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UNIVERSIDAD NACIONALAUTÓNOMA DE MÉXICO

INSTITUTO DEBIOTECNOLOGÍA

MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOSEN BIOTECNOLOGÍA

PCR

ALUMNOS:CORTAZAR MARTÍNEZ

ADRIANASILVA RINCÓN ELSA

PATRICIA

JUNIO, 2004

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ÍNDICE

Introducción 1Historia y Desarrollo 2Metodología básica 4

Componentes de la reacción 4Nucleótidos 4Primers 5

Especificidad 6Secuencias complementarias 6Contenido de G/C 6Secuencia de los extremos 3’ 6Temperatura de asociación 6Cálculo de la temperatura de fusión (Tm) 7Programas de Diseño de Primers 7

Templado 8Polimerasa 8Concentración de Magnesio 9Otros componentes de la reacción 9

Parámetros de la reacción 9Desnaturalización 10Alineamiento 10Extensión 11Número de ciclos 11

Termocicladores 12Identificación de los productos de PCR 13

RT PCR 15PCR en tiempo real 16

Técnicas de detección 17SYBR greenTM 17Hydrolysis probes 18Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) 18Hybridization probes 19Scorpions 20

Cuantificación 21Genes estándares 24El efecto de limitar los reactivos 24PCR competitivos cuantitativos 25Máquinas para PCR en tiempo real 26Ventajas del tiempo Real 27

Primers Degenerados 28Uso de los primers degenerados 28Diseño de los primers degenerados 29

Alineación de la secuencia 29Información de la secuencia terminal de aminoácidos 29Degeneración de primers 29

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La reacción de PCR 29El cóct el de PCR 29Los ciclos de PCR (el termociclador) 29

Problemas comunes 30Secuenciación 30Controles 30

Long PCR 30Aspectos Generales 31

Programa genérico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600 32Hot Start 32

PCR in situ 32Principios y Métodos 32

Otras variantes de la PCR 33Multiplex PCR 33Nested PCR 34

Clonación de productos de PCR 34Clonación TA 35Clonación de extremos romos 36Clonación direccional a través de primers modificados. 36Clonación de fragmentos largos de DNA 37

Mutagénesis por PCR 37Mutagénesis con PCR-extensión solapada 37Mutagénesis sitio dirigida 38

Aplicaciones especiales de la PCR 39Bibliografía 40

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INTRODUCCIÓN

La biotecnología, en un sentido amplio se puede definir como la aplicación deorganismos, componentes o sistemas biológicos para la obtención de bienes y servicios. LaIngeniería Genética (I.G.), conocida como tecnología del ADN recombinante in vitro, secaracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN deorganismos distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza,combinaciones que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismoshospederos, para nuestro provecho.

No cabe ninguna duda de que la técnica más revolucionaria de los últimos 15 añosha sido la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado nuevas alas a la propiaIngeniería genética y a toda la biología molecular. Fue inventada por Kary Mullis amediados de los años 80.

Muchas de las técnicas clásicas de la Ingeniería genética estaban encaminadas aresolver el complejo problema de cómo clonar o localizar un gen o un segmento de ADN.Sin embargo, esas técnicas son a menudo largas y tediosas, y no es raro que no denresultados. La PCR ha venido a cambiar el panorama, ya que permite en principio producirin vitro grandes cantidades de una secuencia de ADN concreta sin recurrir a la clonación enun organismo huésped. Esencialmente la técnica permite la amplificación selectiva decualquier segmento de ADN, conociendo las secuencias que lo flanquean. Como alguien hadicho, "es una técnica que consigue encontrar la aguja en el pajar, al tiempo que produce unpajar de agujas por amplificación selectiva".

Las aplicaciones de la PCR y de sus numerosas variantes son prácticamenteilimitadas:

• simplifica muchos experimentos de I.G.• permite muchos estudios de expresión genética• secuenciación directa de secuencias amplificadas• detección de mutaciones• seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades• diagnósticos de enfermedades genéticas e infecciosas• en ciencia forense: identificación de restos biológicos, determinación de paternidad,

pruebas periciales en criminalística• en arqueología y paleontología

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HISTORIA Y DESARROLLO

Kary Mullis

Hasta mediados de la década del ochenta, la única estrategia posible para aislar ungen y obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular".Este método se basa en la introducción de fragmentos de ADN, uno de los cuales contendráel gen de interés, en vectores. Éstos son moléculas de ADN (plásmidos o ADN debacteriófagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original comode multiplicarlos dentro de bacterias. Si se conoce un pequeño tramo de la secuencia deaminoácidos de una proteína cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar), se pueden diseñarmétodos para identificar qué bacterias llevan el vector que transporta dicho gen. Estereconocimiento también se puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra la proteínaresultante del gen que se desea clonar. En este caso se reconoce la bacteria portadoraporque fabrica la proteína codificada por el fragmento de interés, la cual se uneespecíficamente al anticuerpo.

Una vez aislado el gen no sólo resulta posible determinar con exactitud su secuenciade bases o analizar en detalle la información de la que es portador, sino que también sepuede estudiar su expresión (la manera en que dirige la síntesis de la proteínacorrespondiente) en distintos organismos y tipos celulares, introducido en células en cultivoo en animales de experimentación, etcétera. Estas técnicas, ya clásicas, han permitido elaislamiento y caracterización de decenas de miles de genes de microorganismos, animales yplantas, lo que provocó un cambio cualitativo en la comprensión del funcionamiento de lacélula.

En 1985, K. Mullis, un investigador de la Corporación Cetus, inventó un métodopara lograr la multiplicación in vitro de fragmentos definidos de ADN sin necesidad derecurrir a los vectores y su replicación en bacterias. Este método revolucionaría en cortotiempo el conjunto de técnicas de la biología molecular. Su uso se extendió rápidamente amiles de laboratorios, no sólo de investigación básica, sino también de diagnóstico clínico.Se trata de la reacción en cadena de la polimerasa, ya muy conocida como PCR, siglasprovenientes del inglés Polymerase Chain Reaction.

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Esta técnica permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el término que se haimpuesto) pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. Eltramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta más de dos milnucleótidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estarnecesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas.

Cuando el proceso era manual la técnica de PCR era lenta y requería de trabajointensivo. Por lo tanto, los científicos de Cetus comenzaron a buscar las maneras deautomatizar el proceso.

Para replicar el ADN, la técnica PCR hizo uso, en un principio, de la ADNpolimerasa de la bacteria Escherichia coli. Pero esta enzima resulta desactivada debido a laalta temperatura requerida para desnaturalizar la doble cadena del ADN, por lo cual debíaagregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. La primera máquinatermocicladora, "Mr. Cycle" fue creada por los ingenieros de Cetus para tratar esanecesidad de agregar la enzima fresca a cada tubo de prueba después del calentamiento ydel proceso de enfriamiento. Sin embargo, este inconveniente fue solucionado de maneraingeniosa cuando se la reemplazó por su equivalente de la bacteria "termófila" Thermusaquaticus. En efecto, la ADN polimerasa de este microrganismo, denominada Taqpolimerasa, actúa eficientemente entre los 75°C y los 80°C y resiste más de dos horas a93°C.

La purificación de la polimerasa de Taq dio lugar a la necesidad de una máquinaque realizara un ciclo más rápidamente entre diversas temperaturas. En 1985, Cetus seasoció con la corporación Perkin-Elmer e introdujo la DNA Termal Cycler. De estamanera es posible mezclar todos los componentes de la PCR al comenzar el primer ciclo yla reacción en cadena puede llevarse a cabo mediante equipos automatizados que realizaránlos ciclos térmicos programados.

En 1989, Cetus anunció un acuerdo de colaborar con Hoffman-LaRoche en eldesarrollo y la comercialización de productos de diagnóstico humanos in vitro y deservicios basados en tecnología de PCR.

En 1990, los científicos alcanzan la primera amplificación y detección simultánea delas secuencias específicas de DNA usando un colorante fluorescente, poniendo elfundamento para la PCR en tiempo real o PCR "cinético" (pruebas TaqMan).

En 1991 Hoffmann-La Roche Inc. adquiere los derechos y las patentes mundiales dela PCR.

El Dr. Kary Mullis comparte el premio Nobel de Química en 1993 por inventar latecnología de PCR.

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METODOLOGÍA BÁSICA

Componentes de la reacción

Los nucleótidos

Los nucleótidos se diluyen en agua, la solución debe ser protegida (por ejemplo conel 10mM Tris pH 7,7-8,0 , concentración final) . Si no, un pH ácido promoverá la hidrólisisdel dNTP en dNDP y dNMP y los hará inútiles para las reacciones de polimerización de laDNA enzimática. Los stocks son diluidos a 10 mM, alicuotados y almacenados a -20 ºC.Es recomendado usar un stock de trabajo que contenga 1mM de cada dNTP.

La estabilidad de los dNTP durante ciclos repetidos de PCR es tal queaproximadamente el 50% permanece como dNTP después de 50 ciclos.

