UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA

FACULTAD DE MATEMÁTICA, ASTRONOMÍA, FÍSICA Y COMPUTACIÓN

SERIE “A”

TRABAJOS DE FÍSICA

N.º 15/2018

CARACTERIZACIÓN DE LA PREPARACIÓN DE LIPOSOMAS UTILIZANDO RELAXOMETRÍAMAGNÉTICA NUCLEAR

María B. Marzola, Carla C. Fraenza, Esteban Anoardo

Editor: Miguel A. Chesta

CIUDAD UNIVESITARIA – 5000 CÓRDOBA

REPÚBLICA ARGENTINA

Caracterización de la preparación deliposomas utilizando Relaxometría

Magnética Nuclear

M. B. Marzola Coronel, C. C Fraenza, E. Anoardo

Laboratorio de Relaxometría y Técnicas Especiales, Grupo de RMNFacultad de Matemática, Astronomía y Física, Universidad Nacional de Córdoba

M. Allende y H. de la Torre ­ Ciudad Universitaria, X5016LAE ­ Córdoba, Argentina

Resumen

Este trabajo de investigación consistió en caracterizar cada paso de la preparación de liposomasutilizando la técnica de relaxometría con ciclado rápido de campo magnético. Para ello, se midieron perfilesde dispersión de la tasa de relajación espín­red R1 en cada una de las instancias relevantes de la preparación,verificando la efectividad de las mismas. Adicionalmente, se realizaron experimentos complementarios conla técnica de dispersión dinámica de luz o DLS por sus siglas en inglés.

Abstract

This work consisted in characterizing each step of the liposome preparation using the fast field­cyclingNMR relaxometry technique. The dispersion profiles of the spin­lattice relaxation rate R1 were measuredfor every relevant instance of the preparation in order to check their effectiveness. Additionally, experimentsusing dynamic light scattering (DLS) technique were carried out.

1. Introducción

Las propiedades de la membrana de ve­sículas lipídicas, comunmente llamadasliposomas, resultan de particular interés

en una creciente cantidad de problemas bio­tecnológicos. La importancia de esudiar estetipo de sistemas es su utilidad para el transpor­te controlado por diferentes vías, de fármacoshidrofílicos e hidrofóbicos en su núcleo acuo­so y bicapa lipídica respectivamente, asi comotambién para contrastes, transfección, etc.

En trabajos previos [1], [2], [3], [4], [5] sepresentó un modelo para interpretar la dis­persión de la tasa de relajación espín­red deprotones, obtenida con la técnica de relaxo­metría magnética nuclear con ciclado rápidode campo magnético (o FFC por sus siglas en

inglés) [6], para liposomas unilamelares. Ade­más de proporcionar información general so­bre la dinámica de los lípidos que conformanla membrana de los liposomas, este modelonos permite inferir sobre las propiedades elás­ticas de la misma. La técnica utilizada ofrecedos potenciales ventajas escasamente explora­das a la fecha: es factible extender los estudiosa sistemas de escalas de pocas decenas de na­nómetros en forma no invasiva, y es posiblepensar en instrumentación de costo razonable,volumen y peso limitado, facilidad de insta­lación, así como mantenimiento y uso. Por loque se ha demostrado que es de gran utilidadestudiar estos sistemas con la técnica de FFC.

Específicamente el objetivo de este trabajofue la verificación de la sensibilidad de la técni­ca con ciclado rápido de campo a las distintas

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FSA Trabajos Originales en Física Serie A1 (2018) 1-10

M. B. Marzola Coronel, C. C. Fraenza, E. Anoardo

instancias de la preparación de liposomas conel fin de asegurar la efectividad de los diversosprocesos a los que el sistema es sometido.

2. Sistema deEstudio­ Liposomas

Un lípido es una molécula orgánica com­puesta principalmente por carbono e hidró­geno y en menor medida oxígeno. Tambiénpueden contener fósforo, azufre y nitrógeno.

