio para estos tratamientos de la prueba
de Kruskal-Wallis.
PESO DEL BAZO Edad 4-5 De acuerdo con los resultados obtenidos las diferencias en los valores del peso del bazo
existentes entre los tratamientos de aves vacunadas a esta edad, fueron significativas tanto para
la prueba de Anova como para las pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis y de la mediana. A su vez, el cuadro de rangos promedio de la prueba de Kruskal-Wallis, muestra un valor más
elevado para el tratamiento 4 que para el resto de tratamientos este aparece subrayado,
resaltándolo como significativamente diferente. El cuadro de valores por encima y por debajo de la prueba de la mediana muestra que el
tratamiento 4, presenta prácticamente todas las mediciones con un valor por encima de la
mediana.
Edad 5-1 Los resultados obtenidos muestran que las diferencias existentes en el peso del Bazo entre los
distintos tratamientos de aves vacunadas, fueron significativas tanto para la prueba de Anova
como para las pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis y de la mediana. El gráfico de medias de la prueba de Anova, muestra valores medios de peso del bazo superiores
a los otros tratamientos y de valor muy similar, en el tratamiento 4 y en el tratamiento 5 de la fase
2. En la prueba de Kruskal Wallis, el cuadro de rangos promedio muestra un valor de peso del bazo
más elevado para el tratamiento 4, el cual aparece subrayado indicando que significativamente
superior. El rango promedio de la prueba de Kruskal-Wallis del tratamiento 5 de la fase 2
(tratamiento 7), muestra un valor elevado, equivalente al del tratamiento 4. El cuadro de valores por encima y por debajo de la mediana de la prueba de la mediana muestra
que la gran mayoría de los valores del tratamiento 4 y del tratamiento 5 de la fase 2, se
encuentran por encima del valor de la mediana igualmente en el resto de tratamientos la mayoría
de sus valores se ubican por debajo de la mediana.
76
Conclusiones del Posanálisis Con el fin de intentar despejar la incertidumbre surgida a partir de los análisis hechos
inicialmente con las tres pruebas, en torno a las diferencias mostradas por el tratamiento
4, se decidió correr estas tres pruebas estadísticas excluyendo esta vez al tratamiento 3
(control positivo), dejando todos los otros tratamientos de aves vacunadas y el tratamiento
1, el control negativo para el análisis. Estos análisis se corrieron para las edades 4-5 y 5-
1y sus resultados se muestran en el Anexo 5. En conclusión, los resultados del posanálisis mostraron que el valor de índice Bursal a la
edad de 5 semanas, 1 día (5-1) para el tratamiento 4, presentó diferencias significativas
con respecto a los otros tratamientos de aves vacunadas y el control negativo, de acuerdo
a los valores de significancia de las tres pruebas ensayadas. El gráfico de medias, el cuadro de rangos promedio y el cuadro de valores por encima y
por debajo de la mediana, muestran que el valor de índice Bursal del tratamiento 4 fue
consistentemente inferior al del resto de tratamientos.
En suma, todo lo anterior indica que, efectivamente, el índice bursal de las aves del
tratamiento 4 presentó un valor bajo y disminuido, comparado con los otros tratamientos
de aves vacunadas y el control negativo a la edad de 5 semanas, 1 día (5-1). Por tanto, el
tratamiento, alteró el comportamiento de la bolsa de Fabricio a esta edad y generó una
disminución en el peso de este órgano del sistema inmune. En cuanto al valor del peso del bazo, los análisis iniciales hechos con todos los
tratamientos, dejaban entrever que el peso del bazo del tratamiento 4, presentaba
consistentemente un valor elevado. De acuerdo con los resultados de los valores de significancia de las tres pruebas
estadísticas empleadas en el posanálisis, el peso del bazo del tratamiento 4 a las edades
4 semanas, 5 días (4-5) y 5 semanas, 1 día (5-1), tuvo diferencias significativas con
respecto al resto de tratamientos de aves vacunadas y el control negativo. El gráfico de medias, el cuadro del rango promedio y el cuadro de valores por encima y por
debajo de la mediana, muestran que el tratamiento 4, presentó valores de peso del bazo
más elevados que el resto de estos tratamientos.
En suma, todo lo anterior indica que el peso del bazo el tratamiento 4 a las edades de 4-
5 y 5-1 fue efectivamente más elevado, es decir, los bazos de muchas de las aves del
tratamiento 4 en estas edades, tuvieron un peso aumentado del bazo consistente con un
agrandamiento de este.
Adicionalmente a la edad de 5-1 el peso del bazo del tratamiento 5 de la fase dos
(Tratamiento 7 en los análisis), mostró también tener un peso del bazo aumentado con
respecto a los otros tratamientos excluyendo al tratamiento 4.
77
3.3 Biología molecular
3.3.1 Diseño y construcción de la prueba de PCR en tiempo real Escogencia de la región para diseño de la prueba Para el diseño de la prueba de PCR en tiempo real, se tuvieron en cuenta varios criterios. En
principio, el método de extracción de RNA usado con las muestras es un método extracción de
RNA total. Por tanto, al ser empleado en macerados de tejidos y muestras infectadas con el virus,
se obtendrán moléculas tanto de los transcritos del virus, así como moléculas de genomas del
virus.
En el virus de Newcastle, los genes presentan un gradiente de transcripción siendo mucho mayor
la transcripción de genes hacia el extremo 3’ del genoma que la de los genes ubicados hacia el
extremo 5’ del genoma. (37)
Este gradiente, está mediado en parte, por la distancia que los genes respecto de secuencia
reguladoras de la transcripción en el extremo 3’ del genoma, pero también, influyen en esto las
regiones intergénicas. Los genes con regiones intergénicas de mayor longitud, son menos
transcritos que aquellos con regiones cortas (37)
El gen L que codifica la polimerasa del virus de Newcastle, es el gen más al extremo 5’ del
genoma y además, posee la región intergénica más larga entre todos los genes del virus.
Todas estas condiciones, lo hacen en blanco más adecuado para el diseño de una prueba de
PCR en tiempo real, en la cual los valores obtenidos de Ct para nivel viral, sean menos
influenciados por los transcritos también presentes en la muestra.
Se decidió entonces, obtener la secuencia del extremo 5’ del genoma de la cepa de campo 0396-
03 del virus de Newcastle empleada en este estudio.
Para tal propósito, se diseñaron un conjunto de varios cebadores dirigidos a esta región con el
fin de abarcar un espectro relativamente amplio de las distintas secuencias de aislados y
variantes del virus.
78
Los cebadores diseñados, se encuentran todos en una región de 711 pares de bases que incluye parte de la región del extremo 5’ del gen L además de la región 5’ no codificante del genoma del virus. La lista de cebadores diseñados y empleados para obtener los productos de PCR enviados
luego a secuenciar aparece enlistada abajo. Los números hacen referencia a su posición
en la región escogida para secuenciar. Tabla 3-1: Lista de cebadores diseñados a partir del alineamiento de secuencias de
genomas del virus De Newcastle para secuenciar el extremo 5’ del genoma. Nombre/Posición Secuencia del Primer
FWNC1-17/1 TGAAGCCGGRGGACAGC
FWNC1-17/2 TGAAGCCGGKGGACAGC
FWNC1-17/3 TGAAGCYGGGGGACAAC
FWNC1-17/4 TGAGGCCGGGGGACAGC
FWNC12-32/1 GACAGCCCGTCCGYCCAT
FWNC12-32/2 ACAGCCCGTCCGYCCGTTCT
FWNC12-32/3 GACAGCCTGTTCGTCCATTTTG
FWNC14-35 CARCCTGTCCGTCCATTCTGT
FWNC446-464 ACTCGTGCTCAACAAAAATTCTACA
FWNC485/1 AATGCGGCMAAGGGATATTACAGT
FWNC485/2 AATGCTGYCAAGGGATATTACAGT
RVNC444-468/1 TAGAAYTTTTGTTGAGCACGAGTCA
RVNC444-468/2 TAGAATTTYTGTTGAGCACGAGTCA
RVNC444-468/3 TAGAATTTTTGYTGAGCACGAGTCA
RVNC444-468/4 GAATTTTTGTTGGGCACGAGTCAA
RVNC444-468/5 GAATTTTTGTTGAGCACGAGTCAA
RVNC495-471/6 TTKACYGCATTGCCTATAGTTTTCA
RVNC495-471/7 TTGACRGCATTCCCTACAGTTTTCA
FWNC138-159/1 AGGGYGACCTTGCTGACACAGT
NCFWNC138-159/2 AGGGTGATCTYGCTGACACAGT
NCFWNC140-160/3 GGTGACCTYGCCGACACAGTG
NCFWNC137-159/4 GAGGGTGAYCTTGCTGATACAGT
NCFWNC239-263/5 GAGGTCACAATAYTGGGTCTTAGAG
NCFWNC138-158/6 AGGGTGATCTYGCCGACACAG
RVNC711/1 GGAAACAGAGATTTGGTGRATGACATA
RVNC711/2 TGAAACAAAGATTTGGTGAATGACAGG
RVNC711/3 GGAAACAAAGATTTGGTGAAWGACAGA
RVNC711/4 GCGAAACAAAGATTTGGTGAATRTCAGA
RVNC711/5 GGAAACAAAGATTTGGTGAASGACAG
RVNC711/6 TGGAAACAAAGATTTGGTGAATRACAAG
RVNC711/7 GGAAA CAA AAR TTT GGT GAA TGA CAG G
RVNC711/8 TGG AAACAAAGATTTGGTRAATGACRAG
RVNC711/9 AGGAAACARAGATTTGGWGAATGACATA RVNC711/10 GGAAAACARAGATTTGGWGGATGACATA
79
Los ensayos efectuados con estos cebadores, dieron buenos resultados y fue posible obtener
fragmentos de PCR para la secuenciación de la región 5’.
Con el fin de obtener una secuencia confiable, se enviaron muestras de varios PCRs que
representaban fragmentos de distintas regiones del fragmento mayor de 711 pares de bases.
También se enviaron muestras del fragmento de 711 pares de bases a secuenciación.
En la parte de abajo, se puede apreciar la secuencia obtenida a partir del fragmento del extremo
5’ del genoma de la cepa de campo 0396-03. La región marcada en amarillo, corresponde a la
señal de poliadenilación del gen L que marca el punto hasta donde llega el transcrito de dicho
gen.
>0396-03 CCCGTCCGTCCATTCTGTGCGGAAAGTTTGGTGAGCACACTAACAGATATGACCCAG ACAACTCAGATCATTGCCAGCCACATCGACACAGTCATTCGGTCTGTAATTTACATAG AGGCTGAGGGTGACCTCGCCGACACAGTGTTCTTATTTACTCCTTACAATCTATCCA CAGACGGTAAAAAGAGAACATCACTTAAGCAGTGCACCAAACAGATCTTGGAAGTCA CAATACTGGGTCTCAGAGCCAAAGATATCAATAAAGTAGGTGATGTAATCAGTTTAGT ACTCAGAGGTGCGGTTTCCCTAGAGGACCTCATCCCATTAAGGACATACCTGAAGCG CAGTACCTGCCCTAAATACCTGAAAGCGGTCCTAGGTATTACTAAACTCAAAGAAAT GTTCACAGATACCTCGTTACTGTACTTGACTCGTGCTCAACAAAAATTCTACATGAAA ACCATAGGTAATGCTGCCAAGGGATATTACAGTAATAAGTGACTCTTAAAGGCAATC GTATGCCAATCAGTTATCTTCCTAACTGATGACTCCCTCACTGACTTAATTATACCAG ATTAGAAAAAAGTTAAATTCCGACTCTTTGAAACTCGTAATCGGATTCAGTTAGTTAAC TTTAAGCAAGAGTGCGCAA La secuencia del extremo 5’ del genoma obtenida, fue alineada con secuencias del extremo 5’
de genomas del virus de Newcastle, incluyendo cepas de genotipo de vacuna y genotipos de
cepas virulentas reportados en Latino América. A partir de dicho alineamiento, se construyó un árbol empleando Clustal W. como se puede
observar en el árbol, la secuencia de la cepa 0396-03 empleada en este estudio, pertenece al
genotipo VIId.
80
Las comparaciones por BLAST, muestran una homología de secuencia presentada con la
cepa de vacuna Lasota en este fragmento del 83% con una cobertura de secuencia del
93%. La tabla de similitud genética calculada por Clustal (ver anexoX), muestra una similitud
genética de 77,1% entre el extremo 5’ del genoma de las cepas de vacuna Lasota y VG/GA
y el extremo 5’ del genoma de la cepa 0396-03. Figura 3-24: Árbol de secuencias construido empleando Clustal W. La cepa 0396-03, aparece agrupada con secuencias del Genotipo VIId.
81
Diseño de la prueba Una vez obtenida la secuencia del extremo 5’ terminal del gen L, se procedió diseñar la prueba
de PCR en tiempo real a partir de esta secuencia. Como ya se mencionó anteriormente, el uso
esta región permite que los niveles virales detectados, muestren valores de Ct menos alterados
por la presencia de transcritos.
Con el fin de mejorar la sensibilidad de la prueba y también de mejorar su reproducibilidad se
decidió diseñar una prueba con doble sonda. Este tipo de prueba, podría mejorar el límite de
sensibilidad de detección además de conferir mejor repetitividad entre medidas de una misma
muestra. Se diseñó entonces una prueba de PCR en tiempo real, que emplea un par de cebadores y dos
sondas Taqman. En la parte de abajo, la tabla muestra con colores distintos, los cebadores y las
sondas empleados en la prueba. La posición de los cebadores y sondas diseñados para la
prueba, en la secuencia del extremo 5’ de 0396-03, son mostradas resaltándolas con los mismos
colores empleados en la tabla con el fin de identificarlos Tabla 3-2. Lista de los cebadores y sondas Taqman de la prueba de PCR en tiempo real de doble
sonda. Las secuencias de estos aparecen en color para identificar su posición en la secuencia.
82
Cuantificación de dosis infectivas En un inicio, se realizaron una serie de pruebas con extracciones de líquido alantoideo de
la cepa del virus de Newcastle 0396-03 empleada en el estudio. También se hicieron varios
ensayos con diluciones seriales hechas a partir del RNA de líquido alantoideo las cuales
abarcaban un rango entre 10-1- 10-7.
Para las extracciones de líquido alantoideo rutinariamente se usan siempre 200 µl. Se debe recordar que el título de la cepa, es de 10 5,4 DI/0,05 mls. Esto significa, que hay
aproximadamente unas 252.000 dosis infectivas por cada 50 µl de líquido alantoideo. Al
extraer 200 µl de este líquido, el RNA obtenido equivaldría aproximadamente un millón de
dosis infectivas.
En la tabla 3-3, se muestra una recopilación en donde se observa la equivalencia de los
niveles de dosis infectivas estimadas en las diluciones con los valores de Ct promedio
obtenidos.
DILUCIÓN
D. INFECTIVA
VALOR PROM. Ct
PURO 1.000.000 12,5
DIL. 10-1 100.000 15,6
DIL. 10-2 10.000 18,8
DIL. 10-3 1000 22,3
DIL. 10-4 100 25,6
DIL. 10-5 10 28,8
DIL. 10-6 1 32,3
DIL. 10-7 0.1 35,4
Tabla 3-3: Valores de Ct promedio de diluciones seriales de líquido alantoideo. Se debe resaltar que en los ensayos realizados los valores de Ct obtenidos para las
diluciones más bajas mostraron un comportamiento muy regular lo que habla de una buena
repetitividad de la medida cuanto los niveles virales que se están midiendo son muy bajos.
En este sentido, la prueba con doble sonda parece funcionar bien en términos de
sensibilidad y reproducibilidad.
83
Basándose en estos valores y en lo observado en las muestras, se califican con frecuencia los
valores de Ct encontrados en los estudios hechos de forma cualitativa basándose en la cantidad
de dosis infectivas estimadas que representan refiriéndose entonces a niveles virales elevados,
medios o bajos.
Figura 3-25. Ensayo de PCR en tiempo real de muestras de diluciones de 0396-03. Se corren
varias réplicas para cada dilución, observándose una muy buena reproducibilidad en los valores
de Ct obtenidos aun en las diluciones más bajas.
En la siguiente página, se muestra el gráfico que representa la relación entre los valores de Ct
promedio obtenidos para las diluciones seriales de líquido alantoideo y el logaritmo de las dosis
infectivas representadas por cada una de estas diluciones.
El coeficiente de correlación es cercano a 1 y la pendiente muy cercana a -3,3 lo que habla de
una reacción de PCR en tiempo real con una eficiencia muy cercana al 100%.
La fórmula lineal obtenida a partir de la gráfica, fue empleada para traducir los valores de Ct
obtenidos a partir de las distintas muestras procesadas para cada uno de los tratamientos, en
valores de dosis infectivas representadas.
84
Figura 3-26: Relación lineal entre el logaritmo de la dosis infectiva y el valor de Ct. Se puede ver en el gráfico, la ecuación empleada para obtener los valores de dosis infectivas de las muestras.
3.3.2 Comportamiento de los niveles virales EDAD 4-5 En la tabla 3-4, se describen los valores de dosis infectivas obtenidos a partir de las pruebas de
PCR en tiempo real efectuadas al conjunto de muestras respectivas, recolectadas para cada uno
de los tratamientos ensayados a la edad de 4-5. Para los tratamientos de dosis única, los
tratamientos 3 y 4, este muestreo corresponde a 3 días luego de la aplicación del único desafío
hecho con virus de campo.
Para los tratamientos con infección con virus de campo repetitiva como los tratamientos 5 de la
fase 1 y 5 de la fase 2 y el tratamiento 6, este muestreo corresponde a 3 días luego de aplicada
la 1a dosis infectiva respectiva.
Como es de esperarse el comportamiento del tratamiento 3 se aparta del comportamiento
observado en los otros tratamientos. El tratamiento 3 es el control positivo, este corresponde a
aves que no fueron vacunadas y que luego fueron desafiadas a la edad de 4-2 con 10.000 dosis
infectivas el virus de campo.
85
Tabla 3-4. Valores de dosis infectivas de las muestras para cada uno los tratamientos en la edad
4-5, 3 días posinfección.
En estos animales el agresivo virus de campo se propaga con poca restricción. Se observa que,
si bien apenas han transcurrido tres días, el virus ha alcanzado Dosis infectivas equivalentes a
niveles virales muy elevados en las muestras de órganos linfoides como el pool del Bazo-Timo y
la muestra de bursa.
Este comportamiento, es consistente con lo visto en las cepas de Genotipo VIId, las cuales,
desde etapas muy tempranas de la infección, alcanzan niveles virales muy elevados en órganos
linfoides presentándose niveles iniciales más elevados a nivel del bazo, seguidos por niveles
también muy elevados, pero algo menores en timo y bolsa de Fabricio. Esta característica, es
definitiva para la patogenicidad del virus, ya que esto le permite afectar y deteriorar el sistema
inmune y su capacidad de contrarrestar la infección.
La muestra del pool de Tráquea- Pulmón, presenta un valor de Dosis infectivas elevado,
indicando una buena replicación del virus en el tracto respiratorio. A pesar de esto, el hisopo de
tráquea muestra un nivel viral bajo y muy modesto.
El valor de dosis infectivas del hisopo cloacal, exhibe una diferencia enorme frente al hisopo de
Tráquea, mostrando la tendencia del virus a tener una mayor excreción por vía fecal. En este
punto, el encéfalo, muestra un nivel muy pequeño de dosis infectivas a pesar de los elevados
niveles en los otros órganos.
86
En cuanto los distintos tratamientos con aves vacunadas, como es de esperarse, los niveles
virales son comparativamente moderados frente a los del control positivo. De acuerdo a los
valores de dosis infectivas, los niveles virales más altos en los tratamientos 5 de la fase 1 y 4 y
5 de la fase 2, se encuentran en la bursa. El valor del tratamiento 4, es entre 3 y 4 veces inferior
al de los tratamientos 5 fase 1 y fase 2 si bien, todos son moderados.
En el caso de las muestras del pool de bazo-timo, el nivel viral del tratamiento 4 en este órgano
fue claramente inferior frente a los tratamientos 5 de las fases 1 y fase 2. Este nivel fue moderado
en el tratamiento 5, fase 1, unas 3 veces menor que el nivel del tratamiento 5, fase 2 con un nivel
medio-moderado.
En estos 3 tratamientos, las muestras de Tráquea-Pulmón mostraron niveles virales escasos
igualmente, también en el caso de las muestras del encéfalo, los niveles virales alcanzados
fueron bajos.
El hisopo cloacal del tratamiento 4, mostró niveles virales apenas unas dos veces y media
menores que los observados en el control positivo (T3), a esta edad. El tratamiento 5 de la fase
2, tuvo un título viral unas 4 veces y 9 veces inferior, que el obtenido por los tratamientos 4 y 3
respectivamente.
