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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA

Métodos fisicoquímicos en Biotecnología

Trabajo de investigación

CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA

Presentan

M. en C. Edgar Ernesto Esquivel Soto

Q.F.B. Lidia Irene Leal Guadarrama

Cromatografía de fase reversa

JUNIO 2004CUERNAVACA, MORELOS

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CONTENIDO

INTRODUCCIÓN

TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA La fase estacionaria Retención de modo mixtoLa fase móvil Elución por gradienteParámetros cromatográficos Factor de capacidad Eficiencia Selectividad ResoluciónCromatografía por supresión iónicaCromatografía secuencial Arreglo positivonegativo Arreglo negativopositivo Arreglo negativonegativo Arreglo positivopositivo

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSAPurificación de biomoléculas Purificación de proteínas y péptidos naturales Purificación de péptidos y proteínas recombinantes Purificación de péptidos obtenidos por digestiones enzimáticas Purificación de péptidos sintéticos

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Purificación de oligonucleótidos sintetizados químicamentePurificación a gran escala DesaladoAnálisis cuantitativo Normalización de área Calibración con estándar externo Calibración con estándar interno Adición de estándar

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ALGUNOS ASPECTOS PARA EL DESARROLLO DE UN ANÁLISIS DECROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSANaturaleza química de la fase estacionariaTamaño y forma de partículaTamaño de la columna Velocidad de FlujoTemperaturaSolventes DesnaturalizaciónGradiente de elución Acondicionamiento de columnaPreparación de las muestrasLimpieza de la columnaAlmacenamiento de columnaResolución de problemas

EQUIPO DE HPLC Sistemas para el tratamiento de los disolventes Sistemas de bombeoSistemas de inyección de la muestra Columnas Tipos de relleno de la columnaTermostatosDetectores Detectores de absorbancia Detectores de arreglos de diodos Detectores de infrarrojo Detectores de índice de refracción Detector de dispersión de luz (ELSD) Detectores de espectrometría de masas

PROVEEDORES

COMENTARIOS

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BIBLIOGRAFÍA

INTRODUCCIÓN

Los avances en el campo de la biotecnología han requerido el uso de técnicas más eficacespara la separación y purificación de biomoléculas. La cromatografía de líquidos haresultado ser una herramienta muy poderosa y eficiente para la separación de mezclascomplejas tanto de compuestos de bajo peso molecular como de proteínas y ácidosnucleicos.

En los inicios de la cromatografía de líquidos se utilizaban columnas de vidrio condiámetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. En este tipo de columnas realizó sustrabajos el botánico ruso Mikhail Tswett. Él empleó esta técnica para separar variospigmentos vegetales, que aparecían como bandas coloreadas en la columna. El relleno delas columnas consistía en partículas de 150 a 200 micras de diámetro. Más tarde seencontró que se podía aumentar la eficiencia disminuyendo el tamaño de las partículas delos rellenos. A finales de los años sesenta se logró desarrollar la tecnología adecuada paraproducir y utilizar partículas del orden de las 3 a 10 micras. A esta nueva forma decromatografía se le llamó cromatografía de líquidos de alta resolución, HPLC por sus siglasen inglés (High Performance Liquid Chromatography).

El sistema cromatográfico de fase reversa fue introducido por Howard y Marlin en 1950.Hasta ese momento, la cromatografía de líquidos se utilizaba básicamente para separarcompuestos polares, siendo la fase estacionaria de un carácter altamente polar y la fasemóvil poco polar. Estos científicos revirtieron la polaridad de las fases con el objetivo deseparar ácidos grasos. Así fue como surgió la cromatografía de fase reversa; aquella en laque la fase estacionaria es no polar y la fase móvil es polar. Entonces, a la primeramodalidad de cromatografía se le empezó a conocer como cromatografía de fase normal.

La técnica de fase reversa, RPC (del ingles Reverse Phase Chromatography), se haconvertido en el tipo de cromatografía más ampliamente utilizada en HPLC e incluye cercade la mitad de los métodos de cromatografía de líquidos descritos en la literatura. Estatécnica proporciona retención y selectividad óptimas cuando las muestras tienen un carácterpredominantemente alifático o aromático.

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En el presente trabajo se pretende dar al lector un panorama de la teoría y aplicaciones de lacromatografía en fase reversa, así como algunas consideraciones importantes durante eldesarrollo de esta técnica cromatográfica. Y dado que la cromatografía de fase reversa seaplica en equipos de alta resolución (HPLC), también se incluye una sección en la que sedescribe brevemente su funcionamiento.

TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA

Todas las formas de cromatografía de líquidos son procesos de migración diferencial, dondelos componentes de la muestra son selectivamente retenidos por una fase estacionaria yeluídos secuencialmente mediante el cambio de polaridad de la fase móvil. En lacromatografía de fase reversa (RPC) se utiliza un empaque hidrofóbico, usualmente ungrupo funcional octadecilo u octilo y una fase móvil polar.

La fase estacionaria

La fase estacionaria para cromatografía de fase reversa consiste en una matriz porosa einsoluble a la que se le han unido químicamente compuestos hidrofóbicos. Los soportespara casi todos los rellenos se preparan con sílica rígida, formada por partículasmecánicamente resistentes, porosas y uniformes, con diámetros de 3, 5 o 10 micras.

La superficie de la sílica está constituida por grupos silanol (SiOH) químicamente reactivosque abarcan una superficie cercana a los 8 mol/mμ 2. (Figura 1)

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Si

SiSi

Si

Si SiO

SiO (CH2)17 CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

O

CH2 CH3

Si

SiSi

Si

Si SiO

SiO (CH2)17 CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

O

CH2 CH3


Figura 1. Grupos silanol libres y grupos silanol derivatizados.

La sílica presenta las ventajas de resistir la aplicación de altas presiones sin contraerse, y deno expandirse al contacto con los solventes. Pero tiene la desventaja de ser químicamenteinestable; a un pH menor de 3 los ligandos unidos a la sílica pueden ser removidos y a unpH mayor de 7.5, la sílica se solubiliza.

A diferencia de la sílica, las matrices de poliestireno son muy estables incluso en pH´s quevan desde 1 hasta 12, lo cual permite lavar y regenerar la columna con hidróxido de sodioque es el agente más efectivo para la remoción de proteínas fuertemente unidas a lasuperficie de la fase estacionaria. Además, el poliestireno tiene un carácter hidrofóbico perse (Figura 2) por lo que ya no requiere ser derivatizado, evitándose así el inconveniente deprocesos ineficientes de unión de ligandos. Sin embargo, presenta la desventaja deexpandirse al contacto con los solventes orgánicos típicamente empleados en RPC.

Figura 2. Estructura química de las matrices de poliestireno.

El acoplamiento de los ligandos a la sílica generalmente se efectúa usando reactivos de tipoclorotrialquilsilanos. (Figura 3) En esta reacción, no todos los grupos silanol reaccionan yaque las cadenas alquilo generan un impedimento estérico que previene la derivatizacióncompleta de todos los grupos disponibles. El recubrimiento de la superficie por sililación se

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CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH






limita a 4 moles/mμ 2. Los grupos silanol residuales imparten una polaridad indeseable a lasuperficie, y son responsables del efecto de retención de modo mixto. Para reducir esteefecto, los grupos silanol residuales se hacen reaccionar con compuestos cloroalquilsilanosmás pequeños como el clorotrimetil y clorotrietilsilano. A este proceso se le conoce como“endcapping” o bloqueo.

Figura 3. Alquilación de grupos silanol.

Por lo general, el grupo alquilo del siloxano en estos recubrimientos es una cadena C8 (noctilo) o una cadena C18 (noctadecilo). (Figura 4)

Figura 4. Ejemplos de grupos siloxanos. A) Grupo alquilo de 2 carbonosB) Grupo alquilo de 8 carbonos C) Grupo alquilo de 18 carbonos.

Si O

CH3

CH3

CH2 CH3

Si O

CH3

CH3

CH2 CH2

Si O

CH3

CH3

CH2 CH2

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

A)

B)

C)

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Si SiOH + Cl (CH2)17 CH3

CH3

CH3

SiSi O (CH2)17 CH3 + HCl

CH3

CH3

Si SiOH + Cl (CH2)17 CH3

CH3

CH3

SiSi O (CH2)17 CH3 + HCl

CH3

CH3


Puede considerarse que la RPC es un proceso de partición en donde los solutos estándistribuidos entre una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. Los solutos nopolares tienden a adsorberse en la fase estacionaria y se mueven a través del sistema máslentamente que los solutos polares.