Como en aplicaciones biológicas el solventeutilizado es agua, se puede decir que los lípidosanfifílicos son un tipo de lípidos que consistende una parte hidrofóbica y una parte hidrofí­lica. En general, la parte hidrofóbica consistede cadenas hidrocarbonadas, mientras que laparte hidrofílica está compuesta por un gru­po polar. Dentro de esta clase de lípidos seencuentran los fosfolípidos, los cuales están com­puestos por una molécula de glicerol, a la quese unen dos ácidos grasos y un grupo fosfato.Este último está unido a otro grupo de átomos,entre los que generalmente está incluido unnitrógeno, como es el caso del grupo colina, abase del cual se forman las fosfatidilcolinas.

Los fosfolópidos poseen una función estruc­tural ya que son un componente principal detodas las membranas celulares debido a su ca­pacidad de formar bicapas lipídicas [7]. En estetrabajo se utilizó un fosfolípido particular lla­mado fosfatidilcolina de soja (SPC) adquiridode la empresa “Lipoid” con el nombre comer­cial “PHOSPHOLIPON 90 G” y cuya especiepredominante es en un 94 %C42H80NO8P concadenas doblemente insaturadas y, en un 4 %,Lisofosfatidilcolina (C25H50NO7P). En la figu­ra 1 se esquematiza la estructura de la especiepredominante:

Figura 1: Estructura molecular de la fosfatidilcolina desoja (SPC). En el extremo derecho se observan los grupospolares, y en el extremo izquierdo se muestran las cadenasapolares.

En solución acuosa, los lípidos anfifílicos alprincipio se disuelven como monómeros pero,al superar cierta concentración, se unen espon­táneamente para minimizar las interaccióneshidrofóbicas desfavorables y formar una va­riada gama de estructuras, que dependen engeneral de la concentración y la temperatura.

Para determinadas concentraciones en unmedio acuoso, los fosfolípidos forman bicapasque se curvan y se cierran espontáneamenteen estructuras cuasi­esféricas llamadas liposo­mas, los cuales encierran en su interior partedel solvente que los rodea. Tales sistemas noestán en equilibrio termodinámico pero pue­den ser estables durante varios días. El tamañode un liposoma puede ir desde unos 20nm has­ta varios micrómetros de radio, y puede estarcompuesto de una (unilamelar) o varias mem­branas concéntricas (multilamelar),cada unade las cuales tiene aproximadamente 6nm deespesor. En la figura 2 se esquematiza un lipo­soma.

Figura 2: Respresentación esquemática de un liposoma.Los círculos representan los grupos polares mientras quelas líneas onduladas hacen referencia a las cadenas hidro­carbonadas.

3. Experimental

I. Preparación de la muestra

Se prepararon liposomas de SPC (Fosfatidil­colina de Soja) suspendidos en agua deuterada(D2O). Se procuró que el diámetro de los mis­mos no supere los 100nm por la aplicabilidaddeseada.

Las suspensiones de liposomas fueron pre­paradas en el Centro de Investigaciones en Quí­mica Biológica de Córdoba (CIQUIBIC), de lafacultad de ciencias químicas, UNC, en la ciu­dad de Córdoba.

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El motivo por el que el medio de suspen­sión es agua deuterada (D2O) y no agua ( H2O)es que se desea detectar la señal de RMN prove­niente unicamente de los núcleos de hidrógenode los lípidos. Por el contrario, si el medio desuspensión fuera agua, la señal que se detecta­ría sería en mayor medida proveniente de losnúcleos de hidrógeno del H2O. Debido a la fal­ta de resolución espectroscópica de la técnicade RMN a utilizar, no se podría discriminar laseñal proveniente de cada tipo de hidrógeno.

Como la frecuencia de la perturbación apli­cada en los experimentos a realizar es propor­cional a la constante giromagnética del hidró­geno, no se generan transiciones entre los ni­veles de energía provenientes de la interaccióndel campo externo

−→B0 con los restantes elemen­

tos que componen la muestra ya sean deute­rios, oxígenos, fósforos, carbonos, etc. Es decirque lo que ocurre es que se “invisibilizan” losnúcleos de todos los elementos que no seanhidrógenos.

Pasos de la preparación

1. PESAJE

Se utilizó una balanza digital “HR­120”(A&D Weighing) con una apreciación de0,0001g. El pesaje se realizó colocando elmaterial dentro de un tubo cónico de vi­drio de peso conocido. La masa total quese utilizó en todos los eperimentos fue:Mli p = (61,19 ±0,05)mg

2. DISOLUCIÓN

Los lípidos se disolvieron en 2ml de clo­roformo aproximadamente.