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Concentraciones entre 20 y 200 µM resultan en un balance óptimo entrerendimiento, especificidad y fidelidad. Los cuatro dNTP deben ser usados enconcentraciones equivalentes para minimizar errores de incorporación de bases. Se debedecidir la mas baja concentración adecuad de dNTP para la longitud y composición de lasecuencia blanco. Por ejemplo, 20 µM de cada dNTP en una reacción de 100 µl essuficiente para sintetizar 2.6 µg de DNA o 100 pM de una secuencia de 400 bp.

Primers

Los oligonucleótidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios que sevan a unir a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN.

La selección de oligonucleótidos iniciadores es muy importante en la reacción encadena de la polimerasa. De este paso depende el éxito en el laboratorio. En la tabla 1 semuestran los criterios principales a considerar para la selección adecuada de los primers.

Tabla 1. Criterios Principales

Tamaño Tamaño ideal: 20-25 nucleótidos de longitud generalmente: 18-30 nucleótidos de longitud

Base en el extremo 3' Debe ser una G o una C Temperaturas de fusión(Tm) 50-65 ºC

contenido GC 40-60%

auto-complementariedadDebe ser evitadaPara minimizar la formación de estructuras secundarias ylos dimeros de primer

Similaridad Debe tener un 100% de apareamiento con el molde

Cuando el objetivo a amplificar es un locus, la posición de los iniciadores debe serrelativa a los codones de inicio y terminación. Es recomendable que el cebador "forward"se encuentre mas o menos a 35 pb del inicio de la secuencia que codifica, de la mismaforma el cebador "reverse" debe localizarse 35 pb despues de la región que codifica.

Las concentraciones óptimas de los primers son generalmente entre 0.1 y 0.5 µM.Altas concentraciones de primer pueden promover “mispriming” y acumulación deproducto no específico y puede incrementar la probabilidad de generar un templadoindependiente llamado dímero de primer. Los productos no específicos y los dímeros deprimers son por si mismos sustratos para PCR y compiten con el producto deseado por laenzima, dNTPs y primers, resultando en un bajo rendimiento del producto deseado.

Los primers pueden contener extensiones en el extremo 5’ o “mismatches” paraincorporar sitios de enzimas de restricción, un codón de inicio ATG, o secuenciaspromotoras en la secuencia blanco. Pueden ser usados primers degenerados para extraergenes nuevos en base a su similitud o su secuencia de aminoácidos.

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Una razón menos obvia por la que los primers fallan es la presencia de estructurassecundarias en el templado de DNA. En este caso la substitución de dGTP por 7-deazo-2’-deoxiGTP ha sido muy usada

Especificidad

La especificidad de los primers es en parte dependiente de su longitud. Los primersdeben ser elegidos de modo que tengan una secuencia única dentro del DNA que seráamplificado. Un primer diseñado con una secuencia altamente repetida dará lugar aproductos no deseados. Sin embargo, el mismo primer puede dar una sola banda si seamplifica una sola clona de una biblioteca genómica.

Secuencias Complementarias del primer

Los primers necesitan ser diseñados con menos de 3 pares de bases de homologíaentre ellos. Si un primer tiene tal región de homología se formarán estructuras parciales dedoble cadena que interferirán con el alineamiento. Si la homología ocurre en el extremo 3'de cualquier primer, ocurrirá la formación de dímeros de primer que, a menudo, prevendrála formación del producto deseado por competición.

Contenido de G/C

La composición base de los primers debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. Lasecuencia de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de poliG o depoliC que pueden promover el reconocimiento no específico. Las regiones poliA y poliTdeben también ser evitados ya que interfieren con el complejo del primer-templado. Estopuede bajar la eficacia de la amplificación. El primer tendrá un contenido de G/C del 50% y~20 bases de largo. Esto pondrá la Tm en la gama de 56°C - 62°C.

Secuencia de los extremos 3'

Es establecido que la posición terminal 3' en primers de PCR es esencial para elcontrol del “mispriming”. La inclusión de un residuo de G o de C en el extremo 3' de losprimers ayuda a asegurar el correcto enlace en el extremo terminal 3' debido al enlace dehidrógeno más fuerte de los residuos G/C. También ayuda a mejorar la eficacia de lareacción reduciendo al mínimo la respiración que pudo ocurrir.

Temperatura de Asociación

La temperatura de asociación de los primers es uno de los factores másdeterminantes de la reacción. Se recomienda que se emplee como temperatura deasociación la temperatura de fusión -5ºC, aproximadamente. Existen muchos métodos paracalcular la temperatura de fusión, pero siempre, después de efectuado el cálculo esnecesario ir al laboratorio y ensayar con diferentes temperaturas de asociación cercanas a latemperatura de fusión para determinar la temperatura óptima para cada reacción.

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Cálculo de la temperatura de fusión (Tm)

Existen muchos métodos para estimar el valor de la temperatura de fusión.Para secuencias de 20 bp o menos, existe la siguiente aproximación:

Tm = 2ºC (A + T) + 4ºC (G + C)

donde se asume una concentración de sal de 0.9M, típica de "dot blot" y otros ensayos dehibridización

A continuación tenemos otra expresión para el cálculo de Tm

Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - 500/L + 16.6 log[M],

donde L se refiere a la longitud del oligonucleótido, y [M] es la concentración de cationesmonovalentes. Esta fórmulas es únicamente aplicable a secuencias polinucleotídicas largas.

El método mas preciso para estimar la Tm de oligornucleótidos está basado en elanálisis termodinámico del proceso de fusión del cual se puede mostrar que,

Los cambios en la entalpía ( ) y la entropía ( ) de la formación del dúplex secalculan a partir de parámetros termodinámicos de vecindades. R es la constante molar delos gases (1.987 cal.K-1mol-1), y C es la concentración molar del oligonucleótido. Sepuede adicionar un segundo término a la ecuación anterior para tener en cuenta el efectoestabilizante de la sal sobre el dúplex:

Los efectos de Na+ y K+ son equivalentes dentro de los márgenes del errorexperimental.

Programas de Diseño de Primers

Existen programas disponibles en la red que ayudan al diseño de primers. Porejemplo:

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

http://alces.med.umn.edu/rawprimer.html

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Templado

Una de las características más atractivas de la PCR es que la cantidad y calidad de lamuestra de DNA sujeta a amplificación no necesita ser alta. Una sola célula o un lisadocelular crudo o especimenes con una longitud promedio de unos pocos cientos de pares debases son usualmente adecuadas para una amplificación exitosa. El criterio esencial es quela muestra contenga al menos una cadena de DNA intacta que abarque la región que va aser amplificada y que las impurezas sean suficientemente diluidas como para no inhibir lapolimerización.

La polimerasa

Un rango de concentración recomendado para Taq polimerasa (Perkin-ElmerCETUR) es entre 1 y 2.5 unidades (SA = 20 unidades/pmol) por 100 µl de reaccióncuando los otros parámetros son óptimos. Sin embargo, los requerimientos de enzimapueden variar con respecto a la secuencia blanco o los primers. Cuando se optimiza unPCR, se recomienda probar rangos de concentración de enzima de 0.5 a 5 unidades/100 µl.Si la concentración de la enzima es muy alta se acumulan productos no específicos, y si esmuy baja se formara una cantidad insuficiente del producto deseado.

Tabla 2. Características de algunas polimerasas termoestables de DNA

Enzima EficienciaRelativaa

Tasa de errorb Procesividad c Tasa deExtensiónd

3’ a 5’exo

5’ a 3’exo

Taq Pol 88 2x10-4 55 75 no siTli Pol (Vent) 70 4x10-5 7 67 si noPfu Pol 60 7x10-7 n.d. n.d. si noRuth n.d. n.d. 30 60 no si

a Porcentaje de conversión de templado a producto por ciclo.b Frecuencia de error por pares de bases incorporadas. c Número promedio de nucleótidos adicionados antes de la disociación.d Número promedio de nucléotidos adicionados por segundo.n.d. = no determinado

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Concentración de Magnesio

Es benéfico optimizar la concentración del ión magnesio, ya que afecta: elalineamiento de los primers, la temperatura de disociación de las cadenas, tanto deltemplado como del producto de PCR, la especificidad del producto, la formación dedímeros de primer y la actividad y fidelidad de la enzima. La Taq polimerasa requieremagnesio libre en la unión con el templado, los primers y los dNTPs. Los PCR debencontener 0.5 a 2.5 mM de magnesio sobre el total de la concentración de dNTP. Lapresencia de EDTA u otros quelantes en el stock del primer o del templado puede alterar laconcentración óptima aparente de magnesio.

Otros componentes de la reacción

Un buffer recomendado para PCR es de 10-50 mM de Tris-HCl (pH entre 8.3 -8.8).Tris es un buffer iónico bipolar que tiene un pKa de 8.3 a 20ºC y un _ pKa de -0.021/ºC sinembargo el verdadero pH de una buffer 20mM de Tris (pH 8.3 a 20ºC) varia entre 7.8 y 6.8durante las condiciones típicas del termociclador.

Hasta 50 mM de KCl puede ser incluido en la mezcla de reacción para facilitar elalineamiento de los primers. NaCl a 50 mM o KCl arriba de 50 mM inhibe la actividad dela Taq polimerasa.