El mecanismo que se ha propuesto para explicar el mecanismo por el cual estas superficiesretienen a los solutos es el siguiente. Cuando un soluto se disuelve en agua, las fuerzas deatracción entre las moléculas de agua se distorsionan o se rompen. Únicamente los solutosaltamente polares o iónicos pueden interaccionar con la estructura del agua. Los solutos nopolares casi no interactúan con estas estructuras y como consecuencia “abandonan” la fasemóvil para adsorberse al hidrocarburo de la fase estacionaria. La fuerza motriz de laretención no es la interacción favorable del soluto con la fase estacionaria, sino el efecto derepulsión del disolvente por el soluto.

La fase móvil

La retención hidrofóbica del soluto en la fase estacionaria puede disminuirse añadiendo undisolvente orgánico a la fase móvil acuosa. Al decrementar la polaridad de la fase móvil, ladistribución de los solutos se cambia hacia la fase móvil.

La cantidad de muestra que se une a la fase estacionaria depende de la concentración delligando inmovilizado, de las propiedades químicas y físicas de la molécula que va a seradsorbida y de la polaridad de la fase móvil y estacionaria. Así, conforme menos polar seala fase móvil, menor será la adsorción de la muestra a la fase estacionaria.

Respecto a las características químicas del ligando, es difícil predecir qué tipo de cadenahidrocarbonada será mejor para determinada aplicación.

En principio, entre menos polar sea la molécula que se va a purificar, se requerirá una faseestacionaria más hidrofóbica. Sin embargo, si la muestra resulta ser muy afín a la matriz, laelución se dificultaría. Así que debe hacerse un análisis cuidadoso de la molécula de interésy determinar la naturaleza química de los contaminantes asociados.

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La porosidad de las partículas de la fase estacionaria también es un factor importante queinfluye en la capacidad de unión. Los poros grandes facilitan la interacción del soluto con elligando. Cuando se requiera una capacidad de unión máxima, deberá escogerse una matrizque contenga poros suficientemente grandes, capaces de alojar todas las moléculas deinterés.

Retención de modo mixto

El modo mixto de retención resulta de la interacción de los grupos silanol cargadosnegativamente expuestos en la superficie de la matriz con los grupos cargadospositivamente de las moléculas de la muestra. Genera ensanchamiento de picos eincremento de los tiempos de retención.

Los grupos silanol expuestos en la superficie de la matriz pueden provenir de un “endcapping” ineficiente o del deterioro de las columnas. La superficie de la matriz se erosionapor el uso de la columna, lo que resulta en la exposición de los grupos silanol. El usoprolongado de soluciones acuosas también puede acelerar el envejecimiento de la columna.El uso de fases móviles de bajo pH, suprime la ionización de los grupos silanol, sinembargo, no hay que olvidar que un pH menor de 3 puede hidrolisar los ligandos de lamatriz.

El mecanismo de separación en cromatografía de fase reversa se basa en la distribución delsoluto entre la fase móvil y la estacionaria. La elución o el arrastre del soluto mediante lafase móvil, se inicia con un eluyente de elevada polaridad como es el caso de una soluciónacuosa; a esta fase móvil inicial se le denomina fase A. Hay que tomar en cuenta que lapolaridad de la fase móvil A debe ser suficientemente baja como para disolver al soluto decarácter hidrofóbico y suficientemente alta como para permitir que el soluto se una a lamatriz hidrofóbica.

Para lograr la desorción secuencial de los solutos unidos a la matriz, se disminuye lapolaridad de la fase móvil. Esto se hace mediante la adición gradual de solventes orgánicosa la fase móvil A como son el metanol o el acetonitrilo. La fase móvil final, denominadafase B, es la que presenta menor polaridad y tiene el mayor poder de elución. La fuerza delsolvente está definida cuantitativamente por el parámetro º. (Tabla 1) Generalmente elε

pH de la fase móvil inicial y final permanece constante. El acetonitrilo y el metanol son los solventes más comunes puesto que ambos tienen bajaviscosidad y no absorben luz UV. El isopropanol es un disolvente con alto poder de

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elución, sin embargo, no es de los más empleados debido a su incrementada viscosidad queresulta en baja transferencia de masa del soluto entre las fases y elevación de presión aún enbajos flujos.

Para describir cuantitativamente la polaridad de los disolventes, Synder desarrolló el índicede polaridad P’. (Tabla 1) En esta escala, los valores de polaridad varían de 10.2 para uncompuesto muy polar como el agua hasta –2 para los muy poco polares. Cualquier índicede polaridad que se desee entre esos límites se puede conseguir mezclando dos disolventesadecuados. De este modo, la polaridad P’AB de una mezcla de disolventes A y B está dadapor:

P’AB = ФAPA+ФBPB

Donde Ф son las fracciones en volumen de cada solvente y P son los parámetros depolaridad de cada solvente.

La fuerza del eluyente se estableció en base a una columna: *C18, ** silica. ND = No determinado

Tabla 1. Índice de polaridad de Snyder.

Disolvente UVnm

Índice derefracción

a 25°C

ViscosidadcP

Índice depolaridad P

´

Fuerzaeluyente ε0

Ciclohexano 200 1.424 1.00 0.2 NDDietiléter 215 1.352 0.24 2.8 **0.43Tetrahidrofurano 212 1.472 0.55 4.0 *3.7Cloroformo 245 1.445 0.57 4.1 **0.26Etanol 210 1.359 1.08 4.3 NDMetanol 205 1.328 0.55 5.1 *1Acetonitrilo 190 1.341 0.38 5.8 *3.1Isopropanol 205 1.377 2.40 3.9 *8.3Agua 190 1.333 1.00 10.2 *Alta

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Elución por gradiente

Las separaciones isocráticas usan la misma composición de fase móvil a través de laseparación. Las eluciones isocráticas se usan cuando la mezcla a separar no es muycompleja o cuando los componentes de la mezcla tienen tiempos de retención muydiferentes.

Pero para separar mezclas de proteínas, generalmente se requiere de un gradiente de eluciónen el que la composición de la fase móvil cambia através del análisis como se indicóanteriormente.

El gradiente de elución se recomienda generalmente para:• Muestras que tengan tiempos de retención semejantes.• Muestras de peso molecular mayor a 1000.• Muestras de origen biológico.

Aún cuando se piense utilizar una elución isocrática, es recomendable hacer un primeranálisis por gradiente para determinar el porcentaje del solvente más adecuado.

En cuanto a los tipos de gradiente, los hay lineales, curvos y escalonados o segmentados.(Figura 5)

Figura 5. Formas de los gradientes más comunes

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%B

Tiempo

Lineal

%B

Tiempo

Curvo

%B

Tiempo

Segmentado


Parámetros cromatográficos

El comportamiento de retención de un compuesto refleja la distribución del soluto entre lafase móvil y la estacionaria. La concentración en cada fase está dada por el coeficientetermodinámico de repartición. Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuidoentre las dos fases.

K=CE

C M

Donde CE y CM son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y la fase móvilrespectivamente.

Factor de capacidad

La razón de reparto o razón de capacidad, k’, relaciona el equilibrio de distribución de lamuestra dentro de la columna, es decir, es la relación del tiempo transcurrido en la faseestacionaria contra el tiempo transcurrido en la fase móvil. Matemáticamente se definecomo el cociente de los moles de un soluto en la fase estacionaria entre los moles en la fasemóvil:

k '=CE V E

C M V M

El factor de capacidad puede ser calculado para cada pico usando la siguiente ecuación:

k '=t R−t0

t0

Donde tR es el tiempo de retención de la muestra y t0 es el tiempo de retención de un solutoque no interactúa con la fase estacionaria, también conocido como tiempo muerto. El

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tiempo de retención transcurre desde la inyección de la muestra hasta que el compuestoalcanza el detector. El primer componente eluído deberá tener un tiempo de retención deldoble del tiempo muerto. Dicho de otra manera, la razón de reparto es el tiempo adicional que un soluto requiere paraeluir, en comparación con un soluto no retenido, para el cual k’=0.

La fase móvil seleccionada debe dar valores de k’ que estén en el rango de 1 a 20. Valoresmayores de k’ generan tiempos de retención largos que resultan en tiempo analíticodesperdiciado; y los valores menores que la unidad no proporcionan una resoluciónadecuada entre los solutos.

