uv-vis-nir y fluorescencia molecular. nuevas … · espectrosocopía uv-vis. todas las moléculas...
TRANSCRIPT
UV-Vis-NIR y Fluorescencia Molecular. Nuevas
herramientas analíticas para Aplicaciones
convencionales y especiales.
Longitudes de onda cortas = mayor energía.
Gamma, Rayos X: Ionización, ruptura de enlaces.
Ultravioleta y Visible: Ruptura de enlaces, ionización, transiciones
electrónicas.
Infrarrojo de cercano a lejano: Vibraciones moleculares.
Microondas a Radio: Incremento del movimiento (calentamiento).
Espectro electromagnético
Espectrosocopía UV-Vis.
Todas las moléculas orgánicas son capaces de absorber la radiación electromagnética en esa zona del espectro (casi todas también en IR).
Las energías de excitación relacionadas con los electrones que forman los enlaces más sencillos son muy elevadas de forma que su absorción se restringe a la zona del UV de vacío (<185 nm), lo que conlleva problemas de trabajo experimental.
Por encima de 185 nm la absorción se restringe a enlaces más complejos o ciertos grupos funcionales (cromóforos) con electrones de valencia con energías de excitación más bajas.
Niveles energéticos de la molécula
Procesos de absorción-emisión molecular
La temperatura puede afectarlas intensidades de emisión de diferentes formas
• Si la formación o decaimientode las especies emisivasdepende de una reacciónquímica entonces la fluorecencia quera afectada
• A temperaturas más bajas el movimiento vibracional se reduce y el camino via fluorescencia se favorece.
• Restringen la formación de complejos en el estadoexcitado.
• Permiten calcular las barrerasde energía y otras funcionestermodinámicas.
• Restringen el movimientorotacional (ej. Medidas de polarización)
Espectros de absorción, fluorescencia, fosforescencia
Stokes Shift
Transiciones activas en UV-Vis
C O
H
H
xxEjempo sencillo x =
=
= n
Transiciones en la zona UV-VIS
Desplazamientos por enlaces conjugados
Instrumentación UV-VIS
MuestraDetector de luz
Espectros
Abs
Monocromador
Concentración
Fuente
Esquemas ópticos UV-Vis
Monochromador
Muestra Detector
Haz simple
Monocromador
Detector de referencia
Beam-
Splitter
Detector de muestra
Haz dual
Cary 50
DAD
8453
Muestra
MonochromatorReference
Sample
Beam-
Splitter
Haz doble
Esquemas ópticos UV-Vis
Cary 100
Cary 300
Cary 4000
Cary 5000
Cary 6000
14
Monocromadores
Slit de entrada
Red
Slit de salida
Configuraciones con monocromador en un plano
Monocromador Ebert
Slit de entrada Slit de salidaRed
Monocromador
Czeny-Turner
Cary 50, Cary 100, Cary 300No disponemos
Esquema òptico equipo de altas prestaciones
Cary 4000, Cary 5000 y Cary 6000
Sistema óptico Littrow fuera de plano
Técnicas de muestreo en UV-Vis-NIR
Luz incidente, Io
Muestra
UV-Vis-NIR Sampling Theory
UV-Vis-NIR Sampling Theory
UV-Vis-NIR Sampling Theory
UV-Vis-NIR Sampling Theory
UV-Vis-NIR Sampling Theory
UV-Vis-NIR Sampling Theory
UV-Vis-NIR Sampling Theory
UV-Vis-NIR Sampling Theory
UV-Vis-NIR Sampling Theory
28
ANALISIS DE MUESTRAS EN DISOLUCIÓN: CARY 50
Diagrama óptico Cary 50 Características principales
Lámpara de Xenon pulsante
Inmune a la luz ambiental
Microvolúmenes, fibras ópticas. Traycell.
Gran velocidad de adquisición de datos.
80 puntos por segundo
Gran velocidad de barrido
24000 nm/min
Intervalo de trabajo. 190-1100 nm
SBW fijo de 1.5 nm
Cumple farmacopea.