La gelatina o la albúmina bovina (100 µg/ml) y detergentes no iónicos como eltween 20 o laureth 12 (0.05 a 0.1% ) son incluidos para ayudar a estabilizar la enzima, sinembargo muchos protocolos trabajan bien sin estos componentes.

Parámetros de la reacción

Con la PCR se realiza in vitro el proceso de replicación del ADN. Está basado en laacción de la polimerasa, que como se sabe es la enzima que dirige la síntesis de ADN, ydesde una cadena simple de ADN sintetiza la complementaria. Para ello necesita al menosuna pequeña fracción de cadena doble de ADN para iniciar la síntesis. Esto hace posible, side forma voluntaria le proponemos una pequeña fracción de oligonucleótidos que seancomplementarios de una porción, se unirá después de la desnaturalización de la doblecadena y mediante el crecimiento hacia el extremo 3´ del DNA por aposición de losnucleótidos correspondientes suministrados y, a través de la acción de la polimerasa, sehace la amplificación del fragmento deseado.

La PCR es un proceso que consta de tres pasos.

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Desnaturalización.

La primera reacción consiste en la desnaturalización del DNA, separándose las doscadenas por ruptura de los enlaces de hidrógeno.

Las condiciones típicas de desnaturalización son 95ºC por 30 segundos, o 97ºC por15 segundos; sin embargo temperaturas más altas pueden ser apropiadas especialmente paratemplados ricos en G + C.

La desnaturalización incompleta permite el apareamiento de las hebras de DNA ypor lo tanto se reduce el rendimiento el producto. En contraste, los pasos dedesnaturalización a altas temperaturas o por mucho tiempo provocan perdida de la actividadde la enzima.

Alineamiento.

La segunda reacción consiste en la hibridación de los primers. Para ello se baja latemperatura y las condiciones serán tales que se facilitará la unión de los primers a lascadenas.

La temperatura y el tiempo requerido para el alineamiento de los primers dependede la composición, tamaño y concentración de los primers amplificadores. Unatemperatura de alineamiento óptima es 5ºC por debajo de la Tm de los primers. Debido aque las DNA polimerasas son activas en un amplio rango de temperaturas, la extensión delos primers puede ocurrir a bajas temperaturas incluyendo el paso de alineamiento. El rangode actividad de las enzimas varia en dos ordenes de magnitud entre 20 y 85ºC. Lastemperaturas de alineamiento en el rango de 55 a 72ºC genera buenos resultados.

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Extensión.

La tercera reacción se efectúa a 72º C, temperatura a la cual, la polimerasa lleva acabo su acción, insertando los diferentes nucleótidos complementarios en el orden que le vaindicando la cadena que actúa como molde.

El tiempo de extensión depende de la longitud y concentración de la secuenciablanco y de la temperatura. La extensión del primer se realiza tradicionalmente a 72ºC.Las estimaciones para la tasa de incorporación de nucleótidos a 2ºC varia de 35 a 100nucleótidos por segundo dependiendo del buffer, pH, concentración de sales y la naturalezadel templado. Un tiempo de extensión de un minuto es considerado suficiente paraproductos de hasta 2 kb de longitud. Sin embargo, tiempos mayores de extensión puedenser útiles cuando la concentración del sustrato es muy pequeña o cuando la concentracióndel producto excede la concentración de la enzima.

Número de ciclos.

Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo. La repetición de este ciclo unas 40veces, por ejemplo, permite obtener, como resultado de un experimento de amplificación,millones de copias del fragmento de interés.

El número óptimo de ciclos dependerá principalmente de la concentración inicialdel templado cuando los otros parámetros son optimizados. Un error común es el deejecutar demasiados ciclos, ya que esto puede incrementar la cantidad y complejidad deproductos no específicos. Pocos ciclos dan como resultado un bajo rendimiento delproducto.

La cantidad de DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR, según lodemostrado en la Tabla 3. Después de cada ciclo, la cantidad de DNA es dos veces laanterior, así que después de dos ciclos tenemos 2 x 2 veces, después de 3 ciclos - 2 x 2 x 2veces u 8 (23) veces la cantidad inicial, después de 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 veces o 16 (24).Así, después de N ciclos tendremos 2N.

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Tabla 3. Relación entre cantidad de DNA y el número de ciclos.

Termocicladores

El termociclador es el aparato que permite llevar a cabo de forma automática yreproducible la sucesión de ciclos de temperatura necesarios para la PCR.

Los primeros termocicladores eran robots que movían una gradilla de tubos entrevarios baños termostáticos a tiempos preestablecidos. Los actuales constan, básicamente, deun bloque de metal que puede ser calentado o enfriado, con posibilidad de programar lastemperaturas y los tiempos.

Existen multitud de termocicladores en el mercado, aunque las característicasprincipales son las siguientes:

• Constan de un bloque térmico, cuyo calentamiento y enfriamiento se produce a granvelocidad, gracias al denominado sistema Peltier. Las rampas de subida y bajada detemperatura son importantes para trasladar los protocolos entre termocicladores, y

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uno de los factores de falta de reproducibilidad, lo que hace que deban ajustarse denuevo las condiciones de tiempos y temperaturas.

Actualmente, están diseñados mayoritariamente para tubos de 0,2 ml aunque aún

existen también para 0,5 ml. Es importante el perfecto ajuste del tubo en el bloque. Por ello,se recomienda utilizar los de la misma marca que el fabricante.

El rango de temperaturas suele abarcar de 4ºC a 110ºC, aunque el rango habitualdebe ser de 15ºC a 95ºC. No debe sobrecargarse al aparato con temperaturas extremas paraprolongar su supervivencia. Los 4ºC se utilizan para refrigerar muestras tras una PCR, pero15ºC también es una temperatura apta para ello. Respecto a llegar a 100ºC o más, tampocoes aconsejable, al menos, de forma habitual. Es preferible emplear termobloques para llevara cabo esta labor.

Existen bloques que permiten ajustar distintas temperaturas en función de las zonasdel mismo. Se dice que tienen función gradiente. Son muy útiles cuando se realiza ajustecontinuo de programas de PCR, especialmente de temperaturas de hibridación, o cuando senecesitan realizar diversos protocolos de forma simultánea.

• Tapa térmica: los más antiguos no la poseen, pero es un elemento indispensablepara evitar la evaporación de la muestra, al contactar totalmente con la tapa deltubo.

• Software para programación de tiempos y temperaturas: se denomina programa acada conjunto de datos térmicos y temporales de un protocolo de PCR. Cadatermociclador tiene su propio software. Puede ajustarse también la velocidad desubida y bajada de temperaturas, es decir, las rampas.

Identificación de los productos de PCR

El hecho de que las moléculas de ADN obtenidas al finalizar la reacción en cadenacorrespondan efectivamente al fragmento de interés queda asegurado por la intervención delos primers que definen los extremos "derecho" e "izquierdo" de ese fragmento. Así, unavez que la reacción ha finalizado, el tamaño del fragmento multiplicado puede determinarsesometiendo los productos de la reacción a una electroforesis en gel de agarosa opoliacrilamida, es decir, a un proceso de separación por difusión bajo la acción de uncampo eléctrico.

Por otra parte, la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridación(unión complementaria) con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de basesesté contenida en el fragmento de interés. En este caso se procede así: el ADN fraccionadopor electroforesis es desnaturalizado y luego transferido a una membrana de nitrocelulosa onylon, que actúa como soporte sólido (Southern blot), y luego es puesto en contacto con lasonda, que se unirá al fragmento buscado ya que ha sido preparada de modo tal que resultaser complementaria del mismo. También es posible colocar el ADN directamente en lamembrana en forma de pequeñas manchas (dot blot) para su posterior hibridación con la

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sonda. La localización de las sondas radiactivas se logra, en ambos casos, medianteautorradiografías

Figura 1. Tres formas de analizar los fragmentos de ADN amplificados mediante la técnica PCR. A:visualización directa. Las muestras colocadas sobre un gel y sometidas a la acción de un campo eléctrico(electroforesis) migran de una manera característica que se puede visualizar por tinción (coloreado) del ADN.(Carriles 1-8: productos de distintas PCRs; carril M: marcadores de ADN de tamaño conocido.) B: Southernblot. El ADN es desnaturalizado (separación de sus hebras constituyentes) y transferido a una membrana denitrocelulosa o nylon para luego incubar la hibridación (unión) con una sonda radiactiva. Ésta quedará fijadadonde se encuentre el tramo de ADN de interés y su presencia se revelará a través de una autorradiografía(placa fotográfica sensible a la emisión radiactiva de la sonda). C: dot blot. Método análogo al anterior, peropracticado sobre una siembra en forma de manchas de los fragmentos de ADN a analizar previamentedesnaturalizados.

Una estrategia distinta para confirmar la identidad del fragmento replicado consisteen realizar dos reacciones de PCR consecutivas. Al finalizar la primera, una alícuota de lamisma es sometida nuevamente al proceso de multiplicación tras haber colocado dosprimers internos. Mediante el empleo de esta metodología, conocida como nested PCR(PCR anidada), la filiación de los fragmentos obtenidos queda confirmada por el hecho deque poseen tamaños previsibles.