Los solventes fuertes proveen pequeños valores de k’, mientras que los solventes débilesdan valores de k’ más altos. Se ha visto que por cada 2 unidades de diferencia en el valor depolaridad de un mezcla de disolventes, el factor de capacidad k’ cambia un orden demagnitud aproximadamente, lo que significa que la retención del compuesto en unacolumna particular puede variarse simplemente mediante la modificación de los solventesde la fase móvil

Eficiencia

Una característica importante de un sistema cromatográfico es su eficiencia, expresadacomo una cantidad adimensional llamada número de platos teóricos. El término “platoteórico” proviene de un estudio teórico en el que se trató a una columna como si estuvieraconstituida de numerosas, discretas y contiguas capas denominadas platos teóricos. Reflejael número de veces que el soluto se reparte entre las dos fases durante su paso a través de lacolumna. Entre más grande sea el número de platos teóricos de una columna, mayor será sueficiencia y por tanto se podrá lograr una mayor resolución.

La eficiencia de una columna puede determinarse a partir de un pico del cromatogramamediante la siguiente ecuación:

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N=5.54 tR

W 1/22

Donde tR es el tiempo de retención del pico y W1/2 es ancho del pico medido a la mitad de laaltura del mismo. (Figura 6)

Figura 6. Determinación de la eficiencia de una columna en base a un pico de un cromatograma.

El número de platos teóricos algunas veces es reportado como platos por metro de columna.En esta expresión, la altura equivalente a un plato teórico H está dada por la ecuación:

H=LN

Donde L es longitud de columna y N es el número de platos teóricos.

La eficiencia depende principalmente de las propiedades físicas de la matriz y de lacolumna. La eficiencia mejora mucho al disminuir el diámetro de la columna, al aumentarsu longitud y al reducir el tamaño de partícula del empaque o al bajar la viscosidad deldisolvente.

tR

W 1/2

Tiempo

Alto de pico

Abs

orba

ncia

tR

W 1/2

Tiempo

Alto de pico

Abs

orba

ncia

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Selectividad

La selectividad se refiere a la capacidad del método para distinguir las propiedades de loscomponentes a nivel molecular y que permite diferenciarlos. Es importante determinar lascaracterísticas de la molécula que nos permitirán separarla, ya sea peso molecular, carácterácidobase, polaridad, tamaño, actividad bioquímica, óptica, etc.

La selectividad puede ser física o química, dependiendo de la naturaleza de lasinteracciones entre el grupo funcional y el medio de separación. Las interacciones queinvolucran fuerzas de dispersión, dipolos y fuerzas de hidrógeno se consideran físicas. Porotro lado, un equilibrio ácidobase o la formación de complejos se clasifican comoselectividades químicas.

La selectividad física es la que predomina en RPC porque en este método los componentesson separados de acuerdo a sus polaridades. Esto significa que la RPC puede usarse paraseparar grupos de compuestos de acuerdo a su estructura química. Las pequeñas diferenciasen las estructuras moleculares de dos compuestos resultan en grandes diferencias deadsorción y por lo tanto permite su separación por RPC.

La selectividad (α) es equivalente a la retención relativa de los picos de la muestra y estádada por la siguiente expresión:

α=k2

'

k1'=

V 2

V 1

Donde V1 y V2 son los volúmenes de retención, k1´ y k2´ son los factores de capacidadpara los picos 1 y 2 respectivamente.

Resolución

La resolución de una columna constituye una medida cuantitativa de su capacidad paraseparar dos solutos.

Los parámetros que contribuyen en la resolución (Rs) de los picos son la selectividad (α),la eficiencia o número de platos teóricos (N) y el factor de retención k’. (Figura 7 y 8)

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Estos parámetros se relacionan en una ecuación de la siguiente manera:

Rs=α−1

4αN k '

1k '

Figura 7. Determinación de la resolución en un par de picos de un cromatograma.

V2

V1

W1 WW 22

Rs =V2 – V2

WW 2 2 + W+ W 1/ 21/ 2

V2

V1

W1 WW 22

Rs =V2 – V2

WW 2 2 + W+ W 1/ 21/ 2

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Figura 8. Resolución de picos en diferentes cromatogramas. En el segundocromatograma hay mayor resolución porque los picos están más separados uno de otro.

Para mejorar la resolución de una columna se pueden variar cada uno de los siguientesparámetros:

•Factor de capacidad: es el elemento más manipulable debido a que depende de lapolaridad de la fase móvil. Para una resolución óptima, k’ debe estar en el intervaloentre 2 y 5.

•Número de platos teóricos: los números de platos teóricos se incrementan aumentandola longitud de la columna. Sin embargo, una consecuencia adversa es un incremento deltiempo necesario para la separación. La relación entre N y Rs está definida por elcuadrado de N. Por ejemplo, un incremento en el número de platos teóricos N de 100 a625 aumentará la resolución por un factor de 2.5 y no por uno de 6.25. Otra forma demejorar la resolución consiste en reducir la altura de los platos lo cual puedeconseguirse disminuyendo el tamaño de partícula del relleno o bajando la viscosidad deldisolvente.

•Selectividad: implica modificar las características químicas del relleno de la columna.

B A B B A A

95 % A 95 % B 99 % A 99 % B R s = 1 R s = 1. 5

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Cromatografía por supresión iónica

La cromatografía de pares iónicos o cromatografía por supresión iónica es un tipo decromatografía de fase reversa que se utiliza para la separación de especies ionizables. Serecomienda el uso de este tipo de cromatografía especialmente para moléculas cargadas degran peso molecular como las proteínas o los ácidos nucleicos.

En este modo de cromatografía, se añade a la fase móvil un compuesto iónico que aporta uncontraión orgánico grande; la concentración de estos agentes está en un rango de 0.01 % a0.03 %.

El mecanismo exacto de la cromatografía de pares iónicos no se ha establecido claramente,sin embargo, existen dos modelos fundamentales.

El primero postula que la molécula del soluto forma un par iónico con el contraión en lafase móvil y de esta manera aumenta la hidrofobicidad de la muestra. (Figura 9) El gradoen el que la muestra ionizada y el contraión forman el complejo de par iónico, así como lafuerza de unión del complejo con la fase estacionaria, afecta al tiempo de retención de lamuestra. Al aumentar la concentración del contraión, aumenta la retención hasta un límiteque generalmente está dado por la solubilidad del contraión en la fase móvil.

El otro mecanismo postula que el contraión se retiene en la fase estacionaria que esnormalmente neutra y le proporciona una carga. Esta fase estacionaria cargada puedeentonces formar complejos con los iones orgánicos de carga opuesta. Es muy probable queel mecanismo real involucre a ambos postulados.

Luego, la elución de los pares iónicos se consigue mediante una fase móvil que contengametanol u otro disolvente orgánico miscible en agua.

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Figura 9. Supresión de cargas de proteínas y de ácidos nucleicos.

El agente más usado para la supresión de cargas en proteínas es el ácido trifluoroacético ypara los ácidos nucleicos es la trietilamina.

El control del pH es el parámetro más importante en este tipo de cromatografía. Laretención aumenta conforme el pH maximiza la concentración de la forma iónica de lossolutos. Un pH bajo asegura que las bases fuertes estén en su forma iónica protonada y quelos ácidos débiles presentes estén en su forma no iónica. La fase móvil es preparadageneralmente con ácido trifluoroacético (TFA) o el ácido ortofosfórico que mantienen elpH cercano a 3. El mayor beneficio de los pH´s bajos usados en la cromatografía de supresión iónica es laeliminación del efecto de modo mixto que genera un incremento en el tiempo de retencióny un ensanchamiento de picos. Pero al mismo tiempo, el método de supresión iónica estálimitado a un intervalo de pH de 3.0 a 7.5, debido a la inestabilidad de las fasesestacionarias fuera de este intervalo de pH.

+ ++ +

++

+

+ +

++

+

+

++

Péptidos cargados positivamente

Oligonucleótidos cargados negativamente

Agentes supresores de iones cargados negativamente

Agentes supresores de iones cargados positivamente

+ ++ +

++

+

+ +

++

+

+

++

Péptidos cargados positivamente

Oligonucleótidos cargados negativamente

Agentes supresores de iones cargados negativamente

Agentes supresores de iones cargados positivamente

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Cromatografía secuencial

En este tipo de cromatografía las columnas se acoplan de manera secuencial, es decir, seconecta una columna después de otra. De esta manera los compuestos a analizar interactúande manera independiente con cada soporte y los mecanismos de retención son diferentes encada columna.