Los títulos virales de estos dos tratamientos, se ubican en un rango de excreción que puede
generar inóculos infectivos para otras aves, propagando el virus a la población a una etapa muy
temprana de la enfermedad. Los tratamientos 5, fase 1 y 6, fase 2, no mostraron excreción viral
por vía fecal a esta edad.
El hisopo traqueal, fue prácticamente negativo para los tratamientos 4 y 6 de la fase 2 y 5 de la
fase 1, mientras que para el tratamiento 5, fase 2, este nivel fue relativamente comparable al
observado en hisopo cloacal.
EDAD 5-1 En la tabla 3-5, se describen los valores de dosis infectivas obtenidos a partir de las pruebas de
PCR en tiempo real efectuadas al conjunto de muestras respectivas, recolectadas para cada uno
de los tratamientos ensayados a la edad de 5-1. Para los tratamientos de dosis única, los
87
tratamientos 3 y 4, este muestreo corresponde a 6 días luego de la aplicación del único desafío
hecho con virus de campo.
Para los tratamientos con infección repetitiva con virus de campo como los tratamientos 5 de la
fase 1 y 5 de la fase 2 y el tratamiento 6, este muestreo corresponde a 3 días luego de aplicada
la 2a dosis infectiva respectiva.
En términos generales, la edad 5-1 se caracterizó porque muchas de las muestras registraron
los niveles virales observados más elevados para casi todos los tratamientos ensayados
indicando quizás, que alrededor de esta edad se presenta el cuadro más agudo y generalizado
de la infección viéndose esto reflejado con mayor fuerza en la fracción de animales del grupo
correspondiente a cada tratamiento en los cuales, se generó una mejor posibilidad de avance de
la infección.
Tabla 3-5. Valores de dosis infectivas de las muestras para cada uno los tratamientos en la edad
5-1, 6 días posinfección.
En el tratamiento 3 correspondiente al grupo control positivo, las cargas virales en órganos
linfoides continuaron creciendo hasta alcanzar niveles ultraelevados con respecto al muestreo
pasado. Los niveles en el pool de bazo-timo se han duplicado y en el caso de la bursa, estos son
10 veces mayores. La carga en bursa, es mayor que la del pool de bazo-timo siendo el doble de
esta.
88
Los niveles en el pool de tráquea-pulmón pasaron a muy elevados aumentado algo más de 3
veces en este muestreo. Los niveles en el encéfalo, ahora son un poco más elevados que en el
pool de tráquea-pulmón. Estos se han incrementado unas 500 veces en 3 días.
El nivel viral del hisopo de cloaca aumentó más de 40 veces con respecto al muestreo anterior
alcanzando un nivel muy elevado. Este nivel creció unas 16 veces en el caso del hisopo de
tráquea. La diferencia de nivel viral entre el hisopo de cloaca y el hisopo de tráquea ha crecido
significativamente alrededor de unas 60 veces. El hisopo de tráquea constituye un1,75% de la
excreción y el de cloaca un 98,25%.
Dentro de los tratamientos de aves vacunadas, el tratamiento 4 muestra los niveles virales más
elevados en todas las muestras de órganos. En todos ellos, los niveles virales se han
incrementado de manera muy marcada Las cargas virales más elevadas se encuentran a nivel
de la bursa y del pool Tráquea- Pulmón. El encéfalo y del pool bazo-timo, muestran niveles
importantes de carga viral, aunque en comparación no tan elevados.
El hisopo cloacal, refleja una carga viral ultraelevada casi 4 veces mayor que el control positivo
mostrando un nivel de excreción extremadamente alto. El hisopo traqueal también muestra un
nivel viral importante, aunque teóricamente unas 100 veces más bajo que el de hisopo cloacal.
En resumen, el virus se propagó y replicó de forma importante en este tratamiento observándose,
además, un nivel de excreción muy elevado sobre todo a nivel de la excreción fecal.
El tratamiento 5 de la fase 2 mostró también niveles virales importantes en algunas muestras. En
el caso de los órganos linfoides, respecto a la edad anterior, los niveles virales de la bursa
cayeron casi 3 veces y en cuanto al pool de bazo-timo, estos aumentaron casi 2,5 veces.
El nivel de carga viral del pool de bazo-timo, es alrededor de la mitad del nivel obtenido para el
tratamiento 4 a esta edad, siendo no tan marcada la diferencia en los niveles y probablemente
en efectos. Se debe tener en cuenta, sin embargo, que en el tratamiento 4, la carga viral aumentó
70 veces con respecto a la edad 4-5, mientras que para el tratamiento 5 de la fase 2, el valor de
la carga viral aumentó alrededor de 2,5 veces.
En el pool de tráquea-Pulmón, hubo un aumento de alrededor de 56 veces en el nivel viral con
respecto a la edad 4-5. Este nivel pasó de muy bajo a medio. En comparación, el tratamiento 4
89
presenta una carga viral muy elevada a esta edad y un incremento de 1000 veces con respecto
a la edad anterior, donde el nivel era bajo.
En cuanto la muestra encéfalo, el nivel viral del tratamiento 5 de la fase 2 a esta edad pasó a ser
muy elevado. Este es algo más de la mitad del nivel observado en el control positivo y alrededor
de 16 veces el observado en el tratamiento 4. El nivel viral pasó de ser prácticamente inexistente
en la edad 4-5 a muy elevado. .
El hisopo cloacal, muestra niveles elevados de excreción fecal. Nuevamente, dicho nivel es
mucho más elevado que el observado a nivel del hisopo traqueal. El nivel de carga viral del
hisopo cloacal pasó de ser moderado a la edad de 4-5, a presentar niveles elevados en esta
edad. El incremento en el nivel fue de unas 27 veces.
A pesar de esto, este nivel es 50 y 13 veces menos que los niveles de los tratamientos 4 y 3
respectivamente. En el caso del hisopo traqueal, los niveles de carga viral cayeron a casi la mitad
de la edad anterior. Estos se mantuvieron en un nivel bajo.
En el caso del tratamiento 5 de la fase 1, todos los niveles virales registrados fueron bajos. El
nivel viral en bazo-timo, cayó cerca de 100 veces y en bursa alrededor de 3,5 veces con respecto
a la edad anterior. El hisopo cloacal, mostró el mayor incremento alcanzando niveles moderados.
Comparativamente, sin embargo, los niveles virales en todas las muestras son claramente
superados por los niveles de carga viral observados en los tratamientos 5 de la fase 2 con
reinfecciones de nivel moderado y por el tratamiento 4 de dosis de infección moderada única.
El tratamiento 6 con reinfecciones de dosis muy bajas, que en el muestreo anterior prácticamente
había sido negativo para carga viral en todas las muestras en la edad anterior, mostró en esta
edad, niveles bajos pero positivos, de carga viral en casi todas las muestras si bien, la muestra
de encéfalo fue negativa. El nivel viral obtenido en bazo-timo y en tráquea-pulmón, fueron 2 y 7
veces superiores a los obtenidos en el tratamiento 5 de la fase 1, con reinfecciones a dosis
elevadas.
Como en todos los tratamientos, la excreción fecal fue mayor que la traqueal. El nivel de
excreción fecal fue de rango bajo, pero cae en el rango donde el virus puede propagarse.
90
EDAD 5-4 En la tabla 3-6, se describen los valores de dosis infectivas obtenidos a partir de las pruebas de
PCR en tiempo real efectuadas al conjunto de muestras respectivas, recolectadas para cada uno
de los tratamientos ensayados a la edad de 5-4. Para los tratamientos de dosis única, los
tratamientos 3 y 4, este muestreo corresponde a 9 días luego de la aplicación del único desafío
hecho con virus de campo.
Para los tratamientos con infección repetitiva con virus de campo como los tratamientos 5 de la
fase 1 y 5 de la fase 2 y el tratamiento 6, este muestreo corresponde a 3 días luego de aplicada
la 3a dosis infectiva respectiva.
En esta edad, los niveles virales de las distintas muestras presentan en general, valores mucho
más bajos al ser comparados con los observados en la edad 5-1, excepción hecha de muestras
del tratamiento 5 de la fase 1 y unas pocas muestras en el tratamiento 3.
Tabla 3-6. Valores de dosis infectivas de las muestras para cada uno los tratamientos en la edad
5-4, 9 días posinfección.
En el caso el tratamiento 3, los órganos linfoides presentaron una caída significativa de los niveles
virales si bien, estos niveles siguen siendo elevado en bazo-timo y muy elevado en bursa.
91
Una recuperación modesta observada del peso del bazo a esta edad coincide con la disminución
marcada del nivel viral del pool de bazo-timo y de la excreción fecal en las aves de este
tratamiento.
La muestra encéfalo es la única que presenta un incremento en la carga viral equivalente a algo
más de 3 veces el observado en la edad anterior. Este incremento en la carga viral en el encéfalo
coincide con una reducción de esta carga a nivel de los órganos linfoides.
El pool de tráquea-pulmón, también muestra una disminución de su carga viral con respecto a lo
visto en la edad 5-1. En teoría esta disminución sería de alrededor de diez veces menos.
De acuerdo los niveles manifestados por las muestras de hisopo traqueal el hisopo cloacal, se
observa una caída fuerte de los niveles de excreción del virus. La excreción respiratoria
prácticamente desapareció, mientras que la excreción fecal a pesar de conservar un nivel
elevado, fue mucho más baja que la excreción mostrada en la edad anterior.
En cuanto a las aves vacunadas, el tratamiento 4 sigue presentando las cargas virales más altas.
Los niveles virales en las muestras de órganos han caído y se asemejan más a los vistos en la
edad 4-5 con excepción del pool de tráquea-pulmón
El nivel de carga viral de hisopo cloacal a pesar de la disminución, sigue siendo de un nivel
elevado el cual sigue siendo mayor que el del control positivo mostrando aún, un nivel de
excreción fecal significativo.
En el tratamiento 5 de la fase 2, los niveles virales caen marcadamente ubicándose incluso por
debajo de los niveles observados a la edad 4-5. La excreción fecal presenta un nivel consistente
a pesar de los bajos niveles en órganos
A diferencia de lo anterior, en el caso del tratamiento 5 de la fase 1 todas las muestras a
excepción de la muestra de bursa, presentan incremento en sus niveles de carga viral o se
mantienen estables.
Comparativamente, la muestra encéfalo sufre un incremento muy elevado y ahora su nivel viral
pasa a ser bajo. El hisopo cloacal sigue mostrando un nivel viral bajo y estable.
92
EDAD 6-0
En la tabla 3-7, se describen los valores de dosis infectivas obtenidos a partir de las pruebas de
PCR en tiempo real efectuadas al conjunto de muestras respectivas, recolectadas para cada uno
de los tratamientos ensayados a la edad de 6-0. Para los tratamientos de dosis única, los
tratamientos 3 y 4, este muestreo corresponde a 12 días luego de la aplicación del único desafío
hecho con virus de campo.
Para los tratamientos con infección repetitiva con virus de campo como los tratamientos 5 de la
fase 1 y 5 de la fase 2 y el tratamiento 6, este muestreo corresponde a 3 días luego de aplicada
la 4a y última dosis infectiva.
En esta edad, no se tomaron muestras para los tratamientos 3 y 6. En el caso del tratamiento 3,
ya todas las aves restantes habían muerto antes de llegar a esta edad. En el caso del
tratamiento 6, las aves restantes no se sacrificaron para toma de muestras debido a que fueron
empleadas en el post ensayo.
En los tratamientos 4 y 5 de la fase 2, los niveles virales observados en las aves muestreadas a
esta edad son comparativamente los más bajos.
En el tratamiento 4, la excreción fecal casi que desapareció conservando apenas un nivel bajo
no comparable a los elevados niveles de excreción presentados en las edades anteriores.
El bazo conserva un nivel moderado de carga viral al igual que el pool de tráquea pulmón
mientras que la bursa, la carga viral casi que ha desaparecido.
En el tratamiento 5 de la fase 2 los niveles virales a nivel de órganos, son bastante bajos. Solo
se conserva una excreción fecal moderada si bien, esta es más elevada que los otros dos
tratamientos y potencialmente problemática.
93
Tabla 3-7. Valores de dosis infectivas de las muestras para cada uno los tratamientos en la edad
6-0, 12 días posinfección.
A diferencia de los tratamientos anteriores, el tratamiento 5 de la fase 1, mostró incrementos
moderados de los niveles virales en muestras como la bursa, el pool de bazo-timo y el encéfalo
comparados con los niveles presentados por las muestras de la edad anterior. Los niveles de
excreción siguen siendo muy incipientes.
Niveles de excreción viral
La tabla 3-8 muestra un sumario de los datos de niveles virales para las muestras de hisopo de
cloaca e hisopo de tráquea para cada uno los tratamientos a través de las distintas edades.
Al comparar los datos se puede observar que los valores de niveles virales obtenidos a partir de
las muestras de hisopo traqueal presentan siempre una menor cantidad de dosis infectivas que
las obtenidas a partir de las muestras de hisopo cloacal a pesar de que la vía de inoculación fue
siempre nasal.
94
Tabla 3-8. Sumario de los datos de dosis infectivas obtenidos para las muestras de hisopo
cloacal y traqueal. En esta tabla, se cruzan las distintas edades y tratamientos.
En términos generales, al comparar las dos muestras para una combinación de tratamiento y
edad particular, la diferencia existente es casi siempre apreciable. Puesto que en la gran mayoría
de casos las muestras de hisopo cloacal presentan dosis más elevadas que el hisopo traqueal
y dado que las diferencias entre los dos valores suelen ser apreciables, se puede afirmar que el
virus tiene una marcada tendencia a excretarse principalmente por vía fecal más que por vía
respiratoria.
Esta tendencia es observada tanto en el control positivo donde las aves no son vacunadas, así
como también en el resto de tratamientos donde las aves son vacunadas. Por lo tanto, esta no
depende de sí las aves son o no vacunadas.
La excreción viral, fue muy elevada en el control positivo (tratamiento 3), pero aún más elevada
en el tratamiento 4 hasta la edad de 5-4. Esta excreción era realizada principalmente por vía
fecal. En ambos tratamientos, la excreción respiratoria tuvo un pico a la edad de 5-1 luego de lo
cual decaía de forma notoria.
Al comparar los dos tratamientos con reinfecciones, el tratamiento 5 de la fase 1 donde las
reinfecciones se hacían con dosis muy elevadas (10.000 dosis infectivas) y el tratamiento 5 de la
fase 2 donde las reinfecciones se hacían con dosis moderadas-medias (150-200 dosis
infectivas), se observa un nivel de excreción mucho mayor en el tratamiento 5 de la fase 2.
En el tratamiento 5 de la fase 2, la excreción fecal muestra un nivel medio- moderado a la edad
de 4-5 llegando a un nivel de excreción elevado en la muestra de la edad 5-1. En las edades
95
posteriores, el nivel de excreción retorna a valores medios-moderados. En este tratamiento, se
presenta una excreción consistente a través de las distintas edades. Mostrándose además que
muchos de los animales están niveles aparte de consistentes pueden ser elevados.
En el caso del tratamiento 5 de la fase 2, la excreción respiratoria se mantuvo en un nivel
moderado pero consistente hasta la edad 5-1. Luego de esto, la excreción decayó a niveles muy
bajos en las edades subsiguientes.
En el caso del tratamiento 6, se observó excreción fecal sólo a la edad de 5-1 y a un nivel bajo.
En las demás edades, este tratamiento sólo mostró excreción respiratoria a un muy bajo nivel.
Probablemente, debido a las dosis infectivas muy bajas y espaciadas.
Comportamiento de niveles virales en órganos
La tabla 3-9, muestra un sumario de los datos de dosis infectivas obtenidos para las muestras de
Bursa y Pool de Bazo- Timo, mientras que la tabla 3-10, muestra un sumario de los datos de
dosis infectivas obtenidos para las muestras de Encéfalo y Pool de Tráquea-Pulmón. En ambas
tablas, se cruzan edades con tratamientos.
Tabla 3-9. Sumario de los datos de dosis infectivas obtenidos para las muestras de Bursa y Pool
de Bazo-Timo. En esta tabla, se cruzan las distintas edades y tratamientos.
Tabla 3-10. Sumario de los datos de dosis infectivas obtenidos para las muestras de Encéfalo y
Pool de Tráquea-Pulmón. En esta tabla, se cruzan las distintas edades y tratamientos.
96
El propósito al juntar las tablas es el de intentar considerar los datos de forma global teniendo en
cuenta el comportamiento de los niveles virales en el conjunto de órganos muestreados
enfatizando más que nada en los tratamientos de aves vacunadas.
En el caso del tratamiento 6, de infección repetitiva espaciada con dosis muy bajas, la mayoría
de muestras solo son positivas a la edad de 5 semanas, 1 día (5-1), 3 días luego de la aplicación
de la 2a dosis infectiva. Ya en el último muestreo a la edad de 5 semanas, 4 días (5-4), 3 días
luego de la 3a dosis infectiva, la única muestra en permanecer apenas positiva, es la muestra de
tráquea-pulmón. Paradójicamente, la muestra de encéfalo que hasta este momento había
permanecido negativa, se positiviza, aunque a un nivel muy bajo. A dosis muy bajas y repetidas
de forma espaciada, el virus logra apenas persistir en el organismo.
En el tratamiento 5 de la fase 1 a pesar de que se aplican dosis infectivas elevadas de manera
repetitiva, los niveles virales en los órganos alcanzan a lo sumo, a elevarse a valores medios-
moderados. Manteniéndose preferentemente en niveles muy bajos.
En los órganos linfoides la bursa y el pool de bazo-timo, se alcanzan niveles medios- moderados
al inicio, los cuales luego caen a niveles muy bajos en la bursa y bajos pero sostenidos en el pool
de bazo-timo. En el encéfalo y el pool de tráquea-pulmón, solo se observan valores bajos.
En el caso del encéfalo, y el bazo los niveles virales crecen. Al parecer la repetición de dosis
elevadas, empujan los niveles en estos órganos hacia el muestreo final, haciendo que persista
la infección en el organismo.
El comportamiento del tratamiento 5 de la fase 2 donde se aplican dosis moderadas de forma
repetitiva, varió según el órgano en particular. En el caso de la bursa, los dos primeros muestreos
presentan niveles virales medios y moderados y luego en los dos últimos muestreos caen a
niveles bajos. Comportamiento que se asemeja al del tratamiento 5 fase 1.
En el caso del pool de bazo-timo, el comportamiento del tratamiento 5 de la fase 2, se mantiene
en los dos primeros muestreos en un nivel medio creciendo algo en el segundo muestreo. Luego
este nivel cae hacia valores muy bajos en los últimos dos muestreos.
97
En el caso del tratamiento 4, el nivel viral inicial en las dos muestras de órganos linfoides es más
bajo que en los tratamientos con reinfección siendo comparativamente más bajo en el pool de
bazo-timo.
Para el segundo muestreo, se presenta un incremento muy fuerte con respecto al nivel inicial en
ambas muestras. En la muestra de bursa se alcanza a un nivel muy elevado cercano a la dosis
estándar y en bazo-timo, un nivel importante.
En los últimos dos muestreos, el nivel viral observado en ambas muestras, cae hacia valores
bajos. En el pool de bazo-timo el virus parece sostenerse y persistir un poco mejor que en la
bursa.
El comportamiento de los tratamientos 4 y 5 de la fase 2, es algo similar en las muestras de
encéfalo y pool de Tráquea-Pulmón. Al igual que en las muestras de los otros tratamientos de
aves vacunadas los niveles iniciales del virus son moderados o muy bajos. Para el segundo
muestreo, se presenta un incremento fuertísimo en los niveles virales.
En el caso el tratamiento 4, el nivel viral alcanzado es mucho mayor en el pool de Tráquea-
Pulmón que en la muestra de encéfalo donde igual alcanza niveles importantes. En el tratamiento
5 de la fase 2, el nivel viral alcanzado en la muestra encéfalo es mucho mayor que en el pool de
Tráquea- Pulmón.
En los dos últimos muestreos, se observan niveles virales descendientes. El descenso observado
es mucho más marcado en la muestra encéfalo que en la del pool tráquea-pulmón para el
tratamiento 4 en el cual, el virus parece persistir bien a nivel del sistema respiratorio.
En ambos tratamientos, en las fases iniciales parece darse una expansión del virus en muchos
órganos, alcanzándose en muchos de estos niveles virales importantes. También se observó un
incremento notorio a nivel de la excreción fecal posiblemente relacionado a niveles virales
elevados en órganos y sistemas asociados al sistema digestivo.
Sin embargo, el tratamiento 4 en estas etapas iniciales logró niveles más importantes para la
muestra de bursa y siguió conservando niveles de excreción fecal elevados hasta edades más
98
tardías. La persistencia del virus en este tratamiento a nivel del sistema respiratorio y del bazo
también fue mucho más consistente.
El caso de la bursa, el comportamiento de los dos tratamientos con reinfecciones fue más bien
similar. En estos tratamientos la bursa fue infectada, pero los niveles virales nunca se elevaron
significativamente y fueron en cambio, descendiendo con el tiempo.