En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que sonreconocidas por ciertas enzimas llamadas en endonucleasas de restricción. Ladeterminación del tamaño al que quedan reducidos los fragmentos al ser puestos encontacto con la enzima de restricción adecuada indica que nos encontramos ante lossegmentos de interés.

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RT PCR

Dado que el RNA usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, esnecesario hacer una transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR.La transcripción reversa genera una copia de la hebra de RNA, pero esta copia es DNAcomplementario (cDNA) el cual es estable al calor y puede resistir la metodología PCR.Los pasos de la RT-PCR son:

1. Transcripción reversa: Unión del primer a la secuencia de RNA objetivo.2. Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del primer mediante

la incorporación de nucleótidos complementarios.3. Fin de transcripción reversa, se obtiene la hebra del cDNA complementario al RNA.4. PCR.

El mRNA es copiado a cDNA por la transcriptasa reversa usando un primer dT (losprimers al azar se pueden también utilizar)(Figura 2). En PCR en tiempo real, se utilizageneralmente una transcriptasa reversa que tenga una actividad endo H. Esto elimina elmRNA permitiendo que la segunda hebra de DNA sea formada. Se adiciona una mezcla dePCR que incluya una polimerasa termoestable (tal como la Taq polimerasa), los primersespecíficos para el gen de interés, los deoxinucleótidos y un buffer conveniente.

Figura 2. Conversión de mRNA a cDNA por la transcriptasa reversa

El cDNA se desnaturaliza a mas de 90º (~94º), las dos hebras se separan. A 50 o 60ºlos primers específicos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. Los sitios deunión a los primers deben estar separados 400 bases, pero generalmente se encuentran a100 bases de distancia especialmente cuando se usa el PCR en tiempo real

A 72ª la polimerasa extiende el DNA desde los primers. Se obtienen 4 cadenas decDNA.

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Después de 30 o 40 ciclos de síntesis de cDNA, los productos de reacción sonanalizdos usualmente por electroforesis en gel de agarosa. El gel se tiñe con bromuro deetidio. Los geles de agarosa para analizar los productos de cDNA de la RT-PCR no nospermite la cuantificación ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una bandaes perceptible sobrepasa la etapa logarítmica de amplificación.

El bromuro de etidio es un colorante que se une a la doble cadena de DNAintercalandose entre los pares de bases. Emite luz fluorescente cuando se irradia en laparte UV del espectro. Sin embargo, la fluorescencia no es muy brillante. Otros colorantes,como el SYBR green, que son mucho más fluorescentes que el bromuro de etidio, seutilizan en el PCR en tiempo real (Figura 3).

Figura 3. El SYBR green fluoresce brillantemente solo cuando se une a DNA de doble cadena.

PCR EN TIEMPO REAL

La RT-PCR es solamente semicuantitativa en el mejor de los casos, en parte por lainsensibilidad del bromuro de etidio (sin embargo, hay maneras más sensibles de detectar elproducto). Los protocolos de PCR competitivos se han desarrollado para hacer el métodomás cuantitativo pero son a menudo complicados. Así la PCR en tiempo real fuedesarrollado debido a:

• La necesidad de cuantificar diferencias en la expresión del mRNA• La disponibilidad de cantidades pequeñas de mRNA en algunos procedimientos,

Hay una variedad de métodos para la cuantificación del mRNA.

Éstos incluyen:

− northern blotting− análisis de protección de ribonucleasa (RPA)− hibridación in situ− PCR

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La PCR es el método más sensible y puede discriminar entre mRNAs cercanamenterelacionados. Es una técnico simple pero es difícil conseguir resultados verdaderamentecuantitativos usando PCR convencional.

El northern blotting y RPAs son patrones excelentes, puesto que no hayamplificación implicada, mientras que la hibridación in situ es cualitativo más quecuantitativo.

Las técnicas tales como el northern blotting y los RPAs trabajan muy bien, perorequieren más RNA del que a veces se dispone. Los métodos de PCR son por lo tantoparticularmente valiosos cuando las cantidades de RNA son bajas, puesto que el hecho deque la PCR implica un paso amplificación significa que es más sensible. Sin embargo, laPCR tradicional es solamente semicuantitativa en parte debido a las dificultades deobservar la reacción durante la parte verdaderamente linear del proceso de la amplificación.

En contraste con la RT-PCR y el análisis de los geles de agarosa, la PCR en tiemporeal da resultados cuantitativos. Una ventaja adicional de la PCR en tiempo real es larelativa facilidad y conveniencia de su uso comparadas a algunos métodos más viejos.

Los productos de amplificación se observan a medida que transcurren los ciclos dela PCR.

Está basado en:

• la detección y cuantificación de un reportero fluorescente, cuya señal aumenta enproporción directa a la cantidad de producto de PCR en la reacción.

• el empleo de un termociclador que tiene acoplado un sistema de detección que escapaz de adquirir y cuantificar la señal emitida por el reportero al final de cada ciclopara cada muestra.

Técnicas de detección

La química de la detección está dada por:

• Agentes intercalantes fluorescentes (SYBR Green)• Sondas hidrolizadas• Hairpin probes (Molecular Beacons, Scorpions)• Sondas de hibridización.

SYBR greenTM

Es un agente intercalante que se une al ADN de doble cadena dando un incrementode la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad de producto de PCR.

Es simple y económico, fácil de usar, sensible, versátil y no se necesitan sondasespecíficas. Sin embargo durante la reacción de PCR puede unirse a dímeros de primers

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y a otros productos inespecíficos, resultando en una sobreestimación de la concentracióndel DNA blanco.

Hydrolysis probes (TaqManTM)

Se emplea una sonda que tiene unidos un fotocromo reportero y un fotocromoquencher. Cuando ambos fotocromos están unidos a la sonda, el reportero no emite señal.Pero, cuando la sonda hibrida con la secuencia de interés durante la reacción de PCR, laactividad exonucleasa de la Taq polimerasa corta al fotocromo reportero del resto de lasonda, permitiendo la emisión una señal fluorescente (Figura 4). Se monitorea la señalfluorescente del reportero que se va acumulando en los sucesivos ciclos de PCR.

Figura 4. Hydrolysis probes

Hairpin probes (Molecular BeaconsTM)

Estas sondas poseen secuencias repetidas invertidas (ITR) en sus extremos 5´y 3´.Este diseño permite que se forme una estructura de horquilla (hairpin) porcomplementariedad de las dos regiones ITR, en ausencia de la secuencia blanco.

La secuencia interna de la sonda es complementaria al blanco, dirigiendo así lahibridación específica, resultando en una eficiente separación del quencher y del reporteroy la consecuente emisión de este último (Figura 5).

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Figura 5. Funcionamiento de las Hairpin probes (Molecular BeaconsTM)

Entre sus ventajas están el que son más específicas que las sondas TaqMan (debentener un cambio conformacional para hibridar con el blanco), permiten distinguir dossecuencias blanco muy similares entre sí y que se pueden combinar varias MolecularBeacons en una única reacción empleando diferentes compuestos fluorescentes paraidentificar secuencias blanco específicas distintas (Múltiplex PCR).

Se requiere de un riguroso diseño de las regiones tallo y asa de la horquilla.

Hybridization probes

El diseño implica el uso de dos secuencias de oligonucleótidos específicos comosondas, cada una marcada con un fluoróforo diferente, comúnmente, el extremo 3´de lasonda donadora con fluoresceína y el extremo 5´de la sonda aceptor con LC Red 640 o LCRed 705 (Figura 6).

Las dos sondas están diseñadas para hibridar en sus blancos específicos en unarreglo cabeza-cola que permite que ambos fluoróforos estén en estrecha proximidadentre sí. Así, la transferencia de energía de resonancia sólo ocurre cuando ambas sondasse hibridan al blanco muy próximas entre sí, siendo la distancia óptima de 1 a 5 basesentre las sondas.

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Figura 6. Hybridization probes

En comparación con las otras dos técnicas, estas sondas están marcadas con unúnico fluorocromo. Esto hace que sean más fáciles de sintetizar y caracterizar, y que elcontrol de calidad sea más sencillo que para las sondas doblemente marcadas.

Scorpions

Los scorpions son primers de PCR con una cola tallo y asa ("Stem-Loop") quecontiene un fluoróforo y un quencher. La estructura de tallo y asa es separada de lasecuencia de del primer de PCR por una modificación química que evita que se copie lasecuencia de tallo y asa del scorpion (Figura 7).

Durante la PCR, los primers de scorpions se amplifican para formar productos dePCR. En la etapa apropiada del ciclo de PCR (la fase de alineamiento), la secuencia de lasonda en la cola del Scorpion se enrosca para hibridarse a la secuencia blanco en elproducto de PCR. Como la cola del scorpion y del producto de PCR es ahora parte de lamisma hebra de DNA, la interacción es intermolecular. La secuencia blanco se eligetípicamente para estar 3 bases dentro del extremo 3' del primer scorpion.

