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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
Fundada en 1551
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA DE POST- GRADO
“PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PECTINASAS POR ACTINOMYCETOS EN
CULTIVO SUMERGIDO UTILIZANDO PECTINA Y CÁSCARA DE NARANJA”
TESIS
Para optar el Grado académico de:
MAGÍSTER EN BIOTECNOLOGÍA
AUTOR
Alexis Germán Arroyo Orbegoso
LIMA – PERÚ 2002
DEDICATORIA A mis padres: Alipio y Anselma,
por su apoyo y comprensión en
los momentos más difíciles
AGRADECIMIENTOS
Mg. Mirtha Roque Alcarraz y Mg. Juan Carlos Woolcott Hurtado, por la
asesoría y orientación impartida durante el desarrollo de la presente tesis.
Dr. Gerardo Gamarra Ballena, por su enseñanza y colaboración prestada.
Blgo. Luis Vargas Apaza, por su constante aliento, orientación y
colaboración.
Dr. Gerardo Gamarra Ballena, Dra. Amparo Zavaleta Pesantes, Mg. Angel
Narváez Villavicencio, Mg. Mirtha Roque Alcarraz y Mg. Juan Carlos
Woolcott Hurtado, por las sugerencias y correcciones finales realizadas para
el logro de la presente tesis.
ÍNDICE
RESUMEN
SUMMARY
I. INTRODUCCIÓN
II. MARCO TEÓRICO
III. MATERIALES Y MÉTODOS
IV. RESULTADOS
V. DISCUSIÓN
VI. CONCLUSIONES
VII. BIBLIOGRAFÍA
ANEXOS
Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso, Alexís Germán
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RESUMEN
El objetivo de esta investigación fue seleccionar las condiciones que
permitan la producción de enzimas pectinasas, a partir de cáscaras de naranja,
empleando Actinomyces naeslundii. En la primera fase, se determinaron las
condiciones de pH , temperatura, agitación y aireación, para un buen
crecimiento del microorganismo. En la segunda, se empleó el diseño
experimental Plackett-Burman, mediante la evaluación de ocho nutrientes, con
dos niveles de variación. Los nutrientes fueron: cáscara de naranja, sulfato de
amonio, úrea, sulfato ferroso, cloruro de calcio, cloruro de sodio, sulfato de
magnesio y carbonato de sodio, utilizándose matraces Erlenmeyer con 150 mL
de medio experimental pH 7.00 a 37 ºC y 300 rpm por 5 días. En la tercera
fase, fue realizada la optimización del medio de cultivo experimental, siguiendo
el diseño de Box-Benhken, en el que hubo evaluación de las concentraciones
de cáscara de naranja, sulfato de amonio y sulfato ferroso en tres niveles. Con
los resultados obtenidos, se realizó el análisis de regresión múltiple. Los
cálculos y gráficos estadísticos fueron ejecutados con el software Statistical
2.1. obteniéndose la máxima producción de enzimas, con las siguientes
concentraciones: cáscara de naranja 16.7 g / L, sulfato de amonio 5 g /L y
sulfato ferroso 0.013 g / L, obteniéndose 0.65 U.I. / mL de actividad enzimática,
en tres días de biotransformación.
Palabra clave: biotecnología, enzimas, pectinasas, pectina.
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SUMMARY
The objective of this research was to choice the conditions that they
permit to optimize the pectinasas enzymes production using orange skins and
Actinomyces naeslundii; on first phase was used qualitative techniques for to
determinate the conditions of pH, cultivation temperature, agitation and aeration
for a good growth microorganism. On the second phase was used the Plackett-
Burman design through the investigation of eight nutrients with two variation
levels; The eight nutrients was: oranges skin, ammonium sulfate, urea, ferrous
sulfate, calcium chloride, sodium chloride, magnesium sulfate y sodium
carbonate. It was used Erlenmeyer flask with 150 mL of experimental medium
pH 7, to 37 ºC, agitation to 300 rpm for 5 days. Third phase of optimization was
developed through Box- Benhken design, oranges skin, ammonium sulfate and
ferrous sulfate concentration were evaluated on three level. It was realized a
multiple regression analyses with the three variables found previously .
calculus and graphics were developed with Statistical 2.1 software. Optimum
Parameters were: oranges skin 16.7 g / L, ammonium sulfate 5 g / L and
ferrous sulfate 0.013 g / L. it was obtained 0.65 UI / mL of enzymatic activity in
three days of biotransformation.
Key word: biotechnology, enzymes, pectinases, pectin.
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I. INTRODUCCIÓN
Las enzimas pectinasas son un conjunto de enzimas que hidrolizan la
pectina. Éstas presentan una extensa aplicación en la industria alimentaria,
principalmente en la obtención y clarificación de jugos, vinos y cervezas
(Fogarty y Ward, 1974; Neubeck, 1975)
Las enzimas pectinasas extracelulares que hidrolizan la pectina pueden
ser producidas por diferentes microorganismos como hongos y bacterias; en
esta investigación trabajamos con una bacteria que en pruebas preliminares
produjo enzimas pectinolíticas.
Siendo el Perú un país rico en productos agrícolas conviene desarrollar
un bioproceso orientado al aprovechamiento integral de recursos provenientes
de la producción agrícola y agroindustrial, además de evitar la contaminación
ambiental, por los residuos provenientes de estas actividades. Uno de estos
residuos por aprovechar es la cáscara de naranja que, por su volumen, resulta
atractivo para la producción industrial de enzimas pectinasas, por lo que, en el
presente trabajo de investigación, se desarrollo un bioproceso a nivel de
laboratorio, para la producción de pectinasas por Actinomyces naeslundii
planteándonos los siguientes objetivos:
- Evaluar los parámetros pH, temperatura, concentración de nutrientes,
aireación y agitación para la producción de enzimas pectinasas en un medio
sintético de laboratorio.
- Evaluar los niveles de producción de pectinasas con los parámetros
establecidos, utilizando un medio natural a base de cáscara de naranja.
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II. MARCO TEÓRICO. 2.1. LOS ACTINOMYCETOS:
Los actinomycetos han despertado un gran interés para biotecnólogos,
genetistas y ecologistas, por su habilidad para producir metabolitos
secundarios.
Muchos actinomycetos pueden crecer en los medios comunes usados
en los laboratorios tales como agar nutricio, agar tripticasa soya, agar sangre y
también en agar infusión cerebro corazón.
Los actinomycetos crecerán en caldos, pero necesitan ser cultivadas
bajo condiciones especiales. El crecimiento en un tubo con caldo sin
movimiento se da en la superficie, dejando el resto del caldo intacto. Los
cultivos líquidos requieren considerable agitación y aireación. La agitación
puede estar entre 200 – 250 rpm. para dar la adecuada aireación y
homogenización del medio. De necesitar mayor mezclado, se puede colocar
baffles en la parte interior del recipiente. Conforme avanza el tiempo de cultivo,
el microorganismo crecerá en forma de pellet (Cross, 1980).
Los actinomycetos son un grupo de bacterias filamentosas , GRAM (+) ,
las células que se van a formar son denominadas conidias, además las
encontramos participando en la degradación de desechos orgánicos en los
suelos como el compostaje.