Intervalo fotométrico: 3.3 UA
Luz difusa:0.05% a 220 nm método ASTM
Ruido fotométrico: <0.005 a 500nm y 2uA
Estabilidad fotométrica: < 0.0004 a 500 nm
0.74
0.76
0.78
0.8
0.82
0.84
0.86
0.88
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Ab
s (
36
6n
m)
Time (min)
Photodegradation of a light sensitive compound
Diode ArraySpectrophotometer
Cary 50 Spectrophotometer
ANALISIS DE MUESTRAS EN DISOLUCIÓN:
AGILENT 8453 DADCaracterísticas principales
Velocidad de adquisición de datos.
10 puntos por segundo
Intervalo de trabajo. 190-1100 nm
SBW fijo de 1.0 nm
Cumple farmacopea.
Intervalo fotométrico: 3.0 UA
Luz difusa:0.05% a 220 nm método ASTM
Ruido fotométrico: <0.0002 a 500nm y 0uA
Estabilidad fotométrica: < 0.001 a 500 nm
Tiempo típico de barrido. 1.5 seg
Campos de aplicación
Medio ambiente.
Nitratos, nitritos, amonios, fosfatos, boro, color.
Todo tipo de ensayos colorimétricos.
Química.
Síntesis química, cinéticas.
Biología.
Actividades enzimáticas.
Km, Constantes de inhibición. Cooperatividad.
Desnaturalización de DNA y proteínas.
Ratio, DNA/proteína.
Interacciones, stop flow.
Abs
Cinética de reacción con stop-flow .
Cuantificación de cromo hexavalente
Cuantificación de ácidos nucleicos/proteína en microvolúmenes
Accesorios para muestras líquidas
Fibras ópticas
Tray cell
Intercambiadores
automáticos de
cubetas
Sistemas de
termostatización
por peltier, y
agitación
magnética
Test de
disolución
Sippers
Automuestreadores
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS LIQUIDAS O
SOLIDAS: VARIAN CARY 100/300
Características principales
Cary 100 Cary 300
Monocromador simple doble
Intervalo trab. 190-900 nm 190-900 nm
Veloc Barrido 3000nm/min 3000nm/min
Resolución límite < 0.24 nm < 0.24 nm
Luz difusa < 0.02% < 0.0005%
Interv fotometrico 3.8 uA 5.0 uA
Ruido fotométrico <0.0008 a 2 uA <0.0008 a 2 uA
- < 0.008 a 5uA
Estab. fotométrica <0.0003 uA <0.0003uA
El SBW de el Cary 300
es completamente variable
entre los 0.2 y 4 nm en pasos de
0.1nm
Rendijas variables
La misma muestra medida con
SBW de 0.2, 2.0 y 4.0 nm.
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS LIQUIDAS O
SOLIDAS: VARIAN CARY 100/300
Mínima luz difusa: Amplia linealidad fotométrica
Muestras de
KMnO4 desde 10
mg/l a 450 mg/l
Muestras líquidas (bioquímica)
Estructura y estabilidad de proteínas.
Estructura y estabilidad de DNA y RNA. Tm, cromaticidad.
Cinéticas diferenciales.
Espectroscopía diferencial de proteínas. Interacciones.
Estudios de membranas. Orientación de Lípidos y Proteínas.
Muestras líquidas (química)
Espectroscopía diferencial.
Muestras turbias, en suspensión, o de fuerte absorbancia.
Estudios de interacción con disolventes.
Muestras sólidas.
Caracterización de muestras sólidas por reflectancia difusa.