En los tres muestreos correspondientes al tratamiento 3 el control positivo, los niveles virales
mostraron algunos aspectos importantes en su evolución.
En el primer muestreo, los niveles virales en los órganos eran ya muy elevados a excepción del
encéfalo con un nivel apenas moderado de virus. Los mayores niveles se encontraban en los
órganos linfoides siendo algo mayores en el bazo.
En el segundo muestreo, el nivel viral del encéfalo se incrementa hasta alcanzar niveles muy
elevados. En la bursa los niveles crecen adicionalmente alcanzando niveles exageradamente
elevados. Los niveles también crecen de forma menos acentuada en los pooles de bazo-timo y
tráquea-pulmón.
En el último muestreo, los niveles virales de los órganos caen de forma notable a excepción del
encéfalo donde el nivel aumenta adicionalmente. El nivel viral también cae notablemente a nivel
de la excreción fecal. Sin embargo, los niveles virales siguen siendo bastante elevados. Es
probable que esto se deba, al enorme deterioro de los órganos que dificulta sostener la
replicación elevada.
Esto podría hablar tal vez, de una cierta recuperación al menos ligera en estas supervivientes.
También podría hablar de que aún bajo condiciones tan restrictivas como las impuestas por el
control positivo, la forma como se desenvuelve la infección, su severidad y el cómo se da el
interjuego de esta con el organismo puede guardar diferencias de un animal a otro haciendo que
algunos sobrevivan más tiempo.
También puede deberse al menos en parte, a sesgos del muestreo introducidos en parte por
hábitos en la escogencia de los animales para necropsia y en parte, a la selección misma hecha
por la mortalidad de las aves en este tratamiento.
99
Niveles virales en el ensayo piloto y en el postratamiento.
La tabla 3-11, muestra los valores de dosis infectivas obtenidos a partir de la muestra del
tratamiento con reinfecciones hecho durante un ensayo piloto de tipo exploratorio. Las muestras
fueron recolectadas a la edad de 5-4.
El ensayo piloto, constó de tres tratamientos; el primer tratamiento denominado tratamiento 1, es
un control negativo donde las aves no se vacunaron, ni se desafiaron. El segundo tratamiento
denominado tratamiento 3, es un control positivo donde no se vacunaron las aves y se les
suministró una dosis única de virus de campo a la edad de 4-2, equivalente a 25-30 dosis
infectivas. En el tercer tratamiento denominado tratamiento 5, las aves fueron vacunadas a la
edad de 3-0 y posteriormente se les inocularon dosis de virus de campo a la edad de 4-2, con
reinfecciones a las edades de 4-5 y 5-1. En todos los casos, la dosis aplicada correspondió a 25-
30 dosis infectivas.
Tabla 3-11. Valores de dosis infectivas obtenidos en el ensayo piloto.
Tratamiento Hisopo Hisopo Tráquea- Encéfalo Bazo- Bursa Cloaca Tráquea Pulmón Timo
PILOTO - - 4524,09 421,73 847,47 14817,65
En este ensayo, el control positivo, el tratamiento 3, manifestó apenas síntomas leves de
infección al inicio y no se observó mortalidad. Al parecer la dosis aplicada, fue suficiente para
generar síntomas no tan fuertes, pero no fue suficiente para que el virus desencadenase la
mortalidad al menos, hasta la edad de 5-4.
En contraposición a esto, en el tratamiento 5 con aves vacunadas, donde se aplicó la dosis inicial
y dos dosis de reinfección más, iguales a la dosis aplicada en el control positivo del ensayo, se
reportó 1 ave muerta. Hacia el final, las aves en este tratamiento, estaban deprimidas, lucían muy
enjuntas, mostraban poca movilidad y reactividad tardía.
100
Los valores de dosis infectivas, reportados en la tabla 3-18 corresponden a muestras de tejidos
tomadas a la edad de 5-4 a partir de las aves del tratamiento 5 con reinfecciones del ensayo
piloto. No se recolectaron muestras de hisopo.
Se observa un nivel viral muy elevado a nivel de la bursa muy superior para esta edad, al nivel
del tratamiento 4 y cercano al nivel del control positivo del ensayo de grupos hecho
posteriormente. El pool de tráquea-pulmón a esta edad, muestra niveles elevados más de 10
veces los niveles del tratamiento 4 y el doble de los del control positivo del ensayo de grupos.
Las muestras de encéfalo y bazo-timo presentan niveles virales medios muy por encima de los
niveles del tratamiento 4 del ensayo de grupos a esta edad.
En la tabla 3-12, se muestran los valores de dosis obtenidos a partir de los ensayos de PCR en
tiempo real para los 3 grupos de aves de la fase 2 empleados en el postratamiento. Estos
animales provinieron de las aves restantes al final de la fase 2 del ensayo de grupos. Estas son
aves que no fueron sacrificadas a las 6 semanas de edad. Las aves empleadas, pertenecían a
los tratamientos 2 y 6 de la fase2.
El tratamiento 2, correspondía al grupo control de aves solo vacunadas. Estas aves, fueron
vacunadas a la edad de 3 semanas. Posteriormente, estas aves fueron mantenidas y
muestreadas, pero nunca se les inoculó con virus de campo.
El tratamiento 6, correspondió al grupo con infección repetitiva con dosis muy baja de virus de
campo. Estas aves eran vacunadas a las 3 semanas de edad. Posteriormente, a las 4 semanas,
2 días de edad se les inoculó una dosis inicial equivalente a 1,5-2 dosis infectivas de virus de
campo luego de lo cual se les suministró una dosis similar cada 3 días, hasta la edad de 5
semanas, 4 días. En total se les suministraron 4 dosis de1,5-2 dosis infectivas de virus de campo.
Como ya se detalló en los resultados anteriores, en el caso del tratamiento 6, hubo algunos
efectos a nivel de signos clínicos a pesar de las dosis tan bajas y aisladas, pero los niveles virales
logrados fueron muy bajos e incipientes, aunque si alcanzó a presentarse excreción fecal
moderada. Se decidió entonces en el postratamiento, seguir aplicando un nivel de dosis infectiva
muy bajo (1,5-2 dosis), pero sometiendo a las aves a un régimen de aplicación de las dosis
101
mucho más seguido e intenso, permitiendo tener una mayor cantidad de dosificaciones de rango
muy bajo aplicadas.
Durante el postratamiento, a los tres grupos de aves se les aplicaban 2 dosificaciones diarias
equivalentes a 1.5-2 dosis infectivas. La primera dosis, era aplicada al inicio de la mañana y la
segunda en la parte final de la tarde. Este régimen de dosificación se mantuvo desde la edad de
6 semanas, 2 días, hasta la edad de 7 semanas, 2días. Las aves fueron sacrificadas a la edad
de 7 semanas, 5 días, tomándose las respectivas muestras para ensayos de PCR.
Tabla 3-12. Valores de dosis infectivas obtenidos para las muestras de los tratamientos
empleados en el postensayo. Este muestreo fue realizado a la edad de 7 semanas, 5 días.
En las aves del tratamiento 6, se produjeron niveles de excreción fecal elevados en la réplica 1
y ultraelevados (más de 100.000 D.I.) en la réplica 2. También se presentó una excreción elevada
por vía oro-nasal.
En la réplica 1, los niveles virales en encéfalo son elevados, en bazo son medio-elevados y en
bursa, timo y pulmón, medios. En la réplica 2, los niveles en el timo son elevados, en pulmón y
encéfalo medio-elevados y en bazo, medios.
Estos niveles virales son mucho mayores a los observados en las aves de este tratamiento
durante la fase 2 de ensayos, más si se tiene en cuenta que las muestras fueron tomadas 11
días luego de reiniciar la inoculación de virus de campo.
A pesar de que la dosificación aplicada fue la misma en los periodos de tratamiento y
postratamiento, hubo mucha mayor intensidad y periodicidad de aplicación de las dosificaciones
102
en el postratamiento. Esto se reflejó en las diferencias claras de niveles virales obtenidos en los
dos periodos.
En el caso el tratamiento 2, la excreción viral tanto por vía oro-nasal como por vía fecal, fue
moderada. Esta fue algo mayor por vía fecal. Los niveles virales en órganos muestran un nivel
medio en el timo y moderado en bursa, bazo y pulmón. Sólo se observa un nivel bajo en la
muestra de encéfalo.
En contraste con lo anterior, la muestra de tráquea presenta niveles virales muy elevados,
bastante por encima de los observados en las otras muestras. A su vez, el hisopo traqueal
presenta niveles virales moderados. Si bien no puede descartarse errores de toma,
almacenamiento o procesamiento de la muestra, se puede pensar también que la respuesta
inmune está clarificando de forma eficiente las partículas de virus. Esto es plausible, más si se
tiene en cuenta que las aves en este tratamiento eran aves vacunadas más grandes al momento
del ensayo las cuales, no habían sido expuestas previamente al virus de campo a edades más
tempranas.
De todas formas, los niveles virales obtenidos en los distintos grupos del postratamiento, son
mucho más consistentes e importantes que los observados en la fase previa para regímenes de
infección con dosificaciones de nivel muy bajo, más si se tiene en cuenta el tiempo transcurrido
de 11 días para la toma de muestras.
Se debe tener en cuenta también, que la exposición al virus de campo a edades más tempranas,
como fue el caso del tratamiento 6 donde las aves habían recibido varias dosis de carga muy
baja del virus desde la edad de 4-2, pareció influir el resultado de la infección en aves de mayor
edad, haciendo que estas desarrollasen mayores cargas una vez, el desafío se hizo mucho más
periódico.
Los ensayos hechos en el piloto y en el postratamiento, apoyan adicionalmente que las dosis
bajas y moderadas parecen incrementar la excreción viral, sobre todo, a nivel de la excreción
fecal.
103
4. Discusión de resultados
4.1 Comportamiento control positivo
Varias investigaciones han descrito perfil de lesiones macroscópicas y el correspondiente análisis
histopatológico de los órganos con lesiones en aves no vacunadas de cepas del virus de
Newcastle pertenecientes al genotipo VIId (100, 101, 125). Todos estos estudios, configuran un
patrón común, el cual es señalado de forma explícita en estas investigaciones en las que se
habla de un tropismo por órganos linfoides y una marcada generación de lesiones y daños en
estos. Dicho patrón, se extiende también a la médula ósea y al tejido linfoide asociado a distintos
sistemas, afectando principalmente el tejido linfoide asociado al sistema digestivo.
En uno de estos estudios, se describe además el comportamiento de los niveles virales y los
cambios de la expresión genética en órganos linfoides como el bazo, el timo y la bursa en etapas
tempranas de la infección de cepas de este genotipo (100).
De acuerdo a la filogenia obtenida a partir del fragmento secuenciado del gen L, la cepa
NDV0396-03 empleada en este estudio, es una cepa del genotipo VIId. Según los estudios antes
mencionados, es típico que, en aves no vacunadas infectadas con cepas de este subgenotipo,
entre el 2o y 3er día luego del desafío, aparezcan bazos con un moteo consistente en manchas
blancas dispersas, indicando necrosis multifocal. Asociado a esto, se observa agrandamiento
considerable de los bazos (100, 101, 125).
En el estudio aquí realizado, en las aves correspondientes al primer muestreo del grupo control
positivo, realizado 3 días luego del desafío con virus de campo, se observaron bazos moteados
compatibles con necrosis multifocal del bazo los cuales, presentaban un tamaño grande en
comparación con las bolsas. Los análisis morfométricos, establecieron inequívocamente la
existencia de un incremento dramático y significativo del peso del bazo para la época de este
muestreo. Este aumento tan marcado en el peso, es consistente con un agrandamiento notorio
de este órgano en las aves muestreadas, igual al observado en los otros estudios.
En las investigaciones antes referenciadas, en el 3er día posinfección, las aves presentaban otros
signos tales como hemorragia en bursa, agregados linfoides del intestino, incluyendo las tonsilas
cecales y timo. En este último, se observaba también necrosis. Los estudios histológicos
mostraban depleción linfoide clara en bazo, timo y bolsa. Dicha depleción, estaba acompañada
104
de infiltración numerosa de macrófagos en bazo y timo (100, 101, 125). Otros signos incluían
daño extenso de mucosas a nivel de tráquea e intestino, necrosis multifocal del páncreas y de la
médula ósea.
En el estudio aquí realizado, se observaron bolsas hemorrágicas, 3 días posinfección. Los
análisis morfométricos indicaban una caída significativa en el índice bursal de las aves,
coincidente con un proceso de pérdida de masa tisular de la bolsa probablemente, asociado a
inmunodepleción.
No se reportaron mayores alteraciones del timo a esta edad. Las tonsilas cecales y el tejido rectal,
aparecían claramente reactivos. En el estudio realizado, no se incluyó la realización de
observaciones ni en el páncreas, ni en la médula ósea.
Uno de los ensayos realizados con cepas del genotipo VIId, muestra que entre el 1er y 3er días
posinfección, los niveles virales (medidos en número de copias), crecen constantemente de
forma muy aguda. Inicialmente los niveles crecen más marcadamente en el bazo y son más
elevados que en timo y bolsa, pero para el 3er día, los niveles en los tres órganos son iguales,
encontrándose todos ellos, por encima de 106 copias (101).
Para el 3er día posinfección, el resultado aquí obtenido, es comparable a la situación inicial entre
las 24 y 48 horas descrita en el estudio mencionado (101). Los niveles virales alcanzados en
órganos linfoides son muy elevados, siendo más altos en el pool de bazo-timo los cuales, para
este momento, doblan los niveles alcanzados en la bolsa. Sin embargo, los niveles virales más
altos no son alcanzados sino días después del muestreo del 3er día posinfección. Adicional a
esto, se observa un nivel elevado de excreción fecal del virus. Los niveles de excreción, no fueron
analizados en los estudios referenciados.
En el mismo ensayo con cepas de genotipo VIId ya mencionado, se observa en el último
muestreo efectuado a los 4 días posinfección, aves con encéfalo congestionado. Adicionalmente,
se observa que las bolsas han comenzado a atrofiarse. Igualmente, se ve en los bazos, el inicio
de una tendencia de disminución en su tamaño, luego de que este hubiese presentado un
incremento anormal en etapas anteriores (101).
En todos los ensayos con cepas de genotipo VIId aquí citados, algunos de los animales habían
sido sacrificados en tiempos previos para propósitos de muestreo, aunque la mayoría habían
muerto espontáneamente o habían sido sacrificados moribundos de forma humanitaria ya fuese
105
al 3er día (100) o entre el 3er y 4o día posinfección (101, 125). El inicio de mortalidad espontanea
de 4 animales del grupo control positivo de este estudio, ocurrió entre el 4o y 5o días posinfección.
La mayor incidencia de mortalidad espontanea se presentó días después entre los 6 a 8 días,
donde murieron 15 animales de forma espontánea.
Existen algunas diferencias en cuanto a la severidad y tiempo de arranque y ocurrencia
posinfección de signos, lesiones y de la mortalidad, entre estos estudios reportados con cepas
de genotipo VIId y el estudio aquí descrito. Como se señala más adelante, algunos signos vistos
en estas aves se presentan en muestreos posteriores y aparecen también otros signos propios
y particulares.
Estas diferencias observadas, pueden deberse en parte, al nivel de dosis infectivas empleadas
en los ensayos citados con cepas de genotipo VIId y el estudio aquí descrito. En dichos estudios,
a los animales les fueron suministrados inóculos cuyas dosis se encuentra entre 105 y 106 dosis
infectivas (100, 101, 125). En el presente estudio, los animales fueron inoculados con una dosis
de 104 dosis infectivas, es decir, una dosis que era entre 10 y 100 veces inferior a la aplicada en
los otros estudios.
Adicionalmente, los índices de patogenicidad intracerebral de las cepas empleadas en los
ensayos citados con cepas de genotipo VIId, tenían índices de patogenicidad intracerebral cuyos
valores estaban entre 1,82 y 1,88 (100, 101, 125). El valor del índice de patogenicidad
intracerebral de la cepa NDV0396-03 empleada en este estudio, era de 1,58, el cual es
relativamente moderado si se compara con los valores de las otras cepas. Es probable que este
menor valor de ICPI, haya contribuido también, a las diferencias vistas en cuanto a la agresividad
y tiempo de presentación de las patologías.
Las diferencias del valor registrado del ICPI con las cepas de los otros estudios y con una cepa
Suramericana más relacionada en origen a la cepa empleada en este estudio, como es el caso
de la cepa de genotipo VIId Venezuela-611-2008, aislada en Venezuela, con un índice de
patogenicidad intracerebral de 1,86 (26), podrían indicar que, durante los procesos de laboratorio
y los pasajes de multiplicación y refrescamiento en huevos embrionados, la cepa empleada
podría quizás haber sido de forma involuntaria, parcialmente atenuada influyendo su nivel de
agresividad. Esto habla de lo importante que es el diseñar prácticas y protocolos con respecto al
mantenimiento de cepas del virus que permitan conservarlas sin que sufran pérdida de sus
características biológicas.
106
Es difícil saber cuál de los dos factores, si la diferencia de carga viral del inóculo o el valor de
índice de patogenicidad intracerebral de la cepa NDV 0396-03, pudiese haber pesado más con
respecto a la diferencia en agresividad en comparación a las infecciones con las otras cepas.
Muestreos 6 y 9 días posinfección
Se podría plantear, basándose en los estudios antes citados, que el tiempo intermuestreo entre
los dos primeros muestreos fue inconvenientemente largo. En el estudio aquí descrito, el
siguiente muestreo se realizó al 6o día posinfección, 3 días luego del 1er muestreo. De acuerdo a
los numerosos cambios observados con respecto al 1er muestreo, los 3 días transcurridos
parecen haber sido demasiado tiempo al menos en el caso del grupo control positivo. Numerosos
procesos parecen haber tenido lugar en el tiempo intermuestreo entre el 3er y 6o día posinfección,
los cuales no fueron documentados.
Los timos que apenas habían insinuado cambios al 3er día posinfección, ahora al 6o día aparecen
atróficos, con pérdida notoria de la masa lobular en prácticamente todos los animales
muestreados, viéndose en algunos casos, presencia de hemorragia. Esta pérdida de masa
lobular estaría necesariamente acompañada de una pérdida grande de las células del timo
incluyendo probablemente, poblaciones de linfocitos.
Las bolsas y los bazos, ahora aparecen notoriamente reducidos y de similar tamaño. Al igual
que en el caso del timo, las bolsas ahora aparecen atróficas en todos los animales del muestreo.
Estos signos, van en línea con las observaciones en el último muestreo de uno de los ensayos
con cepas de genotipo VIId, realizado 4 días posinfección en el cual, se observa que las bolsas
comienzan a atrofiarse y que los bazos muestran una tendencia clara a decrecer, luego de haber
experimentado un agrandamiento abrupto (101).
Consistente con lo anterior los análisis morfométricos confirman que luego del aumento abrupto
de peso visto en el 1er muestreo, los bazos han experimentado un proceso de pérdida muy
marcada de peso durante dicho periodo, estadísticamente significativa. Este peso ahora se ubica
muy por debajo del peso registrado por las aves muestreadas 6 días antes, previo al desafío de
los animales, al igual que del peso mostrado por los grupos control negativo y control vacunal 6
días posdesafío. Esta caída tan marcada del peso del bazo, es compatible con pérdida masiva
de poblaciones de células constitutivas del órgano, incluyendo probablemente linfocitos que son,
una de las poblaciones celulares abundantes en este órgano linfoide.
107
En cuanto a las bolsas, los análisis morfométricos muestran que el índice bursal ha caído de
forma significativa, mostrando valores casi 3 veces más bajos, respecto a los registrados por este
mismo grupo en la edad anterior y por todos los otros tratamientos, 6 días posinfección.
Por consiguiente, es bastante probable que las bolsas de estos animales, hayan sufrido una
pérdida masiva de las poblaciones de las células que las constituyen incluyendo probablemente
linfocitos, dado que estos son una de las poblaciones celulares abundantes en este órgano
linfoide.
Los timos y las bolsas, permanecieron atróficos en el muestreo 9 días posinfección. Igualmente,
las bolsas y los bazos siguieron presentando pesos muy bajos si bien, los análisis morfométricos
muestran una recuperación ligera del peso del bazo. En estas edades, se da la aparición de otras
lesiones reportadas por los estudios citados con cepas de genotipo VIId en edades anteriores,
como proventrículos hemorrágicos y encéfalos congestionados, las cuales, se manifiestan en
este muestreo.
Compatible con el agudizamiento de signos, los niveles virales alcanzaron su máximo al 6o día
posinfección sobre todo en órganos linfoides y a nivel de la excreción fecal. Los niveles de la
bolsa fueron ultraelevados mayores de 105 dosis infectivas, doblando los niveles alcanzados en
el pool de bazo-timo. Este tipo de comportamiento de niveles virales difiere respecto al del estudio
de referencia (101).