Vistos al microscopio tiene la forma de un hongo pequeño de tamaño
bacteriano; la pared celular está constituida por una serie de ácidos murámicos
y diaminopiméricos, careciendo de pectidoglucanos, característica que ayuda a
reconocer a las bacterias. La composición de la membrana ayudó a excluir a
los actinomycetos de la denominación hongo, por encontrar esteroles en la
membrana. En cuanto al citoplasma, se ha clasificado como microorganismo
procariote debido a que no posee un núcleo y que su cromatina se encuentra
libre en el citoplasma. Su información genética posee una inestabilidad muy
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alta. Los actinomycetos generan metabolitos secundarios al final de la fase
logarítmica. En la naturaleza son los mayores productores de antibióticos,
seguidos por los hongos. Tienen la capacidad de degradar pesticidas y
derivados de petróleo. Se han encontrado actinomycetos termófilos que
interviene en el proceso de compostaje, produciendo una serie de enzimas
como las celulasas y amilasas. Los actinomycetos son considerados como los
médicos del suelo.
En los actinomycetos podemos ver actualmente el gran potencial que
tienen en el campo agrícola, biomédico, en la salud y en la biorremediación
(Franco, 2001).
2.2. PECTINAS
Las pectinas o sustancias pécticas son polisacáridos que se componen
principalmente de ácidos poligalacturónicos coloides (poliurónidos derivados
del ácido galacturónico CHO(CHOH)4COOH. Se hallan en los tejidos de las
plantas. Las pectinas son útiles por su capacidad para formar geles o jaleas
con compuestos polihidroxilados, como los azúcares o con cantidades
diminutas de iones polivalentes. En el presente estudio. El vocablo “jalea” se
usará para designar al muy conocido producto semisólido formado por pectina,
azúcar y ácido en condiciones determinadas.
La sustancia que se había supuesto era la causa de que los jugos de
fruta se convirtieran en jalea, fue aislada por Braconnot en 1824, quien la
denominó pectina. Las extensas investigaciones realizadas en los cien años
siguientes esclarecieron las propiedades de las sustancias pécticas, pero poco
hicieron para aclarar su naturaleza química. Entre 1920 y 1940 quedó
establecida la producción de pectinas en escala comercial en cierto número de
naciones y aquéllas llegaron a formar parte importante en el comercio
internacional (Kirk, 1961).
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2.3. ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO DEL SUSTRAT O (CÁSCARA DE
NARANJA).
CUADRO 1.
COMPOSICIÓN FÍSICO-QUÍMICA DE LA CÁSCARA DE NARANJA
(Demain A. Y Solomon N., 1986).
materia seca 90.00 proteína 6.00
Componentes carbohidratos 62.70principales Grasas 3.40
(%) fibra 13.00 cenizas 6.90 calcio 2.00 magnesio 0.16
Minerales Fósforo 0.10(%) Potasio 0.62
Azufre 0.06 colina 770.00
Vitaminas Niacina 22.00(mg/Kg) ac. Pantoténico 14.96
riboflavina 22.20 arginina 0.28
Aminoácidos Cistina 0.11(%) lisina 0.20
metionina 0.11 triptofano 0.06
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2.4. INVESTIGACIONES REFERENTES A LA PRODUCCIÓN DE
PECTINASAS.
En la Fermentación en Sustrato Sólido (FSS), la concentración del
sustrato es mayor que en la Fermentación en Cultivo Sumergido (FCS), debido
a que contiene entre 1 a 10% de agua.(Laukevics, 1988).
En otra investigación, (Solís-Pereira & col., 1996), demostraron que en
una concentración de 5 g/L de glucosa en una FCS la producción de
pectinasas por Aspergillus niger fue reprimida, igualmente como la producción
de otras enzimas hidrolíticas, tales como poligalacturonasas, pectinesterasas y
celulasas; pero en una FSS con concentración de glucosa de 5 g/L la síntesis
de pectinasas no es afectada.
En la FCS el medio es completamente simple, consistiendo en un
producto de la agricultura no refinado, el cual contiene todos los nutrientes
necesarios para el crecimiento microbiano. Los sustratos más empleados en
FSS son productos agrícolas (soya, arroz, trigo, maíz, etc), o subproductos
agro industriales (salvado de trigo, bagazo de caña, residuos de remolacha,
bagazo de cítricos, bagazo de manzana, cáscaras de diversos vegetales, etc.).
Éstos, generalmente, empleados en combinación y/o, complementados con
fuentes de carbono y energía fácilmente metabolizables (almidón,
maltodextrinas, melazas, etc.) y otros nutrientes (úrea, calcio, fosfatos, etc)
(Agosin, 1995).
Estos sustratos son colocados en agua, aunque pueden requerir de
algún pretratamiento. El pretratamiento de estos sustratos ( térmico
principalmente) tiene un doble propósito; esterilización del sustrato y cambios
en las propiedades fisicoquímicas del sustrato (gelatinización del almidón,
aumento de la porosidad, etc.), que influye favorablemente en la degradabilidad
y accesibilidad de los componentes poliméricos (polisacáridos y proteínas) y
estructurales del sustrato (Milstein y Flowers, 1986).
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Una producción de pectinasa usando cáscara de limón con diferentes
pretratamientos, fue realizada determinándose pectin esterasa y
poligalacturonasa. Los resultados menos favorables fueron obtenidos usando
cáscara de limón seca; usando cáscara de limón lavada y no lavada los
resultados fueron similares para la poligalacturonasa, en tanto que el nivel de
pectin esterasa fue particularmente alto con cáscara de limón no lavada. Los
bajos niveles de actividad fueron obtenidos cuando las cáscaras se secaron a
una temperatura final de 120 º C, lo cual indica claramente la importancia de
este tratamiento con las cáscaras, cuando es usado para la producción de
pectinasas (Maldonado, 1986).
Por otro lado, se ha probado sulfato de amonio para suplir la fuente de
nitrógeno, debido al menor costo que el fosfato de amonio. El ensayo dio lugar
a una reducción del 20% de actividad pectinasa (Saval y Huitron, 1983).
El pH óptimo de la enzima poligalacturonasa fue probada usando buffer
acetato para pH 2.5 - 4.5 obteniéndose una actividad pectinolítica máxima a un
pH de 3.5 (El Sayed, 1994).
Las bacterias anaeróbicas productoras de pectinasas presentan un buen
crecimiento a pH 7.0 y una temperatura de 45 ºC. La máxima actividad
poligalacturonasa fue de 4.7 U.I./mL hallada en un caldo de fermentación
(Shivakuman, 1995).
En otra investigación (Abdel - Fattah y Ismail, 1996) trabajaron sobre el
efecto de las reacciones al variar valores de pH y Temperatura de las
preparaciones enzimáticas, hallando valores óptimos de 4.5 y 50 º C,
respectivamente.
La producción de pectinasa extracelular es inducida por sustancias
pécticas o por desechos agroindustriales tales como pulpa de limón o naranja,
los cuales tienen apreciables cantidades de pectina ,(Aguilar y Huitron, 1986).
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Pectina y glucosa fueron usadas como comparación de fuente de
carbono, los resultados obtenidos con glucosa fueron pobres, considerando la
naturaleza inducible de las enzimas pectinolíticas (Kilara, 1982).