Campos de aplicación
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS O
LIQUIDAS: VARIAN CARY 4000/5000/6000
Características principales
Cary 4000 Cary 5000 Cary 6000
Monocromador doble doble doble
Red de difracción 1200 l/mm a 250nm 1200 l/mm a 250nm 1200 l/mm a 250nm
300I/mm a 1192nm 600l/min a 1000 nm
Detectores PMT PMT y PbS smart ref PMT y AsInGa ref
Intervalo trab. 175-900 nm 175-3300 nm 175-1800 nm
Resolución < 0.048 nm < 0.048 nm <0.048nm
Luz difusa UV < 0.00007% < 0.00007% <0.00007%
Luz difusa NIR <0.0002% a1420nm <0.00001 a 1420 nm
<0.00045 a 2365nm
Interv fotometrico >8 uA >8 uA >8uA
36
Non-Measurement Phase Stepping (NMPS)
Grating moves Grating continues Sample measured atto move different wavelength
NMPS to reference
Barridos convencionales
Dark Reference
Dark Reference
Sample
Sample
Chopper moves Grating stops Sample measured atonly during same Wavelength asNMFS of the reference chopper cycle
NMPS los resultados son mucho másprecisos!
3.장점
Non-Measurement Phase Stepping (NMPS)
El NMFS asegura que lasmedidas fotométricas a una long de onda particular, se mantienenconstantes independientementede la velocidad de barrido.
Se muestran los espectrossuperpuestos de unamisma muestra medida a 1800, 900, 600, 450 y 200 nm/min
Más de 8 UA de linealidad. Medidas con filtros Hellma a partir de
cristal Schott NG1.
Una calibración a Abs@546 nm vs.
grosor nominal de los filtros permite
obtener un coeficiente de correlación
de r2 = 0.999951
Más de 3 UA de linealidad con
esfera integradora en NIR y
más de 6 en UV-Vis con Cary
5000 . Medidas con filtros Hellma a
partir de cristal Schott NG1.
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS O LIQUIDAS: AGILENT
CARY 4000/5000/6000
La adición de filtros azules
ilustra la tremenda
linearidad fotométrica de los
Cary en la zona UV-Vis.
El inserto compara la señal
obtenida con dos filtros
superpuestos con la de la
señal de uno solo
multiplicada por dos. La
diferencia resulta ser
inferior a 8 x E-08 %T
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS O LIQUIDAS: AGILENT
CARY 4000/5000/6000
Laboratorios de síntesis química, orgánica, inorgánica, polímeros,
catálisis, materiales.
Identificación de compuestos.
Análisis de estructura.
Química de coordinación.
Isómeros.
Catálisis heterogenea ·in situ”
CAMPOS DE APLICACION: AGILENT CARY 4000/5000/6000
Laboratorios de síntesis de materiales cerámicos, pinturas, recubrimientos
Análisis de color. Coordenadas cromáticas
Laboratorios de óptica, telecomunicaciones, electrónica, nuevas energías,
aeronáutica, materiales.
Reflectividad/absortividad de componentes ópticos, paneles solares, plásticos,
semiconductores, nanotubos de carbono.
Recubrimientos y grosores.
Cálculos de índices de refracción.
Compound Absorption
Edge (nm)
Band Gap Energy
(Eg; eV)
TiO2 370 3.35
K2Ti4O9 310 4.00
(C3H7NH3)2Ti4O
9
387 3.20
C6H12(NH3)2Ti4O9
384 3.23
(Fe3(CH3COO)7
OH)Ti4O9
510 2.43
Reference material
UV application note 81 – The measurement of absorption edge and band gap properties of novel nanocomposite materials
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS: AGILENT CARY
4000/5000/6000
Determinación del energy band gap de diferentes materiales por DRA
Reference material
UV application note 92 – Low reflectance measurements using the „VW‟ technique
Basado en un
ángulo de
incidencia de
7º, índice de
refracción de
1.51 y la cuenta
de 16 franjas
de interferencia
el grosor
calculado fue
de 4.95 m
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS: AGILENT CARY
4000/5000/6000
Reference material
UV application note 93 – Measuring the optical properties of photovoltaic cells using the Varian Cary 5000 UV-Vis-NIR spectrophotometer and the External DRA-2500
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS: AGILENT CARY
4000/5000/6000
Estudio de la reflectividad de células termo-solares en UV-VIS.NIR
Nota: Excelente relación
señal/ruido en las regiones de
muy baja reflectancia dentro
de la zona Vis y tambien en
NIR NIR
Este ejemplo ilustra la potencia de la
configuración del Cary 6000 con un sistema
optico específico para disminuir enormemente
la luz difusa en NIR y la mayor sensibilidad del
detector de InGaAs sobre el de PbS. Con
este sistema se consique mayor rendimiento
óptico, mejor resolución, menores tiempos de
lectura y mayor sensibilidad
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS: AGILENT CARY
4000/5000/6000
Espectros de cristales recubiertos con capas finas antireflectivas con Cary 6000
Luminiscencia
Tipos de fenómenos luminiscentes
Fluorescencia Fosforescencia
Fotoluminiscencia
Bioluminiscencia
Quimioluminiscencia
Sonoluminiscencia
Electroluminiscencia
Otros
Luminiscencia
Triboluminiscencia
Catodoluminiscencia
Radioluminiscencia
Fluorescencia retrasada
„Una emisión de luz que tiene lugar a temperaturas por debajo de las de los
cuerpos incandescentes´.