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Figura 7. Scorpions

Cuantificación

La capacidad de monitorear el progreso en tiempo real de la PCR revolucionótotalmente la manera de cuantificación basada en la PCR de DNA y de RNA. Lasreacciones son caracterizadas en el momento en el que la amplificación de un producto dePCR se detecta después de un número fijo de ciclos. Cuanto más alto es el número decopias del blanco, más pronto se observa el aumento significativo en la fluorescencia.

En la figura 8 se muestra un diagrama representativo de la amplificación. Undiagrama de amplificación es una gráfica de la señal de la fluorescencia contra el númerode ciclos. En los ciclos iniciales de PCR, hay un pequeño cambio en señal de fluorescencia.Esto define la línea de fondo para el diagrama de la amplificación. Un aumento enfluorescencia sobre la línea de fondo indica la detección del producto acumulado de PCR.

Figura 8. Diagrama de Amplificación

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Se adquieren los datos cuando la amplificación está todavía en la fase exponencial.Esto está determinado por la identificación del número de ciclo al cual la intensidad deemisión del fluoróforo aumenta con respecto al ruido de fondo (background). Este númerode ciclo se llama ciclo umbral (Ct: threshold cycle). El Ct está determinado en la faseexponencial de la reacción y es más confiable que las mediciones en el punto finalconvencionales (Figura 9). El Ct es inversamente proporcional al número de copias delDNA blanco: a mayor concentración de blanco, menor Ct medido.

Figura 9. Ciclo Umbral (Ct)

La gráfica del logaritmo del número inicial de copias del blanco para un sistema deestándares contra Ct es una línea recta (Figura 10). La cuantificación de la cantidad deblanco en muestras desconocidas es lograda midiendo Ct y usando la curva estándar paradeterminar el inicio del número de copias. El proceso entero de calcular los Cts, depreparar una curva estándar, y de la determinación del número de copias iniciales para lasmuestras es realizado por el software del sistema 5700 y 7700.

Figura 10. Curva Estándar

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La figura 11a muestra la amplificación, usando el sistema 5700, del gen humano dela β-actinia en diluciones de DNA genómico. En esta figura, el cambio en la fluorescenciadel SYBR Green se grafica contra el número de ciclos. Se corrieron seis réplicas para cadacantidad de DNA. La figura 11b muestra los mismos datos, pero graficando el logaritmodel cambio en la fluorescencia contra el número de ciclos. El software del sistema 5700calcula el Ct para cada reacción. Los valores de Ct se trazan contra el logaritmo de lacantidad inicial de DNA genómico para dar la curva estándar mostrada en la figura 11c

Figura 11. Amplificación de la β-actinia.

Estos tres diagramas ilustran los principios básicos de la cuantificación en tiemporeal de PCR. Cuanto más alta es la cantidad inicial de DNA genómico, mas pronto sedetecta el producto acumulado en el proceso de PCR, y más bajo es el valor de Ct. Losvalores de Ct son reproducibles en las réplicas porque el umbral se escoge en la faseexponencial de la PCR. Esto se demuestra en la figura 11b donde el umbral intersecta lagráfica de amplificación en la región donde hay una relación lineal entre el logaritmo delcambio en fluorescencia y el número del ciclo. En la fase exponencial, los componentes dela reacción no están limitados y las reacciones de replicación exhiben resultadosreproducibles y uniformes.

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Genes estándares

Un control interno consiste en utilizar un gen cuya expresión no cambie.

Un gen que puede ser usado como “loading control” (o estándar interno) debe tenervarias características:

• El gen estándar debe tener el mismo número de copias en todas las células.• Debe expresarse en todas las células• Un número de copias intermedio es ventajoso

Sin embargo, el estándar perfecto no existe, por tanto lo que se decida usar comoestándar o estándares debe ser validado para su muestra. Si es posible, se debe ser capazde demostrar que la expresión del estándar no cambia significativamente cuando lascélulas o tejidos son sujetos a las variables experimentales que se planean usar.

Estándares usados comúnmente:

• mRNA de Gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa• mRNA de Beta actina• mRNA de MHC I (complejo de mayor histocompatibilidad I)• mRNA de Ciclofilina• mRNAs para ciertas proteínas ribosomales. Por ejemplo RPLP0 (proteína ribosomal

larga, P0). También es conocida como 36B4, P0, L10E, RPPO, PRLP0, 60Sproteína ribosomal ácida P0, proteína ribosomal L10, Arbp o fosfoproteínaribosomal ácida P0.

• rRNAs 28S o 18S (RNAs ribosomales)

El efecto de limitar los reactivos

Los ciclos iniciales de PCR se caracterizan por un aumento exponencial en laamplificación del blanco. Si los componentes de la reacción llegan a ser limitantes, elíndice de la amplificación del blanco disminuye hasta que se alcanza una meseta y haypoco o nada de aumento neto en producto de PCR.

La detección de la fluorescencia de los sistemas 5700 y 7700 permite que el Ct seaobservado cuando la amplificación de PCR esta aún en la fase exponencial. Ésta es la razónprincipal por la que el Ct es una medida más confiable del número de copias que comienza,que una medida de la cantidad de producto acumulado en el punto final de la PCR.

Durante la fase exponencial, ninguno de los componentes de la reacción estálimitado, consecuentemente, los valores de Ct son muy reproducibles para las reaccionesque comienzan con el mismo número de copias. Esto conduce a una mayor precisión en lacuantificación del DNA y del RNA.

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Por otra parte, la cantidad de producto de PCR observada en el final de la reacciónes muy sensible a variaciones leves en los componentes de la reacción. Esto es porque lasmedidas en el punto final se hacen generalmente cuando la reacción esta más allá de la faseexponencial y una diferencia leve en un componente limitante puede tener un efectodrástico en la cantidad final de producto. Por ejemplo, las reacciones laterales, como laformación de dímeros de primer, pueden consumir los reactivos a diversos grados de tubo atubo. Así, es posible que una muestra que comienza con un número más alto de copiastermine con menos producto acumulado que una muestra que comienza con un númeromás bajo de copias. Las diferencias entre el punto final y la detección en tiempo real seilustran gráficamente en la figura 12, que demuestra la amplificación de 96 muestrasidénticas. El cambio total en la señal del reportero, en el ciclo 40, varía ampliamente entrelas réplicas (Figura 12a). Sin embargo, los diagramas de la amplificación son notablementesimilares entre los ciclos 22 y 25, durante los cuales se determinan los valores de Ct (Figura12b).

Figura 12. Diferencias entre el punto final y la detección en tiempo real

PCR competitivos cuantitativos

Para compensar los problemas con las medidas en el punto final, se han desarrolladouna variedad de técnicas de PCR competitivo cuantitativo. Se construye un ampliconcompetidor que contiene los mismos sitios de unión que el primer y tiene la mismaeficiencia de amplificación que el blanco, pero es de alguna manera distinguible delblanco. Una característica distinguible es hacer al blanco y los amplicones competidores dediferentes tamaños para poder utilizar la electroforesis en gel para discriminar los dosproductos.

Una cantidad conocida de competidor es colocada en la muestra, después el blancoy el competidor son amplificados en la misma reacción. Si la eficiencia de amplificacióndel blanco y del competidor es idéntica, el cociente del blanco y el competidor seguirásiendo constante a través del proceso de PCR. Así, determinando el cociente del blanco y

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del competidor en el final de la reacción y conociendo la cantidad inicial de competidoragregada, la cantidad de blanco puede ser calculada. PCR competitivo se ha utilizado conéxito para cuantificar DNA y RNA, pero su rango dinámica se limita a un cociente delblanco/competidor cercano de 1:10 a 10:1. La mayor exactitud es obtenida encontrando elpunto de equivalencia en el cual el cociente del blanco y el competidor es 1:1. Para lograresto, se deben probar varias diluciones para alcanzar un cociente conveniente.

Otra desventaja es la necesidad de construir y de caracterizar un diferentecompetidor para que cada blanco sea cuantificado. Además, se deben realizar estudioscuidadosos de la validación para verificar que las eficiencias de la amplificación del blancoy del competidor son iguales antes de que la cuantificación de muestras experimentalespueda comenzar. Incluso una diferencia leve en eficiencia compromete seriamente laexactitud de la cuantificación por PCR competitivo. En el final de la reacción, PCRcompetitivo requiere la cuantificación exacta de los amplicones del blanco y delcompetidor, que exige generalmente pasos de proceso laboriosos de post-PCR.

Máquinas para PCR en tiempo real

Hay muchas máquinas para PCR en tiempo real disponibles. El que se muestra enla figura 13 es el ICycler® de BioRad. La tapa se desliza para acomodar las muestras enuna placa de formato 96-pozos (96-well). Esto significa que podemos mirar varias muestrassimultáneamente. La máquina contiene una cámara fotográfica sensible que supervisa lafluorescencia en cada pozo de la placa en intervalos frecuentes durante la reacción de PCR.

