UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA

Citometría de flujo: Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

Milena Salgado Lynn

Curso de Métodos en Biotecnología

Semestre 2002-2

Coordinador: Dr. Roberto Stock

27 de mayo de 2002

2

Índice

Página

Introducción 3

Historia del Instrumento 5

Descripción y funciones de los componentes del aparato

Sistema de Flujo 7

Sistema Óptico 7

Sistema Eléctrico 8

Obtención de los datos e interpretación 10

Aplicaciones 12

Bibliografía 18

3

Introducción

Actualmente, la mayoría de las preguntas en el campo de la biología celular se enfocan en

saber qué es lo que sucede con las células integrantes de un sistema, cómo son las

interacciones dentro del mismo y, sobre todo, cuáles son las propiedades individuales de

cada una. Estas preguntas han llevado a la necesidad de aislar y/o purificar

subpoblaciones y subcomponentes celulares, generalmente para (1) enriquecer poblaciones o

para (2) eliminarlas. Para alcanzar estos objetivos, el primer paso en el proceso de

aislamiento es la identificación y clasificación de las células. La clasificación de las

células puede basarse en propiedades fisicoquímicas, inmunológicas y funcionales. Los

métodos de clasificación que se basan en propiedades funcionales utilizan características

tales como afinidad, adherencia o crecimiento. La clasificación inmunológica se basa en la

utilización de anticuerpos dirigidos contra epítopes celulares. En la práctica, las

características fisicoquímicas son las más utilizadas para la separación o “sorteo celular”;

se incluyen características como tamaño, volumen, densidad, propiedades de dispersión de

la luz, potencial de membrana, pH, carga eléctrica y contenido celular de diferentes

compuestos como ácidos nucléicos, enzimas y otras proteínas (Orfao, et.al.; 1996).

En los últimos años ha habido un incremento en las técnicas que utilizan más de una

característica celular para clasificar y separar diferentes subconjuntos celulares y

componentes subcelulares. Estas técnicas pueden agruparse básicamente en (a) separación

gruesa y (b) separación de células individuales. La separación gruesa se refiere a métodos

tales como la filtración celular, la centrifugación o sedimentación y el cultivo celular. La

separación de células individuales se refiere principalmente a la citometría de flujo que,

enriquecida con el “sorteo celular”, es la mejor técnica para proveer información en cuanto al

análisis y separación de poblaciones celulares.

La citometría de flujo es un proceso que permite que las células (500 – 4000/ seg) pasen en

fila dentro de un flujo a través del aparato (Beckton Dickinson Immunocytometry

Systems; 1995). Mientras esto sucede, se puede hacer la medición simultánea de múltiples

características físicas de una sóla célula. La ventaja analítica de la citometría de flujo tiene

4

como base la habilidad de hacer mediciones cuantitativas y multiparamétricas en un

número estadísticamente adecuado de células para definir las propiedades de una población

celular o de las subpoblaciones que la componen. El análisis multiparamétrico hace posible

evaluar poblaciones celulares particulares dentro de una mezcla compleja, ya que aprovecha

propiedades intrínsecas de la célula como la dispersión de la luz, y características

controladas como la fluorescencia. Al mismo tiempo, es posible separar las poblaciones

definidas por éste análisis (Parks D.R., et.al.; 1984). Estas ideas son la base de la técnica

conocida como FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting).

El FACS proporciona datos tales como el tamaño relativo de la célula, granularidad o

complejidad interna y la intensidad relativa de fluorescencia. Para llevar a cabo lo anterior,

el aparato necesita (como cualquier citómetro de flujo) de un sistema combinado de flujo,

óptica y electrónica (Figura 1). El sistema de flujo introduce y restringe a las células para

su análisis individual, el sistema óptico excita la muestra y colecta las señales de luz

provenientes de la misma y el sistema electrónico convierte la señal óptica en una señal

electrónica y la digitaliza para el análisis en computadora (Beckton Dickinson

Immunocytometry Systems; 1995). El sistema de citometría de flujo está compuesto por

cinco unidades principales: una fuente de luz (lámpara de mercurio o láser), flujo celular,

unidad de filtros ópticos para la detección de longitudes de onda específicas, fotodiodos o

fotomultiplicadores para la amplificación de la señal y una unidad de operación y

procesamiento de datos.