3. FORMACIÓN DEL “FILM”

Se secó el solvente con una corriente denitrógeno gaseoso, mientras se maniobra­ba el recipiente de tal forma de facilitarla adhesión de los lípidos a las paredesdel mismo durante el secado del solvente,formandose un film.

Figura 3: Respresentación esquemática de la formacióndel film dentro del recipiente.

Una vez formado el film, se dejó el reci­piente en vacío durante tres horas apro­ximadamente para terminar de evaporarel solvente.

Todo el procedimiento descripto hastaahora se realizó con el objetivo de favore­cer la hidratación cuando se agrega la so­lución acuosa ya que el lípido es bastanteinsoluble en agua. Por lo que, si se agre­gara directamente el bufer acuoso, el lípi­do tendería a excluirse del agua forman­do grandes agregados difíciles de desar­mar. Entonces, con este procedimiento selogran formar capas monomoleculares enlas paredes del tubo cónico.

4. HIDRATACIÓN

La muestra se hidrató con (1,3 ± 0,1)mlde agua deuterada. Primero se agrega­ron 0,8ml y se agitó la solución con un“agitador vortex” para ayudar a la hidra­tación. Luego se agregaron los 0,5ml deD2O restantes y se volvió a agitar. Si alfinalizar este procedimiento se observabaque todavía quedaban restos de film sindisolver, se introducía la muestra en unbaño térmico a 40◦C aproximadamentepor unos minutos y se volvía a agitar.

Figura 4: Respresentación esquemática del proceso dehidratación.

5. TRATAMIENTO TÉRMICO

Una vez realizada la hidratación se trans­pasó la muestra a un “eppendorf” y se

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Caracterización de la preparación de liposomas utilizando Relaxometría Magnética Nuclear

lo sometió a cinco ciclos térmicos de frío­calor que consisten en introducir la mues­tra 5 min en un baño térmico a 313 K einmediatamente después ponerla en unrecipiente con Nitrógeno líquido (77 K)otros 5min. Este tratamiento favorece aque el agua pesada interactúe mejor conlos grupos polares de los fosfolípidos. Loque se obtiene en esta instancia es unasuspensión de liposomas multilamelares.

Como la distribución de tamaños de estasvesículas no es uniforme se realizó el si­guiente y último paso de la preparación.

6. EXTRUSIÓN

Este proceso consiste en pasar las vesí­culas por membranas de policarbonatocon poros de 100nm en este caso. De estaforma se obliga a las vesículas a adoptaruna forma esférica con diámetro prome­dio definido por los poros de la mem­brana, implicando esto también que lasvesículas dejen de ser multilamelares. Elinstrumento utilizado para realizar estatarea se denomina extrusor y consta bási­camente de una estructura cilíndrica deteflón dentro de un recinto metálico quesostiene firmemente las mebranas poro­sas y, de cada lado de la estructura seadosa una jeringa. Así se hizo pasar diezveces la muestra de una jeringa a la otraatravesando la membrana porosa.

Figura 5: Respresentación esquemática del proceso deextrusión.

II. Determinación del tamaño de losliposomas

Para determinar los tamaños promedios delas vesículas que se formaron una vez termina­da la preparación, se utilizó un equipo de dis­persión dinámica de luz láser (Zetasizer Nano­Zs, Malvern Instruments, UK), utilizando un

ángulo de detección de 173◦ y provisto de unláser de He­Ne operando a una longitud deonda de 633nm.

III. Medición de un perfil de disper­sión

Se define “tiempo de relajación espín­red”ó T1 al tiempo característico asociado con la re­cuperación hacia la condición de equilibrio dela componente longitudinal (dirección paralelaal eje de cuantzación impuesto por el campoexterno B0) de la magnetización y está deter­minado por los mecanismos que involucranuna transferencia energética desde el sistemade espines a la red.