Figura 13. ICycler® de BioRad

El sistema ABI PRISM 7700, de Applied Biosystems (antes, Perkin Elmer) se basaen el empleo de placas especiales, con tapas ópticas para su adaptación al lector defluorescencia. Cada pocillo tiene una forma similar a la de los tubos de 0,2 µL. Elfuncionamiento es semejante al de un termociclador convencional, en cuanto a tiempos ytemperaturas, aunque se ajusta y se controla desde un ordenador que posee el softwareespecífico. Se registran las emisiones de fluorescencia de forma continua, el software loconvierte posteriormente en una representación gráfica, y preestablece un valor de Ct quepuede ser modificado con posterioridad, en función del análisis del usuario (Figura 14).

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Figura14 .El software 7700 muestra una representación de una placa con 96 pozos, donde se puedenidentificar fácil y rápidamente los estándares y las muestras no conocidas. Después de una corrida de PCR elnúmero inicial de copias se muestra para cada muestra en el pozo.

El sistema LightCycler de Roche (Figura 15), se basa en el empleo de capilares devidrio para la contención de las muestras, y en un mecanismo de giro, similar a unacentrífuga, denominado carrusel. El calentamiento y el enfriamiento se llevan a cabomediante un sistema de aire. Todo ello tiene ventajas e inconvenientes. La principal ventajaes la rapidez, que permite obtener resultados, en muchos casos, en menos de 1 hora. Sinembargo, presenta un alto costo, ya que los capilares y otros materiales son específicos paraeste sistema, y bastante caros. Además, los protocolos de tiempos y temperaturas no sonintercambiables con otros sistemas de PCR cuantitativa, lo que requiere de nuevasoptimizaciones.

Figura 15. LightCycler de Roche

Ventajas del tiempo Real

La determinación de valores de Ct siguiendo la cinética en tiempo real de PCRelimina la necesidad de un competidor que debe de ser amplificado con el blanco. Lacuantificación se puede realizar por el método más básico que es preparar una curvaestándar y determinar cantidad desconocida por comparación con curva estándar.Comparado a las medidas del punto final, el uso de los valores de Ct también amplía lagama dinámica de la cuantificación porque los datos se colectan para cada ciclo de PCR.

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La PCR en tiempo real permite una amplificación confiable con alta especificidady sensibilidad. El producto de PCR se cuantifica en cada ciclo. Hay una alta correlaciónentre la señal (Ct) y la cantidad de blanco.

Con esta técnica se tiene alta precisión y exactitud. También hay la posibilidad dePCR múltiplex. No requiere de análisis posterior a la PCR (electroforesis,etc.). Esto reducela posibilidad de contaminación y elimina fuentes potenciales de error. Se puede realizar unmayor número de reacciones por día. El sistema a “tubo cerrado” sirve como control decontaminación. Existe un amplio rango de aplicación. El diseño de primers y sondas tieneque ser más exigente.

PRIMERS DEGENERADOS

Son primers que tienen un número de opciones en varias posiciones en la secuenciapara permitir el alineamiento y la amplificación de una variedad de secuenciasrelacionadas.

Por ejemplo:

5’-TCG AAT TCI CCY AAY TGR CCN T-3’

Y = pirimidinas = C / T (degeneración = 2X)R = purines = A / G (degeneración = 2X)I  = inosinas  = C / G / A / T N = nucléotido = C / G / A / T (degeneración = 4X)

Uso de los primers degenerados

Los primers degenerados se pueden utilizar:

• Para amplificar secuencias conservadas de un gen o de genes del genoma de unorganismo.

• Para conseguir la secuencia de nucleótido después de secuenciar algunosaminoácidos de una proteína de interés

Hay evidencia de regiones o motivos altamente conservados de aminoácidos que sepueden diseñar utilizando primers degeneradas; estas regiones pueden ser conservadas entreespecies. Las primers degeneradas se pueden utilizar para amplificar estas secuencias. Lassecuencias amplificadas de esta manera se pueden secuenciar para confirmar que lasecuencia esté correcta. Pueden entonces ser utilizadas como sondas para amplificar el gende interés de una biblioteca geonómica (procariótica) o de una biblioteca de DNA(eucariótica).

Cuando se ha aislado exitosamente una proteína de interés, el final de esta proteína(o algunos aminoácidos) pueden ser secuenciados. La secuencia del aminoácido se puede

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utilizar para diseñar primers degenerados. El producto de PCR puede ser secuenciado. Silos primers producen una secuencia truncada (del gen) o parcial, pueden ser utilizadascomo sondas.

Diseño de los primers degenerados

Alineación de la secuencia

Las secuencias de aminoácidos de proteínas similares u homólogas se puedenrecuperar de una base de datos tal como GenBank. Estas secuencias entonces se alinean.Por lo menos 2 bloques de aminoácidos conservados deben estar presentes para permitir eldiseño de los primers de PCR. Otra alineación se puede hacer en el nivel del nucleótido sise desea. Si una base se conserva a través de la alineación se puede suponer que esta baseparticular será la misma en el caso de interés. Los primers deben tener 20-30 nucléotidos delongitud. La alineación de la secuencia también dará el tamaño previsto del producto dePCR.

Información de la secuencia terminal de aminoácidos

Si estos datos están disponibles pueden ser utilizados como un punto de partida parael diseño de los primers.

Degeneración de primers

La degeneración de los primers depende de una multiplicidad de factoresincluyendo el templado. La degeneración se puede bajar con el uso de las inosinas parasustituir 4 bases “wobbles” en vez de usar las 4 substituciones de bases. Para conseguir ladegeneración, simplemente se multiplican todos los valores de la degeneraciónincorporados en la secuencia del primer. Otro factor que se toma en consideración es queconforme la degeneración de los primers aumenta, la concentración de un primer específicodisminuirá. Las substituciones de las bases son solamente las substituciones comunes,aunque se han utilizado otras opciones dependiendo de la secuencia

La Reacción de PCR

El cóctel de PCR

Una mezcla estándar del cóctel de PCR será un buen inicio. Sin embargo, unaexcepción se observa para las concentraciones de primers. Un aumento de la concentraciónpuede ser necesario para compensar la degeneración. Si los primers usados sonabsolutamente degeneradas, se pueden utilizar 50 pmoles como punto de partida yoptimizar a partir de ahí.

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Los ciclos de PCR (el termociclador)

Se requiere de mucha experimentación y optimización. Se comienza con lascondiciones estándar, después se procede optimizando la temperatura de alineamiento delprimer. Se comienza con 35 ciclos y se aumenta a 50 en caso de ser necesario. Se debeconsiderar la viabilidad de la po l imerasa para 50 c ic los .4-5 de los primeros ciclos de PCR se pueden correr con una temperatura de alineamiento5-10 o C más bajo que la temperatura de alineamiento para amplificar los primers conmúltiples “mismatches”.

Problemas Comunes

Algunos problemas que se pueden presentar cuando se utilizan primers degeneradosson:

• Inhibición competitiva debido a la alta degeneración del primer (los primers sealinean al DNA correcto pero no son extendidos por la polimerasa debido a losextremos 3 ' inestables dando como resultado que los primeros ciclos de PCR seanaltamente ineficaces. Esto puede ser superado aumentando ciclos de PCR outilizando 25-30 ciclos estándares seguidos por otra reacción de 30-35 ciclos usandoel primer producto como templado

• Concentración baja del primer específico debido a la alta degeneración, esto puedeser corregido fácilmente aumentando la concentración del primer

• La DNA polimerasa con actividad exonucleasa 3'-5’ no debe ser utilizada ya quedegradan los primers (la Taq polimerasa trabajará muy bien)

• Apareamiento falso o no específico debido a los primers altamente degenerados oal templado que contiene muchos sitios de alineamiento. Se puede intentar laoptimización de la temperatura del alineamiento o el reajuste de los primers

Secuenciación

Después de que la banda del tamaño previsto se haya extraído del gel de agarosa, elproducto se puede secuenciar o clonar directamente. Aunque los primers degenerados sepueden utilizar directamente para secuenciar, pueden dar lugar al apareamiento noespecífico dependiendo del templado. La secuenciación de los productos permite el uso delos sitios del primer situados generalmente en los flancos del vector. 

Controles

Si se amplifica un gen usando los primers diseñadas de un alineamiento esconveniente hacer un dot blot que consiste en un control positivo, DNA templado, algo degDNA relacionado y un gDNA distante para comprobar una posible contaminación. Estodebe ser hecho después de secuenciar y asegurar que se tiene la secuencia deseadahaciendo un búsqueda en la base de datos (por ejemplo. BLASTX).

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LONG PCR

Para llevar a cabo esta técnica de manera eficiente es necesario el uso de dospolimerasas: una polimerasa principal en la reacción que no tenga actividad deproofreading, y una polimerasa que posea una actividad exonuclease 3’-5’, que estépresente en una concentración más baja. La eficiencia disminuye drásticamente cuando seincorporan las bases incorrectas. La actividad exonucleasa 3’-5’ elimina estos errores enlas bases y hace que la reacción posterior proceda. Por lo tanto, la amplificación defragmentos largos de DNA puede llevarse a cabo (Figura 16).