El funcionamiento del FACS es relativamente sencillo y se describe, brevemente, a

continuación. Una suspensión celular se inyecta al flujo laminar donde las células pasan

una después de la otra a través de un capilar y llegan hasta un rayo láser. Cuando este

rayo incide en una célula, la luz de excitación sale hacia delante y hacia los lados de la

célula y esto genera información. La luz dispersada hacia delante provee información sobre

el tamaño de la célula. La luz dispersada hacia los lados provee información sobre la

granularidad, tamaño y morfología celular. Si la célula va marcada con un fluoróforo, la

luz fluorescente se procesa, a través del fotomultiplicador, en el sistema procesador de datos

y los resultados son analizados por el software del citómetro. El FACS posee una unidad de

5

“sorteo” que ofrece la posibilidad de separar subpoblaciones seleccionadas. Las células se

cargan eléctricamente y las gotas resultantes se desvían al pasar a través de un campo

eléctrico. ¿Cómo sucede todo esto y cuáles son las bases de esta tecnología?

Figura 1. Esquema generalizado de los componentes de un citómetro-sorteador; la función de los componentes,

el procesamiento de la señal y la electrónica detrás del sorteo se describen más adelante en el texto (Bonner WA,

et.al.; 1972)

Historia del Instrumento

El FACS nació en el laboratorio de L.A. Herzenberg en 1968, se le llamó así por primera vez

en 1972, y se basó en las técnicas de separación de Sweet y en el sistema de flujo coaxial de

Crossland-Taylor (Bonner W.A., et.al.; 1972). Los instrumentos para medir y contar en

un flujo se tenían desde mediados del siglo pasado, pero la reproducibilidad y la confianza

en los resultados no se alcanzó sino hasta que se aplicó un flujo laminar que guiaba la

corriente de células en un flujo estable y por un canal relativamente largo (Crossland-

Taylor P.J.; 1953). Para ese entonces ya se habían desarrollado sistemas basados en la

microscopía para medir la dispersión y absorción de la luz, así como la fluorescencia usando

iluminación de mercurio y el principio de epifluorescencia. En 1965, Sweet desarrolló la

inyección de tinta y con ella surgió la idea del sorteo electroestático, estabilizando la

Flujocelular

Cristal Piezoeléctrico

Fotomultiplicador

Láser(fuente de luz)

+ 1kV- 1kV

Colector de células

ReservorioPresurizadoDe Células

Reservorio PresurizadoDe flujo externo

Analizador dePulsos yContador(Procesamientode datos)

Señalelectrónica

Pulsos

De carga

Filtrosópticos

6

formación y carga eléctrica de gotas individuales (Sweet R.G.; 1965). En cuanto a

tecnología de fluorescencia, en 1961 Moller demostró que las células vivas de cultivos en

suspensión podían marcarse específicamente con anticuerpos conjugados a fluoresceína

(Coligan, J.F., et.al.; 2001).

Estas técnicas se conjuntaron y dieron origen al FACS. El láser se introdujo al FACS

después de los resultados de Van Dilla et.al. en 1969, además se introdujeron medidas

ópticas en el flujo del sorteo en vez de en el flujo celular y en 1972 se añadió un canal para

la dispersión de la luz del láser que hizo posible la detección de células no fluorescentes y

que ha servido para medir el tamaño de la célula y para discriminar entre vivas y muertas.

El primer instrumento comercial de esta naturaleza fue el FACS I de Becton Dickinson y se

basó en el sistema descrito (Parks D.R., et.al.; 1984). A partir de ahí, se han introducido

pocos cambios que tienen que ver con las mediciones multiparamétricas y con la generación

de softwares de análisis más sofisticados y potentes.