(Sincere, 1989), seleccionaron tres cepas productoras de enzimas
pécticas (Talaromyces flavus, Penicillium charlessi y Tubercularia vulgaris),
utilizando pellets de pulpa de cítricos se obtuvieron actividades pectinolíticas
más altas que las producidas por Aspergillus níger.
En otro estudio de producción de pectinasas bacterianas, utilizando pulpa de
café como sustrato, se encontró 0.76 U (unidades de actividad enzimática) para
pulpa de café húmedo (Cabello y col.,1982).
La presencia de pectina en la composición del medio de cultivo es un
factor importante, ya que influye sobre la diversidad y cantidad de enzimas
pécticas, sabiendo además que la producción de enzimas pectinasas es
inducible y no constitutivo (Trejo y col., 1991).
Moreno y col.,(1995) reportan un estudio de producción de pectinasa a
partir de fermentación en sustrato sólido utilizando cáscara de yuca y limón con
Aspergillus niger ATCC 10864 obteniéndose una productividad volumétrica de
434.4 U.I./(L*h), mayor que otros autores, 39 U.I./(L*h) ( Abdel-Fattah y col.,
1977)
Con respecto a las desventajas que pueden haber en una FSS tenemos
que es un proceso más lento que una FCS, debido a la gruesa barrera de
sólido; también presenta problemas de disipación de calor limitado por la
transferencia de masa intrapartícula (Trejo y col.,1991).
2.5. BIORREACTORES.
El cultivo de bacterias, levaduras y hongos en un cultivo sumergido es
una práctica universal en la industria de fermentaciones, desde la década de
los 40’s. La aplicación de energía a los sistemas de fermentación hace que los
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procesos de transporte convectivos sean órdenes de magnitud más rápidos
que los procesos difusionales que controlan el transporte en el cultivo sólido.
Esto ha permitido el desarrollo de procesos de alta productividad que han
hecho del cultivo sumergido la técnica de más uso en la industria de las
fermentaciones. Aunque la agitación mecánica sigue siendo la forma más
usada de aplicar energía.
Independientemente del tipo de cultivo, existen tres consideraciones,
además de la homogenización y la transferencia de oxígeno, que son de
importancia en el diseño de biorreactores: La primera tiene que ver con la
esterilidad. Llevar a cabo un proceso en ausencia de contaminación es un
requisito fundamental. El diseño de tomas de muestras y sellos mecánicos, el
acabado de la superficie del tanque, así como de la conexión de válvulas y
aditamentos, juega un rol importante en un diseño exitoso. Un segundo aspecto
de importancia es la remoción de calor. En vista de que las temperaturas de
fermentación son moderadas (25 a 40 ºC) y que el cultivo de células es un
proceso exotérmico, el control de la temperatura en un biorreactor requiere de
la remoción de cantidades importantes de calor. Un tercer punto de
fundamental importancia son los aspectos mecánicos, la selección de
reductores de velocidad y el diseño de la flecha de agitación (Miranda y col.,
1996).
2.6. ENZIMAS PECTINASAS COMERCIALES.
La moderna tecnología de los zumos de frutas exige una degradación
rápida e intensa de la pectina, con el fin de que el prensado, la clarificación y la
filtración puedan realizarse de una manera segura y económica.
PECTINEX es una preparación purificada, producida por una cepa de
Aspergillus níger. El producto contiene principalmente pectin-transeliminasa,
poligalacturonasa, pectinesterasa y hemicelulasas, siendo capaz de romper
sustancias pécticas vegetales.
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PECTINEX y ULTRAZYM son productos que han sido obtenidos como
resultado de una investigación y un desarrollo de varios años. Por su amplio
espectro de acción, satisfacen de manera ideal las diversas exigencias que se
imponen a su sistema óptimo de enzima en cada una de las etapas individuales
de producción. Por lo tanto, PECTINEX y ULTRAZYM permiten asegurar
buenos resultados en todo el mundo, bajo las más diversas condiciones
tecnológicas.
VENTAJAS:
La utilización de PECTINEX y de ULTRAZYM garantizan:
-Durante la acción de la enzima sobre la pulpa:
La mejora en la extracción del zumo, aumentando con ello el rendimiento
global del zumo.
La reducción de los tiempos de prensado, con incremento subsiguiente de la
producción.
La liberación de componentes fundamentales como color, aroma, etc., por
descomposición específica de la pulpa.
- Durante el tratamiento enzimático de los zumos:
El desdoblamiento rápido y completo de la pectina.
La floculación rápida y la sedimentación compacta de las sustancias
enturbiadoras, con un mínimo de clarificantes.
La filtración óptima, con menor gasto de material filtrante.
La estabilidad segura de los zumos completamente claros, de sus
concentrados y de sus diluidos. (Andersen, 1991).
2.7. SITUACIÓN DEL MERCADO INTERNACIONAL DE LAS ENZIMAS.
En el cuadro 2, se muestra la situación del mercado internacional, de
acuerdo con los datos publicados por (Eveleigh y col.,1990). Es impactante, por
un lado, el hecho de que más de 2000 enzimas registradas sólo 60 sean
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producidas comercialmente y de éstas sólo cinco cubran más del 80% del
mercado (García y col., 1993).
Es innegable que la expansión del mercado de enzimas observado en
los últimos años en los países de latinoamericana, es un aliciente para la
creación de nuevas empresas nacionales o mixtas que produzcan enzimas a
nivel nacional o subregional (Illanes, 1994).
Cuadro 2.
PRODUCCIÓN MUNDIAL DE ENZIMAS (García y col.,1993)
Enzima Ton / año % del total Proteasa fungal 13 0.95Pectinasa 25 1.83Amilasa fungal 25 1.83Cuajo microbiano 25 1.83Glucosa isomerasa 75 5.50Amilasa bacteriana 325 23.85Amiloglucosidasa 350 25.70Proteasa bacteriana 525 38.51TOTAL 1363 100.00
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES.
3.1.1 MATERIAL BIOLÓGICO:
En el presente trabajo, se utilizó el microorganismo Actinomyces
naeslundii, el cual fue aislado en el Instituto de Microbiología y Biotecnología
"Simón Pérez Alva" de la UNMSM, a partir de una muestra de suelos
naranjales de la localidad de Huaral, distrito de Huando, del departamento de
Lima, e identificado en el Instituto Nacional de Salud (INS)(ANEXO A).
3.1.2 MEDIOS DE CULTIVO:
a).Medios de cultivo complejos:
- Cultivo en sólido: Constituido por Agar Trypticasa Soya y Agar Trypticasa
Soya, suplementado con 1% de pectina cítrica.
- Cultivo en líquido: Constituido por Caldo Trypticasa Soya y Caldo Trypticasa
Soya suplementado con 1% de pectina cítrica.
b).Medio de cultivo experimental:
Constituido por sales minerales y cáscara de naranja como única fuente de
carbono, variando sus concentraciones de acuerdo al siguiente cuadro:
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COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL
NUTRIENTES CONCENTRACIÓN MÍNIMA (g/L)
CONCENTRACIÓN MÁXIMA (g/L)
X1 Cáscara. de naranja 2.000 16.700 X2 (NH4)2 SO4 1.000 5.000 X3 ÚREA 0.700 5.000 X4 FeSO4.7H2O 0.013 0.080 X5 CaCl2 0.020 0.083 X6 NaCl 1.000 5.000 X7 MgSO4.7H2O 0.200 1.000 X8 Na2CO3 0.800 4.000
3.1.3. MATERIALES:
Mechero
Asa de Kolle
Termómetro
Cronómetro
Erlenmeyers de 250 mL
Beakers de 150, 250, 500, 1000 mL
Pipetas de 1, 2, 5, 10, 25 mL
Probetas de 100, 250, 500, 1000 mL
Baguetas
Tubos de ensayo de 15 * 150 mm.