Figura 16. Long PCR

Aspectos Generales

Al usar la PCR para amplificar fragmentos de más de 10 kbp es esencial lapreparación de muestras intactas (libre de mellas) y completamente purificadas con variospasos de extracción y purificación.

La concentración óptima de los primers está en un rango de 0.1 a 1.0 mM. En unaconcentración más baja que la óptima, el producto de la amplificación puede ser pobre. Porotra parte, en una concentración más alta, el alineamiento no específico pueden superar laamplificación del producto deseado. Las concentraciones del primer se pueden fijardependiendo de las características y las cantidades de DNA. Bajas concentraciones deprimer se recomiendan para DNA altamente complejo, tal como DNA genómico humano, opara altas concentraciones de DNA templado. Mientras que altas concentraciones seprefieren para templados de poca complejidad tales como DNA de plásmido, o paracantidades limitadas de DNA templado.

La concentración óptima del magnesio se puede afectar por las características ypropiedades de la mezcla de reacción, incluyendo concentraciones de dNTPs, de losprimers y los agentes quelantes que contenga el templado. El exceso de Mg2+ tiende acausar productos no específicos que se observan como un barrido de bandas en el gel,mientras que el Mg2+ escaso puede generar menos productos amplificados.

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Para establecer la concentración de enzima deben ser consideradas la cantidad o lacomplejidad del DNA templado y de la longitud del fragmento amplificado. Exceso de laenzima puede causar reacciones no específicas. La eficacia de la amplificación puede serdisminuida cuando la concentración de la enzima es baja.

El número óptimo de ciclos es alrededor 25 a 30 ciclos considerando la cantidad ola complejidad del DNA templado y la longitud de los fragmentos amplificados de la DNA.

Se recomiendan condiciones de desnaturalización de 20 segundos en 98°C o 30segundos en 94°C. Un tiempo de la desnaturalización demasiado corto o una temperaturademasiado baja puede causar una eficiencia pobre en la amplificación. Un tiempo de ladesnaturalización demasiado largo o una temperatura de la desnaturalización demasiadoalta puede no generar ningún producto identificable. La temperatura óptima dealineamiento experimental se determina en un rango de 45-68°C.

Programa genérico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600

• Inicial desnaturalizando a 94ºC durante 10-15 segundos.• Ciclos 1-15 94ºC 10 segundos, 68ºC por n minutos (15 veces)• Ciclos 16-30 94ºC, 10 segundos, 68ºC por n minutos +15 segundos/ciclo (15 veces)

Los 15 segundos por ciclo para los ciclos 16-30 puede ser necesaria para solamentefragmentos más largos (20 Kb).

Hot Start

Se puede utilizar el método de hot start para hacer una Long PCR. La reacción sedivide en dos partes: una fracción de templado/primer que es 3/4 o 4/5 del volumen de lareacción, y una fracción de la polimerasa que constituye el resto. Cada fracción contiene lamisma concentración de buffer. La fracción de la polimerasa contiene solamente lapolimerasa, el buffer y agua; el resto de los componentes se incluyen en la fracción detemplado/primer. Se pone la fracción de templado/primer en el tubo y se calienta en lamáquina de PCR a 94ºC por 10 segundos. para desnaturalizar. Después se agrega lafracción de la polimerasa durante el primer paso de alineamiento y extensión.

PCR in situ

La hibridación in situ (ISH) ha demostrado ser una herramienta molecular muyimportante en diagnóstico y la investigación y ha avanzado perceptiblemente el estudio dela estructura y de la expresión del gen a nivel de células individuales. Sin embargo, lautilidad de ISH es limitada por la sensibilidad de cerca de 20 copias del mRNA por lacélula, un obstáculo de la detección que pueda ahora ser superado gracias a las nuevastecnologías.

En años recientes, las estrategias para mejorar los límites de detección en estudiosde ISH han incluido protocolos que amplifican la detección de la señal, o incrementando lacantidad de sondas de hibridación usando cócteles del oligonucléotido o múltiples sondasde cRNA. Una tercera estrategia que emplea la PCR es la amplificación basada en las

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secuencias de nucleótidos del blanco. Esta estrategia fue desarrollada independientementepor varios laboratorios en 1980

Principios y métodos

Los aspectos importantes para la PCR in situ incluyen la fijación y lapermeabilización durante la preparación de la muestra, un mecanismo para ciclación y elmaterial celular en la solución o en laminillas de cristal

Antes de llevar a cabo la PCR in situ, las células o las muestras del tejido fino sonfijadas y permeabilizadas para preservar la morfología y permitir el acceso de los reactivosde PCR a las secuencias intracelulares que se quieren amplificar. La amplificación de PCRde las secuencias blanco se realiza después en las células intactas en tubos micro-Eppendorfo directamente en preparaciones citocentrifugadas o secciones del tejido fino en laminillasde cristal (Figura 17).

Figura 17. PCR in situ

Las células en la mezcla de reacción de PCR son termocicladas en tubos micro-Eppendorf usando cicladores convencionales de bloque. Después de la PCR las células soncitocentrifugadas sobre las laminillas de cristal con la visualización de los productosintracelulares de PCR por ISH o inmunohistoquímica. La PCR in situ en las laminillas decristal es realizada sobreponiendo las muestras con la mezcla de PCR debajo de una tiraque se sella con cera o aceite mineral para prevenir la evaporación de la mezcla dereacción. Un ciclo térmico se completa poniendo las laminillas de cristal sobre los bloquesde calentamiento de un termociclador convencional o diseñado especialmente o usandohornos que completan un ciclo térmico.

La detección de los productos de PCR intracelular se realiza por dos técnicasdiferentes:

1) Indirectamente por ISH con sondas específicas para el producto de PCR (PCR insitu indirecto)

2) Sin ISH con la detección directa de los nucleótidos etiquetados (digoxigenina-11-dUTP, fluoresceina-dUTP, 3H-CTP o biotina-16-dUTP) que se han incorporado enlos productos de PCR (PCR in situ directa)

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OTRAS VARIANTES DE LA PCR

Multiplex PCR

Es una PCR en la cual hay múltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie deproductos. Éstos pueden verse como múltiples bandas en un gel de azarosa. Se usafrecuentemente en diagnóstico médico. Ahorra templado, tiempo y gastos. Requiere unacuidadosa optimización

Nested PCR

Consiste en dos procesos de amplificación sucesivos, de forma que en la segundaPCR se utilizan unos primers contenidos en la secuencia amplificada en la primera reacción(Figura 18). Es decir, el producto de amplificación de la primera PCR es el molde de lasegunda. Se aplica cuando se quiere mejorar la sensibilidad y especificidad de la técnica,especialmente en el caso de muestras de baja calidad o con un pequeño númerode copias dela secuencia a amplificar.

A veces 1 ronda de PCR no da un producto único a partir de un templado complejo,apareciendo un barrido.

Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco másinternamente que los primeros. Se obtiene un producto único porque solo el fragmentocorrecto de ADN posee los sitios correctos de hibridización para el segundo par de primers.

Figura 18. Nested PCR

CLONACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR

Para conseguir una mayor eficiencia en varios usos del “downstream” (por ejemplo,la expresión de genes, la transcripción in vitro, secuenciación, preparación de sondasmarcadas para hibridización) los productos de PCR se clonan a menudo en vectoresapropiados (Figura 19).

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Figura 19. Clonación de productos de PCR

La clonación del DNA amplificado es a menudo un paso difícil en el análisis de losproductos de PCR. Para facilitar la clonación de los productos de PCR, se han desarrolladovarias técnicas.

Para elegir un método, se deben considerar varios factores, como el propósito de laclonación, el tipo de polimerasa usado, y la longitud del producto de PCR. Por ejemplo, sise utiliza una polimerasa con actividad de “proofreading” para un estudio mutagénesissitio-dirigido, la clonación en vectores con extremos romos (blunt end) puede serconveniente. Por otra parte, para la expresión de proteínas, un método que permita laclonación direccional es útil.

Clonación TA

La Taq polimerasa tiene una actividad transferasa terminal que agregapreferencialmente adenina a los extremos 3' de los productos de PCR. Los productos dePCR con esa extensión del adeninas en el extremo 3' se pueden clonar en un vector quecontiene timidinas 3' complementarias (clonación TA).

Los vectores T pueden ser hechos usando una enzima de restricción como la XcmI.Sin embargo, debido a que Xcm I tiene una secuencia de reconocimiento poco común, elsitio de restricción de Xcm I tiene que ser introducido por inserción de un oligonucleótidosintético en el sitio de clonación.

Alternativamente, los vectores T se pueden preparar por la adición enzimática de unsolo residuo de timidilato con la transferasa terminal y el ddTTP o la Taq polimerasa y eldTTP. Las polimerasas usadas para el método de clonación TA deben exhibir actividad detransferasa terminal y carecer de actividad exonucleasa 3'-5’. Además de la Taqpolimerasa, varias DNA polimerasas (por ejemplo, la Tth polimerasa) tienen estascaracterísticas y por lo tanto se pueden utilizar para la clonación TA.