Originalmente, el FACS medía sólo un tipo de fluorescencia pero conforme se desarrollaron

nuevos fluoróforos y se mejoró la producción de anticuerpos monoclonales, se abrieron

nuevas perspectivas en cuanto a la capacidad de detección del aparato. En el laboratorio de

Herzenberg, la habilidad de acoplar los anticuerpos monoclonales a diferentes fluoróforos

generó la inquietud de hacer análisis multicolores por lo que se adaptó el aparato para poder

hacer lecturas de dos diferentes espectros de emisión a partir de un mismo rayo láser. La

aparición de mejores monoclonales y mejores fluoróforos estimuló el desarrollo del FACS de

doble láser ya que se volvió interesante aumentar el número de marcadores que podían

medirse simultáneamente en una sóla célula. Actualmente, los FACS de un sólo láser se

utilizan para medir tres diferentes anticuerpos marcados con diferentes fluoróforos y los

FACS de doble láser se usan para medir hasta 5 colores de fluorescencia al mismo tiempo.

Además, el mismo grupo, desarrolló recientemente un aparato con tres lásers que permite la

medición simultánea de hasta 11 colores de fluorescencia (Herzenberg L.A., et.al.; 2000).

7

Descripción y función de los componentes del aparato

Sistema de flujo

El sistema de flujo del FACS posee un capilar a través del cual se hace pasar un líquido

isotónico, a manera de una funda, con una velocidad y presión constante; estas

características son necesarias para la formación de un flujo laminar (sin turbulencia). Al

mismo tiempo, por el centro del capilar se hace pasar la suspensión celular, con

aproximadamente de 5 x 105 a 2 x 107 células/mL y a una presión mayor que la del flujo

acarreador. Este enfoque hidrodinámico (Figura 2) se asegura de que las células

permanezcan centradas y viajen una tras otra en el chorro de inyección. Este

confinamiento es necesario para hacer mediciones precisas, es decir para el análisis

individual de las células (Bonner W.A., et.al.; 1972. Beckton Dickinson

Immunocytometry Systems; 1995).

Fig. 2. Sistema de flujo del FACS. La muestra pasa

por un flujo laminar producido por otro líquido

isotónico y esto hace que las células viajen

ordenadas una tras otra.

Sistema óptico

La fluorescencia y la luz dispersada se producen cuando una célula contenida en el líquido

inyectado pasa por el rayo enfocado de un láser (Figura 3). La luz dispersada hacia el

frente es colectada por un detector que capta la luz difractada entre 1 y 10º arriba o abajo del

punto de incidencia del láser. La luz dispersada lateralmente y la fluorescencia son

colectadas por un lente que está a 90º del eje de incidencia del láser. Esta luz lateral y la

fluorescencia son divididas por un “beamsplitter” (Divisor del rayo) para separar entre la luz

difractada y la fluorescencia. La fluorescencia es a su vez dividida por un espejo dicróico

que permite distinguir entre diferentes longitudes de onda. Cada detector de fluorescencia

tiene otros filtros ópticos para excluír la luz del láser dispersada y para dejar pasar la luz con

la longitud de onda deseada para ese detector (Bonner W.A., et.al.; 1972. Park D.R., et.al.;

1984).

MuestraFlujo acarreador

Enfoque hidrodinámico

Capilar

8

Fig. 3. Sistema Óptico del FACS. El láser incide en la célula y esta dispersa la luz de manera lateral y frontal

al tiempo que emite fluorescencia. La luz y la fluorescencia son detectadas por separado (Beckton Dickinson

Immunocytometry Systems; 1995. http://www.icnet.uk/axp/facs/davies/flow.html).

Sistema eléctrico

Para la obtención física de las poblaciones celulares, es necesario que las células vayan en

gotas aisladas y con un marcaje que permita distinguir y separar una población de otra.