De forma contraria e inesperada, al 90 día posinfección, los niveles virales tanto de excreción
como los presentes en órganos, muestran una caída notoria. Si bien los niveles siguen siendo
importantes sobre todo en bolsa, las diferencias con el muestreo anterior son marcadas y
evidentes. Contrario a esto, los niveles en encéfalo se incrementaron significativamente.
La razón para esta caída en corto tiempo de los niveles virales, no es clara. Se puede plantear
como hipótesis explicativa, que el estado fisiológico del organismo ha cambiado y muchos
procesos que favorecen la proliferación viral han cambiado
Como ya se mencionó, contrario a esto, la producción se incrementa significativamente en
encéfalo. Es probable que, debido al estrés corporal, muchos de los ahora escasos recursos
fisiológicos disponibles, se desvíen al encéfalo. También es posible, que se haya dado una
recuperación incipiente, manifestada por la recuperación ligera del peso del bazo, que se puede
haber desarrollado en el transcurso de los días, generando una respuesta inmune que funcione
un poco mejor, contribuyendo quizás a regular la carga viral, aunque sin poder despejarla.
108
4.2 Sumario aves vacunadas El hecho de que las cepas virulentas llegan a producir infección así sea de forma leve en las aves
vacunadas, además del crecimiento de las aves en condiciones de hacinamiento y alta densidad
y el contacto permanente con excreciones de otros animales, hacen altamente probable la
exposición de estos, a niveles virales con rangos de magnitud distintos, al igual que la posibilidad
de experimentar infección repetitiva.
Teniendo en cuenta lo anterior, se hicieron varios ensayos empleando una cepa colombiana
muy virulenta del virus de Newcastle de genotipo VIId para infectar animales vacunados. En
estos ensayos, se hizo desafío con dosis que variaban en la cantidad de dosis infectivas
aplicadas incluyendo dosis muy bajas (1-2 dosis), dosis bajas (15-20 dosis), dosis moderadas
(100-200 dosis) y dosis muy altas (10.000 dosis).
Adicionalmente, los ensayos incluyeron un ensayo de aplicación de dosis única moderada (100-
200 dosis) y ensayos en los que se aplicaron dosis repetitivas de distinto nivel. Estos últimos,
incluyeron ensayos con dosis muy elevadas, moderadas, bajas y muy bajas. En general, los
ensayos de dosis repetitiva se hicieron inoculando los animales cada 3er día y se aplicaron
siempre 4 dosis en total. La excepción fue el postratamiento donde dosis de nivel muy bajo (1-2
dosis), se aplicaron diariamente durante 12 días.
Todos los distintos tratamientos manifestaron síntomas y alteraciones. Sin embargo, las cargas
virales más elevadas, se alcanzaron en los ensayos con dosis repetitivas en el rango de dosis
muy bajas (1-2 dosis) a dosis moderadas (100-200 dosis) y el ensayo de dosis única moderada
donde las cargas de algunas muestras llegaron a niveles entre elevados (900-9000 dosis), muy
elevados (10.000-100.000 dosis) y ultraelevados (más de 100.000) dosis. Estos últimos se
alcanzaron a nivel de la excreción fecal.
Una excepción a esto, la constituye el ensayo con dosis repetitivas espaciadas cada 3er día de
nivel muy bajo, cuyas cargas alcanzadas estuvieron el rango de bajas a moderadas,
contrastando con el postratamiento donde dosis de este mismo nivel, se aplicaron de forma diaria
por partida doble. Los niveles virales obtenidos fueron bastante más significativos y la excreción
fecal, estuvo llegó en un grupo a niveles ultraelevados.
En el caso del grupo con dosis muy elevadas (10.000 dosis), aplicadas repetitivamente de forma
espaciada, las cargas virales en órganos y a nivel de excreción, alcanzaron niveles moderados
109
a bajos al igual que en el ensayo de dosis repetitivas espaciadas de nivel muy bajo. En ambos
ensayos, a pesar de los niveles de carga viral, se observaron signos.
En el caso del postratamiento, con dosis repetitivas diarias de nivel muy bajo (1-2 dosis) y el
tratamiento con dosis única de nivel moderado (100-200 dosis), se observó adicionalmente aves
con signos adicionales como peritonitis. Esto coincide con que estos tratamientos, fueron los que
presentaron cargas de virales de excreción fecal ultraelevados.
Los datos morfométricos, también mostraron que las alteraciones a nivel del bazo, fueron
generadas en las aves donde dosis de nivel moderado, con dosis única y repetitiva. El índice
bursal, presentó alteraciones significativas en el tratamiento de dosis única moderada.
4.3 Variabilidad del virus, diferencia genética y dosis bajas
Una pregunta que surge es porque son más fuertes las infecciones con dosis bajas y moderadas.
La respuesta probablemente se encuentre en parte en la variabilidad existente en las cepas del
virus.
Las cepas del virus de Newcastle que afectan a las aves comerciales pertenecen todas un a un
mismo serotipo. Sin embargo, y a nivel genético existen diferencias amplias entre las cepas de
campo del virus y también con respecto las cepas de vacuna.
El virus de Newcastle está clasificado en 18 genotipos. La diferencia genética entre los distintos
genotipos es mayor a10%. Aparte de esto, muchos de los genotipos conocidos presentan a su
vez subgenotipos. Éstos son grupos de cepas con diferencias un poco mayores al 4-5%. En el
caso al genotipo 7 se presentan 8 subgenotipos. El aislado de la cepa 0396-03 empleada en este
estudio es una cepa de genotipo VIId (111).
Respecto a las diferencias con cepas de vacuna como Lasota, estas diferencias llegan a ser en
el caso de algunas cepas de hasta un 24%. La cepa de campo 0396-03 usada en este estudio
tiene una diferencia genética estimada de 22,8% según lo observado en el anexo 5 obtenido a
partir de las comparaciones de secuencia hechas con el fragmento secuenciado a partir de la
región 5’ del genoma de la cepa de campo. Es bastante probable que a nivel promedio la
diferencia con Lasota a nivel de secuencia del resto del genoma sea similar.
110
La importancia de esta variación genética, es que ésta se traduce en cambios a nivel de
aminoácidos en las proteínas del virus. Esto a su vez conduce a cambios conformacionales en
los epitopes del virus, reconocidos por el sistema inmune haciendo que tal reconocimiento pierda
afinidad.
Los cambios pueden incluir epitopes relacionados tanto con la respuesta humoral como celular.
Cuando la inmunidad está basada en la vacunación con una cepa cómo Lasota, la respuesta
estará orientada a reconocer la conformación de sus epitopes.
Si la variación genética de una cepa de campo se ha traducido en variación antigénica importante
con respecto a la vacuna empleada para inmunizar, esto dificultaría la efectividad de la respuesta
frente a la cepa variante.
Como se observa en la literatura sobre variación antigénica de cepas del genotipo VIId (124),
este presenta variaciones antigénicas importantes con respecto a la cepa de vacuna Lasota.
El suero hiperinmune generado por Lasota tiene un reconocimiento ineficiente del antígeno viral
de VIId como lo muestran los ensayos de IH (122). Quizás, porque el reconocimiento que
epitopes de la cepa VIId por anticuerpos generados contra la cepa Lasota ha perdido fuerza de
asociación y afinidad.
La pérdida de afinidad molecular de los epitopes que guía el reconocimiento del patógeno, podría
hacer ineficiente el reconocimiento de concentraciones muy diluidas del virus de desafío
requiriendose concentraciones elevadas y ostenidas de anticuerpos heterólogos para
neutralizarlo (122).
Dado lo anterior, es probable entonces, que el virus no sea, en muchos casos, eficientemente
neutralizado y que la respuesta no se active con la fuerza suficiente permitiendo que el patógeno
pueda permanecer en el organismo por un periodo más largo antes de ser detectado y aclarado.
A dosis bajas el virus probablemente tenga un comportamiento de replicación más gradual y
dosis continuadas podrían fortalecer la expansión del virus generando más focos de infección.
Cuando el sistema inmune se activa probablemente ya el virus haya logrado una expansión más
generalizada alcanzando órganos clave del sistema inmune.
111
Si el efecto sobre el sistema inmune producido por la secreción de citoquinas por órganos como
el bazo (101, 109, 110), que se da por infecciones con este tipo de cepas es relativamente fuerte,
esto puede restringir al sistema inmune limitando su respuesta y haciendo que persistan más las
patologías y a su vez, haciéndolo también más susceptible al efecto de reinfecciones y a generar
mayores niveles de excreción tal y como ha sido observado en los ensayos realizados en este
estudio.
Respecto de la infección repetitiva dosis elevadas, en este estudio se observaron signos claros
de efecto sobre los órganos linfoides, sobre todo en la bursa. Sin embargo, las cargas virales
alcanzadas fueron bajas o moderadas. Quizás la dosificación repetida logra efectos patológicos
debido precisamente al efecto de esta estimulación repetida sobre el sistema inmune. Muchos
de los estudios reportados, han sido hechos con dosis 10 a 100 veces más elevadas que las aquí
empleadas. Los niveles de excreción ultraelevados observados en este estudio, abren las
puertas a ensayos con dosis repetidas ultraelevadas.
4.4 Excreción, persistencia y variabilidad del virus
En los resultados, se pudo observar que la excreción del virus se hace principalmente por ruta
fecal. Es factible pensar, que las partículas de heces secas podrían proporcionar al virus un
vehículo que lo protegería del medio ambiente incrementando su estabilidad y su viabilidad.
Esto le permitiría también ser transportado y diseminado pasivamente a sitios y entrar en
contacto con aves de otras especies o también aves comerciales en las cuales el virus se
replicará y se excretará nuevamente.
Estas dinámicas de recirculación persistente pueden hacer que el virus se mantenga durante
mucho tiempo instalado alrededor de sitios donde se han presentado brotes recurrentes.
Eventualmente, está recirculación con ciclos de excreción-replicación, conduciría que el virus
acumulase gradualmente mayor variabilidad, posiblemente aumentando su distancia genética
con cepas de vacuna haciendo también más difícil la contención y control de la enfermedad
Por consiguiente, es importante tratar de controlar no sólo sobre la enfermedad sino también
sobre la excreción del virus, pues esta puede ayudar a incrementar su variabilidad genética
contribuyendo a que resurjan problemas y a que se expanda la enfermedad.
112
El virus en los ensayos, parece haber penetrado muy bien el componente inmune asociado al
sistema digestivo sobre todo en tratamientos de dosis bajas. En los grupos con mayor excreción,
se presentó peritonitis. Aparte de que puede ser síntoma de infecciones por la propia flora y por
tanto de inmunosupresión, esta también podría estar asociada a secreción citoquinas
inflamatorias como la vista en otros estudios (101, 109, 110).
Así que es probable que no solo el bazo, sino también otros componentes linfoides cuando
presentan niveles muy elevados del virus puedan generar respuesta inflamatoria la cual puede
afectar el sistema inmune.
4.5 Medidas morfométricas y valores de dosis infectivas En las muestras, se observó una buena correlación entre los análisis de las medidas
morfométricas y los valores de dosis infectivas obtenidos de las pruebas de biología molecular.
Generalmente, en aquellos tratamientos y edades donde se detectaron cambios morfométricos
indicativos de anomalía en órganos del sistema inmune, también se detectaron niveles virales
elevados o importantes.
A diferencia de esto, en el último muestreo del tratamiento con dosis única moderada, hubo dos
animales en los que se observó una caída en los valores de parámetros morfométricos de la
bursa. Sin embargo, los niveles virales a esta edad para este tratamiento, fueron moderados.
Una posibilidad, es que esto pueda ser debido a la peritonitis. Es probable que, si esta tiene que
ver con bacterias, puedan ser estas las que estén mediando la inmunosupresión. Si esto fuese
así, sería bastante preocupante para el organismo
4.6 Modelo estadístico y medidas morfométricas
Control positivo
Los análisis descriptivos iniciales permitieron detectar un comportamiento evidentemente distinto
de las medidas morfométricas de la bursa y del bazo. Estos cambios consistieron en un aumento
dramático del peso del bazo a edades tempranas seguido por una caída brusca y una leve
recuperación posterior hacia el final.
113
En el caso de la bursa, se observa una caída muy marcada del peso del órgano; al parecer
subsiguiente al incremento fuerte del tamaño del bazo. Luego de la caída de peso inicial, el peso
del órgano se mantuvo en valores muy bajos indicando una atrofia clara e irreversible.
Los cambios morfométricos en el control positivo fueron todos estadísticamente significativos
para la prueba paramétrica de la Anova y para las pruebas no paramétrica de Kruskal-Wallis y
de la Mediana.
Los cambios morfométricos presentados por el control positivo son concordantes con lo
reportado en la literatura para los cambios observados en órganos linfoides en infecciones con
cepas del genotipo VIId (100, 101)
Aves no vacunadas
Los análisis descriptivos iniciales mostraron que, en el tratamiento de dosis única moderada, se
veían alteraciones en el peso del bazo a las edades 4-5 a 5-4 siendo más marcadas estas
alteraciones a la edad de 5-1. Igualmente, alteraciones en el índice Bursal a las edades de 5-1 y
5-4 siendo más marcadas a la edad 5-1.
Para el tratamiento de dosis moderada repetitiva, estas alteraciones se observaban a la edad de
5-1 en el peso del bazo y algo más sutiles en el índice bursal.
Los análisis con la prueba estadística paramétrica de Anova y las pruebas no paramétricas e
Kruskal-Wallis y de la mediana efectuados con todos los tratamientos no mostraron diferencias
significativas en el caso de los tratamientos de aves vacunadas sólo el tratamiento control
positivo exhibía diferencias significativas.
Sin embargo, el estudio de los distintos indicadores de la prueba paramétrica de Anova y las
pruebas no paramétricas de Kruskal Wallis y de la mediana, mostraban una tendencia de peso
del bazo elevado en el tratamiento de dosis moderada única entre las edades 4-5 a 5-4. Se
observaba también un incremento comparativamente fuerte del peso del bazo a la edad de 5-1
en el tratamiento de dosis repetitiva moderada.
114
Igualmente seguía siendo sugerente la disminución del peso de la bursa a la edad de 5-1 para
el tratamiento 4.
Posanálisis
El Posanálisis que se realizó corriendo las tres pruebas estadísticas, pero sin incluir el control
positivo en los análisis. Este se hizo para las edades de 4-5 y 5-1 y confirmó que para el
tratamiento de dosis única moderada, las diferencias de peso en los bazos eran estadísticamente
significativas, con respecto a los otros tratamientos de aves vacunadas y el control negativo,
reafirmando la tendencia observada de mantener elevado el peso del bazo.
Igualmente, esta estrategia confirmó como significativo el incremento en el peso del bazo en el
tratamiento de dosis repetida moderada a la edad de 5-1.
En el Posanálisis, se confirmó también que para el tratamiento de dosis única moderada, la
diferencia existente con respecto a los otros tratamientos de aves vacunadas y al grupo control
negativo, respecto del valor del índice Bursal a la edad de 5-1 era significativa. Confirmando una
caída importante en el peso de la bursa respecto de los otros tratamientos de aves vacunadas
en esta edad lo cual, podría ser evidencia sugerente de que puede haberse presentado
inmunosupresión.
115
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1 Conclusiones
El comportamiento del control positivo del ensayo fue coincidente en cuanto los cambios
observados en los órganos linfoides y las manifestaciones patológicas tempranas mostrados por
cepas del genotipo VIId. Sin embargo, el patrón de mortalidad observado en la cepa 0396-03 fue
mucho menos agudo y más extendido en el tiempo que el usualmente observado en cepas de
este genotipo. El mayor efecto de los tratamientos con dosis moderadas únicas o repetitivas y con dosis bajas
repetitivas en aves vacunadas, fue un incremento muy marcado en la excreción fecal del virus
implicando un nivel de replicación viral importante en componentes del sistema digestivo. De acuerdo los análisis estadísticos, se observó una tendencia significativa a mantener bazos
con peso consistentemente elevado en el tratamiento de dosis única moderada entre las edades
4-5 a 5-4 e incrementos significativos y marcados del peso de este en las aves del tratamiento
con dosis repetitiva moderada a la edad de 5-1. La presencia de niveles virales importantes en el bazo fue coincidente con los valores de peso
elevado en este indicando que estos contribuían a dicha alteración. Sin embargo, muchas veces
persistieron estas alteraciones morfométricas del bazo aun con niveles virales bajos indicando
que otros factores podrían estar incidiendo indirectamente en dicha alteración. La presencia de niveles virales importantes en otros órganos coincidió muchas veces en los
tratamientos de infección con dosis moderadas en aves vacunadas a la presencia alteraciones
morfométricas significativas y consistentes principalmente en el bazo, pero también en la bursa.
Este nivel de coincidencia fue más sostenido cuando los niveles virales de excreción fecal eran
elevados. En los tratamientos ensayados en este estudio, los tratamientos de dosis moderada única,
Repetitiva, de dosis bajas repetitivas y dosis muy bajas repetidas diariamente, generaron
infecciones que alcanzaban niveles virales más elevados en órganos y mayor excreción viral que
el tratamiento con dosis elevadas estándar.
Cuando las dosis infectivas son de niveles bajos o muy bajos, las dosis repetitivas son necesarias
para generar cuadros infecciosos sólidos. Sin esta repetitividad, las dosis bajas y muy bajas
generan con mayor probabilidad infecciones de tipo incipiente.
.
116
5.2 Recomendaciones Es necesario, profundizar en este tipo de estudios con un esquema más riguroso que incluya
medidas morfométricas y pruebas de molecular pero también, pruebas complementarias para
monitorear el nivel de inmunidad, estudios histopatológicos y de inmunohistoquímica de las
muestras de tejidos para establecer la naturaleza de cambios producidos por la enfermedad y
los posibles fenómenos de inmunosupresión.
Se deben replicar este tipo de estudios, con cepas más actualizadas de brotes recientes de la
enfermedad, procurando que tengan un índice de patogenicidad intracerebral sin alterar, muy
probablemente semejante al exhibido por las cepas actuales de campo del virus de Newcastle.
Aunque sería interesante indagar en las causas de la atenuación.
Sería deseable hacer estudios en principio conocer qué tejidos en concreto, son los responsables
de producir los virus que generan los elevados niveles de excreción fecal, vistos en tratamientos
con dosis moderadas y bajas individuales o repetitivas. También indagar sobre los mecanismos
de replicación y persistencia del virus en ellos.
Es necesario evaluar los ensayos de desafío y protección basados únicamente en la aplicación
de la dosis estándar. Se debe considerar ensayos donde se empleen dosis de distinta
concentración yendo de dosis bajas hasta dosis altas incluyendo también, dosis repetitivas.
En este estudio, la aplicación de las dosis infectivas se hizo empleando diluciones líquidas de
stock de líquido alantoideo por vía óculo-nasal. Sería interesante realizar estudios empleando
extracto de polvo de heces esterilizado impregnado con virus, para desafíos para ver si cambia
el comportamiento, el patrón que infección del virus y si aumenta su eficiencia, sobre todo, desde
el punto de vista de la excreción y la recirculación.
También, mirar la dinámica de liberación del virus a partir de heces secas para indagar si en este
medio, se genera una especie de liberación prolongada y gradual del virus.
.
117
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Fenavi, Volumen 91.
ANEXO I
Tablas de descripción de signos clínicos y lesiones macroscópicas para cada uno de los tratamientos
Tablas de comparación de signos clínicos y lesiones macroscópicas entre los tratamientos para cada una de las edades
Lesiones y Signos clínicos Tratamiento 5, Fase 1. Infección repetitiva con dosis infectivas muy elevadas.
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Edad/Estadio Replica Bolsa de Fabricio y Timo Bazo Tonsila Cecal, Placas de Peyer y Tejido Rectal
4 semanas, 2 días. 10 días Posvacunacíon, muestreo previo al desafío infectivo. Aplicación 1er dosis infectiva
1 Bolsa de Fabricio con hemorragia ligera 1 ave de 4
Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
2
Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
4 Semanas, 5 días; 3 días luego de la 1era Dosis infectiva. Aplicación 2a dosis infectiva
1 Bolsa de Fabricio edematosa 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4, Tejido Rectal reactivo 1 ave de 4
2 Bolsa de Fabricio hemorrágica 2 aves de 4 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 3 aves de 4
5 Semanas, 1 día. 3 días luego de la 2a Dosis infectiva. Apli cación 3a Dosis infectiva
1 Bolsa de Fabricio edematosa 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4
2 Bolsa de Fabricio hemorrágica 1 ave de 4, Bolsa de Fabricio edematosa 1 ave de 4
Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4
5 semanas, 4 días 3 días luego de la 3a Dosis infectiva. Aplicación 4a dosis infectiva.