La consideración más importante en el diseño de acoplamiento de columnas involucra lacompatibilidad de la fase móvil con cada columna. El eluyente debe facilitar la uniónselectiva de los compuestos de interés en una o ambas columnas.

Las columnas pueden acoplarse de manera que los contaminantes queden retenidos en laprimera o en la segunda columna. Esta modalidad es empleada más frecuentemente para lapurificación de proteínas. A continuación se revisan los tipos de acoplamiento.

Arreglo positivonegativo

En un acoplamiento de columnas positivonegativo, la proteína de interés se une a laprimera columna y los contaminantes fluyen sin interactuar. En la segunda columna loscontaminantes quedan retenidos, pero la proteína de interés no. En los siguientes pasos secambia la polaridad de la fase móvil generando la elución de la proteína de una maneraconcentrada.

Generalmente las proteínas están presentes en muy bajas concentraciones en las muestrasbiológicas, así que la estrategia más eficiente es utilizar una columna que retenga a laproteína y la concentre.

Arreglo negativopositivo

La columna inicial retiene a los contaminantes, mientras que la segunda columna une a laproteína de interés. En este arreglo, la primera columna (llamada “negativa” porque no

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retiene a la proteína o componente de interés) generalmente se remueve, luego se procede laelución de la proteína de la segunda columna (positiva) sin que los contaminantesinterfieran puesto que fueron eliminados al retirar la primera columna.

Una de las desventajas de este arreglo es que la primera columna debe unir a la mayoría delos compuestos contaminantes.

Arreglo negativonegativo

La proteína de interés no tiene ningún tipo de interacción con ninguna columna. Ladesventaja de este arreglo es que la proteína se va diluyendo conforme atraviesa el sistemacromatográfico.

Arreglo positivopositivo

Es el arreglo que genera la mayor selectividad pues la proteína es retenida tanto en laprimera columna como en la segunda, así que de alguna manera la proteína se somete a dospasos de purificación. La proteína se une a la columna inicial y los contaminantes pasan delargo. Cuando la proteína eluye de la primera columna pasa a la segunda donde es retenida.En este caso se requiere de un segundo proceso de elución para liberar a la proteína.

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APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE FASEREVERSA

La cromatografía de fase reversa fue desarrollada en 1950 y fue ideada para la separaciónde pequeñas moléculas orgánicas. Más tarde, con la aparición de nuevos soportes para lafase estacionaria y nuevos detectores, se convirtió en una herramienta indispensable para laseparación de biomoléculas como proteínas, péptidos y oligonucleótidos.

Purificación de biomoléculas

En la actualidad, la RPC se usa de manera generalizada para separar los siguientes gruposde biomoléculas:

• Proteínas y péptidos de origen natural• Proteínas y péptidos recombinantes • Péptidos obtenidos por digestión enzimática • Péptidos sintetizados químicamente • Oligonucleótidos sintéticos

A continuación se señalan algunas consideraciones generales para lograr estrategias depurificación correctas.

Purificación de proteínas y péptidos de origen natural

La purificación de péptidos y proteínas a partir de sus fuentes naturales requiere dediferentes técnicas cromatográficas debido a la complejidad de la mezcla original. Para elúltimo paso de purificación se usa la RPC y la filtración por gel de alto rendimiento. Sinembargo, la RPC no es un método tan apropiado para separar péptidos y proteínas defuentes biológicas debido a la presencia de lípidos y otros solutos altamente hidrofóbicosque se unen fuertemente a la fase estacionaria, dificultando su separación de la columna.

Hay varios puntos a considerar cuando se utiliza la RPC para purificar moléculasprovenientes de mezclas biológicas complejas. En primer lugar, si una proteína o péptido seva a utilizar en estudios funcionales, debemos asegurarnos que la actividad biológica se

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mantiene después de cada paso de purificación. Este no es un problema crítico cuando setrata de péptidos o proteínas pequeñas, pero las proteínas grandes tienden a desnaturalizarsebajo las condiciones de la RPC. La elección adecuada del medio de fase reversa y las condiciones de elución, incluyendo eltiempo de exposición a condiciones potencialmente desnaturalizantes, deberá optimizarse afin de mantener la integridad funcional de la molécula. Además, la presencia de proteasasen las muestras puede dificultar la purificación de polipéptidos, por lo que es aconsejabletrabajar con agilidad durante las primeras etapas de purificación a fin de minimizar eltiempo de contacto entre las proteasas y la muestra. Una manera de evitar la degradación deproteínas es adicionando a la solución amortiguadora inhibidores específicos de proteasas.

Otro problema común de purificación a partir de mezclas naturales es el fenómeno deagregación. Los agregados solubles como dímeros o trímeros pueden ser separados de losmonómeros por filtración en gel.

Purificación de péptidos y proteínas recombinantes

La dificultad para aislar péptidos o proteínas de sus fuentes naturales, se puede superar através de la producción de éstas con técnicas recombinantes. Los polipéptidosintracelulares son más difíciles de purificar, ya que es necesario lisar las células para suobtención. En cambio, las proteínas o péptidos secretados al medio son relativamentefáciles de purificar y en general, no son susceptibles a las proteasas intracelulares.

La purificación de péptidos recombinantes del medio extracelular puede dificultarse por losvolúmenes tan grandes que se obtienen por lo que se requiere de un paso inicial paraconcentrar la muestra. Este inconveniente se puede resolver si se une al péptido unasecuencia terminal específica como proteína A, glutatión trasferasa, o poliamino ácidos, loque permitirá una purificación cromatográfica por afinidad. Una vez concentrado ypurificado el péptido será necesario remover el asa a través de métodos enzimáticos oquímicos. La purificación de péptidos recombinantes puede monitorearse mediante RPC,análisis de amino ácidos, mapeo de epítopes, bioensayos o electroforesis en gel depoliacrilamida.

Purificación de péptidos obtenidos por digestiones enzimáticas

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La digestión de una proteína con proteasas, usualmente tripsina, genera una mezcla depéptidos que pueden ser separados por RPC para obtener un mapa peptídico de la proteína.Incluso puede asignarse la posición de los puentes de disulfuro al comparar loscromatogramas de una digestión en donde los puentes de disulfuro permanezcan intactos ylos cromatogramas de otra digestión en donde los puentes de disulfuro hayan sidoreducidos con mercaptoetanol.β

Purificación de péptidos sintéticos

En la actualidad, la síntesis química de péptidos menores de 20 amino ácidos es unprocedimiento de rutina en muchos laboratorios. Las cantidades sintetizadas van demiligramos hasta gramos. La generación de péptidos sintéticos genera contaminantesadyacentes como péptidos truncados o con modificaciones en la secuencia de aminoácidos.También se encuentran presentes pequeñas moléculas orgánicas como fenol y tioles,producidos al separar el péptido sintético de la fase estacionaria o soporte.

Los péptidos con menos de 20 aminoácidos, en general, se pueden obtener con un altogrado de pureza usando solamente RPC. Para purificar microgramos de muestra podríautilizarse un empaque con partículas de 5 m, pero si se requieren cantidades mayoresμ

será necesario utilizar una matriz de 15 a 30 m. μ

Purificación de oligonucleótidos sintetizados químicamente

La síntesis de fase sólida automatizada es un procedimiento comúnmente utilizado paragenerar oligonucleótidos de 20 a 30 pares de bases de largo. El carácter hidrofóbico de las bases nitrogenadas disminuye en el ordenadenina>timina>guanina>citosina. Entonces, los oligonucleótidos ricos en adenina tenderána eluir más lento que aquellos ricos en citosina.

Los principales contaminantes son secuencias truncadas junto con pequeñas cantidades deoligonucleótidos que difieren en la secuencia. La separación entre las secuencias completasde las incompletas se puede simplificar si la purificación se lleva a cabo usando gruposprotectores 5´ tritilo que poseen tres anillos de benceno; de esta manera sólo losoligonucleótidos completos tendrán la hidrofobicidad suficiente para permanecer ancladosa la fase estacionaria.