Cuando una célula atraviesa el rayo láser, se ilumina por varios microsegundos y durante

ese tiempo emite un pulso fluorescente. Si este pulso cae en los límites de amplitud

predeterminados, se genera eléctricamente un pulso cargado. Este pulso toma en cuenta la

demora que hay entre el evento de la célula estando incidida por el láser y la célula estando

en el lugar donde debe formarse la gota. Este pulso llega a un cristal piezoeléctrico que está

conectado a la estructura por la que pasa el capilar. Este artefacto se expande y contrae

ligeramente cuando se aplica un voltaje y este movimiento guía a un oscilador que hace

vibrar la estructura por donde pasa el capilar. La vibración lleva una frecuencia cercana a la

frecuencia con la que naturalmente el flujo se rompe en una gota. Esto estabiliza la

formación de la gota en esa frecuencia, resultando en una gota de tamaño uniforme y una

demora de tiempo bien definida entre la detección de una célula por el rayo del láser y la

Detector deFluorescencia 1

Filtro

Espejo Dicróico

Rayoláser

ExpansorDel rayo

Lente deenfoque

Detector deLuz dispersafrontal

Lente colector

Divisor del RayoDetector deLuz dispersalateral

Detector deFluorescencia 2

Filtro

Punto de enfoque(célula)

9

incorporación de la célula a una gota libre. Si la célula se va a sortear, un potencial en el

orden de los 100 V se aplica, mediante un electrodo, al fluido (isotónico) que va dentro del

capilar. La conductividad eléctrica del fluido asegura que cualquier gota que se separa de la

inyección, mientras se aplica el voltaje, llevará una carga eléctrica. La duración del voltaje

aplicado se escoge para cargar una o más gotas que puedan contener a la célula deseada. Se

pueden sortear dos poblaciones de células al mismo tiempo al aplicar una carga positiva a

gotas que contengan una población y una carga negativa a gotas que contengan otra

población. La hilera de gotas pasa entre dos placas cargadas a más o menos varios miles de

volts, separando las gotas cargadas de las no cargadas. Las gotas que no se desplazan se

remueven por una aspiradora y las que se desplazan se colectan en los recipientes adecuados

(Figura 4a) (Bonner WA, et.al.; 1972. Park DR, et.al.; 1984).

El sistema electrónico también está involucrado con la amplificación de las señales que

salen de los detectores, tanto de fluorescencia como de luz dispersa, y con el procesamiento de

los datos para su evaluación (Fig. 4b)

a)

CristalPiezoeléctrico

Capilar

Placasseparadoras

Detector deLuz dispersa

Rayodeláser

Señal para cargaDe la gota

Señal para laFormación de la gota

FotomultiplicadorFluorescencia 1 (F1)

FotomultiplicadorFluorescencia 2 (F2)

F1F2

Dispersión (D)

Muestrasseparadas

Aspiradora

Muestra

Líquido acarreador

10

b)

Fig. 4. Sistema eléctrico del FACS. a) Las señales luminosas son colectadas y transformadas en pulsos

eléctricos que regresan a la estructura central y forman y dan carga eléctrica a la gota; al estar cargadas las

células pueden separarse. b) Procesamiento de las señales luminosas en las señales eléctricas necesarias para la

separación de las muestras y su análisis (Parks DR, et.al.; 1984).

Obtención de los datos e interpretación

El aparato de FACS va acompañado por una computadora que adquiere los datos

proporcionados por el sistema eléctrico y hace una presentación gráfica. La computadora

produce un histograma o un despliegue de dos parámetros (dot plot o contour plot) a partir de

la luz dispersada por las células o a partir de la fluorescencia (Fig. 5). El análisis de los

datos generalmente se complica porque el volumen de la muestra puede ser variable y por la

complejidad de ésta, por lo que es escencial que la forma de interpretación se diseñe

específicamente para contestar a las preguntas que se formularon en la investigación. Sin

embargo, existe una interpretación generalizada para este tipo de gráficas y aquí se muestra

un ejemplo.

Digitalización

Amplificador deLa carga de

La gota

AmplificadoresLineales y/o

Logarítmicos deLa señal

AlmacenamientoEn computadora y

Análisis

SistemaDe

presentación

EvaluaciónDe señalanáloga

Oscilador

DecisiónAnáloga o

Sorteo digital

Coincidencia yCronometraje de la

Carga de la gota

F1 F2 D

F1

D

F2

Señal para formación de gota

Señal para

Carga de gota

11

Fig. 5. Interpretaciones gráficas por el Software del FACS. a) Histograma. b) Dot Plot. c) Contour Plot.