1 Bolsa de Fabricio edematosa 3 aves de 4, Bolsa de Fabricio hemorrágica 1 ave de 4
Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4
2 Bolsa de Fabricio edematosa 4 aves de 4 Tejido Rectal Reactivo 3 aves de 4
6 semanas. Último muestreo 3 días luego de la 4a dosis infectiva
1 Bolsa de Fabricio edematosa 3 aves de 5 Tonsila Cecal Reactiva 5 aves de 5, Tejido Rectal Reactivo 3 aves de 5
2 Bolsa de Fabricio edematosa 4 aves de 5 Esplenomegalia 1 ave de 5 Tonsila Cecal Reactiva 5 aves de 5, Tejido Rectal Reactivo 4 aves de 5
Tratamiento 5 Fase 1. Las aves son vacunadas a la 3a semana. Posteriormente, luego de la 4a semana, se aplican a las aves 4 dosis de virus de campo
equivalentes a 10.000 dosis infectivas aplicando cada dosis de forma periódica cada 3 días (infección repetitiva con dosis muy elevada). La tabla describe las
lesiones y signos clínicos observados en las aves durante los muestreos efectuados a lo largo del experimento.
Lesiones y Signos clínicos Tratamiento 5, Fase 1. Infección repetitiva con dosis infectivas muy elevadas.
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Edad/Estadio Replica Tráquea, Laringe, pulmón Encéfalo Otros Signos y Lesiones
4 semanas, 2 días. 10 días Posvacunacíon, muestreo previo al desafío infectivo. Aplicación 1er dosis infectiva
1 Saco vitelino retenido 2 aves de 4
2
Saco vitelino retenido 2 aves de 4
4 Semanas, 5 días; 3 días luego de la 1era Dosis infectiva. Aplicación 2a dosis infectiva
1 Traqueítis 1 ave de 4
2 Laringitis 1 ave de 4
5 Semanas, 1 día. 3 días luego de la 2a Dosis infectiva. Aplicación 3a Dosis infectiva
1 Laringitis 1 ave de 4; Traqueítis 1 ave de 4
2 Laringitis 1 ave de 4; Traqueítis 1 ave de 4 Saco vitelino retenido 1 ave de 4
5 semanas, 4 días; 3 días luego de la 3a Dosis infectiva. Aplicación 4a dosis infectiva.
1 Traqueítis catarral 1 ave de 4; Enfisema Pulmonar 1 ave de 4
2 Traqueítis catarral 2 aves de 4; Enfisema Pulmonar 1 ave de 4
6 semanas. Último muestreo 3 días luego de la 4a dosis infectiva
1 Laringitis 2 aves de 5 Encéfalo Congestionado 1 ave de 5
2 Laringitis 5 aves de 5; Traqueítis 5 aves de 5; Enfisema Pulmonar 1 ave de 5
Tratamiento 5 Fase 1. Las aves son vacunadas a la 3a semana. Posteriormente, poco después de la 4a semana, se aplican a las aves 4 dosis de virus de campo
equivalentes a 10.000 dosis infectivas aplicando cada dosis de forma periódica cada 3 días (infección repetitiva con dosis muy elevada). La tabla describe las
lesiones y signos clínicos observados en las aves durante los muestreos efectuados a lo largo del experimento.
Lesiones y Signos clínicos Tratamiento 3 (Control Positivo)
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Edad/Estadio Replica Bolsa de Fabricio y Timo Bazo Tonsila Cecal, Placas de Peyer y Tejido Rectal
4 semanas, 2 días; muestreo previo al desafío con 10.000 D.I .(dosis estándar). Aplicación desafío
1 Bolsa de Fabricio de Tamaño disminuido 1 ave de 4
Bazo de Tamaño disminuido 1 ave de 4 Tonsila Cecal reactiva 2 aves de 4
2 Bolsa de Fabricio con Hemorragia ligera 1 ave de 4
Tonsila Cecal reactiva 2 aves de 4
4 Semanas, 5 días; 3 días luego de la Aplicación de la Dosis infectiva estándar única
1 Timo disminuido de Tamaño 1 ave de 4 Necrosis Multifocal del Bazo 2 aves de 4; Bazo Congestionado 1 ave de 4.
Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal reactivo 4 aves de 4
2 Bolsa de Fabricio de Tamaño disminuido 1 ave de 4; Bolsas de Fabricio Hemorrágicas 4 aves de 4
Necrosis Multifocal del Bazo 2 aves de 4; Bazos que lucen de igual tamaño que las Bolsas de Fabricio.
Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 4 aves de 4
5 Semanas, 1 día. 6 días luego de la Aplicación de la dosis estándar infectiva única.
1 Atrofia de la Bolsa de Fabricio a 4 aves de 4; Atrofia del Timo 4 aves de 4.
Bazos de igual Tamaño col las Bolsas de Fabricio
Tonsila Cecal Reactiva a Necrótica 4 aves de 4; Tejido Rectal Reactivo 4 aves de 4; Placas de Peyer Activas 4 aves de 4.
2 Atrofia de la Bolsa de Fabricio 2 aves de 2; Atrofia del Timo 2 aves de 2 Bolsa de Fabricio Hemorrágicas 2 aves de 2
Tonsila Cecal de Reactiva a Necrótica 2 aves de 2, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 2Placas de Peyer de Activas a Necróticas 2 aves de 2
5 semanas, 4 días 9 días luego de la de la Aplicación de la dosis estándar infectiva única
1 Atrofia de la Bolsa de Fabricio 3 aves de 3; Atrofia de Timo 3 aves de 3; Bolsa de Fabricio hemorrágica 1 ave de 4
Tonsila Cecal Reactiva 2 aves de 3, Tejido Rectal Reactivo 1 ave de 3
2 Atrofia de la Bolsa de Fabricio 1 ave de 2; Atrofia del timo 1 ave de 2.
Tejido Rectal Reactivo 1 ave de 2; Tonsila Cecal reactiva 1 ave de 2.
6 semanas, Último muestreo 12 días luego de la aplicación de la dosis infectiva estándar.
1 No se hizo necropsia todas las aves habían muerto
2 No se hizo necropsia todas las aves habían muerto
Tratamiento 3 (Control positivo). En este tratamiento, las aves no son vacunadas a la 3a semana. Estos animales permanecen sin vacunar. Posteriormente,
poco después de la 4a semana, las aves son desafiadas con una dosis única equivalente a 10.000 dosis infectivas (dosis de desafío estándar). La tabla describe
las Lesiones y Signos clínicos observados en las aves durante los muestreos efectuados a lo largo del experimento.
Lesiones y Signos clínicos Tratamiento 3 (Control Positivo)
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Edad/Estadio Replica Tráquea, Laringe, pulmón Encéfalo Otros Signos y Lesiones
4 semanas, 2 días; muestreo previo al desafío con 10.000 D.I (dosis estándar).
1 Saco vitelino retenido y hemorrágico 1 ave de 4
2
Saco vitelino retenido 1 ave de 4
4 Semanas, 5 días; 3 días luego de la Aplicación de la Dosis infectiva estándar
1 Traqueítis catarral 3 aves de 4 Saco vitelino retenido 1 ave de 4; Blefaritis 3 aves de 4; Conjuntivitis 4 aves de 4
2 Laringitis 3 aves de 4; Traqueítis 3 aves de 4
Encéfalo Congestionado 1 ave de 4 Proventrículo Hemorrágico 1 ave de 4
5 Semanas, 1 día. 6 días luego de la Aplicación de la dosis estándar infectiva única.
1 Laringitis 4 aves de 4; Traqueítis 4 aves de 4
Encéfalo Congestionado 3 aves de 4 Proventrículo Hemorrágico 4 aves de 4; Conjuntivitis 4 aves de 4.
2 Laringitis 2 aves de 2; Traqueítis 1 ave de 2 Encéfalo Congestionado 1 ave de 4 Conjuntivitis 2 aves de 2; Proventrículo Hemorrágico 2 aves de 2
5 semanas, 4 días 9 días luego de la de la Aplicación de la dosis estándar infectiva única
1 Laringitis 3 aves de 3; Tapón traqueal 1 ave de 3
Encéfalo Congestionado 2 aves de 3 Proventrículo Hemorrágico 1 ave de 3; Conjuntivitis 3 aves de 3; Deshidratación 3 aves de 3
2 Laringitis 2 aves de 2 Encéfalo Congestionado 1 ave de 2 Conjuntivitis 2 aves de 2; Proventrículo Hemorrágico 1 ave de 2
6 semanas, Último muestreo 12 días luego de la aplicación de la dosis infectiva estándar.
1 No se hizo necropsia todas las aves habían muerto
2 No se hizo necropsia todas las aves habían muerto
Tratamiento 3 (Control positivo). En este tratamiento, las aves no son vacunadas a la 3a semana. Estos animales permanecen sin vacunar. Posteriormente,
poco después de la 4a semana, las aves son desafiadas con una dosis única equivalente a 10.000 dosis infectivas (dosis de desafío estándar). La tabla describe
las Lesiones y Signos clínicos observados en las aves durante los muestreos efectuados a lo largo del experimento.
Lesiones y Signos clínicos Tratamiento 1 (Control Negativo)
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Edad/Estadio Replica Bolsa de Fabricio y Timo Bazo Tonsila Cecal, Placas de Peyer y Tejido Rectal
4 semanas, 2 días 1 Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
2
Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
4 Semanas, 5 días 1 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4
2 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4
5 Semanas, 1 día. 1 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4
2 Bazo aumentado de Tamaño 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4
5 semanas, 4 días 1 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4
2 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo leve 1 ave de 4
6 semanas. Último muestreo 1 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 5, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 5
2 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 5, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 5
Tratamiento 1 Control Negativo. En este Tratamiento, las aves no recibieron ninguna dosis de virus de vacuna Lasota; tampoco se les aplicó ninguna dosis de
virus de cepa de campo virulenta. Estas aves fueron simplemente mantenidas hasta la edad de 6 semanas, tomándose las muestras respectivas en las edades
de muestreo. La tabla describe las lesiones y signos clínicos observados en las aves durante los muestreos efectuados a lo largo del experimento.
Lesiones y Signos clínicos Tratamiento 1 (Control Negativo)
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Edad/Estadio Replica Tráquea, Laringe, pulmón Encéfalo Otros Signos y Lesiones
4 semanas, 2 días 1
2 Tráquea con ligero contenido Mucoso 4 aves de 4
4 Semanas, 5 días. 1 Saco vitelino retenido 1 ave de 4
2 Saco vitelino retenido 1 ave de 4
5 Semanas, 1 día. 1
2 Saco vitelino retenido 1 ave de 4
5 semanas, 4 días 1
2 Saco vitelino retenido 1 ave de 4
6 semanas. Último muestreo 1 tráqueas con ligero contenido mucoso 2 aves de 5
2 tráqueas con ligero contenido mucoso 1 ave de 5
Tratamiento 1 Control Negativo. En este Tratamiento, las aves no recibieron ninguna dosis de virus de vacuna Lasota; tampoco se les aplicó ninguna dosis de
virus de cepa de campo virulenta. Estas aves fueron simplemente mantenidas hasta la edad de 6 semanas, tomándose las muestras respectivas en las edades
de muestreo. La tabla describe las lesiones y signos clínicos observados en las aves durante los muestreos efectuados a lo largo del experimento.
Lesiones y Signos clínicos Tratamiento 4. Desafío con una dosis única moderada.
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Edad/Estadio Replica Bolsa de Fabricio y Timo Bazo Tonsila Cecal, Placas de Peyer y Tejido Rectal
4 semanas, 2 días. 10 días Posvacunacíon, muestreo previo al desafío infectivo con dosis única moderada
1 Bolsas de Fabricio desuniformes Bazo de Tamaño disminuido 1 ave de 4 Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
2 Bolsas de Fabricio desuniformes
Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
4 Semanas, 5 días; 3 días luego de la aplicación dosis infectiva única
1 Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4
2 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4
5 Semanas, 1 día. 6 días luego de la aplicación dosis infectiva única
1 Timo disminuido de tamaño 1 ave de 4; Desuniformidad en el Tamaño de las Bolsas de Fabricio.
Necrosis Multifocal Subcapsular del Bazo 1 ave de 4
Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 1 ave de 4
2 Bolsas de Fabricio Edematosas 3 aves de 4 Esplenomegalia 1 ave de 4; Los Bazos no guardan relación 1:2 con las Bolsas de Fabricio.
Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4; Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4; Placas de Peyer Activas 1 ave de 4.
5 semanas, 4 días 9 días luego de la aplicación dosis infectiva única
1 Bolsa de Fabricio de Tamaño disminuido 2 aves de 4; Bolsa de Fabricio Edematosa 2 aves de 4
Esplenomegalia 2 aves de 4 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4; Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4; Tejido Rectal Reactivo 1 ave de 4
2 Bolsa de Fabricio de Tamaño disminuido 2 aves de 4; Bolsa de Fabricio Edematosa 2 aves de 4.
Esplenomegalia 2 aves de 4 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4; placas de Peyer activas 1 ave de 4
6 semanas. Último muestreo 12 días luego de la aplicación dosis infectiva única
1 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4; Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4
2 Bolsa de Fabricio de Tamaño disminuido 2 aves de 4;
Tratamiento 4. En este Tratamiento, las aves son vacunadas a la 3a semana. Posteriormente, poco después de la 4a semana se les aplica a las aves una única
dosis de virus de campo equivalente a 150-200 Dosis infectivas (Dosis de nivel moderado-bajo). La tabla describe las lesiones y signos clínicos observados en
las aves durante los muestreos efectuados a lo largo del experimento.
Lesiones y Signos clínicos Tratamiento 4. Desafío con una dosis única moderada-baja.
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Edad/Estadio Replica Tráquea, Laringe, pulmón Encéfalo Otros Signos y Lesiones
4 semanas, 2 días. 10 días Posvacunacíon, muestreo previo al desafío infectivo con dosis única moderada
1 Laringitis 4 aves de 4; Traqueítis 1 ave de 4.
2 Laringitis 1 ave de 4; Traqueítis 1 ave de 4.
4 Semanas, 5 días; 3 días luego de la aplicación dosis infectiva única
1 Laringitis 2 aves de 4
2 Laringitis 2 aves de 4
5 Semanas, 1 día. 6 días luego de la aplicación dosis infectiva
1 Laringitis 3 aves de 4; Traqueítis 1 ave de 4 Ave de Tamaño disminuido 1 ave de 4
2 Ave de Tamaño disminuido 1 ave de 4
5 semanas, 4 días. 9 días luego de la aplicación dosis infectiva única
1 Traqueítis 1 ave de 4; tráquea con contenido mucoso abundante 1 ave de 4
Encéfalo Congestionado 1 ave de 4 Peritonitis 3 aves de 4; Peritonitis con contenido caseoso 1 ave de 4
2 Laringitis 1 ave de 4; Traqueítis con contenido mucoso 1 ave de 4
Encéfalo congestionado 1 ave de 4 Peritonitis 2 aves de 4
6 semanas. Último muestreo 12 días luego de la aplicación dosis infectiva única
1 Tráquea con contenido mucoso 2 aves de 4 Peritonitis 1 ave de 4
2 Tráquea con contenido mucoso 1 ave de 4; enfisema pulmonar 1 ave de 4.
Encéfalo congestionado 1 ave de 4
Tratamiento 4. En este Tratamiento, las aves son vacunadas a la 3a semana. Posteriormente, poco después de la 4a semana se les aplica a las aves una única
dosis de virus de campo equivalente a 150-200 Dosis infectivas (Dosis de nivel moderado-bajo). La tabla describe las lesiones y signos clínicos observados en
las aves durante los muestreos efectuados a lo largo del experimento.
Lesiones y Signos clínicos Tratamiento 6 infección repetitiva con dosis muy bajas
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Edad/Estadio Replica Bolsa de Fabricio y Timo Bazo Tonsila Cecal, Placas de Peyer y Tejido Rectal
4 semanas, 2 días. 10 días Posvacunacíon, muestreo previo al desafío infectivo. Aplicación 1er dosis infectiva
1 Bolsa de Fabricio Congestionada 1 ave de 4 Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal reactiva 3 aves de 4
2 Bolsas de Fabricio de Tamaño dispar
Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
4 Semanas, 5 días; 3 días luego de la 1era Dosis infectiva. Aplicación 2a dosis infectiva
1 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4; Placas de Peyer Activas 1 ave de 4
2 Bolsas de Fabricio de Tamaño dispar Tonsila Cecal Reactiva 2 aves de 4; Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4; Placas de Peyer Activas 1 ave de 4
5 Semanas, 1 día. 3 días luego de la 2a Dosis infectiva. Aplicación 3a Dosis infectiva
1 Timo de Tamaño disminuido 1 ave de 4; Tonsila Cecal Reactiva 2 aves de 4; Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4
2 Timos de Tamaño disminuido 1 ave de 4; Bolsa de Fabricio edematosa 2 aves de 4; Bolsas de Fabricio desuniformes.
Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 2 aves de 4; Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4.
5 semanas, 4 días 3 días luego de la 3a Dosis infectiva. Aplicación 4a dosis infectiva.
1 Bolsa de Fabricio Edematosa 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva2 aves de 4;Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4; Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4.
2 Bolsa de Fabricio edematosa 1 ave de 4; Bolsa de Fabricio Hemorragia ligera 1 ave de 4.
Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4; Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4 Tejido Rectal Reactivo 1 ave de 4.
6 semanas. Último muestreo 3 días luego de la 4a dosis infectiva
1 - - -
2 - - -
Tratamiento 6. En este Tratamiento, las aves son vacunadas a la 3a semana. Posteriormente, poco después de la 4a semana, se aplican a las aves 4 dosis de
virus de campo equivalentes a 1,5-2 dosis infectivas aplicando cada dosis de forma periódica cada 3 días (infección repetitiva con dosis muy baja). La tabla
describe las lesiones y signos clínicos observados en las aves durante los muestreos efectuados a lo largo del experimento.
Lesiones y Signos clínicos Tratamiento 6 infección repetitiva con dosis muy bajas
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Edad/Estadio Replica Tráquea, Laringe, pulmón Encéfalo Otros Signos y Lesiones
4 semanas, 2 días. 10 días Posvacunacíon, muestreo previo al desafío infectivo. Aplicación 1er dosis infectiva
1 Laringitis 3 aves de 4
2 Laringitis 2 aves de 4; Traqueítis con contenido Mucoso 1 ave de 4
4 Semanas, 5 días; 3 días luego de la 1era Dosis infectiva. Aplicación 2a dosis infectiva
1 Laringitis 1 ave de 4
2 Laringitis 1 ave de 4
5 Semanas, 1 día. 3 días luego de la 2a Dosis infectiva. Aplicación 3a Dosis infectiva
1 Laringitis 3 aves de 4; Traqueítis 1 ave de 4; Encéfalo congestionado 2 aves de 4
2 Laringitis 3 aves de 4; Traqueítis 2 aves de 4
Encéfalo Congestionado 1 ave de 4
5 semanas, 4 días 3 días luego de la 3a Dosis infectiva. Aplicación 4a dosis infectiva.
1 Encéfalo Congestionado 1 ave de 4
2 Laringitis 1 ave de 4; Tráquea con contenido mucoso abundante 2 aves de 4
6 semanas. Último muestreo 3 días luego de la 4a dosis infectiva
1 - - -
2 - - -
Tratamiento 6. En este Tratamiento, las aves son vacunadas a la 3a semana. Posteriormente, poco después de la 4a semana, se aplican a las aves 4 dosis de
virus de campo equivalentes a 1,5-2 dosis infectivas aplicando cada dosis de forma periódica cada 3 días (infección repetitiva con dosis muy baja). La tabla
describe las lesiones y signos clínicos observados en las aves durante los muestreos efectuados a lo largo del experimento.
Lesiones y Signos clínicos Tratamiento 5 (Fase 2). Infección repetitiva con dosis moderadas-bajas.
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Edad/Estadio Replica Bolsa de Fabricio y Timo Bazo Tonsila Cecal, Placas de Peyer y Tejido Rectal
4 semanas, 2 días. 10 días Posvacunacíon, muestreo previo al desafío infectivo. Aplicación 1er dosis infectiva
2 Bolsas de Fabricio de Tamaño dispar
Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
4 Semanas, 5 días; 3 días luego de la 1era Dosis infectiva. Aplicación 2a dosis infectiva
2 Bolsas de Fabricio de Tamaño dispar
5 Semanas, 1 día. 3 días luego de la 2a Dosis infectiva. Aplicación 3a Dosis infectiva
2 Timo de Tamaño disminuido 2 aves de 4; Bolsa de Fabricio Edematosa 2 aves de 4; Bolsas de Fabricio de Tamaño desuniforme.
Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 2 aves de 4
5 semanas, 4 días 3 días luego de la 3a Dosis infectiva. Aplicación 4a dosis infectiva.
2 Bolsa de Fabricio edematosa 1 ave de 4 Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4; Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4
6 semanas. Último muestreo 3 días luego de la 4a dosis infectiva
2 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4; Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4;Placas de Peyer Activas 1 ave de 4.