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Purificación a gran escala

La purificación a gran escala de péptidos y oligonucleótidos sintéticos o proteínasrecombinantes por cromatografía de fase reversa requiere de una alta resolución para laseparación de estos compuestos. En estos casos, la purificación a escala analítica seoptimiza usando una matriz de fase reversa de partículas pequeñas y se escala utilizandouna matriz con una selectividad similar pero hecho con partículas más grandes.

Hay esencialmente tres etapas en la purificación de una biomolécula a partir de extractos omuestras naturales: la captura, purificación intermedia y el pulido.

El propósito de la captura es aislar, concentrar y estabilizar la molécula blanco de lamuestra cruda en forma rápida y con un buen porcentaje de recuperación. La captura no seespera que sea un paso altamente resolutivo, pero es necesaria para aislar la molécula deinterés de distintas sustancias contaminantes; es decir, es un proceso de separación degrupo.

La fase intermedia de purificación se enfoca en separar a la molécula blanco de la mayoríade las impurezas como proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, endotoxinas y virus. Lacapacidad de resolver componentes similares es de suma importancia en esta etapa depurificación dado que los contaminantes presentes comparten características funcionales yestructurales con la molécula blanco.

El pulido es el último paso para la obtención de un producto puro, este procedimiento seutiliza para remover el resto de los contaminantes e impurezas, de tal manera que elproducto final pueda ser obtenido puro para su posterior uso. Los contaminantes en estaetapa son a menudo muy similares a la molécula blanco. Los más comunes incluyen avariantes estructurales y conformacionales de la propia molécula.

Desalado

La desalación es un procedimiento de rutina en el laboratorio y consiste en la separación decontaminantes de bajo peso molecular de las biomoléculas de mayor peso molecular. A esteprocedimiento en ocasiones también se le denomina “cambio de buffer”. Las técnicas nocromatográficas para desalar incluyen a la ultra filtración y a la diálisis.

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Las proteínas, péptidos y ácidos nucleicos pueden desalarse adecuadamente usando lacromatografía de fase reversa puesto que las muestras pueden recuperarse y reconstituirseen volúmenes pequeños y de esta manera evitar el fenómeno de dilución que resulta de lafiltración por gel.

Una vez que se ha procesado toda la muestra, el soluto se eluye usando volúmenespequeños de fase móvil de baja polaridad, típicamente acetonitrilo. Si el solvente utilizadoes volátil, éste puede ser removido por evaporación y la muestra residual podrá serresuspendida en el volumen deseado de otro solvente o solución.

Análisis cuantitativo

La cromatografía de fase reversa también puede proporcionar información cuantitativaacerca de las especies separadas, lo cual le da un impacto de aplicación aún mayor a estatécnica. La cuantificación en RPC se basa en la comparación del área del pico delcompuesto problema con las de uno o más estándares.

Los instrumentos cromatográficos están equipados con integradores electrónicos digitales,los cuales permiten una precisa estimación de las áreas de pico.

Hay cuatro técnicas principales para la cuantificación: normalización de área, calibracióncon estándar externo, estándar interno y la adición de estándar.

Normalización de área

El área de los picos se reporta como un porcentaje de área total. (Figura 10) Ésta técnica esmuy empleada para estimar las cantidades relativas de impurezas en una muestra; ladesventaja es que asume que todos los componentes tienen el mismo nivel absorción a lalongitud de onda que se monitorea.

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Figura 10. Ejemplo de normalización de área.

Calibración con estándar externo

Implica preparar soluciones del estándar con una concentración conocida. Se inyecta elmismo volumen de cada solución y se construye una curva de calibración en función de laconcentración y las áreas de pico. La concentración de los estándares debe ser parecida a laconcentración que se espera para las muestras. Las muestras de concentración desconocidase preparan, inyectan y analizan de la misma manera. La concentración de las muestras seobtiene a partir de la curva de calibración.

A este método se le llama estándar externo porque los estándares se analizan encromatogramas separados de las muestras. Calibración con estándar interno

Consiste en la adición de un compuesto diferente al analito a cada una de la soluciones quese van a analizar. Se analizan soluciones de muestra de diferentes concentraciones a las quese ha añadido la misma cantidad de estándar interno.

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Tiempo

93%

2.8% 2.2%

0.8% 1.2%


Requerimientos para un estándar interno: • Tener buena resolución (Rs>1.25)• Factor de capacidad similar al compuesto problema• El compuesto que se utilice como estándar interno no debe estar presente en la

muestra original• Que tenga alto grado de pureza

Adición de estándar

Este método se usa para análisis de trazas. Diferentes cantidades del analito que se deseamedir se adicionan a la solución problema, la cual contiene una concentración desconocidade analito. A la cuantificación total se le resta el valor de la cantidad adicionada; de estamanera se puede calcular la concentración desconocida.

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ALGUNOS ASPECTOS PARA EL DESARROLLO DE UNANÁLISIS DE CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA

En la siguiente sección se tratarán algunas consideraciones que hay que tomar en cuenta enla aplicación de la cromatografía de fase reversa para la separación de biomoléculas comoes la selección de columna, la fase móvil, las condiciones de elución, preparación de lasmuestras, manejo de las columnas, así como la resolución de problemas más comunes.

Naturaleza química de la fase estacionaria

Para la separación de proteínas grandes hay una preferencia a usar sílicas con ligandos nbutilo y noctilo sobre los alquilos noctadecilo ya que las biomoléculas no son capaces deintercalarse en las capas nalquilo largas como lo hacen las moléculas pequeñas; además,no se genera una adsorción tan fuerte de las proteínas en las cadenas alquilo pequeñas y porconsiguiente se requiere menor cantidad de solventes orgánicos para la elución, lo cualdisminuye el riesgo de desnaturalización de la proteína.

Tamaño y forma de partícula

La accesibilidad de la muestra a la matriz depende en gran medida del tamaño de poro. Losempaques con tamaños de poro menores de 300 armstrongs se usan para la separación depéptidos y oligonucleótidos. Generalmente se recomiendan tamaños de poro de 300armstrongs o mayores para la separación de proteínas porque como se mencionóanteriormente, los poros grandes generan mejor resolución para biomoléculas más largas.

El tamaño de la partícula también difiere entre una separación analítica y una preparativa.Las separaciones analíticas se desarrollan en columnas con partículas de 3 a 5 micras, laspreparativas con partículas de 10 a 30 micras y las separaciones a gran escala utilizanpartículas de 40 a 50 micras. El inconveniente es que a mayor tamaño de partícula, lacolumna se vuelve más frágil y por tanto se reduce su tiempo de vida.

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Respecto a la forma de las partículas, las columnas con empaque de partículas irregularesson menos caras que las partículas esféricas y son más comúnmente empleadas enaplicaciones de gran escala.

Tamaño de la columna

La resolución de biomoléculas de alto peso molecular en las separaciones de fase reversa,es menos sensible al largo de la columna que la resolución de moléculas orgánicaspequeñas, de tal manera que los ácidos nucleicos, proteínas y péptidos largos pueden serpurificados eficientemente en columnas cortas. El incrementar el largo de las columnas engeneral no incrementa la resolución significativamente y sí podría dañar a las proteínasporque la pérdida de actividad biológica es proporcional al tiempo de residencia de laproteína en la columna.

Por otra parte, las separaciones analíticas generalmente usan columnas de 100 a 250 mm delargo x 4 mm de diámetro; y las separaciones preparativas requieren columnas condiámetros más anchos, por ejempo, de 9 mm aproximadamente.

Velocidad de Flujo

La velocidad de flujo es un factor importante para la resolución de moléculas pequeñas, yaque la tendencia de las moléculas a difundirse disminuye al incrementar el flujo,produciendo picos más angostos y por lo tanto, mejora la resolución. Las proteínas tienenmenor difusibilidad que las moléculas pequeñas, por lo que se obtiene una buena eficienciaaún con flujos bajos.

Generalmente las separaciones en columnas de 100 a 250 mm de largo x 4.6 mm dediámetro se eluyen con un flujo de 1 ml/min y las separaciones preparativas que sedesarrollan en columnas de 250 mm x 9.4 mm de diámetro utilizan flujos de 4 ml/min.

Las variaciones en la velocidad de flujo son especialmente significativas en lasseparaciones a gran escala, pero no es crítica en los experimentos analíticos.