(http.//www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/FACS.html. Coligan, J.F., et.al.; 2001)

En la figura 5a tenemos representada en el eje de la abscisa la intensidad de la fluorescencia

roja o verde y en la ordenada tenemos el número de células con cada nivel de fluorescencia.

En esta figura podemos ver que hay el doble de células clasificadas como rojas que de células

clasificadas como verdes o como células sin fluorescencia, sin embargo, la intensidad de luz

fue mayor en las células “verdes” que en las células “rojas”. Este despliegue de datos es el

mejor si las células son “rojas”, “verdes” o no marcadas y ninguna tiene una doble tinción.

En el eje de las X de la figura 5b tenemos la intensidad de la fluorescencia verde y en el eje

de las Y tenemos la intensidad de la fluorescencia roja. Los puntos individuales representas

células individuales y la idea es ver la densidad relativa de los puntos en cada cuadrante.

De esta gráfica se puede concluir que no hay células marcadas doblemente (cuadrante

arriba-derecha) y que había muchas células no marcadas (abajo-izquierda). El número de

células marcadas con un fluoróforo de emisión en verde (abajo-derecha) es más o menos el

mismo que el de células no marcadas, también vemos que el número de células marcadas

con un fluoróforo de emisión en rojo es casi el doble que el de las otras dos categorías (arriba-

izquierda). Aquí también se puede ver que la intensidad de las “verdes” fue mayor que la

de las “rojas”. Este método es muy útil cuando ha habido una doble tinción, el cual es el

caso en la figura 5c. En esa figura, el cuadrante de arriba a la derecha presenta una

población muy pequeña (2.1%) de células marcadas doblemente. Los porcentajes

presentados en la figura 5c son determinaciones de frecuencia que muestran el número de

Roj

o

a) b) c)

12

células que presentan una característica definida (Coligan, J.F., et.al.; 2001.

http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/FACS.html).

En la interpretación de estos resultados, el establecimiento de controles negativos y positivos

es crítico, ya que definirán la localización de la población de interés. Por ejemplo, si se

quiere distinguir una población de células positiva para cierta fluorescencia, el límite

mínimo del área de interés deberá definirse de manera que incluya únicamente a ese típo de

células. Para lograr esto, es necesario tener un control positivo que sirva como base para la

definición del área positiva. Si el límite mínimo se establece cerca de la zona donde se

encuentran las células negativas, la frecuencia de las positivas podría sobreestimarse o

subestimarse dependiendo de la señal de fondo que den los marcadores. Después de tener

todos los controles positivos se pueden seleccionar ventanas donde se analicen experimentos

individuales (Coligan, J.F., et.al.; 2001).

Aplicaciones

En general, el FACS se utiliza para analizar y separar células según características

definidas. En un principio el FACS se utilizó para analizar células linfoides murinas,

especialmente para separar entre células B y células T y para ver su viablilidad. También se

utilizó para aislar poblaciones que estaban involucradas en la respuesta inmune y que

estuvieran funcionalmente activas (Julius, M.H., et.al.; 1975). Actualmente, el desarrollo

y uso de anticuerpos monoclonales específicos para moléculas de superficie hacen posible la

definición y estudio de subpoblaciones de linfocitos que no son posibles utilizando otras

técnicas.

Además del análisis de linfocitos específicos, el FACS se ha vuelto una herramienta en la

farmacología, la toxicología, la bacteriología, virología, ciencias ambientales y en el

monitoreo de bioprocesos. A través de la dispersión de la luz, la fluorescencia y la

absorbancia de las células teñidas o no teñidas, se pueden medir un gran número de

parámetros celulares (Tabla 1).

13

Con respecto a la medición utilizando la luz dispersada, en el citómetro, la luz que se

dispersa hacia el frente se utiliza para determinar el tamaño de la célula. Para lograrlo se

necesita calibrar el aparato con cuentas de poliestrireno que tengan tamaños definidos.