La relaxometría con ciclado rápido de cam­po ó FFC NMR (por sus siglas en inglés) esuna técnica de Resonancia Magnética Nuclearque permite obtener tiempos de relajación deun sistema de núcleos en función del campomagnético externo aplicado [6]. Debido a quela frecuencia de Larmorω0 es proporcional a lamagnitud del campo magnético aplicado comose indica en la siguiente ecuación 1:

ω0 = γB0, (1)

donde γ es la constante giromagnética decada elemento, suele expresarse el campo mag­nético externo (B0) en función de la frecuenciade Larmor (de núcleos de Hidrógeno en estecaso) ω0.

Si se mide la dependencia deT1 con el valorde campo, se obtiene la denominada “curva dedispersión de la tasa de relajación espín­red”,la cual consiste en expresar la tasa de relaja­ción R1 = T1

−1 en función de la frecuencia deLarmor.

Las dos secuencias de campo ciclado que seusan comunmente para la medición deT1 son:la secuencia Pre ­ Polarizada (PP) y la secuenciaNo ­ Polarizada (NP). El principio de funcio­namiento y sus características se describen acontinuación.

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M. M. Marzola Coronel, C. C. Fraenza, E. Anoardo

Secuencia PP

Esta secuencia se utiliza para medir T1a campos muy bajos (en general menores a10MHz). En la figura 6 se muestra un esquemade la misma.

Figura 6: Esquema de la secuencia pre­polarizada. Semuestra gráfica y cualitativamente los distintos valoresque toma el campo B0. Se puede ver que el campo Br seesquematiza con más de una “linea” debido a que su valorvaría durante el experimento. El pulso de radiofrecuenciase denota con las letras PW , τ es el período temporal enque la magnetización se encuentra bajo la acción del campoBr, y el lapso de tiempo en que el campo B0 cambia de unvalor a otro se denota con las letras sw [8].

La muestra es polarizada en un campo mag­nético Bp, tan alto como técnicamente sea po­sible donde se forma una magnetización deequilibrio proporcional al campo M0(Bp). Elproceso de relajación tiene lugar en un campoBr el cual es el que cambia su valor para po­der medir el perfil de dispersión y, el intervalode tiempo que el sistema se encuentra someti­do a este campo, depende de las propiedadesrelaxométricas de la muestra. La magnetiza­ción inicial en este campoBr se asume igual ala magnetización en el campo de polarizaciónya que se ignora la relajación ocurrida duran­te el intervalo de cambio “sw”, por lo que setiene Mz(0) = M0(Bp). Luego, la misma em­pieza a relajar hacia la nueva magnetizaciónde equilibrio proporcional al campo de rela­jación M0(Br), y relajará (disminuirá en estecaso) más, mientras mayor sea el tiempo τ quese deje expuesta a este campo. Este tiempo τes el que va cambiando en cada secuencia acampo Br fijo para determinar un valor deT1.En este intervalo de tiempo, el valor al que re­laja la magnetización está dado por una de lassoluciones de las ecuaciones de Bloch:

Mz(τ) = M0(Br) + [M0(Bp) −M0(Br)]e−τ/T 1

(2)

La señal remanente después de este inter­valo de relajación es detectada en un campoBd, de nuevo, tan alto como sea posible. Parala detección de la señal remanente, se aplica eneste caso un pulso deπ / 2 de duración de 6,5µs(también se pueden utilizar ecos de espín) paraobservar la señal nuclear (señal de inducciónlibre o FID por su siglas en inglés). Se adquirióla integral bajo un sector muy pequeño de laFID cercano al punto máximo de la misma, demodo de aprovechar el mayor valor de señal y,al mismo tiempo, no lidiar con posibles imper­fecciones de los primeros puntos de la misma.Finalmente toma lugar el proceso de repolari­zación de la muestra, antes de que comience elciclo nuevamente.

Secuencia NP

Cuando el valor del campo de relajaciónes próximo al valor de polarización, la evolu­ción de la magnetización toma lugar entre unvalor inicial y final de campo muy cercanos,lo cual incrementa el error de la medición. Enestos casos es preferible utilizar la secuenciaNP ya que aumentar el valor del campo Bpno es una posibilidad debido a impedimentoselectrónicos.

Por lo tanto esta secuencia se utiliza paramedir T1 a valores de campo próximos al valorde polarización, en este caso la magnetizacióncrece desde un valor inicial proximo a cero. Lamisma se esquematiza en la figura 7.