Placas petri
Embudos de vidrio
Kitasato
Tips de 50, 1000, 5000 µL.
Parafilm
Algodón
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Pinzas
Gradillas
Filtro gelman 0.2 µM
Bomba de aire de 500 mL / min (URANUS)
3.1.4. REACTIVOS:
Medio Agar Trypticasa Soya (TSA)
Medio Caldo Trypticasa Soya (TSB)
Úrea
Sulfato de magnesio
Cloruro de calcio
Solución amortiguadora (buffer) de fosfato 0.05 M, pH 7
Ácido sulfúrico q.p.
Hidróxido de sodio
Alcohol etílico de 96 º
Agar-agar
Solución amortiguadora (buffer) de acetato 0.05 M, pH 4.8
Solución de pectina al 1%
Reactivo de Ácido 3,5- dinitrosalicilico (DNS) (Miller, 1959)
Estándar de Ácido D-galacturónico para análisis (SIGMA)1 mg /mL
Sulfato de amonio
Tartrato de sodio y potasio
Estándar de Albúmina sérica de bovino 10 mg / mL
Pectina (sigma)
Pectina cítrica de grado alimentario
Cáscaras de naranja
Sulfato ferroso
Cloruro de sodio
Rojo de rutenio
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3.1.5. EQUIPOS
Autoclave
Biorreactor de 1 litro
Espectrofotómetro de rango visible SPECTRONIC 20
Estufa con temperatura controlada a 37 º C MEMMERT S 30
Baño maría con temperatura controlada a 37 ºC INSTRUMENTAL.
Horno a 180 º C
Centrífuga
Agitador a 200 r.p.m.
Cocinilla
Refrigeradora
Balanza analítica
Balanza de platillos
Bomba de vacío
Vortex
Equipo de destilación
Micro pipetas de 50, 1000, 5000 µL
3.2. MÉTODOS
3.2.1. ACONDICIONAMIENTO DEL MICROORGANISMO (Cabello y
col.,1982).
El microorganismo que utilizamos en esta investigación fue sembrado
periódicamente, tanto en un medio sólido como en el líquido, de la siguiente
manera:
- Se sembró una colonia de Actinomyces naeslundii en un tubo con Caldo
Trypticasa Soya, suplementado con 1% pectina cítrica, y luego se incubó
durante 5 días a 37 º C.
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- A continuación, se realizó una siembra del medio líquido en Agar Trypticasa
Soya, suplementado con 1% pectina cítrica, y se realizó la incubación durante 3
días a 37 º C.
- Posteriormente, se repitieron los pasos anteriores por 60 días.
3.2.2. EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LOS PARÁMETROS pH,
TEMPERATURA Y AIREACIÓN-AGITACIÓN EN UN MEDIO SINTÉTICO,
PARA LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS.
a) DETERMINACIÓN DEL pH ÓPTIMO ( Becker y col.,1999).
En primer lugar, el microorganismo fue Inoculado en caldos de TSB,
amortiguados a tres pH (5, 7 y 8.5); a continuación, se incubó en estufa a 37
ºC por 72 horas; y, finalmente, se midió la masa celular por espectrofotometría
a 600 nm.
b) DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA (Becker y col.,1999).
En el presente caso, se siguió el siguiente procedimiento:
- Inoculación del microorganismo en caldos de TSB
-Incubación de los tubos los tubos a temperaturas de 28ºC, 37ºC y 45 ºC
durante 72 horas
-Medición de la masa celular, por espectrofotometría a 600 nm.
c) DETERMINACIÓN DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN (Becker y col.,1999).
La aireación-agitación se evaluó a las 72 horas de incubación, a 37 ºC,
comparando el aumento de la masa microbiana por espectrofotometría, a 600
nm de los tubos con caldo control de TSB, en dos condiciones
experimentales:
-Tubos con sello de parafina estéril y sin agitación (SIN aireación-agitación)
-Tubos sin sello de parafina estéril y con agitación (CON aireación-agitación)
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3.2.3. CONDICIONES DEL PROCESO DE BIOTRANSFORMACIÓN:
a) ACONDICIONAMIENTO DEL SUSTRATO
Se utilizó cáscara de naranja como sustrato para la biotransformación, la cual
tuvo el siguiente tratamiento:
La cáscara de naranja fue recolectada de comerciantes de jugo de naranja
cercanos a la UNMSM. Enseguida, se extrajo el aceite de la cáscara de naranja
utilizando un equipo de arrastre al vapor; a continuación, la cáscara fue secada
a 80 º C por 24 horas en estufa. Posteriormente, la cáscara de naranja fue
triturada en un molino manual de tornillo sin fin y tamizada a un tamaño de
partícula menor a 0.5 mm de diámetro
b) MANTENIMIENTO DEL MICROORGANISMO: El microorganismo
Actinomyces naeslundii se mantuvo por resiembras periódicas en el medio
Agar Trypticasa Soya (TSA), suplementado con 1 % de pectina cítrica. Las
condiciones de crecimiento del microorganismo fueron de 37 ºC durante 24
horas.
c) PREPARACIÓN DEL INÓCULO: El inóculo se preparó a partir de un cultivo
de 24 horas, haciendo diluciones de éste en solución fisiológica estéril, hasta
obtener una suspensión de células de 3 x 10 9 u.f.c./mL. De aquí, se tomaron
alícuotas de 45 mL, que se transfirieron a matraces erlenmeyer cuyos
contenidos fueron de 150 mL.
d) DISEÑO DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL : El medio de cultivo
estuvo representado por nutrientes ubicados dentro de un rango mínimo-
máximo:
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CUADRO 3. COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL
NUTRIENTES CONCENTRACIÓN
MÍNIMA (g/L) CONCENTRACIÓN
MÁXIMA (g/L) X1 Cáscara de naranja 2.000 16.700 X2 (NH4)2 SO4 1.000 5.000 X3 ÚREA 0.700 5.000 X4 FeSO4.7H2O 0.013 0.080 X5 CaCl2 0.020 0.083 X6 NaCl 1.000 5.000 X7 MgSO4.7H2O 0.200 1.000 X8 Na2CO3 0.800 4.000
Estos componentes fueron evaluados en una plantilla estadística de PlacKett-
Burman, de donde se obtuvo los nutrientes más significativos para la
producción de enzimas pectinasas.
e). OBTENCIÓN DE PECTINASAS: La obtención del extracto enzimático crudo
fue realizada por centrifugación, a 5000 rpm por 20 minutos de las muestras
constituidas por 5mL de cultivo, tomadas cada 8 horas, durante 7 días.