Aún así, el error puede ser grande ya que las mediciones están influenciadas por el índice

de refracción de las partículas. Además de medir el tamaño, se pueden combinar otras

características para determinar a un grupo de células. Por ejemplo, se han monitoreado

juntos el tamaño y el contenido de DNA en cultivos de E. coli, así como también se han

monitoreado al mismo tiempo el tamaño y la producción de CO2 en cultivos sincronizados

de Saccharomyces cerevisiae. En estudios como el último que se menciona, los tamaños

muestran la distribución de subpoblaciones de células madre en un ciclo del cultivo

sincronizado (Rieseberg, M., et.al.; 2001).

Características celulares Componentes celulares

Tamaño DNA

Granularidad del citoplasma RNA

Forma de la célula Proteína (total)

Potencial de membrana Lípidos

pH intracelular Antígenos

Viabilidad Actividad enzimática

Autofluorescencia Carbohidratos de superficie

Estado Redox intracelular Receptores de superficie

Contenido de PHB

Calcio intracelular

Contenido de ergosterol

Tabla 1. Características y componentes celulares que pueden determinarse vía FACS (Rieseberg, M., et.al.;

2001)

La mayoría de las aplicaciones de la citometría de flujo se basan en el monitoreo de la

fluorescencia. Los parámetros celulares que pueden medirse se caracterizan en extrínsecos o

intrínsecos, dependiendo del reactivo que se necesite. Para los ensayos de fluorescencia

intrínseca no se necesita un pretratamiento como fijación, tinción o lavados. Los estudios

sobre componentes celulares específicos utilizando fluoróforos (fluorescencia extrínseca)

requieren una tinción previa al análisis de las células. En la tabla 2 se muestran los

fluoróforos más comunes para tinciones específicas en el FACS.

14

Fluorocromo Longitud de

excitación (nm)

Longitud de

emisión (nm)

Aplicación principal

BCECF-AM 503 528 (pH 9.0) pH intracelular

DAPI 345 455 Ácidos nucléicos

DiOC6(3) 484 501 Potencial de membrana

EGFP 489 508 Productos intracelulares

FITC 495 519 Detección de proteínas

Hoechst 33342 343 483 Ácidos nucléicos

Nile Red 540 610 Lípidos

PerCP 490 675 Conjugado de anticuerpos

Ioduro de Propidio 536 617 Ácidos nucléicos

R-Ficoeritrina 480, 565 578 Conjugado de anticuerpos

SNARF-1 AM 548 635 Potencial de membrana

Sytox Green 490 525 Ácidos nucléicos

Tabla 2. Fluorocromos más utilizados en FACS, aplicación más común, y longitudes de emisión y excitación.

(Rieseberg, M., et.al.; 2001. http://www.icnet.uk/axp/facs/davies/multi.html)

Algunas de las aplicaciones más comunes utilizando fluoróforos son la viabilidad y el

estado fisiológico, la apoptósis, el análisis del ciclo celular y el contenido de ácidos nucléicos,

el crecimiento celular y los índices de mortalidad y la concentración de calcio intracelular.

La concentración de células viables en un cultivo es uno de los parámetros más importantes

en la evaluación de bioprocesos. Una de las formas de evaluar la viabilidad es determinar la

integridad de la membrana y para ello existen colorantes de exclusión o colorantes de

retención. Los colorantes de exclusión tiñen los ácidos nucléicos de las células con

membranas defectuosas y los de inclusión generalmente utilizan sustratos fluorescentes

que son degradados por las enzimas intracelulares y que generan productos fluorescentes.

Como indicador del estado fisiológico puede usarse el pH intracelular ya que es un factor

importante para la regulación de diferentes procesos celulares y para la actividad metabólica

de células en cultivo. Existen derivados de diacetato de fluoresceína y ciertos sustratos

fluorescentes que se utilizan para medir el pH intracelular como el BCECF-AM y la

Calceína-AM. Otro indicador de daño celular es el potencial de membrana. Los cambios de

15

intensidad de la fluorescencia relacionada al potencial de membrana se han utilizado para

detectar e indicar daño fisiológico en bacterias (Rieseberg, M., et.al.; 2001).