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Caracterización de la preparación de liposomas utilizando Relaxometría Magnética Nuclear

Figura 7: Esquema de la secuencia no­polarizada. Semuestra gráfica y cualitativamente los distintos valoresque toma el campo B0. Se puede ver que el campo Br seesquematiza con más de una “linea” debido a que su valorvaría durante el experimento. El pulso de radiofrecuenciase denota con las letras PW , τ es el período temporal enque la magnetización se encuentra bajo la acción del campoBr, y el lapso de tiempo en que el campo B0 cambia de unvalor a otro se denota con las letras sw.

En esta secuencia se inicia el ciclo sin nin­gún campo de polarización B0(0) = 0, porlo tanto la curva de relajación se construye apartir de un valor de magnetización cercanoa cero Mz(0) ∼ 0. Luego se enciende el cam­po de relajación y la magnetización empiezaa crecer para llegar al valor de equilibrio coneste campo. La magnetización será más grandemientras mayor sea el tiempo τ que se dejesometido el sistema a este campo. La evoluciónde la misma puede entonces describirse con lasiguiente ecuación:

Mz(τ) = M0(Br)(1 − e−τ/T 1) (3)

Luego la señal es detectada de la mismamanera que en la seuencia PP.

Descripción general y parámetros utilizados

Los perfiles de dispersión de la tasa derelajación espín­red,fueron medidos usandola técnica de relaxometría con ciclado rápidode campo, con un relaxómetro “SpinmasterFC2000/C/D” (Stelar; Mede, Italia) y usandoun volumen de muestra de 1ml. En todos loscasos se utilizó un campo magnético de polari­zación de 15MHz , y un campo de adquisiciónde 14,19MHz (expresados en frecuencia de Lar­mor para núcleos de hidrógeno). Los perfilesse midieron dentro del rango de frecuenciasde 30KHz a 15MHz (valores del campo de re­lajación),rango en el cual se puede asegurar

que las mediciones no están afectadas por lapresencia de campos locales [1]. La cantidadde puntos que componen el perfil se fijó en 30y, la medición del mismo demoró entre 2hs y5hs según la temperatura de la medición. Unavez preparadas la suspensión de liposomas, elperíodo de tiempo en el que se la sometió atodas las mediciones no fue nunca mayor a 10días. Luego de este lapso no se puede garanti­zar el estado de estabilidad de la muestra. Latemperatura de la muestra fué controlada conuna variación de 1K aproximadamente, usandoel control de temperatura del relaxómetro.

Medición genérica de un punto del perfil

Como ya se mencionó, un perfil de disper­sión de la tasa de relajación es justamente ungráfico del valor de R1 en función del campomagnético Br en el cual tiene lugar la relajación.Por lo tanto, para la medición de un punto deesta curva lo que se hace es fijar un valor decampo Br, y se repite el ciclo ya descripto perovariando el tiempoτ en el que la muestra per­manece en este campo. Este ciclo se realizó 16veces por lo que se obtuvieron curvas con 16puntos para la determinación de un valor deT1.

Secuencia NP: Esta secuencia se utilizó pa­ra la medición de los valores deR1 correspon­dientes a campos magnéticosBr entre 10MHzy 15MHz . En este caso mientras mayor sea eltiempo τ que la muestra se encuentra sometidaal campo de relajación, mayor será la magne­tización adquirida y más parecida al valor desaturación correspondiente a este valor de cam­po Br. Por lo tanto se obtiene una curva de “re­cuperación de la magnetización”. Típicamenteluce como en la figura 8.

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M. M. Marzola Coronel, C. C. Fraenza, E. Anoardo

Figura 8: Esquema cualitativo de la forma funcional dela magnetización en función del tiempo de residencia alvalor de campo Br utilizando una secuencia NP.

Secuencia PP: Esta secuencia se utilizó parala medición de los valores de R1 correspon­dientes a campos magnéticos entre 30KHz y10MHz . A diferencia de la secuencia NP, mien­tras más larga sea la permanencia del sistemaen el campo de relajación, más va a decrecer lamagnetización respecto a su valor alcanzadoen el campo de polarización, pareciendose alvalor en equilibrio con el campo Br. En estecaso se obtienen gráficos como el de la figura9, que ilustran la pérdida de magnetización.