3.2.4. MÉTODOS DE ANÁLISIS:
a) DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD PECTINOLÍTICA:
La Actividad enzimática del extracto obtenido luego de la biotransformación, fue
evaluada por la liberación de azúcares reductores de la pectina (1% p/v pectina
sigma); la cual fue medida colorimétricamente, con el reactivo ácido 3,5 -
dinitrosalicílico (DNS). Se realizó una curva estándar de ácido D-galacturónico
al 1% preparado en solución amortiguadora de acetato 0.1M y pH 4.8 (Miller y
col., 1959) teniendo en cuenta que una unidad enzimática se definió como la
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cantidad de enzima que liberó 1µM de ácido D-galacturónico por minuto a 50
ºC (ANEXO M ).
b) DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BIOMASA: Fue utilizada
la técnica de recuento en placa de células viables, para lo cual se tomaron
alícuotas del cultivo cada 8 horas (1 mL);luego, se realizó diluciones seriadas,
para colocar 0.1 mL de células diluidas en la superficie de una placa TSA,
extendiéndose éstas, con una asa de Drigalski, e incubadas, finalmente, a 37
ºC (ANEXO C).
3.2.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO:
a) ANÁLISIS Y SELECCIÓN DE NUTRIENTES MÁS INFLUYENTES EN LA
PRODUCCIÓN DE PECTINASAS.
En una primera etapa de análisis se utilizó el diseño experimental de
Plackett-Burman para identificar los nutrientes de mayor influencia en la
producción de pectinasas, esto permitió evaluar 8 variables en 12
experimentos con 2 réplicas, teniendo en cuenta una concentración alta (+1) y
una baja (-1) de cada uno de los nutrientes. La evaluación de los mismos, se
realizó en frascos erlenmeyers de 250 mL de capacidad, que contenían 150
mL de medio experimental.
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CUADRO 4.
PLANTILLA DE PLACKETT BURMAN ( Ayala y Pardo,1995 )
VARIABLES
N
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 1 1 1 -1 1 1 -1 -1 -12 1 -1 1 1 -1 -1 1 13 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 14 1 1 1 -1 -1 1 1 -15 1 1 -1 -1 1 -1 1 16 1 -1 -1 1 -1 1 -1 17 -1 -1 -1 -1 1 1 1 18 -1 -1 1 1 1 -1 1 -19 -1 1 -1 1 -1 1 1 -1
10 1 -1 1 -1 1 1 -1 -111 -1 1 1 1 1 1 -1 112 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1
Donde:
X1= Cáscara de naranja. X5= CaCl2
X2= (NH4)2SO4 X6= NaCl
X3= (NH2)2CO X7= MgSO4
X4= FeSO4*7H2O X8= Na2CO3
b) OPTIMIZACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE NUTRIENTES PARA LA
MÁXIMA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS.
Se utilizó el Diseño de Box – Benhken, el cual sirvió para determinar las
concentraciones óptimas de cada variable independiente (X1= Cáscara de
naranja; X2= (NH4)2 SO4 y X4= FeSO4. 7H2O ), para la máxima producción de
pectinasas, diseño que fue complementado con la técnica de análisis de
respuesta superficial a las variables independientes anteriores, para luego
ajustarlas al modelo polinomial cuadrático siguiente:
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Z=b0+b1*X1+b2*X2+b3*X4+b4*X1*X2+b5*X1*X4+b6*X2*X4+b7*X12+b8*X2
2+b9*X42
Donde:
Z = Variable dependiente (Producción de enzima)
X1= Cáscara de naranja. X2= (NH4)2SO4. X4= FeSO4*7H2O.
b0 = Constante por determinar
b1, b2, b3 = Coeficientes lineales por determinar
b4, b5, b6, b7, b8, b9 = Coeficientes cuadráticos por determinar
CUADRO 5.
PLANTILLA DE BOX BENHKEN (Robles y Col. 1995)
VARIABLES N
X1 X2 X4 1 1 1 1 2 1 -1 -1 3 1 1 0 4 1 0 -1 5 1 0 -1 6 1 -1 0 7 -1 1 1 8 -1 1 -1 9 -1 0 0
10 -1 0 -1 11 -1 0 1 12 -1 1 0 13 0 1 -1 14 -1 -1 -1 15 0 0 0
16 0 0 0
Para la identificación de un valor óptimo, fue necesario estimar la
curvatura de las variables ensayadas, determinándose los coeficientes del
modelo polinomial, usando la técnica de regresión múltiple, cuyos valores
fueron asignados a las ecuaciones XY polinomiales, para generar respuestas
predictivas (representadas en los gráficos de respuesta en superficie y de
líneas de contorno).
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c) BIOTRANSFORMACIÓN FINAL EN BIORREACTOR.
Con las concentraciones óptimas obtenidas del experimento anterior, se
realizó un último experimento, en el cual fueron evaluados el crecimiento
microbiano y la actividad enzimática, utilizando para ello un inóculo en fase
logarítmica con la finalidad de aprovechar la fuente de carbono en el
mantenimiento del microorganismo.
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IV. RESULTADOS
4.1. EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS pH,
TEMPERATURA Y AIREACIÓN-AGITACIÓN EN UN MEDIO SINTÉTICO,
PARA LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS.
4.1.1. DETERMINACIÓN DEL pH ÓPTIMO
FIGURA 1. EFECTO DEL pH SOBRE EL CRECIMIENTO DEL
MICROORGANISMO
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
5.0 7.0 8.5
pH
Den
sid
ad ó
pti
ca a
600
nm
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FIGURA 2. CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO A DIFERENTES pH
Tubo # (1 2 3 ) (4 5 6) (7 8 9 10)
pH = 7.0 pH = 8.5 pH = 5.0
4.1.2. DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA
La evaluación del crecimiento del microorganismo vs. temperatura en
caldo TSB , determinó que la temperatura óptima fue de 37 ºC, luego de 72
horas de incubación (Figura 3).
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FIGURA 3. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO
DEL MICROORGANISMO
00.10.20.30.40.50.60.7
28 37 45
Temperatura ( ºC )
Den
sid
ad ó
pti
ca a
600
n
m
4.1.3. DETERMINACIÓN DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN
En experimentos previos se determinó que la mayor concentración de
biomasa ( D.O. 0.65) se obtuvo en un medio control con aireación-agitación a
300 rpm. Estos resultados, presentaron la necesidad de fijar valores de
agitación 300 rpm y aireación 0.5 vvm, para el proceso de biotransformación
sobre medio natural. (Figura 4).
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FIGURA 4. EFECTO DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN EN EL CRECIMIENTO
DEL MICROORGANISMO
00.10.20.30.40.50.60.7
SIN CON
AIREACION-AGITACION
Den
sid
ad ó
pti
ca a
600
nm
4.2. CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Y PRODUCCIÓN DE
PECTINASAS.
En la Figura 5, se observa que la máxima producción de pectinasas es
alcanzada en la etapa estacionaria del crecimiento microbiano, es decir, a las
64 horas.
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FIGURA 5. CURVA DE CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Y
PRODUCCIÓN DE PECTINASAS EN MEDIO TS- PECTINA 1%
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
8.00
8.50
9.00
9.50
10.00
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 104
112
120
Tiempo (horas)
Lo
g (
ufc
/mL
)
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
AC
T. P
EC
TIN
AS
A U
I/mL
Log N° DE (ufc/ml). ACTIVIDAD PECTINASA ( U.I/ml )
4.3. PROCESO DE BIOTRANSFORMACIÓN
4.3.1. ANÁLISIS Y SELECCIÓN DE NUTRIENTES MÁS INFLUYENTES EN
LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PECTINASAS.