Temperatura

La temperatura puede afectar profundamente a la cromatografía de fase reversa,especialmente la utilizada para solutos de bajo peso molecular, péptidos pequeños y

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oligonucleótidos. Dado que el transporte de masas en solución entre la fase móvil y la fase

estacionaria es un proceso controlado por difusión, incrementar la temperatura disminuye laviscosidad del solvente y esto generalmente favorece la transferencia de masas y por lo

tanto, mejora la resolución. En cambio, cuando las proteínas se desnaturalizan por unincremento de la temperatura, la estructura de éstas se desdobla y tiene más sitios deinteracción con la fase estacionaria, por lo tanto se incrementa el tiempo de retención.

Solventes

Todos los solventes, soluciones amortiguadoras, sales, así como el agua usada para prepararla fase móvil, deben ser de alta pureza química, libre de iones metálicos así como departículas suspendidas. La pureza química es importante en RPC preparativa puesto quecualquier contaminante en la fase móvil puede producir picos indeseables, y contaminar labiomolécula purificada.

Los solventes usados para preparar la fase móvil o la fase móvil ya preparada debendesgasificarse en un baño de ultrasonido por 10 a 15 minutos para prevenir la formación degas que afectaría la estabilidad de la columna. También pueden desgasificarse utilizandovacío y burbujeando helio.

Desnaturalización

Las interacciones de las proteínas con los solventes orgánicos, en general, conduce a ciertapérdida de la estructura terciaria que puede generar varios estados conformacionales y cadaestado a su vez puede interactuar de manera diferente con la fase estacionaria. Eldesdoblamiento puede exponer los residuos hidrofóbicos de la proteína con el consecuenteincremento de la retención, lo que puede generar insuficiente recuperación de la proteína.Los complejos enzimáticos y proteínas de componentes múltiples son más lábiles a perderactividad que los péptidos pequeños. Ahora bien, el proceso de desnaturalización presentauna cinética lenta y puede reducirse este proceso disminuyendo el tiempo que la proteínapermanece en la columna. En caso de que ocurriera cierta desnaturalización, laconformación podría regenerarse al reincorporar la proteína a sus condiciones nativas. Encaso de que una proteína o péptido fuera purificada con el fin de determinar su estructuraprimaria, la desnaturalización no sería un problema.

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Gradiente de elución

La retención de las proteínas disminuye exponencialmente al adicionar a la fase móvil unmodificador orgánico. Este comportamiento de las proteínas obliga al uso de eluciones congradiente para la separación de mezclas proteicas.Cuando se pretende separar por primera vez los componentes de una mezcla compleja, seusa un gradiente “grueso” para una separación inicial, que servirá para ajustar la forma delgradiente hasta llegar al punto óptimo. Esto usualmente implica la disminución de lapendiente del gradiente en el lugar donde eluyen los componentes deseados y del aumentode la pendiente antes y después de ese punto.La elección de la pendiente del gradiente dependerá de que tan próximos eluyan loscomponentes contaminantes de la molécula blanco. Por lo general, cuando disminuimos lapendiente del gradiente incrementamos la resolución, pero también aumentamos lostiempos de retención.

Los gradientes en RPC siempre provienen de una condición de alta polaridad (fase móvil Aaltamente acuosa) a una de baja polaridad (fase móvil B con alto contenido de solventeorgánico). Los gradientes o pendientes de gradiente se reportan usualmente como elincremento en el porcentaje de la fase móvil B por unidad de tiempo (%B/min) o porunidad de volumen (%B/ml).

Un gradiente típico va de 0 % B a 100 % B en 10 a 30 volúmenes de columna. Con un flujode 1 ml/min para una columna de 1 ml, corresponde un gradiente de 3 a 10 % B/min.

Acondicionamiento de columna

El acondicionamiento de columna debe realizarse siempre que se use una columna porprimera vez, después de un almacenamiento prolongado, y cada vez que se desee cambiar lafase móvil para un análisis.

El acondicionamiento se lleva a cabo usando la misma fase móvil que la del análisiscromatográfico. El procedimiento general para el acondicionamiento de las columnas es elsiguiente:

1. Lavar con 3 volúmenes de columna de fase móvil B para eliminar posiblescontaminantes del análisis anterior.

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2. Correr 2 a 3 volúmenes de columna de un gradiente lineal de 100 % fase B a 100 %fase A. No debe cambiarse de manera abrupta la fase móvil porque existe el riesgode que la columna se dañe.

3. Equilibrar con fase A hasta que todas las señales de monitoreo sean estables.

Cada vez que se cambie la fase móvil, es importante correr un blanco para corroborar laausencia de impurezas y analizar la estabilidad del sistema. Después de haber equilibrado la columna con la fase móvil A, el segundo paso es aplicar lamuestra a la columna. Enseguida se procede a eluir con la misma fase móvil A. Lamolécula de interés deberá unirse a la matriz y los solutos indeseados serán arrastrados porla fase móvil.

Preparación de las muestras

La muestra debe disolverse en la fase móvil que se empleará para hacer el análisiscromatográfico. Si la muestra no es completamente soluble en la fase móvil, puedeadicionarse ácido fórmico, acético o alguna sal; este procedimiento mejora la solubilidad yno afecta la separación, siempre y cuando estos agentes se encuentren en bajo porcentaje.

Todas las muestras deben centrifugarse a 10,000 rpm por 10 minutos antes de la inyeccióno filtrarse a través de una membrana de 0.22 micras para eliminar partículas.

No se recomienda almacenar las fases móviles acuosas de pH neutro por más de 3 díasporque existe el riesgo de crecimiento microbiano y además la muestra podría oxidarse.

Limpieza de la columna

Se recomienda limpiar la columna periódicamente, especialmente cuando se detecte unaelevación en la presión o pérdida de resolución. Hay que considerar que la pérdida deresolución debido al ensanchamiento de los picos puede deberse a la presencia de grupossilanol en la superficie de la sílica o incluso a la disolución de la matriz debido al usofrecuente de fases móviles con pH por arriba de 7.

Un procedimiento común de limpieza es:

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1. Lavar a bajo flujo con varios volúmenes de columna utilizando 0.1 % de TFA(ácido trifluoroacético) en agua.

2. Correr un gradiente, aproximadamente 20 a 30 volúmenes de columna, desde 0.1 %de TFA en agua hasta 0.1 % de TFA en isopropanol. El isopropanol es muy usadopara la limpieza de columnas debido a su alto poder de elución.

3. Equilibrar con 100 % de isopropanol conteniendo 0.1 % de TFA y luego llevar lacolumna nuevamente a agua con 0.1 % de TFA empleando un gradiente.

4. Utilizar un gradiente para introducir la fase móvil A.5. Equilibrar con varios volúmenes de columna de fase móvil A antes de iniciar el

análisis.

Para columnas de poliestireno, un procedimiento efectivo de limpieza es equilibrar convarios volúmenes de columna empleando hidróxido de sodio 0.5 M. El hidróxido de sodioes un agente de limpieza muy efectivo.

Almacenamiento de la columna

Las columnas de fase reversa hechas a base de sílica no deben almacenarse en solucionesacuosas debido a la inestabilidad de la sílica en condiciones acuosas. Las columnas debenalmacenarse en solventes orgánicos como metanol libre de TFA.

Resolución de problemas

A continuación se presentan algunas soluciones para los problemas más comunes duranteel desarrollo de un análisis por cromatografía de fase reversa.

Síntoma Causa Solución

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El flujo de la columnase ha reducido.

•Presencia de materialparticulado en la fase móvil.

•Precipitación de proteínas en lacolumna.

•Filtre las muestras y la fasemóvil antes de usarlas.

•Reemplace el filtro de la fasemóvil, la precolumna, y/o lacolumna. •En ambos casos limpie yregenere la columna.

No hay flujo por lacolumna.

•La bomba no funciona.

•Alguna pieza, adaptador o tubodel sistema esta obstruído.

•Revise que la bomba estéfuncionando adecuadamente.•Verifique si la bomba o elsistema presentan fugas o si hayobstrucciones.

La presión seincrementa durante unao varias corridas.

•Precipitación de la muestra en lacolumna.

•Limpie y regenere la columna.•Reemplace el filtro de la fasemóvil, la precolumna, y/o lacolumna. •Cambie el aditivo usado parasolubilizar la muestra. •Filtre las muestras y la fasemóvil antes de usarlas.


La muestra no eluye enel gradiente usado.