Figura 9: Esquema cualitativo de la forma funcional dela magnetización en función del tiempo de residencia alvalor de campo Br utilizando una secuencia PP.

El valor de cada T1 se obtuvo ajustando porcuadrados mínimos cada curva de crecimien­to/disminución de la magnetización según seael caso. Los procesos de relajación resultaronser todos monoexponenciales y, las funcionesde ajustes utilizadas según la secuencia aplica­da, fueron las dadas por las ecuaciones 2 y 3en el marco teórico.

4. Resultados yAnálisis de datos

Se realizó este estudio para verificar si cadainstancia de la preparación de la muestra de

liposomas tenía el efecto deseado y si la técnicautilizada podía detectarlo a través de mostrarcambios en la dispersión de R1.

En términos generales, lo que se midió fueun perfil de dispersión de la tasa de relajaciónespín­red luego de cada proceso relevante enla preparación de liposomas, específicamen­te luego de la hidratación, luego de los ciclostérmicos, y por último, una vez terminada laextrusión (muestra final).

Todos los perfiles que se muestran en estasección se comparan con un perfil de disper­sión obtenido previamente correspondiente auna muestra que posee la misma composiciónpero con el proceso de preparación finalizado.Los perfiles estudiados poseen 15 puntos envez de 30 (como la muestra de referencia) paraahorrar tiempo de medición, pero esto no esrelevante ya que las curvas obtenidas no vana ser ajustadas sino que sólo se desea analizarsu comportamiento.

Post­Hidratación

Una vez formado el film, se procedió a la hi­dratación de la muestra, siguiendo el protocolodescripto en la sección I.1. Luego, se separóuna pequeña parte de la muestra para realizarun experimento de DLS y, lo restante se utilizópara la medición del perfil de dispersión.

El perfil de dispersión obtenido, se ilustraen la figura 10.

105 106 1071

10

100

S P C a 3 0 5 K p r e p a r a c i ó n c o m p l e t a S P C a 3 0 5 K l u e g o d e l a h i d r a t a c i ó n

R1 [s

-1]

[Hz]

Figura 10: Dispersión experimental de la tasa de relaja­ción espín­red para una suspensión de liposomas de SPC(•) y para una suspensión de SPC luego de la hidratación(N).

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Caracterización de la preparación de liposomas utilizando Relaxometría Magnética Nuclear

Se puede observar una gran diferencia en­tre los dos perfiles ya que para ν0 = 15MHzlos valores de R1 de ambas muestras ilustra­das son indistinguibles y es aproximadamenteR1 ∼ 7s−1, pero para ν0 = 30KHz la muestracon la preparación completa posee un valor deR1 mayor a 100s−1, mientras que el valor deR1 de la muestra que sólo está hidratada, esinferior a 30s−1. Por lo tanto se puede ver quecomparativamente, este último perfil es muchomenos dispersivo, es decir, la diferencia entreR1 a 15MHz y a 30kHz es menor en este últimocaso.

Post­Ciclos térmicos

Una vez terminada la medición anterior seprocedió a realizarle a la muestra el tratamientotérmico. El perfil de dispersión obtenido luegode este proceso, se ilustra en la figura 11.

105 106 1071

10

100

S P C a 3 0 5 K p r e p a r a c i ó n c o m p l e t a S P C a 3 0 5 K l u e g o d e l o s c i c l o s t é r m i c o s

R1 [s

-1]

[Hz]

Figura 11: Dispersión experimental de la tasa de relaja­ción espín­red para una suspensión de liposomas de SPC(•) y para una suspensión de SPC luego de el tratamientotérmico ( ).

Si se comparan las figuras 10 y 11 se puedeobservar que el perfil no cambió considerable­mente respecto al paso de preparación anterior,es decir, presenta características mucho menosdispersivas que el correspondiente perfil de lamuestra con preparación completa.

Post­Extrusión

Por último, luego de los ciclos térmicos sesometió la muestra al proceso de extrusión.