„La luminiscencia tiene lugar por la capacidad de ciertas sustancias de
absorber la luz a frecuencias relatívamente altas y re-emitirla
instantaneamente en paquetes discretos de frecuencias más bajas '
Ventajas de Fluorescencia
•Mayor Sensibilidad que UV/VIS (100-1000 veces)
•Mayor Selectividad.
• Solo el 10% de sustancias emiten fluorescencia
• Espectros de Emisión y Excitación específicos.
• Separaciones de mezclas (Barridos sincrónicos).
•Información cualitativa del ambiente químico.
• PH.
• Polaridad local.
• Viscosidad.
• Temp
•Gran intervalo lineal
• Absorción: 3 órdenes
• Emisión 6-7 órdenes
•Información multidimensional.
• 2 transiciones, doble información.
•Marcadores más seguros
• Sustituyen los marcadores radioactivos.
•Técnica sencilla y económica
• Tanto los instrumentos como la operación es sencilla y económica.
•Dispersión Raleigh por los solutos de la muestra, que puede dar lugar a la aparición de picos fantasma, picos de segundo orden, etc
•Bandas de Raman del disolvente, que pueden confundirse con bandas de emisión del compuesto estudiado
•Fotobleach. O destrucción del fluoroforo en el estado excitado
48
excitación
emisión
Fuente de luz Muestra
Detector de luz
Espectro exc.
Fluorescence Spectrophotometer
I
Monocromador
Monocromador
Instrumentación Fluorescencia
Espectro em.
Fluorescencia ECLIPSE
Barridos completos en
menos de 3 sg.Rango hasta 900 nm en
excitación y emisión
Fuente de Xe de alta
Intensidad
Fluorescencia,
Fosforescencia. Barridos de
excitación y emisión
Fluorescencia a luz
ambiente con sólo 0,5
mL de muestra
Electrónica ultrarápida con
resolución de menos de 1 us
Amplio rango de
accesorios;
Peltier,
microplacas,
multicubetas…
Rendijas
variables en
excitación y
emisión
Accesorios y software para todas las aplicaciones
Polarizadores rápidos automáticos
Polarizadores manuales
Filtros rápidos para Ca
intracelular
Sondas de control de
temperatura
Criostatos
Soportes de
muestras
sólidas
Sistemas peltier
Sistema biomelt
Lector de placas
Efectos de la temperatura
La temperatura puede afectar las intensidades de emisión de
diferentes formas
Las velocidades de reacción dependen de la temperatura.
Si la formación o decaimiento de las especies emisivas depende de una
reacción química entonces la fluorecencia quera afectada
El rendimiento cuantico (& y la vida media de emisión) son tambien
dependientes de la temperatura:
A temperaturas más bajas el movimiento vibracional se reduce y el camino
via fluorescencia se favorece.
Empleo de de criostatos de N2(l) o He para bajar la temperatura y/o
formar sólidos
• Restringen la formación de complejos en el estado excitado
• Permiten calcular las barreras de energía y otras funciones
termodinámicas
• Restringen el movimiento rotacional (ej. Medidas de polarización)
Optica colectora de la fuente en montaje
Schwarzchild
Optica colectora Schwarzchild –
dentro del módulo de lámàras !