En los estudios sobre apoptosis, se han utilizado conjugados fluorescentes de Anexina-V ya

que este anticoagulante es una proteína que se une a fosfolípidos, especialmente a fosfatidil

serina. Uno de los indicadores de apoptosis es la externalización de fosfatidil serina porque

este fosfolípido se encuentra en la cara interna de la membrana de células normales,

mientras que en células apoptóticas se transloca hacia la cara externa. De esta manera, la

diferencia en intensidad de fluorescencia de los complejos de anexina-V – fosfatidil serina

entre células apoptóticas y normales puede detectarse por medio del FACS. Para el estudio

del ciclo celular, se utilizan colorantes para ácidos nucléicos como el ioduro de propidio, el

Sytox Green, Hoechst, etc. En aplicaciones biotecnológicas, el análisis del ciclo celular y de

RNA se han utlizado para monitorear el estado fisiológico y el comportamiento de

crecimiento de varios microorganismos en cultivo. Los índices de crecimiento celular

pueden medirse usando bromodeoxiuridina (BrdU – análogo de Timidina) y una tinción

con ioduro de propidio. Las células que están sintetizando DNA incorporan BrdU y con

anticuerpos fluorescentes específicos contra esta base se hace la detección. Después de eso, se

hace una tinción con ioduro de propidio para medir el contenido total de DNA. Los índices

de mortalidad de una población pueden determinarse usando un método basado en la

exclusión de ioduro de propidio según la integridad de la membrana. Con respecto a la

concentración de calcio intracelular, se han desarrollado colorantes para medir calcio y su

aplicación ha sido principalmente clínica (Rieseberg, M., et.al.; 2001). En general, hay un

gran número de aplicaciones del FACS para el área de biotecnología y se resumen en la

tabla 3.

Aplicaciones Énfasis Microorganismo/

Célula

Contenido de DNA

( ciclo celular)

Control de productividad

Control de productividad

Investigación de Mecanismos

Relación Ciclo celular/IgG de superficie

Proliferación

CHO

BHK

S. cerevisiae

Hibridoma

S. cerevisiae

16

pH intracelular Estudios de apoptósis

Validación de metodologías

Hibridoma

Hibridoma

Tamaño celular Monitoreo del cultivo

Monitoreo del cultivo

Estudios de apoptosis

S. cerevisiae

E. coli

Células de mamífero

Contenido de RNA Producción de goma Xantana Xantomonas campestris

Proteína total Monitoreo del cultivo

Producción de goma Xantana

s. cerevisiae

X. campestris

Investigación de PHB Limitación y exceso de sustrato Ralstonia eutropha

Acetinobacter calcoacetius

Methylobacterium rhodesianum

Productos intracelulares Optimización de la produccion de Ab

Comparación de GFP mutantes

Hibridoma

CHO

Apoptosis Anexina-V CHO

Calcio Intracelular Toxicidad H2Os Lineas celulares de mamífero

Potencial de membrana Pruebas de daño en bacterias

Comparación de diferentes cromóforos para el

potencial de membrana mitocondrial

Acinetobacter calcoaceticus

U937

Viablilidad Esterasa

Pruebas de suceptibilidad a antibióticos

Efecto de metales pesados

Limitación de glucosa

Linfocitos

Bacterias

A. johnsonii

E. coli

Tabla 3. Resumen de aplicaciones del FACS en el área de biotecnología (Rieseberg, M., et.al.; 2001)

De 1972 a la fecha, se han ampliado las aplicaciones del FACS y han dado base a nuevas

ideas como es la tecnología de las microesferas o el MACS (Magnetic-Activated Cell

Sorting). Además de células se pueden analizar microesferas, o micropartículas, que lleven

un marcaje fluorescente. Estas microesferas se utilizaron en un principio para estudiar la

fagocitósis de macrófagos y ahora se utilizan para detectar proteínas virales, como

estándares de calibración para análisis cuantitativos y para estudios de cinética enzimática

en tiempo real. Como la mayoría de las microesféras son paramagnéticas, se pueden

inmobilizar en un campo magnético fuerte (MACS) y durante el tiempo que están

inmobilizadas dan tiempo a procesos de lavado o liberación de sustancias, lo que es

interesante para el estudio de ácidos nucléicos y otros componentes(Wedemeyer, N., et.al.;