Este paso se realizó para verificar si se podíareproducir un perfil típico de liposomas deSPC (muestra con preparación completa). Am­bos perfiles (suspensión de SPC luego de laextrusión y liposomas de SPC) se ilustran en lafigura 12.

105 106 1071

10

100

S P C a 3 0 5 K p r e p a r a c i ó n c o m p l e t a S P C a 3 0 5 K l u e g o d e l a e x t r u s i ó n

R1 [s

-1]

[Hz]

Figura 12: Dispersión experimental de la tasa de relaja­ción espín­red para una suspensión de liposomas de SPC(•) y para una suspensión de SPC luego de la extrusión( ).

Las curvas no son 100 % indistinguibles, pe­ro como lo que se desea observar son las pro­piedades dispersivas de la misma, se podríadecir que ambas curvas poseen las mismascaracterísticas a tal fin. La discrepancia obser­vada se puede deber tal vez a diferencias en latemperatura del experimento no reportadas.

La medición de este último perfil demues­tra la importancia de realizar todos y cada unode los pasos de preparación descriptos en lasección I.1 en orden de obtener un perfil conlas características del graficado en la figura 12y similares a las obtenidas para liposomas entrabajos previos [1] [2].

DLS

Para completar este análisis de la prepa­ración, se sometió a las muestras correspon­dientes a las instancias previa y posterior a laextrusión, a un estudio de dispersión dinámicade luz para observar la influencia que poseeeste proceso en la distribución de tamaños delas vesículas. Los resultados se muestran enlas figuras 13 y 14 donde se pueden observarlas distribuciones de diámetros de las vesículas

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M. M. Marzola Coronel, C. C. Fraenza, E. Anoardo

según la cantidad (“número”) que poseen undeterminado diámetro, correspondientes a an­tes y después de la extrusión, respectivamente.

Figura 13: Distribución de diámetros de las vesículassegún la cantidad que posee un determinado diámetro,antes de la extrusión

Figura 14: Distribución de diámetros de las vesículassegún la cantidad que posee un determinado diámetro,luego de la extrusión, usando una membrana de tamañode poro de 100nm de diámetro.

En la figura 13 se puede observar que an­tes de realizar la extrusión se tienen vesículasde tamaños de 800nm, 900nm y 1000nm apro­ximadamente, mientras que una vez realiza­do este proceso (diámetro de poro del filtro= 100nm), lo que se obtiene son vesículas dediámetros mucho más pequeños (∼ 30 − 40nmy ∼ 80 −90nm).

Este último análisis destaca la importanciadel proceso de extrusión para eliminar grandesagregados.

5. Conclusiones

En cuanto a las propiedades intrínsecas dela muestra, se logró caracterizar cada instanciade la preparación de liposomas. Esta carac­terización será de gran utilidad para futurosexperimentos que se realicen con este tipo desistemas utilizando la técnica de relaxometríacon ciclado rápido de campo magnético. Severificó que cada instancia de la preparaciónde liposomas tiene el efecto deseado y que latécnica utilizada puede detectar tales efectos através de mostrar cambios en la dispersión deR1.

Las diferencias observadas a bajas frecuen­cias en el perfil de dispersión de la instanciafinal de la muestra (post­extrusión) respecto alos perfiles de dispersión de los pasos previos,se deben a que en este rango de frecuencias losprocesos dinámicos que contribuyen mayorita­riamente a la relajación espín­red en membra­nas de liposomas (fluctuaciones de orden y ladifusión translacional de los lípidos [1] [2]) noson eficientes para el caso de vesículas gigan­tes multilamelares. La baja dispersividad en losperfiles previos a la extrusión podría explicarsecon el hecho de que los procesos que intervie­nen en la relajación de este tipo de sistemas(vesículas gigantes multilamelares) son dema­siado rapidos como para poder ser observadosdentro del rango de freciencias estudiado.

Referencias

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Caracterización de la preparación de liposomas utilizando Relaxometría Magnética Nuclear

[3] Fraenza CC, Meledandri CJ,Anoardo E,Brougham DF. The Effect of Choleste­rol on Membrane Dynamics on DifferentTimescales in Lipid Bilayers from FastFieldCycling NMR Relaxometry Studiesof Unilamellar Vesicles. ChemPhysChem.2014;15:425–35.

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