•La concentración del solvente Ben el gradiente es muy baja.•El poder de elución del solventeorgánico es muy bajo.

•Incremente la concentración delsolvente.

•Sustituya la columna por unacon ligandos menos hidrofóbicos.•Cambie el solvente por otro demayores propiedades de elución.

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Los componentes de lamuestra eluyen en lafase de equilibrio.

•La muestra no es losuficientemente hidrofóbica paraadsorberse en la columna.

•La concentración inicial desolvente es muy alta.

•Incremente la concentración delagente supresor de iones.•Cambie la columna por una conligandos más hidrofóbicos.•Sustituya el solvente orgánicopor otro con menores propiedadesde elución. •Disminuya la concentración delsolvente.

La resolución es menora lo esperado.

Síntoma

La resolución es menora lo esperado.

•La pendiente del gradiente esmuy alta. •Baja selectividad

•El volumen de la celda dedetección es muy grande.•La columna esta mal empacada.

•Proteínas o lípidos precipitadosen la columna.

•La concentración de la muestraes demasiado alta.

Causa

•Hay grupos silanol libres en lasuperficie de la fase estacionaria.

•La velocidad del flujo es muyalta.

•Use un gradiente más bajo.

•Adicione o ajuste laconcentración del agente supresorde iones.•Cambie la celda de flujo.

•Determine los platos teóricos dela columna y de ser necesario,cámbiela •Limpie y regenere la columna.Incremente la concentración desolvente en la fase móvil inicial.

•Limpie y regenere la columna.Disminuya el volumen de cargade la muestra.

Solución

•Disminuya el pH para suprimirla ionización de los grupos silanolo cambie de columna.•Disminuya el flujo de elución.

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Ensanchamiento debanda o asimetría.

•La columna está mal empacada.

•La columna está sobre cargada.

•Hay difusión de la muestra.

•Determinar el número de platosteóricos. De ser necesarioreemplace la columna. •Limpie y regenere la columna.Disminuya el volumen de cargade la muestra. No debe haber másde 1 mg de muestra por gramo defase estacionaria.•Incremente la velocidad de flujo.

No se puede reproducirun perfil de eluciónprevio.

•La columna no está equilibrada,falta acondicionamiento.

•La fase móvil no se preparócorrectamente o el solvente seevaporó. •Alteración de la muestra duranteel almacenaje.

•Continúe el acondicionamientode columna hasta que la líneabasal sea estable,aproximadamente 5 a 10volúmenes de columna. •Prepare nuevamente la fasemóvil.

•Prepare nuevamente la muestra.

Buena recuperación dela muestra pero pocaactividad biológica.

•Los componentes de la muestraestán desnaturalizados oinactivados en la fase móvil.

•Disminuya el tiempo de corridaa fin de limitar la exposición de lamuestra a los reactivos de la fasemóvil.•Use una matriz con ligandosmenos hidrofóbicos paradisminuir la concentración desolvente B en la fase móvil ocambie el solvente de la fasemóvil.


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La cantidad de muestraen las fraccioneseluídas es muchomenor a lo esperado.

•Precipitación de la muestra.

•La muestra se ha adsorbidofuertemente a la columna porretención iónica. •La muestra se ha degradado porproteasas o nucleasas.

•Cambie la composición de lafase móvil a fin de mantener laestabilidad. •Disminuya el pH de la fasemóvil o adicione un agentesupresor de iones.•Agregue inhibidores deproteasas o nucleasas o minimiceel tiempo de separación.

Picos muy pequeños •La muestra absorbe poco a esalongitud de onda.

•Monitoree la muestra a diferentelongitud de onda.

Picos extraños en elcromatograma.

•Impurezas en la fase móvil.

• Elución incompleta de lacorrida anterior.

•Use reactivos de mejor calidad. •Lave la columna.

Ruido en elcromatograma

•Burbujas de aire atrapadas en lacolumna o en la celda deldetector.

•Elimine el gas de la fase móvil.

El tiempo de retenciónpara un mismocomponente de lamuestra aumenta con eltiempo.

•Hay un comportamiento demodo mixto debido a grupossilanol en la superficie de lasílica.

•Disminuya el pH para suprimirla ionización de los grupossilanol. O bien, cambie lacolumna.

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EQUIPO DE HPLC

La técnica de fase reversa es el tipo de cromatografía más ampliamente utilizada en HPLCque son las siglas del inglés High Performance Liquid Chromatography. La cromatografíade líquidos de alta resolución utiliza presiones elevadas para hacer pasar un flujo de fasemóvil a través de una columna empacada con partículas micrométricas. Sin la aplicación depresión sería prácticamente imposible que el eluyente pasara a través de la columna.

Dadas las características de una columna de cromatografía de fase reversa, se requerirá deun equipo de HPLC para realizar la separación. Así que es relevante comentar de formageneral cómo está conformado este equipo.

Un equipo de HPLC básicamente debe contar con un sistema de bombeo que impulse elflujo de la fase móvil a través de la columna, una columna que separe los componentes dela muestra, un detector que mida alguna característica de dichos componentes conforme vansaliendo de la columna y un procesador que convierta la señal electrónica del detector en uncromatograma.

La figura 11 muestra un esquema de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución típico;enseguida se explicará brevemente cada uno de los componentes.

Al det ect orFilt r o

Fuent e de helio regulada

Vá lvula d e s a lid a

Bomba

Vá lvula d e e nt r ad a

Am o r t ig uad o r d e puls ac io ne s

Ent rada de jeringa para cebar

Vá lvula d e d r e naj e

Re g ulad o r d e c o nt r a pr e s ió n

Transductor de presión

Vá lvula d e iny e c c ió nCo lum na

Al det ect orFilt r o



Bomba










Bomba








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Figura 11. Diagrama que muestra las partes más importantes que integran un cromatógrafo de líquidos dealta resolución.

Sistemas para el tratamiento de los disolventes

Los recipientes que contienen los solventes a menudo se equipan con un sistema paraeliminar los gases disueltos, como oxígeno y nitrógeno, que interfieren formando burbujasen los sistemas de detección.

Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacío, dispositivos paracalentar y agitar los disolventes o sistemas de difusión que permiten arrastrar los gasesdisueltos fuera de la solución mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad.

Para poder hacer eluciones por gradiente, los equipos de HPLC modernos cuentan conrecipientes conectados a una mezcladora, lo que permite variar la relación de losdisolventes en forma programada y modificar los valores de manera lineal o exponencial.

Sistemas de bombeo

Las bombas utilizadas en el HPLC son muy potentes y precisas. El flujo debe ser libre depulsaciones y con un caudal que pueda variar entre 0.1 y 10 ml/min, la presión puede serhasta de 6000psi (lbs/in2) y todos los componentes deben ser resistentes a la corrosión.Existen tres tipos de bombas: bombas recíprocas, bombas de jeringa y bombas de presiónconstante o neumática.

La bombas recíprocas son las más usadas, el 90 % de los equipos de HPLC modernoscuentan con este sistema de bombeo. El disolvente es expulsado de una cámara por elmovimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor. Las bombas recíprocas tienenla desventaja de que producen un flujo con pulsaciones que se manifiesta como ruido en lalínea base del cromatograma. Entre las ventajas de estas bombas se pueden citar su pequeñovolumen interno (35 a 400 l), sus altas presiones de salida (por encima de las 10,000μ psi),su fácil adaptación a la elución con gradiente y sus caudales constantes que sonprácticamente independientes de la contrapresión de la columna y de la viscosidad deldisolvente. Como una parte más del sistema de bombeo esta el restrictor colocado a la

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salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la señal y un valor preestablecido, se utilizapara aumentar o disminuir la velocidad del motor de la bomba.

Sistemas de inyección de la muestra

A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía de líquidospor HPLC, es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. Elproblema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobre carga de lascolumnas. Por ello, los volúmenes que se emplean han de ser muy pequeños, de 20 lμ

hasta 500 l. Además, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema. μ

El método más ampliamente utilizado para la introducción de la muestra utiliza dispositivosen forma de bucle, que pueden introducir la muestra a presiones de hasta 7000psi con unaprecisión aceptable.

Columnas

Como se explicó en la primera parte de este trabajo, la separación de los componentes de lamuestra se produce en la columna.