El análisis del diseño de Plackett Burman demostró que los nutrientes
que más influyeron sobre la producción de pectinasas fueron: Cáscara de
naranja , (NH4)2SO4 y FeSO4*7H2O, seleccionándose éstos, para un análisis
posterior de optimización ( ANEXO K ).
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4.3.2.OPTIMIZACIÓN DE LOS 3 NUTRIENTES SELECCIONADOS EN LA
ETAPA ANTERIOR.
Mediante la optimización de los 3 nutrientes más influyentes, utilizando
el diseño de Box Benhken, obtuvimos los siguientes resultados:
Cáscara de naranja ( 16.7 g/ L ), (NH4)2SO4 (5 g/ L ), FeSO4*7H2O (0.013 g/ L )
y una producción máxima predictiva de pectinasas de 0.71 U.I./mL (ANEXOS
L, L.1 y L.2).
4.3.3. BIOTRANSFORMACIÓN FINAL EN BIORREACTOR
La cinética microbiana, llevada a cabo con los resultados obtenidos del
diseño de Box Benhken, maximizó la respuesta entre las 60 y 80 horas, tiempo
en el que se logró una producción de 0.65 U.I./mL de la enzima.
CUADRO 6.
CONCENTRACIONES ÓPTIMAS A TRABAJAR EN BIORREACTOR
VARIABLES CONCENTRACIÓN (g / L)
VALORES X1 = Cáscara de naranja 16.700
ÓPTIMOS x2 = (NH4)2 SO4 5.000 X4 = FeSO4.7H2O 0.013 X3 = (NH2)2CO 2.850
VALORES X5 = CaCl2 0.051 MEDIOS X6 = NaCl 3.000
X7 = MgSO4 0.600 X8 = Na2CO3 2.400
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Volumen del medio experimental : 1000 mL
Concentración celular del inóculo : 3 x 10 9 u.f.c / mL
Tiempo de biotransformación : 120 horas
Volumen de inóculo : 100 mL
Temperatura : 37 ºC
Aireación : 0.5 vvm.
Agitación : 300 rpm.
pH : 7.0
En el resultado del crecimiento de la población microbiana que se
muestra en la Figura 6, podemos notar que éste obtuvo un máximo valor entre
las 60 y 80 horas de transcurrido el proceso de biotransformación.
En la misma figura, se muestra la producción de pectinasas, durante el
proceso de biotransformación, registrándose una alta producción de 0.65
U.I./mL a las 72 horas, valor muy cercano a lo pronosticado en las Curvas de
Superficie Respuesta 0.71 U.I./mL (ANEXO L.2).
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FIGURA 6. CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y PRODUCCIÓN DE
PECTINASAS POR Actinomyces naeslundii EN UN BIORREACTOR DE 1
LITRO
5.005.506.006.507.007.508.008.509.009.50
10.00
0 16 32 48 64 80 96 112
Tiempo (horas)
Lo
g (
ufc
/mL
)
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
Act
. pec
tin
asa
(UI/m
L)
Log N° DE ufc/mL. ACTIVIDAD PECTINASA ( U.I/mL )
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V. DISCUSIÓN
El crecimiento de Actinomyces naeslundii en caldo TSB suplementado
con 1% de pectina evidenció a las 48 horas un mayor desarrollo a pH 7.0 y
temperatura de 37ºC (Figuras 1,2,3) que a los pH 5.0 y 8.5 y a las
temperaturas de 28 y 45 ºC. Los valores de pH y temperatura óptimos
obtenidos, concuerdan con lo reportado por Bergey(1974), donde menciona un
pH 7.0 y una temperatura de 37 º C, para un buen crecimiento de Actinomyces
naeslundii, por lo que en adelante se trabajó con una solución amortiguadora
de fosfato a pH 7.0.
En el experimento se determinó que el microorganismo necesitó
aireación y agitación, para un mayor crecimiento, concordando con lo expuesto
por Cross (1980). Los valores de 0.5 vvm para la aireación y de 300 rpm para
la agitación fueron fijados en el presente trabajo (Figura 4). No se reportan
resultados comparativos en la literatura citada ya que, dichos trabajos se
realizaron mayormente a nivel de erlenmeyers, procedimientos que dificultan la
evaluación de las variables antes mencionadas.
La producción de pectinasas por Actinomyces naeslundii ,en medio
líquido (Figura 5), evidenció que la enzima alcanza su mayor rendimiento al
final de la etapa logarítmica del crecimiento microbiano, lo cual ratifica lo
expuesto por Franco (2001) y también concuerda con lo obtenido por Aguilar y
Huitron, (1986) en el sentido de que las pectinasas son enzimas inducidas por
la presencia de sustancias pécticas
El análisis estadístico, mediante el diseño experimental de Plackett
Burman, permitió seleccionar los nutrientes más influyentes en el proceso de
biotransformación, los cuales fueron posteriormente ajustados con el diseño de
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Box Benhken, obteniendo finalmente valores óptimos para cáscara de naranja,
16.7 g/ L; (NH4)2SO4 ,5 g/ L; FeSO4*7H2O, 0.013 g/ L. La utilización de estos
diseños estadísticos han sido desarrollados también por otros autores como:
Robles H.,(1995); Miranda y col.,(1996);Trujillo y col.,(2001); y Vasquez y
col.,(2001).
En el trabajo de investigación se obtuvo una correlación estadística de
0.84, lo cual significa que la ecuación de coeficientes se acerca al evento
experimental, para la producción de pectinasas. Las Figuras L.1.4, L.1.5, L.1.6,
y L.1.8 muestran un equilibrio inestable que perjudica el análisis de
óptimización y nos aleja de la solución. Mientras que las Figuras L.1.1, L.1.2,
L.1.3, L.1.7 y L.1.9 muestran tendencias hacia la maximización de la
producción de enzimas, siendo la más representativa la Figura L.1.7, donde se
puede apreciar que la elevación de la concentración de X1 (cáscara de
naranja) y la disminución de X4 (FeSO4*7H2O), estimularía la producción de
pectinasas, además de una mejor correlación.
Al comparar las actividades enzimáticas máximas producidas en el
medio TSB, suplementado con 1% de pectina y el medio experimental
desarrollado, cuyos valores fueron 0.80 U.I./mL y 0.65U.I./mL respectivamente,
se encontró que en el primer medio hay mayor actividad enzimática, debido a la
mejor disponibilidad de Actinomyces naeslundii , para utilizar la pectina en
estado libre que, atrapada en partículas de cáscaras de naranja. Asimismo, el
valor de 0.65 U.I./mL de actividad enzimática es menor que lo reportado por
otros investigadores como Cabello y col. (1982), quienes obtuvieron 3.77
U.I./mL de actividad producidas por un Bacillus. Spp. en un medio sumergido,
constituido por pulpa de café, sales minerales y agua.
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VI. CONCLUSIONES
1. Se obtuvo una actividad enzimática de 0.65 U.I./mL en cultivo sumergido en
medio óptimizado, compuesto por cáscara de naranja 16.5 g/L, (NH4) 2SO4 5
g/L y FeSO4*7H2O 0.013 g/L.