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Clonación de extremos romos

Las DNA polimerasas con actividad exonucleasa 3'-5' remueve los nucleótidos malapareados de los extremos 3' del DNA de doble cadena y genera productos con extremosromos. Los productos de PCR generados por estas polimerasas se pueden clonar envectores con extremos romos.

Existen técnicas que permiten remover una sola extensión de nucleótidos de losproductos de PCR generados con la Taq polimerasa; estos productos de PCR se puedentambién clonar por la ligación de extremos romos en un vector conveniente.

Generalmente la clonación de extremos romos de los productos de PCR (o decualquier DNA) en plásmidos es menos eficiente que la clonación extremos cohesivos. Porlo tanto se ha desarrollado una variación más eficiente del método de clonación deextremos romos. En este método, una enzima de restricción poco común se agrega a lamezcla de ligación para linearizar cualquier vector ligado a sí mismo formado durante lareacción.

Clonación direccional a través de primers modificados.

Varios métodos de clonación requieren la modificación de los primers de PCR paramejorar la eficacia de la clonación y facilitar la clonación direccional de los productos dePCR.

Un método común para una clonación direccional eficiente es introducir sitios derestricción adicionales en el extremo 5' de cada uno de los primers. Mientras que procede laamplificación, estos primers se incorporan en el producto de PCR. Después de la PCR, elfragmento de DNA amplificado se digiere con la enzima de restricción apropiada y se ligaen un vector linearizado.

Algunas enzimas de restricción no pueden cortar en las secuencias localizadas cercade los extremos del DNA de doble cadena lineal. Además, puesto que la secuencia delproducto de PCR es a menudo desconocida, la enzima de restricción elegida podríapotencialmente reconocer y cortar los sitios dentro del producto.

Otro método que utiliza los primers modificados es la clonación con ligadura-independiente

En l a c lonac ión med iada po r l a u rac i l g l i cos i l a sa ,los extremos 5' de los primers de PCR son parcialmente complementarios a las secuenciasdel vector y contienen varios residuos de dUMP. La incorporación de estos primers durantela PCR da lugar a la colocación selectiva de los residuos de dUMP en el extremo 5' de losproductos de la amplificación. Después de que los residuos de dUMP sean quitados poruracil DNA glicosilasa, los lados apirimídicos que resultan son susceptibles a ser cortadospor las condiciones alcalinas. Los extremos 3' de una sola cadena que resultan se puedenentonces alinear a los extremos complementarios del vector y las moléculas quiméricas deDNA que resultan se transforman sin ligación in vitro.

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Un ejemplo de clonación direccional que no requiere primers especiales es laclonación direccional basada en la Exonucleasa III. Bajo condiciones controladas dereacción, la actividad exonucleasa 3'-5' de la Exonucleasa III se puede utilizar paradegradar el producto de PCR de los extremos 3' de ambas cadenas. El producto modificadode PCR que resulta se puede clonar fácilmente en un vector linearizado con las basescomplementarias.

Clonación de fragmentos largos de DNA

Usando mezclas de diversas polimerasas se ha podido amplificar blancos largos deDNA. Para la clonación de productos grandes de PCR (mayor de 10 KB) el uso de vectoresbasados en plásmidos es difícil porque la capacidad de clonación en vectores es limitada.

La clonación eficiente de fragmentos largos de DNA se puede alcanzar solamentecon vectores cosmidos y sistemas de empaquetado. Recientemente, un método basado encósmidos se ha desarrollado para clonar fragmentos de hasta 36 KB con alta eficiencia.

MUTAGÉNESIS POR PCR

Consiste en introducir cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) deADN.

Mutagénesis con PCR-extensión solapada

El método de extensión solapada (Figura 20) requiere 2 primers mutagénicos y otros2. Amplifica un fragmento 5´ y un fragmento 3´ que se solapan. Ambos portan la mutación.Se utilizan los productos en otra reacción para producir el ADN mutado de longitudcompleta.

Figura 20. Método de extensión solapada

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Mutagénesis sitio dirigida

La mutagénesis sitio-dirigida in vitro es una técnica invaluable para estudiar relacionesde la estructura-función de proteínas, la expresión del gen y la modificación del vector.Varios métodos de los métodos reportados requieren de DNA de una sola cadena comotemplado. La razón de esto, ha sido históricamente la necesidad de separar los filamentoscomplementarios para evitar el realineamiento. El uso de PCR en mutagénesis sitio-dirigidalogra la separación de las hebras usando un paso de desnaturalización que separa las hebrascomplementarias y permitiendo la polimerización eficiente de las primers de PCR. Losmétodos de PCR sitio-dirigidos permiten así que las mutaciones sitio-específicas seanincorporadas en cualquier plasmido de doble cadena.

El gen de interés es amplificado con una ADN polimerasa en condiciones donde lafidelidad transcripcional es baja y se introducen errores en las copias generadas. Dado quela mayoría de las mutaciones no son beneficiosas, dos mutaciones favorables se acumularánen el mismo gen, solamente con baja probabilidad y muchas mutaciones beneficiosas seránenmascaradas por las deletéreas. Para combinar varias mutaciones deseables, se utiliza unsegundo método, donde el conjunto de fragmentos de ADN generado por la PCR esdigerido por DNasa I, una enzima que corta en forma inespecífica, y se reensamblan lostrozos por PCR. En principio, cada mutación puede ser recombinada y propagadaindividual e independientemente de otras mutaciones. Este proceso se asemeja al “crossing-over” que tiene lugar en los cromosomas de los organismos vivientes.

Para introducir mutaciones solamente en una región particular de un gen, puedeutilizarse la mutagénesis en cassette por PCR. El fragmento de ADN conteniendo el puntomutado es recortado en dos sitios de restricción flanqueantes. Luego, un producto de PCR,que puede ligarse exactamente en estos sitios de restricción, se genera con un primerdegenerado. Este iniciador se sintetiza químicamente para llevar una mezcla al azar denucleótidos en uno o más codones y la proteína codificada lleva, por lo tanto, un conjuntode aminoácidos al azar, en esta posición particular. Desafortunadamente, un codóncompletamente formado al azar exhibirá una fuerte desviación hacia algunos aminoácidosque son codificados por más de un codón, por ejemplo, el aminoácido serina es codificadopor seis codones diferentes, mientras que triptofano está codificado por un solo codón),siendo también difícil evitar la incorporación de un codón de terminación. La solución aeste problema es usar trinucleótidos presintetizados (codones) para todos los 20aminoácidos como bloques de construcción para la síntesis de ADN de losoligonucleótidos, en lugar de utilizar los mononucleótidos convencionales. Estos bloquespueden ser mezclados en cualquier proporción y solamente se necesita agregar aquellostrinucleótidos que el investigador desea en esta posición en la secuencia proteica (Figura21).

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Figura 21. Estrategias para mutagénesis, con el fin de obtener las modificaciones localizadas o engenes enteros. En el panel (A) se muestra en forma esquemática el proceso de PCR “sujeto a error”, comouna estrategia para la distribución no dirigida de mutaciones en un gen de interés. Se muestran dos tipos demutaciones, las favorables (cuadrados) y las desfavorables (círculos). En ciclos sucesivos de PCR, seintroducen más mutaciones de cada tipo y, generalmente, las moléculas contendrán alguna de cualquier tipo.Así, el efecto benéfico de las mutaciones favorables puede ser opacado, completamente, por la presencia delas desfavorables. Una posible solución a este problema, se muestra en el panel (B) y se conoce como“mezclado de ADN”. El producto de PCR se corta en pequeños trozos, utilizando la enzima ADNasa I y sereensamblan, subsecuentemente, mediante PCR. Las mutaciones quedan, por lo tanto, cruzadas y los genescon el mayor número de mutaciones favorables pueden ser enriquecido por selección. El panel (C) muestra elprincipio de PCR utilizando un “primer degenerado”. Este “primer” o iniciador contiene una mezcla de todoslos cuatro posibles nucleótidos (abreviados en la letra N) en una posición determinada o, alternativamente,una mezcla de codones ensamblados a partir de trinucleótidos. Las proteínas sintetizadas a partir de este genllevarán, por lo tanto, un grupo “randomizado” de aminoácidos en esta posición.  

APLICACIONES ESPECIALES DE LA PCR

Durante los últimos años, la PCR se ha convertido en una herramienta importantepara analizar el genoma humano.

Además de generar cantidades grandes de templado para secuenciar, la PCR se hautilizado para el mapeo de cromosomas y para analizar cambios grandes y pequeños enestructura cromosómica. Por ejemplo, la PCR lo ha hecho posible:

• Usar las secuencias repetidas en el genoma como marcadores genéticos.• Genere sondas de hibridación específicas para cromosoma.• Estudiar la evolución de las secuencias de un gen y los efectos de variabilidad de la

secuencia en la función del cromosoma.• Amplificar e identificar las secuencias blanco in situ.

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BIBLIOGRAFÍA

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http://www.med.sc.edu:85/pcr/realtime-home.htm

http://www.espanol.pcrlinks.com/

http://folk.uio.no/kristban/realtime/pfaffl.pdf