2001. Scheffold, A., et.al.; 2000).

17

De 1968 a la fecha, el FACS ha crecido como instrumento y como método gracias al impulso

que han dado los usuarios de esta tecnología. Este aparato, que medía sólo tres parámetros y

era usado sólo en la inmunología, ahora ha llegado a niveles de complejidad que parecen

difíciles de superar, ya que pueden medirse hasta 13 parámetros diferentes y ha encontrado

aplicaciones en casi todas las áreas de la biotecnología. De hecho, las nuevas aplicaciones

están limitadas por la imaginación de los investigadores y por el desarrollo de nuevos

anticuerpos, fluoróforos y sustratos fluorescentes que permitan detectar nuevos

componentes celulares. En definitiva, las ventajas que ofrece el FACS en cuanto a la

separación de componentes subcelulares o subpoblaciones celulares son difíciles de superar

ya que, además de hacer la separación física de las células de interés, se puede hacer una

medición cuantitativa y multiparamétrica de ciertas características celulares en una

mezcla compleja y estadísticamente adecuada de células. En general, el FACS es una

herramienta muy útil que puede dar muchos más datos sobre las poblaciones celulares y que

no ha llegado al límite de su aplicabilidad.

18

Bibliografía

Beckton Dickinson Immunocytometry Systems. 1995. FACS Training Manual.

Modulos: 1, 5-6.

Bonner, W. A.; Hulett, H.R.; Sweet, R.G. y Herzenberg, L.A. 1972. Fluorescence Activated

Cell Sorting. The Review of Scientific Instruments, 43(3): 404-409.

Coligan, J.F.; Kruisbeek A.M.; Margulies, D.H.;Shevach, E.M.; Strober, W. 2001. Current

Protocols in Immunology. National Institutes of Health. Ed. John Wiley & Sons, Inc.

Capítulo 5: Cell Sorting.

Crossland-Taylor, P.J. 1952. A Device for Counting Small Particles Suspended in a Fluid

through a Tube. Nature, 171: 37-38.

Herzenberg, L.A.; De la Rosa, S.C.y Herzenberg, L.A. 2000. Monoclonal Antibodies and

the FACS: complementary tools for the immunobiology and medicine. Immunology

Today, 21(8): 383-390.

http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/FACS.html

http.//www.icnet.uk/axp/facs/davies/flow.html

http://facs.stanford.edu/5MinuteGuide/5MinuteGuide.htm

Julius, M.H.; Sweet, R.G.; Fathman, C.G. y Herzenberg, L.A. 1975. Fluorescence-activatedcell sorting and its applications. pp. 107-21. En: Richmond C.R., et.al.. Mammaliancells: probes and problems. Oak Ridge, Tenn., Technical Information Center.

Orfao, A. y Ruiz-Argüelles, A. 1996. General Concepts about Cell Sorting Techniques.

Clinical Biochemistry, 29(1): 5-9.

Parks, D.R. y Herzenberg, L.A. 1984. Fluorescence-Activated Cell Sorting: Theory,

Experimental Optimization, and Applications in Lymphoid Cell Biology. Methods in

Enzymology, 108: 197-241.

Rieseberg, M.; Kasper, C.; Reardon, K.F. y Scheper T. 2001. Flow Cytometry in

biotechnology. Appl Microbiol Biotechnol, 56: 350-360.

Scheffold, A. y Kern, F. 2000. Recent Developments in Flow Cytometry. Journal of

Clinical Immunology, 20(6): 400-407.

Sweet, R.G. 1965. High frequency recording with electrostatically deflected Ink jets. The

Review of Scientific Instruments, 36: 131

Wedemeyer, N. y Pötter, T. 2001. Flow cytometry: an “old” tool for novel applications in

medical genetics. Clinical Genetics, 60: 1-8.