La mayoría de las columnas para HPLC se construyen con tubos de acero inoxidable dediámetro interno uniforme. Esta clase de tubos miden entre 10 y 30 cm. El diámetro internode las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las partículas de los rellenosmás comunes son 3, 5 y 10 m. μ

Para aumentar la vida de la columna analítica se coloca delante una precolumna queelimina la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes. La composicióndel relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna analítica; sin embargo,el tamaño de la partícula es por lo común mayor para minimizar la caída de presión.

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Tipos de relleno de la columna

El relleno puede ser de dos tipos de partículas porosas o pediculares. El último consiste enbolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas con unos diámetros característicos de30 a 40 m. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada de síliceμ . Elrelleno pedicular se utiliza ampliamente en precolumnas y no para columnas analíticas.

Los rellenos de partículas porosas para HPLC están formados por micro partículas porosascon diámetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersión posible para un tamañoμ

determinado. La sílice es el material más comúnmente empleado para este tipo decolumnas, debido a que se pueden producir partículas con diámetros muy uniformes.

Termostatos

En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura y las columnastrabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, si se controla la temperatura de lascolumnas se obtienen mejores cromatogramas. La mayoría de los aparatos lleva hornos quecontrolan la temperatura en las columnas. Otra forma de controlar con precisión latemperatura es colocando las columnas en camisas con agua que provenga de un baño detemperatura constante.

Detectores

Los detectores en cromatografía de líquidos como HPLC son de dos tipos básicos. Losdetectores basados en una propiedad de la fase móvil que responden a cambios en el índicede refracción, la constante dieléctrica o la densidad, las cuales se modifican por la presenciade los analitos. Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto respondena alguna de las propiedades de la muestra como es la absorción en UV, fluorescencia,actividad óptica, etc. Algunos de estos detectores se describen a continuación.

Detectores de absorbancia

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Son los detectores más empleados ya que tanto las proteínas como los ácidos nucleicosabsorben luz de esta región. Las longitudes de onda típicamente monitoreadas son:

• 210220 nm: corresponde a la absorción de la unión peptídica. Se usaprincipalmente para monitorear péptidos que carecen de aminoácidos aromáticos.

• 228 nm para His • 240 nm para Cys• 254 nm para Phe• 250–260 nm para medir oligonucleótidos• 280 nm para Trp y Tyr

Los detectores de absorbancia ultravioleta más simples son los fotómetros de filtros conuna lámpara de mercurio como fuente. La desventaja que presentan estos aparatos es que elefluente no se puede monitorear a varias longitudes de onda al mismo tiempo. A fin de reducir el ensanchamiento de banda, el volumen de una cubeta de flujo (en formade Z) para medir absorbancia ha de ser lo menor posible. Las longitudes de la cubeta vande 2 a 10 mm (Figura 12) de modo que los volúmenes se limitan por lo común de 1 a 10

l. Además la presión no debe ser mayor de unos 600μ psi. pues existe el riesgo de romper lacubeta del detector.

Figura 12. Esquema de la cubeta de un detector de absorbancia.

Detectores de arreglos de diodos

De la columna

Vent anas de cuarzo

Fuente UV Det ector

Al desecho

De la columna

Vent anas de cuarzo

Fuente UV Det ector

Al desecho

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Este tipo de instrumentos permiten hacer barridos a distintas longitudes de onda de cadauno de los componentes separados. De esta manera, se generan una colección decromatogramas a diferentes longitudes de onda de cada pico.

Mediante los arreglos de diodos se puede determinar la mejor longitud de onda a la quedebe monitorearse el compuesto de interés.

Detectores de fluorescencia

Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a los fluorímetros yespectrofluorímetros. La fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoeléctricocolocado perpendicularmente respecto al haz de excitación. Una ventaja de los detectoresde florescencia es su alta sensibilidad, unas tres órdenes de magnitud mayor a la obtenidapor métodos de absorbancia.Detectores de infrarrojo

Una de las mayores limitaciones del uso de detectores de infrarrojo se debe a lainterferencia generada por los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas anchas deabsorción infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prácticamente el uso de estedetector para muchas aplicaciones.

Detectores de índice de refracción

Son considerados detectores universales, pues el índice de refracción es una propiedadfísica de todos los compuestos. Miden las variaciones en el índice de refracción de la fasemóvil cuando hay diferentes solutos presentes.

Estos detectores tienen la desventaja de no ser tan sensibles como la mayoría de los otrosdetectores, por ejemplo, son dos a tres veces menos sensible que un detector deabsorbancia. Además son muy inestables a los cambios de temperatura por lo que serequiere un estricto control de ésta.

Detector de dispersión de luz (ELSD)

El efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una nubemediante un flujo de nitrógeno o aire. Las gotitas viajan a través de un tubo de conducción

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a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporación de la fase móvil, lo que originaunas finas partículas del compuesto problema. La nube de partículas de analito pasa a travésde un haz de láser y mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiación dispersadaperpendicularmente al flujo.

Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que puede emplearse para casitodos los solutos no volátiles y es más sensible que el detector de índice de refracción.

Detectores de espectrometría de masas

La espectrometría de masas es el método de detección más reciente y cada vez se generalizamás su uso.

La muestra al salir de la columna es ionizada. Luego los iones se separan de acuerdo a surelación carga/masa.

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PROVEEDORES

A continuación se presentan los nombres y direcciones electrónicas de los proveedores másimportantes de columnas y equipos cromatográficos.

Compañía Página de internetABI http://www.appliedbiosystems.com/Alltech http://www.alltechweb.com/Beckman http://www.beckman.com/BioRad http://www.biorad.com/Merck http://chrombook.merck.de/chrombook/index.jsp?j=1J & W Scientific http://www.chem.agilent.com/cag/cabu/jandw.htmJ.T. Baker http://www.jtbaker.com/chromatography/PerkinElmer http://las.perkinelmer.com/VWR http://www.chromatography.co.uk/products/Default.htmWaters http://www.waters.com/Whatman http://www.whatman.com/

Otras páginas de internet de interés

http://www.rpi.edu/dept/chemeng/BiotechEnviron/IONEX/be_index.htm

http://www.separationsnow.com/basehtml/SepH/1,1353,30000home00,00.html

http://ntri.tamuk.edu/fplc/rev.html

http://www.ionsource.com/tutorial/chromatography/rphplc.htm

http://www.nestgrp.com/protocols/vydac/rpcbuffernote.shtml

http://www.biocompare.com/jump/2105/ReversePhaseChromatography.html

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COMENTARIOS

Sin duda, la cromatografía de fase reversa se ha convertido en una herramientaindispensable en la investigación biotecnológica. Esta técnica de separación debe sucrecimiento a su rapidez, simplicidad, relativo bajo costo y versatilidad. Justamente laadaptabilidad de la cromatografía de fase reversa permitió el surgimiento de lacromatografía por supresión iónica y la secuencial que se revisaron en el presente trabajo.También se procuró dar una visión de las aplicaciones de la cromatografía en fase reversaen el área de la biotecnología y algunos aspectos a considerar al momento de desarrollaruna separación de fase reversa.

Con seguridad se seguirán implementando modificaciones de la técnica que permitanexpandir aún más su uso. Ahora la tendencia es el empleo de columnas capilares quemejoren la resolución de los análisis así como el acoplamiento a detectores más sensiblesque generen mayor información del compuesto en estudio como los arreglos de diodos ylos espectrómetros de masas.

BIBLIOGRAFÍA

1. Karger B.L., Snyder L.R. and Horvath C., An introduction to separation science. JohnWiley and Sons, Canada, 1973.

2. Gooding K. and Regnier F., HPLC of Biological Macromolecules, Vol 51,Chromatographic Science Series, Marcel Dekker Inc., USA, 1990.

3. Hearn M., HPLC of proteins, peptides and polynucleotydes, VCH Publishers Inc.,USA, 1991.

4. Howard G.A. and Martin A.J.P., The separation of the C12C18 fatty acids by reversedphase partition chromatography, Biochem J, 1950, 46:532538.

5. Lindsay S. High Performance Liquid Chromatography, 2nd ed., John Wiley and Sons,UK, 1992.

6. Reversed Phase Chromatography. Principles and Methods, Amersham PharmaciaBiotech, Sweden, 1997.

7. Skoog D. A. and Leary J. J., Análisis instrumental, 4a ed., McGrawHill, México,1999.

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8. Snyder L. R., Kirkland J. J. and Glajch J. L., Practical HPLC method development, 2nd

ed., John Wiley and Sons, USA, 1997.

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