Tratamiento 5 (Fase 2). En este Tratamiento, las aves son vacunadas a la 3a semana. Posteriormente, poco después de la 4a semana, se aplican a las aves 4
dosis de virus de campo equivalentes a 150-200 dosis infectivas aplicando cada dosis de forma periódica cada 3 días (infección repetitiva con dosis moderada-
baja). La tabla describe las lesiones y signos clínicos observados en las aves durante los muestreos efectuados a lo largo del experimento.
Lesiones y Signos clínicos Tratamiento 5 (Fase 2). Infección repetitiva con dosis moderadas-bajas.
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Edad/Estadio Replica Tráquea, Laringe, pulmón Encéfalo Otros Signos y Lesiones
4 semanas, 2 días. 10 días Posvacunacíon, muestreo previo al desafío infectivo. Aplicación 1er dosis infectiva
2 Laringitis 3 aves de 4; Traqueítis 2 aves de 4
4 Semanas, 5 días; 3 días luego de la 1era Dosis infectiva. Aplicación 2a dosis infectiva
2 Laringitis 1 ave de 4; Traqueítis 1 ave de 4
5 Semanas, 1 día. 3 días luego de la 2a Dosis infectiva. Aplicación 3a Dosis infectiva
2 Laringitis 2 aves de 4
5 semanas, 4 días 3 días luego de la 3a Dosis infectiva. Aplicación 4a dosis infectiva.
2 Tráquea con contenido mucoso 2 aves de 4 Encéfalo Congestionado 1 ave de 4
6 semanas. Último muestreo 3 días luego de la 4a dosis infectiva
2
Tratamiento 5 (Fase 2). En este Tratamiento, las aves son vacunadas a la 3a semana. Posteriormente, poco después de la 4a semana, se aplican a las aves 4
dosis de virus de campo equivalentes a 150-200 dosis infectivas aplicando cada dosis de forma periódica cada 3 días (infección repetitiva con dosis moderada-
baja). La tabla describe las lesiones y signos clínicos observados en las aves durante los muestreos efectuados a lo largo del experimento.
Comparación de Signos clínicos y lesiones de los distintos tratamientos a la edad de 4 semanas, 2 días
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión descrito
Tratamiento Replica Bolsa de Fabricio y Timo Bazo Tonsila Cecal, Placas de Peyer y Tejido Rectal
Tratamiento 1 (control negativo) 1 Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
2
Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
Tratamiento 3 (control positivo) 1 Bolsa de Fabricio de Tamaño disminuido 1 ave de 4
Bazo de Tamaño disminuido 1 ave de 4 Tonsila Cecal reactiva 2 aves de 4
2 Bolsa de Fabricio con Hemorragia ligera 1 ave de 4
Tonsila Cecal reactiva 2 aves de 4
Tratamiento 5 (Fase 1) 1 Bolsa de Fabricio con hemorragia ligera 1 ave de 4
Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
2
Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
Tratamiento 4 1 Bolsas de Fabricio desuniformes Bazo de Tamaño disminuido 1 ave de 4 Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
2 Bolsas de Fabricio desuniformes
Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
Tratamiento 6 (Fase 2) 1 Bolsa de Fabricio Congestionada 1 ave de 4 Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal reactiva 3 aves de 4
2 Bolsas de Fabricio de Tamaño dispar
Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
Tratamiento 5 (Fase 2) 2 Bolsas de Fabricio de Tamaño dispar
Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
Comparación de Signos clínicos y lesiones de los distintos tratamientos a la edad de 4 semanas, 2 días
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión descrito
Tratamiento Replica Tráquea, Laringe, pulmón Encéfalo Otros Signos y Lesiones
Tratamiento 1 (control negativo) 1
2 Tráquea con ligero contenido Mucoso 4 aves de 4
Tratamiento 3 (control positivo) 1 Saco vitelino retenido y hemorrágico 1 ave de 4
2
Saco vitelino retenido 1 ave de 4
Tratamiento 5 (Fase 1) 1 Saco vitelino retenido 2 aves de 4
2
Saco vitelino retenido 2 aves de 4
Tratamiento 4 1 Laringitis 4 aves de 4; Traqueítis 1 ave de 4.
2 Laringitis 1 ave de 4; Traqueítis 1 ave de 4.
Tratamiento 6 (Fase 2) 1 Laringitis 3 aves de 4
2 Laringitis 2 aves de 4; Traqueítis con contenido Mucoso 1 ave de 4
Tratamiento 5 (Fase 2) 2 Laringitis 3 aves de 4; Traqueítis 2 aves de 4
Comparación de Signos clínicos y lesiones de los distintos tratamientos a la edad de 4 semanas, 5 días
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión descrito
Tratamiento Replica Bolsa de Fabricio y Timo Bazo Tonsila Cecal, Placas de Peyer y Tejido Rectal
Tratamiento 1 (control negativo) 1 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4
2 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4
Tratamiento 3 (control positivo) 1 Timo disminuido de Tamaño 1 ave de 4 Necrosis Multifocal del Bazo 2 aves de 4; Bazo Congestionado 1 ave de 4.
Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal reactivo 4 aves de 4
2 Bolsa de Fabricio de Tamaño disminuido 1 ave de 4; Bolsas de Fabricio Hemorrágicas 4 aves de 4
Necrosis Multifocal del Bazo 2 aves de 4; Bazos que lucen de igual tamaño que las Bolsas de Fabricio.
Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 4 aves de 4
Tratamiento 5 (Fase 1) 1 Bolsa de Fabricio edematosa 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4, Tejido Rectal reactivo 1 ave de 4
2 Bolsa de Fabricio hemorrágica 2 aves de 4 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 3 aves de 4
Tratamiento 4 1 Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4
2 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4
Tratamiento 6 (Fase 2) 1 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4; Placas de Peyer Activas 1 ave de 4
2 Bolsas de Fabricio de Tamaño dispar Tonsila Cecal Reactiva 2 aves de 4; Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4; Placas de Peyer Activas 1 ave de 4
Tratamiento 5 (Fase 2) 2 Bolsas de Fabricio de Tamaño dispar
Comparación de Signos clínicos y lesiones de los distintos tratamientos a la edad de 4 semanas, 5 días
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión descrito
Tratamiento Replica Tráquea, Laringe, pulmón Encéfalo Otros Signos y Lesiones
Tratamiento 1 (control negativo) 1 Saco vitelino retenido 1 ave de 4
2 Saco vitelino retenido 1 ave de 4
Tratamiento 3 (control positivo) 1 Traqueítis catarral 3 aves de 4 Saco vitelino retenido 1 ave de 4; Blefaritis 3 aves de 4; Conjuntivitis 4 aves de 4
2 Laringitis 3 aves de 4; Traqueítis 3 aves de 4
Encéfalo Congestionado 1 ave de 4 Proventrículo Hemorrágico 1 ave de 4
Tratamiento 5 (Fase 1) 1 Traqueítis 1 ave de 4
2 Laringitis 1 ave de 4
Tratamiento 4 1 Laringitis 4 aves de 4; Traqueítis 1 ave de 4.
2 Laringitis 1 ave de 4; Traqueítis 1 ave de 4.
Tratamiento 6 (Fase 2) 1 Laringitis 1 ave de 4
2 Laringitis 1 ave de 4
Tratamiento 5 (Fase 2) 2 Laringitis 1 ave de 4; Traqueítis 1 ave de 4
Comparación de Signos clínicos y lesiones de los distintos tratamientos a la edad de 5 semanas, 1 día
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión descrito
Tratamiento Replica Bolsa de Fabricio y Timo Bazo Tonsila Cecal, Placas de Peyer y Tejido Rectal
Tratamiento 1 (control negativo) 1 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4
2 Bazo aumentado de Tamaño 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4
Tratamiento 3 (control positivo) 1 Atrofia de la Bolsa de Fabricio a 4 aves de 4; Atrofia del Timo 4 aves de 4.
Bazos de igual Tamaño col las Bolsas de Fabricio
Tonsila Cecal Reactiva a Necrótica 4 aves de 4; Tejido Rectal Reactivo 4 aves de 4; Placas de Peyer Activas 4 aves de 4.
2 Atrofia de la Bolsa de Fabricio 2 aves de 2; Atrofia del Timo 2 aves de 2 Bolsa de Fabricio Hemorrágicas 2 aves de 2
Tonsila Cecal de Reactiva a Necrótica 2 aves de 2, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 2Placas de Peyer de Activas a Necróticas 2 aves de 2
Tratamiento 5 (Fase 1) 1 Bolsa de Fabricio edematosa 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4
2 Bolsa de Fabricio hemorrágica 1 ave de 4, Bolsa de Fabricio edematosa 1 ave de 4
Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4
Tratamiento 4 1 Bolsas de Fabricio desuniformes Bazo de Tamaño disminuido 1 ave de 4 Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
2 Bolsas de Fabricio desuniformes
Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal reactiva 4 aves de 4
Tratamiento 6 (Fase 2) 1 Timo de Tamaño disminuido 1 ave de 4; Tonsila Cecal Reactiva 2 aves de 4; Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4
2 Timos de Tamaño disminuido 1 ave de 4; Bolsa de Fabricio edematosa 2 aves de 4; Bolsas de Fabricio desuniformes.
Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 2 aves de 4; Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4.
Tratamiento 5 (Fase 2) 2 Timo de Tamaño disminuido 2 aves de 4; Bolsa de Fabricio Edematosa 2 aves de 4; Bolsas de Fabricio de Tamaño desuniforme.
Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 2 aves de 4
Comparación de Signos clínicos y lesiones de los distintos tratamientos a la edad de 5 semanas, 1 día
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión descrito
Tratamiento Replica Tráquea, Laringe, pulmón Encéfalo Otros Signos y Lesiones
Tratamiento 1 (control negativo) 1
2 Saco vitelino retenido 1 ave de 4
Tratamiento 3 (control positivo) 1 Laringitis 4 aves de 4; Traqueítis 4 aves de 4
Encéfalo Congestionado 3 aves de 4 Proventrículo Hemorrágico 4 aves de 4; Conjuntivitis 4 aves de 4.
2 Laringitis 2 aves de 2; Traqueítis 1 ave de 2
Encéfalo Congestionado 1 ave de 4 Conjuntivitis 2 aves de 2; Proventrículo Hemorrágico 2 aves de 2
Tratamiento 5 (Fase 1) 1 Laringitis 1 ave de 4; Traqueítis 1 ave de 4
2 Laringitis 1 ave de 4; Traqueítis 1 ave de 4 Saco vitelino retenido 1 ave de 4
Tratamiento 4 1 Laringitis 3 aves de 4; Traqueítis 1 ave de 4 Ave de Tamaño disminuido 1 ave de 4
2 Ave de Tamaño disminuido 1 ave de 4
Tratamiento 6 (Fase 2) 1 Laringitis 3 aves de 4; Traqueítis 1 ave de 4;
Encéfalo congestionado 2 aves de 4
2 Laringitis 3 aves de 4; Traqueítis 2 aves de 4
Encéfalo Congestionado 1 ave de 4
Tratamiento 5 (Fase 2) 2 Laringitis 2 aves de 4
Comparación de Signos clínicos y lesiones de los distintos tratamientos a la edad de 5 semanas, 4 días
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Tratamiento Replica Bolsa de Fabricio y Timo Bazo Tonsila Cecal, Placas de Peyer y Tejido Rectal
Tratamiento 1 (control negativo) 1 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4
2 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo leve 1 ave de 4
Tratamiento 3 (control positivo) 1 Atrofia de la Bolsa de Fabricio 3 aves de 3; Atrofia de Timo 3 aves de 3; Bolsa de Fabricio hemorrágica 1 ave de 4
Tonsila Cecal Reactiva 2 aves de 3, Tejido Rectal Reactivo 1 ave de 3
2 Atrofia de la Bolsa de Fabricio 1 ave de 2; Atrofia del timo 1 ave de 2.
Tejido Rectal Reactivo 1 ave de 2; Tonsila Cecal reactiva 1 ave de 2.
Tratamiento 5 (Fase 1) 1 Bolsa de Fabricio edematosa 3 aves de 4, Bolsa de Fabricio hemorrágica 1 ave de 4
Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4, Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4
2 Bolsa de Fabricio edematosa 4 aves de 4 Tejido Rectal Reactivo 3 aves de 4
Tratamiento 4 1 Bolsa de Fabricio de Tamaño disminuido 2 aves de 4; Bolsa de Fabricio Edematosa 2 aves de 4
Esplenomegalia 2 aves de 4 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4; Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4; Tejido Rectal Reactivo 1 ave de 4
2 Bolsa de Fabricio de Tamaño disminuido 2 aves de 4; Bolsa de Fabricio Edematosa 2 aves de 4.
Esplenomegalia 2 aves de 4 Tonsila Cecal Reactiva 4 aves de 4; placas de Peyer activas 1 ave de 4
Tratamiento 6 (Fase 2) 1 Bolsa de Fabricio Edematosa 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva2 aves de 4;Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4; Tejido Rectal Reactivo 2 aves de 4.
2 Bolsa de Fabricio edematosa 1 ave de 4; Bolsa de Fabricio Hemorragia ligera 1 ave de 4.
Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4; Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4 Tejido Rectal Reactivo 1 ave de 4.
Tratamiento 5 (Fase 2) 2 Bolsa de Fabricio edematosa 1 ave de 4 Esplenomegalia 1 ave de 4 Tonsila Cecal Reactiva 3 aves de 4; Tonsila Cecal Necrótica 1 ave de 4
Comparación de Signos clínicos y lesiones de los distintos tratamientos a la edad de 5 semanas, 4 días
Signos y Lesiones presentes en distintos órganos/ Número de Aves del total muestreado que presentan el signo o lesión específico
Tratamiento Replica Tráquea, Laringe, pulmón Encéfalo Otros Signos y Lesiones
Tratamiento 1 (control negativo) 1
2 Saco vitelino retenido 1 ave de 4
Tratamiento 3 (control positivo) 1 Laringitis 3 aves de 3; Tapón traqueal 1 ave de 3
Encéfalo Congestionado 2 aves de 3 Proventrículo Hemorrágico 1 ave de 3; Conjuntivitis 3 aves de 3; Deshidratación 3 aves de 3
2 Laringitis 2 aves de 2 Encéfalo Congestionado 1 ave de 2 Conjuntivitis 2 aves de 2; Proventrículo Hemorrágico 1 ave de 2
Tratamiento 5 (Fase 1) 1 Traqueítis catarral 1 ave de 4; Enfisema Pulmonar 1 ave de 4
2 Traqueítis catarral 2 aves de 4; Enfisema Pulmonar 1 ave de 4
Tratamiento 4 1 Traqueítis 1 ave de 4; tráquea con contenido mucoso abundante 1 ave de 4
Encéfalo Congestionado 1 ave de 4 Peritonitis 3 aves de 4; Peritonitis con contenido caseoso 1 ave de 4
2 Laringitis 1 ave de 4; Traqueítis con contenido mucoso 1 ave de 4
Encéfalo congestionado 1 ave de 4 Peritonitis 2 aves de 4
Tratamiento 6 (Fase 2) 1 Encéfalo Congestionado 1 ave de 4
2 Laringitis 1 ave de 4; Tráquea con contenido mucoso abundante 2 aves de 4
Tratamiento 5 (Fase 2) 2 Tráquea con contenido mucoso 2 aves de 4
Encéfalo Congestionado 1 ave de 4
ANEXO 2
Tabla de similitud y diferencia genética de las cepas empleadas en la construcción del árbol filogenético
Percent Identity
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
1 77.1 78.0 91.6 82.5 84.4 82.2 82.0 78.1 85.0 85.0 98.7 82.9 82.3 97.0 97.3 83.7 91.2 89.5 92.8 99.1 93.4 86.2 84.3 86.1 80.8 94.2 78.7 85.6 97.9 96.1 96.0 81.9 83.1 83.7 96.1 90.7 85.9 79.0 89.1 89.2 91.0 84.9 1 0396-03 Col
2 29.1 98.5 76.2 78.9 80.1 79.3 85.0 98.7 81.3 81.0 77.4 79.9 79.8 77.5 77.1 80.1 76.3 76.5 77.1 77.4 76.9 78.0 80.5 81.9 79.9 78.1 96.4 76.8 77.4 77.8 77.4 77.7 80.5 80.2 77.1 76.0 77.4 96.7 77.2 77.1 76.9 80.4 2 AF077761.1-LaSota G II
3 27.6 1.5 77.1 78.7 80.4 79.3 85.0 99.3 81.3 81.0 78.3 79.9 79.8 78.4 78.0 80.4 77.2 77.1 78.0 78.3 77.8 78.7 80.8 81.9 79.9 78.7 96.4 77.5 78.3 78.4 78.3 77.5 80.2 80.5 78.0 76.9 78.1 96.7 77.8 77.7 77.8 80.7 3 AF309418.1-B1 G II
4 9.0 30.8 29.3 83.1 85.0 82.5 82.6 77.2 86.7 86.4 91.8 83.8 83.2 91.3 91.6 84.3 92.4 91.2 91.8 92.2 92.1 87.9 84.9 86.2 81.3 89.5 77.5 86.7 90.6 91.0 91.0 82.5 84.1 84.3 92.4 91.9 87.3 77.8 90.7 91.0 91.9 85.3 4 AY562985.1-cockatoo-Indonesia-14698- 90�
5 20.9 26.4 26.8 20.1 95.4 91.3 85.3 78.9 89.2 88.9 82.9 91.3 90.3 83.1 83.2 95.1 83.7 82.2 83.8 83.1 83.8 83.2 94.6 89.4 83.8 84.1 79.5 81.6 81.9 83.2 83.1 98.7 93.6 95.4 83.8 83.2 83.1 79.8 81.7 81.9 83.5 95.2 5 AY562987.1-gamefowl-U.S.(CA)-211472-02 �
6 18.2 24.6 24.2 17.4 4.9 95.5 87.6 80.5 90.4 90.1 84.9 95.2 94.2 84.7 84.9 98.2 85.3 84.1 86.7 85.0 86.4 84.1 99.0 92.4 86.2 85.6 81.6 82.3 83.8 84.6 84.3 94.6 96.7 98.5 85.3 84.9 84.3 81.6 83.7 83.8 85.2 99.6 6 AY562990.1-Largo-71 G V c
7 21.2 25.7 25.7 20.8 9.5 4.7 85.0 79.5 87.9 87.9 82.6 96.7 95.7 82.2 82.3 94.5 82.8 81.3 84.0 82.8 83.8 81.3 95.1 89.7 84.6 83.1 80.5 80.1 81.9 82.0 82.0 90.3 93.4 94.8 82.9 82.3 81.4 80.5 80.8 81.0 82.9 95.7 7 EF065682.1-rAnhinga G V a
8 21.5 17.4 17.4 20.6 17.0 14.0 17.3 85.5 88.3 88.0 82.3 85.6 84.9 82.0 81.9 86.7 82.3 82.5 82.9 82.3 83.2 83.2 87.1 89.5 84.3 84.7 85.6 82.8 82.0 82.6 81.7 84.7 86.2 86.5 82.5 82.3 83.2 85.9 82.8 82.8 82.2 87.6 8 EF201805.1-Mukteswar G III
9 27.4 1.4 0.8 29.1 26.5 23.9 25.4 16.8 81.7 81.4 78.4 79.8 79.6 78.6 78.1 80.5 77.4 77.1 78.1 78.4 78.0 78.3 81.3 82.3 80.1 78.9 96.6 77.4 78.4 78.6 78.4 77.7 80.4 80.7 78.1 77.1 78.0 96.9 77.8 77.7 78.0 80.8 9 EU289028.1-VG-GA G II
10 17.4 22.8 22.8 15.2 12.0 10.6 13.7 13.1 22.1 99.7 84.9 88.5 87.4 85.0 85.2 90.1 86.4 86.2 86.2 85.0 85.3 85.9 90.3 94.5 87.1 85.9 81.9 84.3 84.4 85.0 84.7 88.2 89.4 90.3 86.1 85.9 85.8 82.2 85.2 85.2 86.2 90.7 10 FJ751918.1-QH1 G VIII
11 17.4 23.3 23.3 15.6 12.4 10.9 13.7 13.5 22.6 0.3 84.9 88.2 87.1 84.7 84.9 89.8 86.4 85.9 86.2 85.0 85.3 85.6 90.0 94.2 86.8 85.6 81.6 84.0 84.4 84.7 84.4 87.9 89.1 90.0 85.9 85.9 85.5 81.9 84.9 84.9 86.2 90.4 11 FJ751919.1-QH4 G VIII
12 1.4 28.6 27.2 8.9 20.3 17.5 20.6 21.1 27.0 17.6 17.6 83.1 82.5 97.5 97.8 84.1 91.2 89.5 93.0 99.6 93.9 86.5 84.7 85.9 81.0 94.6 79.0 85.9 97.2 96.6 96.4 82.5 83.8 84.1 96.6 90.7 86.4 79.3 89.1 89.2 91.0 85.3 12 FJ872531.1-Muscovy duck-Fujian G VII d
13 20.1 24.7 24.7 18.9 9.5 5.0 3.4 16.5 25.0 12.9 13.3 19.9 98.7 83.2 83.4 94.2 83.5 82.5 84.7 83.2 84.6 82.3 94.8 89.7 85.0 84.3 80.8 81.0 82.3 82.8 82.5 90.3 92.8 94.5 83.8 83.1 82.2 80.8 82.0 82.2 83.7 95.4 13 GQ288381.2-Cormorant-US(CA)-1997 G V a
14 21.0 25.0 25.0 19.8 10.7 6.2 4.5 17.6 25.2 14.3 14.7 20.8 1.4 82.6 82.8 93.1 82.6 82.0 83.8 82.6 84.0 82.0 93.7 88.9 84.9 83.1 80.7 80.4 82.0 82.2 81.9 89.2 92.1 93.4 83.2 82.2 81.6 80.7 81.6 81.7 83.1 94.3 14 GQ288386.2-Cormorant-US(NV)-2005 G V a
15 3.1 28.3 26.9 9.4 20.0 17.7 21.2 21.4 26.6 17.4 17.8 2.6 19.7 20.6 97.6 84.0 90.4 88.9 92.5 97.9 94.0 87.1 84.9 85.5 80.8 95.1 78.9 86.1 95.5 97.6 97.5 82.6 83.4 84.0 96.0 90.0 86.5 79.2 88.5 88.6 90.6 85.2 15 GQ994434.1-QG-Hebei-07 G VII e
16 2.8 29.1 27.7 9.0 19.9 17.6 21.0 21.7 27.4 17.2 17.7 2.3 19.5 20.4 2.5 84.4 91.0 89.2 92.5 98.2 93.7 87.1 84.7 86.2 80.7 94.8 78.7 86.4 95.8 96.7 96.6 82.8 83.2 84.4 96.3 90.6 86.5 79.0 88.8 88.9 90.9 85.3 16 GU564399.1-FMW G VII b
17 19.2 24.5 24.1 18.4 5.2 1.8 5.8 15.2 23.8 10.9 11.3 18.5 6.2 7.3 18.7 18.1 84.6 83.4 85.6 84.3 85.3 83.1 97.8 91.3 86.1 84.6 81.3 81.6 83.1 83.8 83.5 94.0 95.5 99.4 84.6 84.1 83.2 81.3 82.9 83.1 84.4 98.4 17 HM117720.1-NDV-P05 G V c
18 9.6 30.5 29.0 8.2 19.2 17.0 20.4 21.1 28.7 15.6 15.6 9.6 19.3 20.6 10.5 9.8 17.9 91.0 91.3 91.6 91.6 85.9 85.2 86.2 82.6 88.8 77.7 86.1 89.8 90.7 90.9 83.1 84.3 84.6 91.8 99.6 86.2 78.0 90.9 90.9 99.3 85.6 18 HQ697254.1-Banjarmasin-010-10 G VII i
19 11.6 30.3 29.3 9.6 21.4 18.6 22.6 20.9 29.3 15.8 16.2 11.6 20.8 21.5 12.3 12.0 19.6 9.8 89.5 89.8 89.2 85.5 84.0 86.1 81.6 88.2 77.1 85.2 88.5 88.6 88.8 81.6 83.8 83.4 90.1 90.6 84.9 77.4 97.8 97.8 90.3 84.4 19 HQ697255.1-Sukorejo-019-10 G VII h
20 7.7 29.2 27.7 8.9 19.0 15.1 18.7 20.2 27.5 15.8 15.8 7.5 17.6 18.9 8.0 8.0 16.5 9.4 11.6 93.4 98.2 85.9 86.5 87.4 81.9 90.3 78.7 85.0 91.3 91.6 91.3 83.8 85.6 85.6 93.7 90.9 85.6 79.0 88.8 88.9 91.2 86.8 20 JF343538.1-ND-03-018 G VII f
21 0.9 28.6 27.2 8.3 20.1 17.3 20.4 21.1 26.9 17.4 17.4 0.5 19.7 20.6 2.1 1.8 18.3 9.0 11.2 7.0 94.3 86.8 84.9 86.1 81.1 95.1 79.0 86.2 97.6 97.0 96.9 82.6 83.7 84.3 97.0 91.2 86.5 79.3 89.4 89.5 91.5 85.5 21 JN400896.1-SDSG01-2011 G VIId
22 7.0 29.4 27.9 8.5 19.0 15.5 18.9 19.7 27.7 17.0 17.0 6.5 17.8 18.7 6.3 6.7 16.9 9.0 12.0 1.8 6.0 86.7 86.2 86.5 81.4 90.6 78.6 86.1 91.9 93.4 93.1 83.5 85.0 85.3 94.3 91.2 86.4 78.9 89.1 89.2 91.8 86.5 22 JN618348.1-XJ-2-97 G VII f
23 15.7 27.5 26.4 13.5 19.8 18.5 22.5 19.7 27.1 16.1 16.5 15.3 20.9 21.4 14.5 14.5 20.0 16.1 16.8 16.1 14.9 15.1 83.4 85.6 82.9 85.9 79.3 89.2 85.3 87.0 86.7 82.6 82.9 83.1 87.6 85.5 98.1 79.6 85.6 85.3 86.1 84.1 23 JN800306.1-Peru-2008 G XII
24 18.4 23.8 23.5 17.6 5.7 1.1 5.2 14.6 22.8 10.7 11.1 17.7 5.5 6.7 17.5 17.8 2.3 17.2 18.8 15.3 17.6 15.7 19.6 91.9 85.6 85.2 82.0 81.6 83.7 84.4 84.1 93.6 96.6 98.1 85.2 84.7 83.8 82.0 83.5 83.7 85.0 99.1 24 JQ247691.1-Ca-2098-71 G V c
25 16.0 21.9 21.9 15.8 11.8 8.2 11.4 11.6 21.2 5.9 6.2 16.2 11.4 12.4 16.8 15.8 9.4 15.8 16.0 14.2 16.0 15.4 16.5 8.7 87.3 85.8 83.1 84.3 85.5 85.2 84.9 88.6 91.0 91.6 86.5 85.8 85.8 83.4 85.3 85.3 86.4 92.4 25 JX012096.2-AF2240-I G VIII
26 23.2 24.6 24.6 22.6 19.0 15.7 17.9 18.3 24.3 14.6 15.0 23.0 17.3 17.5 23.2 23.5 15.9 20.6 22.2 21.7 22.8 22.3 20.0 16.5 14.4 81.7 80.8 81.6 81.1 81.1 80.5 83.4 86.1 86.1 81.1 82.2 82.3 81.1 81.6 81.6 82.8 86.4 26 JX119193.1-DominicanRepublic-2008 G XVI
27 6.2 27.5 26.5 11.5 18.6 16.5 20.0 17.7 26.3 16.3 16.7 5.7 18.3 20.0 5.2 5.5 17.9 12.5 13.2 10.7 5.2 10.3 16.0 17.1 16.4 22.0 79.8 85.5 92.7 94.5 94.3 84.0 84.3 84.6 93.4 88.3 85.5 80.1 87.7 87.9 88.6 85.8 27 JX193075.1-Guangxi-14-2002 G VII e
28 26.3 3.7 3.7 28.5 25.5 22.2 23.8 16.6 3.6 21.9 22.4 25.9 23.3 23.6 26.0 26.4 22.6 28.1 29.2 26.4 25.9 26.6 25.4 21.6 20.1 23.2 24.8 78.4 78.6 79.2 78.4 78.3 81.7 81.4 78.6 77.4 78.4 99.7 77.8 77.7 78.3 81.9 28 JX316216.1-R2B G III
29 16.5 29.7 28.5 15.1 22.3 21.2 24.4 20.4 28.7 18.5 18.9 16.1 23.0 24.0 15.9 15.5 22.2 15.9 17.2 17.4 15.7 15.9 12.0 22.3 18.4 22.0 16.6 26.9 84.4 85.8 85.8 81.3 81.1 81.6 87.0 85.6 88.2 78.7 85.0 85.3 85.9 82.3 29 KC152048.1-GD450-2011 G XII
30 2.1 28.6 27.2 10.3 21.8 19.0 21.7 21.5 26.9 18.3 18.3 2.9 21.0 21.5 4.7 4.4 20.0 11.2 12.9 9.5 2.5 8.8 16.9 19.2 16.8 22.8 7.9 26.6 18.2 94.6 94.5 81.3 82.8 83.1 94.6 89.4 84.7 78.9 88.0 88.2 89.7 84.3 30 KC542897.1-Tianjin-01-2007 G VIIb
31 4.0 27.9 27.0 9.8 19.9 18.0 21.5 20.6 26.7 17.5 17.9 3.6 20.4 21.3 2.4 3.4 19.0 10.1 12.7 9.1 3.1 7.0 14.7 18.2 17.2 22.8 5.8 25.7 16.3 5.7 99.0 82.8 82.9 83.8 95.1 90.3 86.7 79.5 88.5 88.6 90.6 84.9 31 KC542899.1-JILIN-2008 G VIIb
32 4.2 28.6 27.1 9.7 20.0 18.4 21.4 21.9 26.9 17.8 18.3 3.7 20.8 21.7 2.6 3.6 19.4 9.9 12.5 9.4 3.2 7.3 15.1 18.6 17.6 23.7 6.0 26.8 16.3 5.9 1.1 82.6 82.9 83.5 95.1 90.4 86.4 78.7 88.3 88.5 90.7 84.6 32 KC542904.1-Shandong-01-2009 G VIIb
33 21.8 28.4 28.8 21.0 1.4 5.7 10.7 17.8 28.5 13.3 13.7 20.9 10.7 12.0 20.6 20.5 6.4 20.1 22.3 19.0 20.7 19.4 20.6 6.9 12.7 19.6 18.8 27.4 22.7 22.7 20.5 20.7 92.5 94.3 83.4 82.6 82.5 78.6 81.1 81.3 82.9 94.2 33 KF767466.1-Belize-Spanish Lookout-2008 �
34 19.9 23.7 24.2 18.5 6.8 3.4 7.0 15.7 24.0 11.8 12.2 18.9 7.7 8.6 19.5 19.7 4.7 18.3 18.9 16.4 19.1 17.2 20.1 3.5 9.8 15.9 18.3 21.9 22.8 20.4 20.2 20.1 8.0 95.8 84.1 84.1 82.8 82.0 83.4 83.4 84.1 96.9 34 KJ123642.1-Brazil-SJM-75 G V c
35 19.2 24.3 23.9 18.4 4.9 1.5 5.5 15.4 23.6 10.7 11.1 18.5 5.8 7.0 18.7 18.2 0.6 18.0 19.7 16.5 18.4 16.9 20.0 2.0 9.1 16.0 17.9 22.4 22.3 20.1 19.0 19.4 6.0 4.3 84.6 84.1 83.2 81.4 82.9 83.1 84.4 98.7 35 KJ577136.1-Chimalhuacan G V c
36 4.0 29.1 27.7 8.2 19.0 16.9 20.1 20.8 27.4 16.0 16.2 3.5 18.9 19.7 4.2 3.9 17.9 8.9 10.8 6.7 3.1 6.0 13.9 17.1 15.4 22.7 7.0 26.6 14.7 5.7 5.2 5.2 19.6 18.5 17.9 91.5 86.7 78.9 89.7 89.8 91.6 85.8 36 KJ782375.1-go-CH-GD-QY-1997 G VII e
37 10.1 30.9 29.5 8.7 19.9 17.6 21.0 21.1 29.2 16.2 16.2 10.1 19.9 21.3 11.0 10.3 18.5 0.5 10.3 9.9 9.6 9.6 16.7 17.8 16.4 21.2 13.0 28.6 16.5 11.8 10.7 10.5 20.7 18.5 18.6 9.2 85.8 77.7 90.4 90.4 98.8 85.2 37 KP776462.1-Pak-AW-14 G VII i
38 16.1 28.6 27.4 14.3 20.0 18.3 22.3 19.7 27.6 16.3 16.8 15.5 21.2 22.1 15.2 15.3 19.7 15.7 17.6 16.5 15.3 15.5 2.0 18.9 16.3 20.9 16.6 26.8 13.3 17.7 15.1 15.5 20.8 20.3 19.8 15.1 16.3 78.7 85.0 84.7 86.4 84.3 38 KR732614.1-Peacock-Peru-2011 G XII
39 25.8 3.4 3.4 28.0 25.0 22.2 23.8 16.2 3.2 21.5 21.9 25.4 23.3 23.6 25.6 25.9 22.6 27.6 28.7 25.9 25.4 26.1 24.9 21.6 19.7 22.7 24.4 0.3 26.4 26.1 25.2 26.3 26.9 21.5 22.4 26.1 28.1 26.3 78.1 78.0 78.6 81.9 39 KT445901.1-Komarov G II
40 12.1 29.0 28.1 10.1 22.1 19.2 23.3 20.5 28.1 17.2 17.7 12.1 21.5 22.2 12.9 12.5 20.3 9.9 2.3 12.5 11.8 12.1 16.5 19.5 17.0 22.1 13.8 28.0 17.4 13.5 12.9 13.1 23.0 19.5 20.3 11.4 10.5 17.3 27.5 99.4 90.4 84.0 40 KT760568.1-Guizhou-1032-2012 G VII h
41 11.9 29.2 28.3 9.8 21.8 19.0 23.0 20.5 28.3 17.2 17.7 12.0 21.2 21.9 12.7 12.3 20.0 9.9 2.3 12.3 11.6 11.9 16.9 19.2 17.0 22.1 13.6 28.2 17.0 13.3 12.7 12.9 22.7 19.5 20.1 11.2 10.5 17.8 27.7 0.6 90.4 84.1 41 KT760569.1-goose-Yunnan-1200-2013 G VII�
42 9.7 29.4 28.0 8.7 19.5 17.2 20.2 21.3 27.7 15.8 15.8 9.7 19.1 20.0 10.3 9.9 18.2 0.8 10.7 9.6 9.2 8.9 15.9 17.4 15.6 20.3 12.7 27.1 16.1 11.4 10.3 10.1 20.3 18.5 18.2 9.0 1.2 15.5 26.6 10.5 10.5 85.5 42 KU885948.1-Peacock-MZS-UVAS-Pak-2014 G �
43 17.6 24.0 23.6 16.9 5.0 0.5 4.5 14.0 23.4 10.2 10.5 16.9 4.8 6.0 17.1 17.0 1.7 16.5 18.2 15.0 16.8 15.3 18.5 0.9 8.2 15.5 16.3 21.7 21.1 18.4 17.6 17.9 6.2 3.2 1.4 16.3 17.1 18.3 21.7 18.8 18.6 16.7 43 OR-CHIA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
fecha*TRATAMIENTO
INDICE BURSAL
fecha = 4-2
Descriptivosa
INDICE BURSAL
N Media
Desviación
estándar Error estándar
95% del intervalo de confianza
para la media
Límite inferior Límite superior
1,0 7 4,897 ,5903 ,2231 4,352 5,443
2,0 4 6,116 2,1857 1,0929 2,638 9,594
3,0 8 5,239 1,3988 ,4946 4,070 6,408
4,0 8 4,675 ,6097 ,2156 4,166 5,185
5,1 8 5,110 ,9548 ,3376 4,311 5,908
5,2 4 5,479 1,6101 ,8050 2,917 8,041
6,0 8 4,800 ,9833 ,3476 3,978 5,622
Total 47 5,090 1,1511 ,1679 4,752 5,428
Descriptivosa
INDICE BURSAL
Mínimo Máximo
1,0 4,0 5,7
2,0 4,6 9,3
3,0 3,6 7,5
4,0 3,8 5,4
5,1 4,1 7,1
5,2 4,1 7,7
6,0 3,7 6,0
Total 3,6 9,3
a. fecha = 4-2
ANOVAa
INDICE BURSAL
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos 7,306 6 1,218 ,908 ,499
Dentro de grupos 53,649 40 1,341
Total 60,954 46
a. fecha = 4-2
Gráficos de medias
fecha = 4-5
Descriptivosa
INDICE BURSAL
N Media
Desviación
estándar Error estándar
95% del intervalo de confianza
para la media
Límite inferior Límite superior
1,0 8 5,893 1,2046 ,4259 4,886 6,900
2,0 4 4,883 ,4139 ,2069 4,224 5,541
3,0 8 4,565 ,7829 ,2768 3,911 5,220
4,0 8 5,393 ,4984 ,1762 4,977 5,810
5,1 8 4,841 1,1132 ,3936 3,911 5,772
5,2 4 4,897 ,4770 ,2385 4,138 5,656
6,0 8 4,902 ,9804 ,3466 4,082 5,721
Total 48 5,081 ,9451 ,1364 4,806 5,355
Descriptivosa
INDICE BURSAL
Mínimo Máximo
1,0 4,7 8,0
2,0 4,3 5,3
3,0 3,0 5,6
4,0 4,6 6,1
5,1 3,9 7,2
5,2 4,5 5,6
6,0 3,5 6,3
Total 3,0 8,0
a. fecha = 4-5
ANOVAa
INDICE BURSAL
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos 9,191 6 1,532 1,916 ,101
Dentro de grupos 32,786 41 ,800
Total 41,977 47
a. fecha = 4-5
Gráficos de medias
fecha = 5-1
Descriptivosa
INDICE BURSAL
N Media
Desviación
estándar Error estándar
95% del intervalo de confianza
para la media
Límite inferior Límite superior
1,0 7 4,736 ,4238 ,1602 4,344 5,128
2,0 4 5,676 ,6024 ,3012 4,717 6,634
3,0 6 2,013 ,4369 ,1784 1,554 2,471
4,0 8 3,844 1,1486 ,4061 2,884 4,804
5,1 8 5,489 ,8266 ,2922 4,798 6,180
5,2 4 5,151 3,0013 1,5006 ,375 9,927
6,0 8 5,647 1,1531 ,4077 4,683 6,611
Total 45 4,631 1,6461 ,2454 4,136 5,125
Descriptivosa
INDICE BURSAL
Mínimo Máximo
1,0 4,3 5,5
2,0 4,9 6,3
3,0 1,6 2,6
4,0 2,0 5,7
5,1 4,1 6,6
5,2 3,4 9,6
6,0 4,2 7,8
Total 1,6 9,6
a. fecha = 5-1
ANOVAa
INDICE BURSAL
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos 65,757 6 10,960 7,789 ,000
Dentro de grupos 53,469 38 1,407
Total 119,226 44
a. fecha = 5-1
Gráficos de medias
fecha = 5-4
Descriptivosa
INDICE BURSAL
N Media
Desviación
estándar Error estándar
95% del intervalo de confianza
para la media
Límite inferior Límite superior
1,0 8 5,865 ,9816 ,3470 5,044 6,685
2,0 4 4,771 ,7370 ,3685 3,598 5,943
3,0 5 1,594 ,4587 ,2051 1,025 2,164
4,0 8 4,443 1,4826 ,5242 3,204 5,683
5,1 8 5,158 ,9836 ,3478 4,336 5,981
5,2 4 5,430 ,7908 ,3954 4,172 6,689
6,0 8 5,296 ,8448 ,2987 4,589 6,002
Total 45 4,775 1,5394 ,2295 4,312 5,237
Descriptivosa
INDICE BURSAL
Mínimo Máximo
1,0 4,1 7,0
2,0 4,0 5,7
3,0 1,1 2,1
4,0 2,2 6,3
5,1 4,0 7,3
5,2 4,4 6,1
6,0 4,2 6,6
Total 1,1 7,3
a. fecha = 5-4
ANOVAa
INDICE BURSAL
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos 66,023 6 11,004 10,932 ,000
Dentro de grupos 38,248 38 1,007
Total 104,271 44
a. fecha = 5-4
Gráficos de medias
fecha = 6-0
Descriptivosa
INDICE BURSAL
N Media
Desviación
estándar Error estándar
95% del intervalo de confianza
para la media
Límite inferior Límite superior
1,0 10 4,976 1,0510 ,3324 4,224 5,728
4,0 8 4,306 1,0636 ,3761 3,417 5,195
5,1 10 5,474 ,5484 ,1734 5,081 5,866
5,2 4 4,198 ,1880 ,0940 3,899 4,497
Total 32 4,867 ,9636 ,1703 4,519 5,214
Descriptivosa
INDICE BURSAL
Mínimo Máximo
1,0 3,9 7,4
4,0 2,7 5,7
5,1 4,5 6,3
5,2 4,0 4,4
Total 2,7 7,4
a. fecha = 6-0
ANOVAa
INDICE BURSAL
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos 8,109 3 2,703 3,661 ,024
Dentro de grupos 20,674 28 ,738
Total 28,784 31
a. fecha = 6-0
Gráficos de medias
Pruebas NPar
fecha = 4-2
Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
INDICE BURSAL 1,0 7 23,71
2,0 4 31,75
3,0 8 24,38
4,0 8 20,56
5,0 8 25,13
6,0 8 20,94
7,0 4 26,75
Total 47
a. fecha = 4-2
Estadísticos de pruebaa,b,c
INDICE
BURSAL
Chi-cuadrado 2,404
Gl 6
Sig. asintótica ,879
a. fecha = 4-2
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
INDICE BURSAL > Mediana 4 2 4 4 4 3
<= Mediana 3 2 4 4 4 5
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
7,0
INDICE BURSAL > Mediana 2
<= Mediana 2
a. fecha = 4-2
Estadísticos de pruebaa,b
INDICE
BURSAL
N 47
Mediana 4,956
Chi-cuadrado ,622c
Gl 6
Sig. asintótica ,996
a. fecha = 4-2
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 14 casillas (100,0%) han
esperado frecuencias menores que
5. La frecuencia mínima de casilla
esperada es 2,0.
fecha = 4-5
Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
INDICE BURSAL 1,0 8 34,25
2,0 4 22,38
3,0 8 17,75
4,0 8 31,88
5,0 8 18,13
6,0 8 23,06
7,0 4 21,50
Total 48
a. fecha = 4-5
Estadísticos de pruebaa,b,c
INDICE
BURSAL
Chi-cuadrado 9,979
Gl 6
Sig. asintótica ,126
a. fecha = 4-5
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
INDICE BURSAL > Mediana 6 2 2 7 2 4
<= Mediana 2 2 6 1 6 4
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
7,0
INDICE BURSAL > Mediana 1
<= Mediana 3
a. fecha = 4-5
Estadísticos de pruebaa,b
INDICE
BURSAL
N 48
Mediana 4,971
Chi-cuadrado 11,500c
Gl 6
Sig. asintótica ,074
a. fecha = 4-5
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 14 casillas (100,0%) han
esperado frecuencias menores que
5. La frecuencia mínima de casilla
esperada es 2,0.
fecha = 5-1
Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
INDICE BURSAL 1,0 7 23,14
2,0 4 34,00
3,0 6 4,00
4,0 8 15,50
5,0 8 31,63
6,0 8 32,13
7,0 4 19,75
Total 45
a. fecha = 5-1
Estadísticos de pruebaa,b,c
INDICE
BURSAL
Chi-cuadrado 25,528
Gl 6
Sig. asintótica ,000
a. fecha = 5-1
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
INDICE BURSAL > Mediana 3 4 0 1 7 6
<= Mediana 4 0 6 7 1 2
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
7,0
INDICE BURSAL > Mediana 1
<= Mediana 3
a. fecha = 5-1
Estadísticos de pruebaa,b
INDICE
BURSAL
N 45
Mediana 4,700
Chi-cuadrado 22,132c
Gl 6
Sig. asintótica ,001
a. fecha = 5-1
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 14 casillas (100,0%) han
esperado frecuencias menores que
5. La frecuencia mínima de casilla
esperada es 2,0.
fecha = 5-4
Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
INDICE BURSAL 1,0 8 33,00
2,0 4 19,50
3,0 5 3,00
4,0 8 19,75
5,0 8 23,88
6,0 8 26,63
7,0 4 29,00
Total 45
a. fecha = 5-4
Estadísticos de pruebaa,b,c
INDICE
BURSAL
Chi-cuadrado 18,486
gl 6
Sig. asintótica ,005
a. fecha = 5-4
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
INDICE BURSAL > Mediana 6 1 0 3 4 5
<= Mediana 2 3 5 5 4 3
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
7,0
INDICE BURSAL > Mediana 3
<= Mediana 1
a. fecha = 5-4
Estadísticos de pruebaa,b
INDICE
BURSAL
N 45
Mediana 5,046
Chi-cuadrado 9,983c
gl 6
Sig. asintótica ,125
a. fecha = 5-4
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 14 casillas (100,0%) han
esperado frecuencias menores que
5. La frecuencia mínima de casilla
esperada es 2,0.
fecha = 6-0
Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
INDICE BURSAL 1,0 10 15,70
4,0 8 12,88
5,0 10 23,60
7,0 4 8,00
Total 32
a. fecha = 6-0
Estadísticos de pruebaa,b,c
INDICE
BURSAL
Chi-cuadrado 10,280
gl 3
Sig. asintótica ,016
a. fecha = 6-0
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
INDICE BURSAL > Mediana 5 0 0 2 9 0
<= Mediana 5 0 0 6 1 0
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
7,0
INDICE BURSAL > Mediana 0
<= Mediana 4
a. fecha = 6-0
Estadísticos de pruebaa,b
INDICE
BURSAL
N 32
Mediana 5,004
Chi-cuadrado 12,400c
gl 3
Sig. asintótica ,006
a. fecha = 6-0
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 4 casillas (28,6%) han esperado
frecuencias menores que 5. La
frecuencia mínima de casilla
esperada es 2,0.
PESO BAZO (G)
fecha = 4-2
Descriptivosa
PESO BAZO (G)
N Media
Desviación
estándar Error estándar
95% del intervalo de confianza
para la media
Límite inferior Límite superior
1,0 7 ,529 ,0756 ,0286 ,459 ,598
2,0 4 ,850 ,2646 ,1323 ,429 1,271
3,0 8 ,538 ,1506 ,0532 ,412 ,663
4,0 8 ,900 ,2619 ,0926 ,681 1,119
5,1 8 ,600 ,0926 ,0327 ,523 ,677
5,2 4 ,850 ,1000 ,0500 ,691 1,009
6,0 8 ,750 ,1927 ,0681 ,589 ,911
Total 47 ,698 ,2212 ,0323 ,633 ,763
Descriptivosa
PESO BAZO (G)
Mínimo Máximo
1,0 ,4 ,6
2,0 ,6 1,2
3,0 ,3 ,8
4,0 ,5 1,4
5,1 ,5 ,7
5,2 ,8 1,0
6,0 ,6 1,2
Total ,3 1,4
a. fecha = 4-2
ANOVAa
PESO BAZO (G)
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos 1,017 6 ,169 5,497 ,000
Dentro de grupos 1,233 40 ,031
Total 2,250 46
a. fecha = 4-2
Gráficos de medias
fecha = 4-5
Descriptivosa
PESO BAZO (G)
N Media
Desviación
estándar Error estándar
95% del intervalo de confianza
para la media
Límite inferior Límite superior
1,0 8 ,925 ,1282 ,0453 ,818 1,032
2,0 4 ,800 ,1414 ,0707 ,575 1,025
3,0 8 1,650 ,2928 ,1035 1,405 1,895
4,0 8 1,162 ,2446 ,0865 ,958 1,367
5,1 8 ,813 ,1356 ,0479 ,699 ,926
5,2 4 1,000 ,2944 ,1472 ,532 1,468
6,0 8 ,900 ,1414 ,0500 ,782 1,018
Total 48 1,058 ,3488 ,0503 ,957 1,160
Descriptivosa
PESO BAZO (G)
Mínimo Máximo
1,0 ,8 1,1
2,0 ,7 1,0
3,0 1,3 2,1
4,0 ,8 1,6
5,1 ,6 1,0
5,2 ,7 1,4
6,0 ,8 1,1
Total ,6 2,1
a. fecha = 4-5
ANOVAa
PESO BAZO (G)
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos 3,994 6 ,666 15,845 ,000
Dentro de grupos 1,722 41 ,042
Total 5,717 47
a. fecha = 4-5
Gráficos de medias
fecha = 5-1
Descriptivosa
PESO BAZO (G)
N Media
Desviación
estándar Error estándar
95% del intervalo de confianza
para la media
Límite inferior Límite superior
1,0 7 ,943 ,1718 ,0649 ,784 1,102
2,0 4 1,125 ,3202 ,1601 ,616 1,634
3,0 6 ,600 ,1789 ,0730 ,412 ,788
4,0 8 1,400 ,3703 ,1309 1,090 1,710
5,1 8 1,050 ,2330 ,0824 ,855 1,245
5,2 4 1,325 ,3403 ,1702 ,783 1,867
6,0 8 1,063 ,3068 ,1085 ,806 1,319
Total 45 1,069 ,3560 ,0531 ,962 1,176
Descriptivosa
PESO BAZO (G)
Mínimo Máximo
1,0 ,8 1,3
2,0 ,9 1,6
3,0 ,4 ,9
4,0 ,9 1,8
5,1 ,7 1,4
5,2 1,0 1,8
6,0 ,8 1,8
Total ,4 1,8
a. fecha = 5-1
ANOVAa
PESO BAZO (G)
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos 2,586 6 ,431 5,475 ,000
Dentro de grupos 2,991 38 ,079
Total 5,576 44
a. fecha = 5-1
Gráficos de medias
fecha = 5-4
Descriptivosa
PESO BAZO (G)
N Media
Desviación
estándar Error estándar
95% del intervalo de confianza
para la media
Límite inferior Límite superior
1,0 8 1,175 ,2375 ,0840 ,976 1,374
2,0 4 1,325 ,4500 ,2250 ,609 2,041
3,0 5 ,720 ,3564 ,1594 ,278 1,162
4,0 8 1,488 ,4224 ,1493 1,134 1,841
5,1 8 1,188 ,1959 ,0693 1,024 1,351
5,2 4 1,000 ,1826 ,0913 ,709 1,291
6,0 8 1,138 ,1408 ,0498 1,020 1,255
Total 45 1,173 ,3473 ,0518 1,069 1,278
Descriptivosa
PESO BAZO (G)
Mínimo Máximo
1,0 ,8 1,6
2,0 ,8 1,9
3,0 ,4 1,2
4,0 1,0 2,2
5,1 1,0 1,5
5,2 ,8 1,2
6,0 ,9 1,3
Total ,4 2,2
a. fecha = 5-4
ANOVAa
PESO BAZO (G)
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos 2,041 6 ,340 3,957 ,004
Dentro de grupos 3,267 38 ,086
Total 5,308 44
a. fecha = 5-4
Gráficos de medias
fecha = 6-0
Descriptivosa
PESO BAZO (G)
N Media
Desviación
estándar Error estándar
95% del intervalo de confianza
para la media
Límite inferior Límite superior
1,0 10 1,440 ,2066 ,0653 1,292 1,588
4,0 8 1,525 ,2659 ,0940 1,303 1,747
5,1 10 1,280 ,2486 ,0786 1,102 1,458
5,2 4 1,300 ,1826 ,0913 1,009 1,591
Total 32 1,394 ,2449 ,0433 1,305 1,482
Descriptivosa
PESO BAZO (G)
Mínimo Máximo
1,0 1,1 1,7
4,0 1,1 1,8
5,1 1,0 1,7
5,2 1,1 1,5
Total 1,0 1,8
a. fecha = 6-0
ANOVAa
PESO BAZO (G)
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos ,324 3 ,108 1,969 ,142
Dentro de grupos 1,535 28 ,055
Total 1,859 31
a. fecha = 6-0
Gráficos de medias
Pruebas NPar
fecha = 4-2 Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
PESO BAZO
(G)
1,0 7 11,50
2,0 4 32,88
3,0 8 13,63
4,0 8 35,56
5,0 8 18,00
6,0 8 28,63
7,0 4 37,38
Total 47
a. fecha = 4-2
Estadísticos de pruebaa,b,c
PESO
BAZO (G)
Chi-cuadrado 24,734
Gl 6
Sig. Asintótica ,000
a. fecha = 4-2
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
PESO BAZO
(G)
> Mediana 0 2 1 6 0
<= Mediana 7 2 7 2 8
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
6,0 7,0
PESO BAZO (G) > Mediana 2 4
<= Mediana 6 0
a. fecha = 4-2
Estadísticos de pruebaa,b
PESO
BAZO (G)
N 47
Mediana ,700
Chi-cuadrado 24,565c
Gl 6
Sig. Asintótica ,000
a. fecha = 4-2
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 10 casillas (71,4%) han esperado
frecuencias menores que 5. La
frecuencia mínima de casilla
esperada es 1,3.
fecha = 4-5
Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
PESO BAZO
(G)
1,0 8 21,19
2,0 4 11,63
3,0 8 43,50
4,0 8 32,31
5,0 8 13,63
6,0 8 19,06
7,0 4 23,00
Total 48
a. fecha = 4-5
Estadísticos de pruebaa,b,c
PESO
BAZO (G)
Chi-cuadrado 27,696
Gl 6
Sig. Asintótica ,000
a. fecha = 4-5
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
PESO BAZO
(G)
> Mediana 2 0 8 6 0
<= Mediana 6 4 0 2 8
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
6,0 7,0
PESO BAZO (G) > Mediana 2 1
<= Mediana 6 3
a. fecha = 4-5
Estadísticos de pruebaa,b
PESO
BAZO (G)
N 48
Mediana 1,000
Chi-cuadrado 26,047c
Gl 6
Sig. Asintótica ,000
a. fecha = 4-5
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 14 casillas (100,0%) han
esperado frecuencias menores que
5. La frecuencia mínima de casilla
esperada es 1,6.
fecha = 5-1
Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
PESO BAZO
(G)
1,0 7 17,07
2,0 4 26,13
3,0 6 5,00
4,0 8 33,19
5,0 8 23,63
6,0 8 23,88
7,0 4 33,88
Total 45
a. fecha = 5-1
Estadísticos de pruebaa,b,c
PESO
BAZO (G)
Chi-cuadrado 21,101
gl 6
Sig. asintótica ,002
a. fecha = 5-1
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
PESO BAZO
(G)
> Mediana 1 1 0 6 3
<= Mediana 6 3 6 2 5
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
6,0 7,0
PESO BAZO (G) > Mediana 1 3
<= Mediana 7 1
a. fecha = 5-1
Estadísticos de pruebaa,b
PESO
BAZO (G)
N 45
Mediana 1,000
Chi-cuadrado 15,268c
gl 6
Sig. asintótica ,018
a. fecha = 5-1
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 11 casillas (78,6%) han esperado
frecuencias menores que 5. La
frecuencia mínima de casilla
esperada es 1,3.
fecha = 5-4
Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
PESO BAZO
(G)
1,0 8 23,50
2,0 4 28,50
3,0 5 8,70
4,0 8 33,25
5,0 8 24,00
6,0 8 21,81
7,0 4 14,25
Total 45
a. fecha = 5-4
Estadísticos de pruebaa,b,c
PESO
BAZO (G)
Chi-cuadrado 13,647
gl 6
Sig. asintótica ,034
a. fecha = 5-4
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
PESO BAZO
(G)
> Mediana 3 3 0 6 3
<= Mediana 5 1 5 2 5
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
6,0 7,0
PESO BAZO (G) > Mediana 2 0
<= Mediana 6 4
a. fecha = 5-4
Estadísticos de pruebaa,b
PESO
BAZO (G)
N 45
Mediana 1,200
Chi-cuadrado 13,093c
gl 6
Sig. asintótica ,042
a. fecha = 5-4
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 10 casillas (71,4%) han esperado
frecuencias menores que 5. La
frecuencia mínima de casilla
esperada es 1,5.
fecha = 6-0
Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
PESO BAZO
(G)
1,0 10 18,35
4,0 8 21,44
5,0 10 12,10
7,0 4 13,00
Total 32
a. fecha = 6-0
Estadísticos de pruebaa,b,c
PESO
BAZO (G)
Chi-cuadrado 5,504
gl 3
Sig. asintótica ,138
a. fecha = 6-0
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
PESO BAZO
(G)
> Mediana 5 0 0 5 3
<= Mediana 5 0 0 3 7
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
6,0 7,0
PESO BAZO (G) > Mediana 0 2
<= Mediana 0 2
a. fecha = 6-0
Estadísticos de pruebaa,b
PESO
BAZO (G)
N 32
Mediana 1,300
Chi-cuadrado 1,983c
gl 3
Sig. asintótica ,576
a. fecha = 6-0
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 6 casillas (42,9%) han esperado
frecuencias menores que 5. La
frecuencia mínima de casilla
esperada es 1,9.
INDICE BURSAL
PESO BAZO (G)
Unidireccional
fecha = 4-5
ANOVAa
INDICE BURSAL
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos 6,641 5 1,328 1,585 ,191
Dentro de grupos 28,496 34 ,838
Total 35,137 39
a. fecha = 4-5
Gráficos de medias
fecha = 5-1
ANOVAa
INDICE BURSAL
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos 18,311 5 3,662 2,301 ,067
Dentro de grupos 52,515 33 1,591
Total 70,826 38
a. fecha = 5-1
Gráficos de medias
Unidireccional fecha = 4-5
ANOVAa
PESO BAZO (G)
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos ,633 5 ,127 3,838 ,007
Dentro de grupos 1,122 34 ,033
Total 1,756 39
a. fecha = 4-5
Gráficos de medias
fecha = 5-1
ANOVAa
PESO BAZO (G)
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos 1,063 5 ,213 2,479 ,052
Dentro de grupos 2,831 33 ,086
Total 3,894 38
a. fecha = 5-1
Gráficos de medias
Pruebas NPar fecha = 4-5 Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
INDICE BURSAL 1,0 8 27,63
2,0 4 17,38
4,0 8 25,25
5,0 8 14,38
6,0 8 18,31
7,0 4 16,50
Total 40
a. fecha = 4-5
Estadísticos de pruebaa,b,c
INDICE
BURSAL
Chi-cuadrado 7,523
gl 5
Sig. asintótica ,185
a. fecha = 4-5
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
INDICE BURSAL > Mediana 6 1 0 6 2 4
<= Mediana 2 3 0 2 6 4
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
7,0
INDICE BURSAL > Mediana 1
<= Mediana 3
a. fecha = 4-5
Estadísticos de pruebaa,b
INDICE
BURSAL
N 40
Mediana 5,100
Chi-cuadrado 8,000c
gl 5
Sig. asintótica ,156
a. fecha = 4-5
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 12 casillas (85,7%) han esperado
frecuencias menores que 5. La
frecuencia mínima de casilla
esperada es 2,0.
fecha = 5-1
Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
INDICE BURSAL 1,0 7 17,14
2,0 4 28,00
4,0 8 9,88
5,0 8 25,63
6,0 8 26,13
7,0 4 13,75
Total 39
a. fecha = 5-1
Estadísticos de pruebaa,b,c
INDICE
BURSAL
Chi-cuadrado 14,175
gl 5
Sig. asintótica ,015
a. fecha = 5-1
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
INDICE BURSAL > Mediana 2 3 0 1 6 6
<= Mediana 5 1 0 7 2 2
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
7,0
INDICE BURSAL > Mediana 1
<= Mediana 3
a. fecha = 5-1
Estadísticos de pruebaa,b
INDICE
BURSAL
N 39
Mediana 4,952
Chi-cuadrado 11,768c
gl 5
Sig. asintótica ,038
a. fecha = 5-1
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 12 casillas (85,7%) han esperado
frecuencias menores que 5. La
frecuencia mínima de casilla
esperada es 1,9.
Pruebas NPar fecha = 4-5 Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
PESO BAZO
(G)
1,0 8 21,19
2,0 4 11,63
4,0 8 31,63
5,0 8 13,63
6,0 8 19,06
7,0 4 22,38
Total 40
a. fecha = 4-5
Estadísticos de pruebaa,b,c
PESO
BAZO (G)
Chi-cuadrado 13,017
gl 5
Sig. asintótica ,023
a. fecha = 4-5
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
PESO BAZO
(G)
> Mediana 3 1 0 7 1
<= Mediana 5 3 0 1 7
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
6,0 7,0
PESO BAZO (G) > Mediana 3 2
<= Mediana 5 2
a. fecha = 4-5
Estadísticos de pruebaa,b
PESO
BAZO (G)
N 40
Mediana ,900
Chi-cuadrado 10,332c
gl 5
Sig. asintótica ,066
a. fecha = 4-5
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 12 casillas (85,7%) han esperado
frecuencias menores que 5. La
frecuencia mínima de casilla
esperada es 1,7.
fecha = 5-1
Prueba de Kruskal-Wallis
Rangosa
TRATAMIENTO N Rango promedio
PESO BAZO
(G)
1,0 7 11,57
2,0 4 20,25
4,0 8 27,31
5,0 8 17,94
6,0 8 18,06
7,0 4 27,88
Total 39
a. fecha = 5-1
Estadísticos de pruebaa,b,c
PESO
BAZO (G)
Chi-cuadrado 9,882
gl 5
Sig. asintótica ,079
a. fecha = 5-1
b. Prueba de Kruskal Wallis
c. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
Prueba de la mediana
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
PESO BAZO
(G)
> Mediana 1 1 0 6 3
<= Mediana 6 3 0 2 5
Frecuenciasa
TRATAMIENTO
6,0 7,0
PESO BAZO (G) > Mediana 1 3
<= Mediana 7 1
a. fecha = 5-1
Estadísticos de pruebaa,b
PESO
BAZO (G)
N 39
Mediana 1,000
Chi-cuadrado 11,085c
gl 5
Sig. asintótica ,050
a. fecha = 5-1
b. Variable de agrupación:
TRATAMIENTO
c. 12 casillas (85,7%) han esperado
frecuencias menores que 5. La
frecuencia mínima de casilla
esperada es 1,5.