2. Las condiciones de crecimiento y producción de pectinasas por Actinomyces
naeslundii son: pH 7.0, 37 ºC, 300 rpm y 0.5 vvm de aireación.
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producción de ensilado de residuos de sardina (sardinops sagax sagax)
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Bioingeniería, PERÚ.
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del almidón de papa, MgSO4, CaCO3 & KH2PO4 en medio fermentativo a
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thuringiensis, II Congreso Peruano de Biotecnología y Bioingeniería,
PERÚ.
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ANEXOS
A. IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA DE Actinomyces naeslundii
Morfología de la colonia: circular, entera, convexa y de color blanco
Estudio microscópico: La observación microscópica se realizó a un cultivo
joven de 24 horas, resultando una coloración GRAM POSITIVO
CUADRO 7.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
CARACTERÍSTICAS RESULTADOS Formación de ácidos
Arabinosa Negativo Fructosa Positivo
Galactosa Positivo
Glucosa Positivo Manitol Negativo Ribosa Negativo Xilosa Negativo Almidón soluble Positivo
Catalasa Negativo Motilidad Positiva Indol Negativo NO3 - NO2 Positivo Voges- Proskaeur Negativo Ureasa Negativo Hidrólisis de gelatina Negativo Hidrólisis de Pectina Positivo
Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, I pp .663 –665.
Con las pruebas anteriores y otras adicionales, se identificó que nuestro
microorganismo fue Actinomyces naeslundii
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B EVALUACIÓN CUALITATIVA DE LA ACTIVIDAD PECTINASA DE
Actynomices naeslundii.( Mc Kay., 1988)
- Se sembró por puntura en una placa petri con agar control TSA suplementado
con 1% de pectina cítrica, incubándose, enseguida, a 37 º C por 5 días. Luego,
la placa fue colocada a 50 º C por 48 horas. A continuación, se retiró la colonia
crecida por lavados sucesivos con agua destilada estéril. Finalmente, se
adicionó el reactivo rojo de rutenio al 1 % sobre el área donde estuvo la
colonia, tornándose ésta de un color púrpura, lo cual evidenció la degradación
de la pectina.
ACTIVIDAD HIDROLÍTICA DEL MICROORGANISMO SOBRE LA PECTINA
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C. RECUENTO DE CÉLULAS VIABLES (Becker y col.,1999)
- Tomar una muestra de cultivo, y hacer diluciones 10X (Cada dilución 10X se
prepara añadiendo 1 mL de células a 9 mL de diluyente estéril).
- Colocar 0.1 mL de células diluidas sobre la superficie de una placa de agar
TSA.
- Después de colocar la alícuota de 0.1 mL de células diluidas sobre la placa de
agar TSA, la gota se extiende sobre la superficie con un asa de Drigalski (a
modo de palo de hockey).
- Una vez que la superficie de la placa está seca, se coloca ésta en la estufa de
incubación a 37 ºC
D. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE ACETATO DE SODIO pH 5, 0.015M:
CH3COOH 0.3264 g/L
CH3COONa 0.7839 g/L
Agua destilada 1000 mL
E. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATO DE SODIO pH 7, 0.015M:
NaH2PO4 0.497 g/L
Na2HPO4 1.618 g/L
Agua destilada 1000 mL
F. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATO DE SODIO pH 8.5,
0.015M:
NaH2PO4 0.04 g/L
Na2HPO4 2.087 g/L
Agua destilada 1000 mL
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G.1. EVALUACIÓN DE LA TEMPERATURA
N Densidad óptica a 600 nm
28 º C 37 ºC 45 ºC 1 0.18 0.62 0.38 2 0.22 0.75 0.41 3 0.28 0.60 0.34 4 0.30 0.78 0.30 5 0.38 0.55 0.25
PROMEDIO 0.27 0.66 0.34
G.2. EVALUACIÓN DEL pH
N Densidad óptica a 600 nm
5 7 8.5 1 0.15 0.71 0.13 2 0.19 0.60 0.20 3 0.23 0.73 0.15
PROMEDIO 0.19 0.68 0.16
G.3. EVALUACIÓN DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN
N Densidad óptica a 600 nm. sin aireación-agitación con aireación-agitación
1 0.38 0.642 0.31 0.583 0.44 0.72
PROMEDIO 0.38 0.65
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H. ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO DE LA CÁSCARA DE NARANJA
ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO % materia seca (AOAC, 1961) 92.00 Proteína (AOAC, 1961) 4.00 Pectina (Kirk, 1961) 4.00 Aceites y grasas (UNI,1994) 2.50 Cenizas (AOAC, 1961) 5.00
I. CURVA DE CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Y
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN UN MEDIO TSB SUPLEMENTADO
CON 1% PECTINA
II.
TIEMPO Log N° DE ACTIVIDAD (Horas) ufc / mL PECTINASA
( U.I/mL ) 0 6.48 0.00 8 6.49 0.00 16 6.45 0.05 24 6.81 0.10 32 6.48 0.12 40 6.49 0.21 48 9.45 0.22 56 9.48 0.61 64 9.43 0.80 72 9.48 0.77 80 9.46 0.74 88 9.00 0.72 96 8.93 0.68
104 7.15 0.59 112 6.08 0.50 120 5.60 0.40
Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso, Alexís Germán
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J. CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO EN UN MEDIO CÁSCARA
DE NARANJA
TIEMPO NÚMERO
DE Log N° DE ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA PROTEÍNA
(Horas) CÉLULAS CEL/mL PECTINASA TOTAL ( u.f.c / mL ) ( U.I/mL ) (mg/Ml) 0 3.0*108 8.48 0.00 0.00 8 3.2*108 8.51 0.00 0.00
16 3.1*108 8.49 0.11 0.00 24 6.9*108 8.84 0.26 0.07
32 8.0*108 8.90 0.26 0.11 40 5.8*108 8.76 0.27 0.11 48 10.3*108 9.01 0.40 0.16 56 5.1*108 8.71 0.58 0.23 64 22.0*108 9.34 0.64 0.24 72 3.5*109 9.54 0.65 0.25 80 3.0*109 9.48 0.62 0.26 88 12.3*108 9.09 0.52 0.19 96 96.0*107 8.98 0.49 0.15 104 16.1*106 7.21 0.46 0.12 112 14.2*105 6.15 0.40 0.09
120 3.5*105 5.54 0.38 0.09
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L.1. FIGURAS REFERENTES A LAS ECUACIONES XY POLINOMIALES PARA EL CÁLCULO DE LAS RESPUESTAS EN SUPERFICIE Y LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS
FIGURA L.1.1
RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO
X4 = FeSO4 * 7H2O = 0.08 g / L
0.345 0.366 0.387 0.408 0.430 0.451 0.472 0.493 0.514 0.535 above
Function Plot (NEW.STA 10v*10c)
Z=0.7199-0.01064*x-0.1432*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y
LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X4 = FeSO4 * 7H2O = 0.08 g / L
0.345 0.366 0.387 0.408 0.429 0.451 0.472 0.493 0.514 0.535
3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.7199-0.01064*x-0.1432*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y
X1 = CASC. NARANJA g / Lt
X2
= (
NH
4 )
2SO
4 g
/ Lt
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
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FIGURA L.1.2
RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO
X4 = FeSO4 * 7H2O = 0.0465 g / L
0.269 0.302 0.334 0.367 0.399 0.431 0.464 0.496 0.529 0.561 above
Function Plot (NEW.STA 10v*10c)
Z=0.4929+0.0008*x-0.08854*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y
LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X4 = FeSO4 * 7H2O = 0.0465 g / L
0.269 0.302 0.334 0.367 0.399 0.431 0.464 0.496 0.529 0.561
3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)
Z=0.4929+0.0008*x-0.0885*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.002210*x*y
CASC. NARANJA g / Lt
( NH
4 )2
SO
4 g
/ Lt
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso, Alexís Germán
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FIGURA L.1.3
RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X4 = FeSO4 * 7H2O = 0.013 g / L
0.274 0.321 0.369 0.417 0.465 0.513 0.561 0.608 0.656 0.704 above
Function Plot (NEW.STA 10v*10c)
Z=0.7199-0.0106*x-0.1432*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y
LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X4 = FeSO4 * 7H2O = 0.013 g / L
0.274 0.321 0.369 0.417 0.465 0.513 0.561 0.608 0.656 0.704
3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.7199-0.01064*x-0.1432*y-0.0005*x^2+0.0179*y^2+0.00221*x*y
CASC. NARANJA g / Lt
( N
H4
)2 S
O4
g / L
t
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso, Alexís Germán
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FIGURA L.1.4
RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC. NARANJA = 16.7 g / L
0.153 0.195 0.237 0.278 0.320 0.362 0.404 0.446 0.488 0.530 above
Function Plot (NEW.STA 10v*10c)
Z=0.2184+0.0242*x+4.1914*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y
LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC. NARANJA = 16.7 g / L.