• Una colección eficiente de la luz
implica que podremos enviar más luz
a la muestra
• ~100 veces más potente que la
lámpara del Cary 50
La potencia del xenon: Módulo de lámpara del
Eclipse
Inmune a la luz ambiente en la medida de muestras fluorescentes
– Gran flexibilidad en la medida de las muestras
Gran intensidad pero baja potencia media
La lámpara de Xenon solo se enciende en el momento en que el instrumento toma
una medida
– Menor probabilidad de degradación de la muestra
– Mayor vida útil de la lámpara
sample chamber open
sample chamber closed
Segmentos de aplicación de la espectroscopía de
fluorescenciaLas aplicaciones biológicas ocupan un ~70% del mercado de la fluorescencia.
• Investigación bioquímica y biofísica
• Enzimología
• Biología molecular
• Ciencias de los alimentos y nutrición
• Farma
El enorme crecimiento de las aplicaciones de fluorescencia en el campo de lasciencias de la vida ha sido posible gracias al desarrollo de un gran número de nuevas“sondas” fluorescentes.
Física/Química/Ciencias de los materiales• Departamentos de física-química
• Química analítica.
R&D en empresas farmaceuticas.
Laboratorios de enseñanza.
Espectro de fluorescencia de Europio en disolución
potenciadora DELFIA™
Modo Fluorescencia
Modo Fosforescencia (TRF) mode
Pico desestructurado a 450 nm atribuido a la
emisión de fondo de la solución potenciadora
Delay time = 0 s
Delay time = 100 s Optimización
del delay time0
1
2
3
4
5
6
7
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
Gráfica logarítmica de la intensidad de la fosforescencia vs. Concentración.Linealidad en el intervalo entre 0.1 – 1000 nM (inserto 0.1 –10000 nM)
Aplicaciones de FRET o RT FRET
TR FRET
Caracteriación del proceso de hibridación por FRET de una proteína
marcada con un quencher (DABCYL) y una sonda de DNA marcada con un
compuesto fluorescente (5 y 6 carboxifluoresceína)
Cary Eclipse equipado con paquete biomelt (sistema multiceldas termostatizado
con peltier, controlador y sondas de temperatura. Software para el cálculo de
temperaturas de melting (Tm) mediante el método de la derivada
Aplicaciones: Estudios de interacciones e hibridación de
ácidos nucléicos o proteínas.
Imagen de experimento de entrada de Ca con sonda Fura 2
Aplicaciones: Medida de Calcio intracelular
Pueden medirse y caracterizarse toda la familia de proteínas GFP en
células intactas o en orgánulos intracelulares
Aplicaciones: Medida de la familia de proteínas GFP
Estructura de la
proteína verde
fluorescente
Esquema de un Fluoroinmunoensayo
Aplicaciones: Inmunoensayos con sondas fluorescentes
Aplicaciones: Ensayos de actividad antioxidante en suero
Resultado ORAC value = 20k (Smuestra-Sblanco) / (STrolox-Sblanco)
Donde k es el factor de dilución
El método está basado en los cambios conformacionales que sufre la proteína R-
Phycoeritrina (R-PR) en presencia de radicales libres que conlleva un quenching
de la fluorescencia en modo tiempo-dependiente.
Requiere de tres medidas cinéticas a temperatura controlada (37º):1- Curva de decaimiento de la R-PE con AAPH (un generador de radicales libres) Sblanco
2- Curva de decaimiento de la R-PE con AAPH y TROLOX (un antioxidante standard) STrolox
3- Curva de decaimiento de la R-PE en suero de un voluntario sanoSmuestra
Luego se integra el área bajo la curva de decaimiento y se calcula el valor de
ORAC
ORAC Assay – Determination of ORAC value
El significado de tener un Cary
1954 Introducción del Cary 14 UV-Vis-NIR
1970 Introducción del
espectrofotómetro Cary 17 UV-Vis-NIR
Howard Cary – el hombre que
realizó los primeros diseños 2011. La tradición en
la vanguardia del
conocimiento