0.153 0.195 0.237 0.278 0.320 0.362 0.404 0.446 0.488 0.530
3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.2184+0.0242*x+4.1914*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y
( NH4 )2 SO4 g / Lt
Fe S
O4
* 7
H2O
g /
Lt
0.013
0.018
0.023
0.028
0.033
0.038
0.043
0.048
0.053
0.058
0.063
0.068
0.073
0.078
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
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FIGURA L.1.5
RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC. NARANJA = 9.35 g / L
0.306 0.340 0.375 0.410 0.445 0.479 0.514 0.549 0.583 0.618 above
Function Plot (NEW.STA 10v*10c)
Z=0.1979+0.01797*x+6.6939*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y
LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC. NARANJA = 9.35 g / L
0.306 0.340 0.375 0.410 0.445 0.479 0.514 0.549 0.583 0.618
3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.1979+0.01797*x+6.6939*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y
( NH4 )2 SO4 g / Lt
Fe S
O4
* 7
H2O
g /
Lt
0.013
0.018
0.023
0.028
0.033
0.038
0.043
0.048
0.053
0.058
0.063
0.068
0.073
0.078
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
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FIGURA L.1.6
RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC. NARANJA = 2 g / L
0.259 0.293 0.326 0.360 0.393 0.426 0.460 0.493 0.527 0.560 above
Function Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.12008-0.00828*x+9.19944*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y
LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC. NARANJA = 2 g / L
0.259 0.293 0.326 0.360 0.393 0.426 0.460 0.493 0.527 0.560
3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.12008-0.00828*x+9.1994*y+0.0179*x^2-24.895*y^2-1.6309*x*y
( NH4 )2 SO4 g / Lt
Fe S
O4
* 7H
2O
g / L
t
0.013
0.018
0.023
0.028
0.033
0.038
0.043
0.048
0.053
0.058
0.063
0.068
0.073
0.078
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
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FIGURA L.1.7
RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4)2 SO4 = 5 g / L
0.354 0.394 0.434 0.473 0.513 0.553 0.593 0.633 0.673 0.712 above
Function Plot (NEW.STA 10v*10c)
Z=0.473+0.02765*x+1.7229*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.3405*x*y
LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4)2 SO4 = 5 g / L
0.354 0.394 0.434 0.473 0.513 0.553 0.593 0.633 0.673 0.712
3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)
Z=0.473+0.02765*x+1.7229*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.3405*x*y
CASC. NARANJA g / Lt
Fe
SO
4 *
7H2O
g /
Lt
0.013
0.018
0.023
0.028
0.033
0.038
0.043
0.048
0.053
0.058
0.063
0.068
0.073
0.078
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso, Alexís Germán
Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM
FIGURA L.1.8
RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4)2 SO4 = 3 g / L
0.256 0.275 0.294 0.313 0.332 0.351 0.370 0.388 0.407 0.426 above
Function Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.06701+0.02323*x+4.9847*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.34048*x*y
LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4)2 SO4 = 3 g / L
0.256 0.275 0.294 0.313 0.332 0.351 0.370 0.388 0.407 0.426
3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)
Z=0.06701+0.02323*x+4.9847*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.34048*x*y
CASC. NARANJA g / Lt
Fe
SO
4 *
7H2O
g /
Lt
0.013
0.018
0.023
0.028
0.033
0.038
0.043
0.048
0.053
0.058
0.063
0.068
0.073
0.078
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Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso, Alexís Germán
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FIGURA L.1.9
RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4)2 SO4 = 1 g / L
0.259 0.293 0.326 0.360 0.393 0.426 0.460 0.493 0.527 0.560 above
Function Plot (NEW.STA 10v*10c)Z=0.0942+0.01881*x+8.2465*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.34048*x*y
LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4)2 SO4 = 1 g / L
0.259 0.293 0.326 0.360 0.393 0.426 0.460 0.493 0.527 0.560
3D Contour Plot (NEW.STA 10v*10c)
Z=0.0942+0.01881*x+8.2465*y-0.0005*x^2-24.895*y^2-0.34048*x*y
CASC. NARANJA g / Lt
Fe
SO
4 *
7H2O
g /
Lt
0.013
0.018
0.023
0.028
0.033
0.038
0.043
0.048
0.053
0.058
0.063
0.068
0.073
0.078
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Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso, Alexís Germán
Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM
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M. DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA DEL ÁCIDO D-
GALACTURÓNICO (MÉTODO DE MILLER & COL., 1959).
Procedimiento:
BLANCO MUESTRA volúmen de medio 0.5 mL 0.5 mL buffer acetato 1.0 mL 1.0 mL Llevar a ebullición 10 min ------ preincubación 50 ºC x 15 min 50 ºC x 15 min sustrato (pectina al 1%) 0.5 mL 0.5 mL Incubar 50 ºC x 30 min 50 ºC x 30 min DNS 3.0 ML 3.0 mL centrifugar a 4000 rpm x 10 minutos decantar y llevar a 100 ºC x 5 minutos leer la absorvancia a 540 nm
CURVA STANDARD DE ACIDO D-GALACTURÓNICO
00.20.40.60.8
11.21.41.61.8
2
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
Acido D-galacturónico (mg/mL)
Ab
sorv
anci
a (5
40 n
m)
Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso, Alexís Germán
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Actividad Enzimática ( UI / mL ) = ( M – B ) * 103 ? moles
PM * (Tiempo de reacción de 30 min)
Donde:
M, B = concentración de ácido D - galacturónico en mg / mL
PM = peso molecular del ácido D – galacturónico ( 212.2 )
N.
BIORREACTOR UTILIZADO PARA LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS