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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
INSTITUTO SUPERIOR DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
EFECTO INHIBITORIO DEL XILITOL A DIFERENTES
CONCENTRACIONES SOBRE EL STREPTOCOCCUS MUTANS
AISLADO DE LA SALIVA DE NIÑOS (AS) DE 6 A 7 AÑOS DE LA
UNIDAD EDUCATIVA MUNICIPAL “SAN FRANCISCO DE
QUITO”: ESTUDIO IN VITRO.
Trabajo de Investigación presentado como requisito previo a la obtención del Título
de Especialista en Odontopediatría.
AUTOR: Corina del Roció Orellana García
TUTOR: Dr. Fernando Aguilera Zurita
Quito, julio 2016
ii
AUTORIZACIÓN DEL AUTOR PARA PUBLICACIÓN
DERECHOS DE AUTOR
Yo Corina del Roció Orellana García en calidad de autor del trabajo de
investigación: “Efecto inhibitorio del xilitol a diferentes concentraciones sobre el
Streptococcus mutans, aislado de la saliva de niños (as) de 6 a 7 años de la
Unidad Educativa Municipal “San Francisco de Quito”: estudio in vitro” autorizo
a la Universidad Central del Ecuador a hacer uso del contenido total o parcial
que me pertenece, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponde, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido
en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad
Intelectual y su Reglamento.
También autorizo a la Universidad Central del Ecuador realizar la digitalización
y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación
Superior.
_____________________
Orellana García Corina del Roció
C. I.: 1715939391
iii
iv
v
DEDICATORIA
Corina del Roció Orellana García
Dedico esta tesis a Dios, por haberme dado la vida y
permitirme culminar esta meta.
A mi madre Clarita por ser el pilar más importante en mi
vida, por su amor, su dedicación y ayuda incondicional.
A mi padre Ángel por su ejemplo, por su apoyo, su lucha
constante y su cariño.
A mi esposo y a mis amados hijos Ángel y Carolina el
regalo más grande que Dios me ha dado, por ser la razón
de mi superación diaria y mi alegría.
A mi hermana por su ayuda constante durante todo
este trabajo, y a mis queridos sobrinos por su alegría
diaria.
vi
AGRADECIMIENTO
Corina del Roció Orellana García
A todos los doctores y maestros del posgrado de
Odontopediatría de la Universidad Central del
Ecuador que con sus conocimientos, han sabido
formarme como profesional.
A mi tutor el Señor Doctor Fernando Aguilera y a la
MSc. Alejandra Cabrera, por su ayuda, dedicación y
sabiduría.
Al personal que trabaja en el Laboratorio de
microbiología del INSPI-Q, Dr. Jorge Reyes Jefe de
la red de resistencia a los antimicrobianos; Bq.
Clínica Carolina Satán Técnica de laboratorio; y al
Msc. Eduardo Villacis Jefe de Bacteriología, por sus
conocimientos, apoyo, paciencia y trabajo.
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
AUTORIZACION DEL AUTOR………………………………………….…... ii
APROBACIÓN DEL TUTOR………………………………………………….. iii
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL…………………………………………….. iv
DEDICATORIA……………………………………………………………….. v
AGRADECIMIENTO………………………………………………………….. vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS…………………………………………………... vii
LISTA DE FIGURAS………………………………………………………… ix
LISTA DE TABLAS……………………………………………………………
LISTA DE GRÁFICOS……………………………………………………….
LISTA DE ANEXOS………………………………………………………….
x
xi
xii
RESUMEN……………..……………………………………………………… xiii
ABSTRACT……………………………………………………………………. xiv
1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………...... 1
2. REVISIÓN DE LA LITERATURA…………………………….………….. 2
2.1 CARIES DENTAL……………………………………………………... 3
2.2STREPTOCOCCUS MUTANS…………………………………………
2.3. XILITOL………………………………………………………………..
2.3.1. PROPIEDADES DEL XILITOL…………………….……………..
2.3.2. EFECTOS ADVERSOS DEL XILITOL.……………………..…....
2.3.3. ESTUDIOS REALIZADOS CON EL XILITOL…………………..
2.3.4. METODOLOGIA UTILIZADA EN DIVERSOS ESTUDIOS……
2.4 ESPECTROFOTÓMETRO…………………………………………….
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………………………………...
4. OBJETIVOS………………………………………………………………..
3
4
5
6
6
8
10
11
12
a. OBJETIVO GENERAL………………………………………………… 12
b. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ………………………………………
5. HIPÓTESIS…………………………………………………………………
12
13
6. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………….. 14
7. METODOLOGÍA ……………………………………………………… 15
a. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ………………………………. 15
b. POBLACIÓN DE ESTUDIO Y MUESTRA ………………………. 15
viii
c. CRITERIOS DE INCLUSIÓN, EXCLUSIÓN Y ELIMINACION……
d. DEFINICIÓN OPERACIONAL DE LAS VARIABLES……………...
16
16
VARIABLES INDEPENDIENTES…………………………………….. 16
VARIABLE DEPENDIENTE…….…………………………………….. 17
e. ESTANDARIZACIÓN……………………..………………………… 17
f. MANEJO Y MÉTODO DE RECOLECCIÓN DE DATOS…………... 18
g. ASPECTOS BIOÉTICOS……………………………………………...
h. ANÁLISIS ESTADÍSTICO…………………………………………….
33
34
8. RESULTADOS……………………………………………………………... 35
9. DISCUSIÓN………………………………………………………………… 44
10. CONCLUSIONES………………………………………………………….. 47
BIBLIOGRAFÍA ………………………………………………………………. 48
ANEXOS……………………………………………………………………….. 54
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura No. 1. Socialización de la investigación con el personal de salud.................... 18
Figura No. 2. Reunión con los padres de familia de los niños de la muestra .............. 19
Figura No. 3. Preparación del agar Mitis Salivarius (AMS) ........................................ 20
Figura No. 4. Esterilización a 121ºC durante 15 minutos ............................................ 21
Figura No. 5. Colocación del medio en las Cajas Petri ................................................ 21
Figura No. 6. Preparación del caldo cerebro-corazón (BHI) + Glicerol ................... 22
Figura No. 7. Colocación del BHI + Glicerol en los tubos .......................................... 23
Figura No. 8. Toma de muestras de saliva de los niños (as) ........................................ 24
Figura No. 9. Muestra de saliva recolectada ................................................................ 24
Figura No. 10. Transporte de las muestras en un cooler ................................................ 25
Figura No. 11. Rotulado del medio ................................................................................ 26
Figura No. 12. Medios rotulados para cada una de las muestras ................................... 26
Figura No. 13. Absorción de 1ml de saliva con la pipeta. ............................................. 26
Figura No. 14. Siembra de un 1ml de saliva en el Agar Mitis Salivarius
Enriquecido. ........................................................................................... 27
Figura No. 15. Siembra de un 1ml de saliva en el Agar Mitis Salivarius
enriquecido. ............................................................................................ 27
Figura No. 16. Incubación de las muestras en una atmósfera de CO2 a 37º C,
durante 48 horas ..................................................................................... 27
Figura No. 17. Colonias de S. mutans ............................................................................ 28
Figura No. 18. Preservación del S. mutans en (BHI+GLICEROL) ............................... 29
Figura No. 19. Solución de xilitol de 30,43% o 2M ...................................................... 29
Figura No. 20. Colocación del S. mutans ....................................................................... 30
Figura No. 21. Colocación de la Solución de Xilitol ..................................................... 31
Figura No. 22. Mezcla de 3 ml de crecimiento bacteriano ............................................ 31
Figura No. 23. Mediciones de la absorbancia con el espectrofotómetro
Eppendorf BioPhotometer® D30 .......................................................... 32
Figura No. 24. Observación a simple vista del grado de turbidez en diferentes
porcentajes de xilitol .............................................................................. 32
x
LISTA DE TABLAS
Tabla No.1. Fórmula para la preparación de 1 litro de medio de cultivo .................. 20
Tabla No.2. Preparación del caldo cerebro-corazón (BHI) + Glicerol ...................... 22
Tabla No.3. Tabla de procedimiento ......................................................................... 30
Tabla No.4. Valor medio y desviacion estándar del índice de absorvancia por
grupo a las 24 horas de exposición ........................................................ 35
Tabla No.5. Valor medio y desviación estándar del índice de absorbancia por
grupo a las 48 horas de exposicion. ....................................................... 37
Tabla No.6. Resultado de la prueba de Kruskal Wallis. ............................................ 38
Tabla No.7. Resultado de la prueba U Mann Whitney. ............................................. 39
Tabla No.8. Comparacion del valor medio del indice de absorbancia por grupo
a las 24 y 48 horas de exposición .......................................................... 40
Tabla No.9. Reduccion en porcentaje ......................................................................... 42
xi
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico No.1. Media del índice de absorbancia por grupo a las 24 horas de
exposición …………………………..……………...………....36
Gráfico No.2. Media del índice de absorbancia por grupo a las 48 horas de
Exposición………………………………………………………37
Gráfico No.3. Media del índice de absorbancia por grupo…………….………41
Gráfico No.4. Gráfico 1 Relación de la concentración de Xilitol con el índice
medio de absorbancia a las 24 h y 48 h………………….....…...42
xii
LISTA DE ANEXOS
Anexo N° 1. Formulario de Consentimiento Informado y Explicativo 55
Anexo N° 2 Permiso de la Unidad Educativa Municipal “San Francisco de Quito” 57
Anexo N° 3 Manejo y eliminación de muestras. 58
Anexo N°4 Normas del Manual de Bioseguridad en el Laboratorio de la
Organización Mundial de la Salud (Organización Mundial de la salud, 2005)
65
Anexo N°5 Resultado de Análisis Microbiológico del tema de investigación. 72
xiii
TEMA: “Efecto inhibitorio del xilitol a diferentes concentraciones sobre el
streptococcus mutans, aislado de la saliva de niños (as) de 6 a 7 años de la
Unidad Educativa Municipal “San Francisco de Quito”: estudio in vitro”
Autor: Corina del Roció Orellana García
Tutor: Fernando Nelson Aguilera Zurita
RESUMEN
Objetivo: Evaluar cual es el mejor efecto inhibitorio del xilitol en diferentes
concentraciones y en dos períodos de tiempo de exposición, sobre
Streptococcus mutans aislado de la saliva de niños de 6 a 7 años.
Metodología: Fueron recolectadas muestras de saliva de los niños; se sembró
1 ml de la muestra en Agar Mitis Salivarius enriquecido (Bacitracina, Telurito y
Sacarosa), se incubaron a una atmósfera de CO2 a 37ºC durante 48 horas. La
identificación del S. mutans se realizó con pruebas de confirmación (Tinción
GRAM, catalasa, manitol y sorbitol), las cepas fueron almacenadas en el caldo
de preservación BHI más Glicerol a 80 ºC. Para las diferentes concentraciones
de xilitol, se preparó una solución disolviendo 30,43g de xilitol en 100 ml de
agua destilada, se esterilizó en autoclave a 121°C durante 15min, las muestras
se sembraron en el xilitol a distintas concentraciones, obteniéndose los
siguientes grupos: G1: Xilitol al 0,1%, G2: Xilitol al 0,5%, G3: Xilitol al 1%, G4:
Xilitol al 5%, G5: Xilitol al 12%, G6: Xilitol al 18%, se incubó a 37ºC en
condiciones de anaerobiosis, realizándose mediciones de la densidad óptica a
las 24 y 48 horas con el espectrofotómetro Eppendorf BioPhotometer® D30 con
filtro de 600nm. Los datos obtenidos fueron analizados mediante Kruskal
Wallis, U Mann Whitney y Wilcoxon, con un nivel de significancia del 5%.
Resultados: El xilitol mostró efecto inhibitorio en todas las concentraciones
p(<0,05) a las 24 horas, con excepción del 12% p=0,008 y el 18 % p=0,13 a las
48 horas.
Conclusion: Todas las concentraciones mostraron efecto inhibitorio sobre el S.
mutans, mientras que en concentraciones mayores al 5% no se observó
diferencia entre 24 y 48 horas.
PALABRAS CLAVE: INHIBICIÓN/ ABSORBANCIA/ CONCENTRACIÓN/
XILITOL/ STREPTOCOCCUS MUTANS/ IN VITRO.
xiv
TITLE: “Inhibitory effect of the Xylitol to different concentrations on the
Streptococcus mutans, isolated from the saliva of children aged 6 to 7
years of the Municipal Education Unit “San Francisco of Quito ": Study in
vitro" .
Autor: Corina del Roció Orellana García
Tutor: Fernando Nelson Aguilera Zurita
ABSTRACT
Objective: To evaluate which is the best inhibitory effect of the xylitol in
different concentrations and in two periods of exposure time, on Streptococcus
mutans isolated from the children’ saliva aged 6 to 7 years.
Methodology: samples of saliva of children were collected; 1 ml of the sample
in Agar Mitis Salivarius enriched (Bacitracin, Tellurite and sucrose) was sowed,
It was incubated to an atmosphere of CO2 to 37 ° C during 48 hours. The
identification of the S. mutans was performed by assertion tests (GRAM
staining, catalase, mannitol and sorbitol), the strains were stored in the broth of
preservation BHI plus glycerol to 80 ° C. For the different xylitol concentrations,
a solution dissolving 30, 43 g of xylitol in 100 ml of distilled water was prepared,
Is was sterilized in autoclave at 121 ° C during 15 min, the samples was sowed
in the Xylitol to different concentrations, obtaining the following groups: G1:
Xylitol to 0.1%, G2: Xylitol to 0.5%, G3: Xylitol to 1%, G4: Xylitol to 5%, G5:
Xylitol to 12% G6: Xylitol to 18%, incubated at 37 ° C in anaerobic conditions,
measurements of the optical density at 24 and 48 hours with the
spectrophotometer Eppendorf BioPhotometer® D30 with 600nm filter was
performing. The data obtained were analyzed using Kruskal Wallis, U Mann
Whitney and Wilcoxon, with a level of significance of 5%.
Results: Xylitol showed inhibitory effect at all concentrations p (<0,05) after 24
hours, with the exception of 12% p = 0, 008, and 18% p = 0, 13 after 48 hours.
Conclusion: all concentrations showed inhibitory effect on S. mutans, while no
difference between 24 and 48 hours was observed at concentrations above 5%.
KEYWORDS: INHIBITION / ABSORBANCE / CONCENTRATION / XYLITOL /
STREPTOCOCCUS MUTANS / IN VITRO.
1
1. INTRODUCCIÓN
En el Ecuador según los resultados obtenidos en el Estudio Epidemiológico
de Salud Bucal en escolares menores de 15 años realizado en el 2009, se
ha mostrado una alta prevalencia de caries en niños, el promedio de ceod
en niños de 6 años fue de 79,4% y de 13,5% a los 12 años, de estos un
14,8% presentó dolor e infección, lo que demuestra la necesidad de buscar
medidas preventivas que reduzcan el riesgo de caries infantil. (1), (2), (3),
(4), (5), (6). Pérez et al., 2002 (7), mencionaron que un 10% de niños a los
6 años presentaron uno de sus molares con un daño importante y el 0,67 %
ya han perdido uno de ellos.
El Streptococcus (S) mutans es el principal agente etiológico de la caries
dental, metaboliza los carbohidratos como la sacarosa, glucosa, fructosa,
manitol, produciendo ácidos como el láctico, propiónico y fórmico, que
desmineralizan el esmalte causando la caries dental, se ha demostrado
que al estar asociado a otros microorganismos como el S. sobrinos y el
Bacilo Scardovia Wiggsiae aumentan el riesgo de caries de la primera
infancia hasta en un 44% (7), (8), (9), (10), (11).
En los últimos 38 años con motivos preventivos se han comparado los
edulcorantes artificiales, entre ellos el xilitol un edulcorante artificial
formado por un alcohol de azúcar de 5 carbonos, el mismo que ha
disminuido hasta en un 60 % la incidencia de caries dental (12) (13).
Existen varios estudios que hablan sobre la eficacia del xilitol, a partir del
5% como las investigaciones realizadas por Radmerikhi S et al., 2013 (14),
quienes miden la densidad óptica mediante el espectrofotómetro en cepas
liofilizadas de S. mutans concluyendo que el 5% de Xilitol reduce el número
de S. mutans, estos resultados concuerdan con los obtenidos por Marttinen
et al., 2012 (15).
Por lo cual, el propósito de esta investigación es evaluar el efecto inhibitorio
del xilitol en diferentes concentraciones y en dos períodos diferentes de
tiempo de exposición, sobre el crecimiento del S. mutans aislado de la
saliva de niños de 6 a 7 años.
2
2. REVISIÓN DE LA LITERATURA
2.1. CARIES DENTAL
De acuerdo con la hipótesis de la placa ecológica, la caries es la
consecuencia de cambios en el balance natural de la microflora presente
en la placa bacteriana, causados por alteraciones en las condiciones
ambientales y locales en la cavidad bucal (4).
El S. mutans es considerado como uno de los colonizadores principales en
el proceso de la caries dental, y al estar asociado con otros
microorganismos como el S. sobrinus se potencializa su efecto cariogénico
(4), (9), (10), (15)
El mecanismo de colonización de microorganismos en la cavidad bucal, es
una situación casi imposible de predecir, en el recién nacido la cavidad
bucal es estéril y a las pocas horas es colonizada por microorganismos
facultativos y aeróbicos, pudiendo observarse colonias de Streptococcus,
estafilococos y lactobacilos. (16).
Según Wanq et al., 2005 (16), y Omobolaji et al., 2014 (17), existe una
correlación entre la colonización del S. mutans y la caries dental; siendo
proporcional el número de S. mutans con el número de caries, la dieta y la
edad de los niños (18),(19), (20).
Al ser la caries dental una enfermedad multifactorial, esta no solo debe ser
tratada desde un punto de vista restaurador sino también preventivo,
tomando en cuenta que es la enfermedad con mayor prevalencia en la
niñez a nivel mundial. (21), (22).
En Odontopediatría la prevención da mucha importancia a la reducción del
consumo de azúcares, siendo esto muy difícil de lograr, por lo que se
aconseja el uso de edulcorantes entre ellos el xilitol, el cual inhibe el
crecimiento y metabolismo de varias bacterias bucales como el S. mutans.
(23), (24).
3
En la actualidad Sun Y et al., 2016 (23), investigan la fabricación de una
vacuna que bloquee la adhesión del S. mutans a glucoproteínas salivales
evitando la formación de biofilm y de esta manera se protegerá al diente de
la caries. (25), (26).
2.2. STREPTOCOCCUS MUTANS
S. mutans es un coco Gram positivo, no móvil, dispuesto en cadena,
catalasa negativo, capaz de cambiar el pH bucal de 7 a 4.2 en
aproximadamente 24 horas, se lo ha subclasificado por sus propiedades
inmunológicas, genéticas y biológicas en los serotipos: c, e, f y k, siendo el
serotipo c el predominante en la cavidad bucal. (27), (28), (29), (30), (21).
Los factores de virulencia del S. mutans responsable de su cariogenicidad
incluyen la capacidad de adherirse a superficies lisas y propiedades
acidogénicos-acidúricas, que provocan la desmineralización rápida de las
piezas dentarias mediante la producción de ácidos. (31).
Los S. mutans no poseen las enzimas para el metabolismo de xilitol–5
fosfato (compuesto formado por la fosforilación del xilitol dentro de la célula
bacteriana) produciéndose la acumulación de este compuesto tóxico en su
interior, lo que provoca una inhibición en su crecimiento, disminuyendo su
tiempo de supervivencia y evitando la formación de ácidos (12).
Investigaciones han señalado que los edulcorantes no calóricos inhiben el
crecimiento del S. mutans, este es la razón por lo que se utilizan en la
prevención de la caries dental, el xilitol un edulcorante no calórico ha
demostrado ser eficaz en la reducción de la incidencia de la caries, en la
estabilización de las cavidades ya formadas y la remineralización de los
dientes. (12), (13).
Ha sido investigado y utilizado en diversas presentaciones, para evaluar su
eficacia como agente preventivo de caries especialmente en estudios
realizados en poblaciones infantiles tanto en vivo como in vitro y es
4
utilizado para la fabricación de diferentes productos de higiene bucal como
pastas dentales, enjuagues bucales, gasas de limpieza, y chicles.(13), (21).
2.3. XILITOL
El xilitol es un derivado hidrogenado de la xilosa, fue descrito por primera
vez en 1980, está presente en pequeñas cantidades en frutas, hortalizas,
cereales y en el metabolismo de los mamíferos, puede ser fabricado a
partir del árbol del abedul, residuos del maíz, tamarindo, caña de azúcar,
etc. (15), (32).
La fabricación de este edulcorante no calórico se produce por hidrolisis de
la hemicelulosa, de esta se consigue xilosa, que por hidrogenación
catalítica se obtiene el xilitol (33).
Existen una variedad de cepas de levadura que presentan potencial para la
producción del xilitol, entre estas tenemos que las levaduras nativas del
genero Cándida son los microorganismos que presentaron mayor
capacidad para metabolizar la xilosa (34).
A este edulcorante se lo describen como un alcohol de azúcar de 5
carbonos con muchas propiedades beneficiosas para la salud, pudiendo
ser utilizado principalmente como edulcorante artificial con menos de dos
tercios de las calorías de la mayoría de los azúcares (12) (32), (35).
Es seguro para el organismo, tolerado por diabéticos, y es beneficioso
para la salud humana pudiendo ser utilizado en medicina para el
tratamiento o la prevención de enfermedades y su principal aplicación es
en la salud oral (12), (28).
La sensibilidad del S. mutans al xilitol es variable esto dependerá del tipo
de cepa utilizada en el estudio, el xilitol tiene dos mecanismos inhibitorios:
una inhibición directa de las enzimas glucolíticas por xilitol 5 fosfato
derivado del xilitol y la inhibición indirecta de absorción de azúcar a través
de la competencia por el donante de fosforilo, HPr-P, entre la glucosa y
5
xilitol Miyasawa et al,. 2006 (36), Hoshino et al., 2004 (37) mencionaron
que no todas las especies bacterianas presentan el mismo potencial
cariogénico, y que la presencia de más de una de las especies de S.
mutans aumenta el riesgo de desarrollar caries.
2.3.1. PROPIEDADES DEL XILITOL
El xilitol tiene diversas propiedades: es un edulcorante nutritivo de
poder endulzante semejante a la sacarosa, está clasificado dentro de
los polioles, entre los cuales también encontramos al sorbitol, maltitol, y
manitol. (38).
Al disolverse en la boca produce un enfriamiento debido a su elevado
calor de disolución de -23,37 KJ/mol que si lo comparamos con la
sacarosa este es de 6,21 KJ/mol esto es lo produce una sensación de
frescura. (33).
Su metabolismo no incrementa los niveles de azucares en sangre por
lo que ha sido utilizado en alimentos para diabéticos, al tener
características de hidrato de carbono se metaboliza como tal pero en
forma más lenta que otros azúcares, produciendo un número menor de
calorías. (35).
La acción antimicrobiana del xilitol, para actuar como un agente anti-
caries probablemente se debe a su capacidad de ser transportado al
interior de las bacterias, inhibiendo la fermentación, ya sea por el
agotamiento en la célula del fosfato de alta energía o por
envenenamiento del sistema glucolítico, no pudiendo ser metabolizado
por las bacterias produciendo su muerte. (13), (39), (40), (41).
6
2.3.2. EFECTOS ADVERSOS DEL XILITOL
Pero no todos los experimentos revelan sus efectos altamente
positivos también podemos identificar estudios que mencionan algunos
aparentes efectos adversos del xilitol: como por ejemplo en la
investigación realizada por Seki et al., 2011 (42), en niños de 3-4 años,
quienes consumieron goma de mascar durante 12 meses, se observó
que más del 10% de los niños presentaron diarrea (43)
Y de igual manera Badui S, 1999 (35) menciona en su libro que la
toxicidad del xilitol sólo se presenta cuando se consume en exceso,
produciendo efectos laxantes y diuréticos, y su dosis letal media ha
sido investigada en ratones siendo de 25.7g/Kg de peso.
Sin embargo ElSalhy et al., 2012 (18) mencionaron en su estudio
realizado en 50 niños de entre 10-12 años que el enjuague con xilitol al
20% durante 4 semanas, no produjo diarrea o cualquier otro trastorno
abdominal.
No obstante, a pesar de los efectos adversos que podrían presentarse
en los niños si se consume en exceso durante el empleo del xilitol, este
continua siendo uno de los edulcorantes más utilizados en la actualidad
por sus efectos inhibitorios sobre el crecimiento no solo de bacterias de
la cavidad bucal si no también con otras bacterias patógenas.
2.3.3. ESTUDIOS REALIZADOS CON EL XILITOL
En algunas investigaciones se ha analizado la efectividad del xilitol
como agente anti-caries en diferentes productos como pastas dentales,
enjuagues bucales, caramelos y chicles, mencionando su gran efecto
refrescante en la boca, produciendo un aumento en el flujo salival, lo
que favorece la limpieza y protección de los dientes, disminuyendo la
placa bacteriana e inhibiendo el crecimiento de bacterias asociadas con
la caries dental (32).
7
El mecanismo de acción es inhibir el crecimiento bacteriano,
principalmente de Streptococcus mutans en la saliva y en la biopelícula
además de mejorar el flujo salival, evitar la inflamación gingival,
disminuir el efecto adherente de microorganismos e impedir la
desmineralización del esmalte, ya que reduce la producción de ácidos,
(38), (39).
El xilitol inhibe el crecimiento y metabolismo de varias especies de
bacterias, pero entre las bacterias bucales el S. Mutans, parece ser el
objetivo principal del xilitol, esto ha sido demostrado en diversos
estudios en los que se han utilizado diferentes concentraciones de
xilitol. (24).
El S. mutans fue sometido a un 6% de xilitol lo que produjo una
inhibición en su crecimiento del 50%, posterior a esto (44), (45) en otra
investigación se concluyó que el 0,1% de xilitol, podía inhibir al S.
mutans in vivo y Radmerikhi et al., 2013 (45), en su estudio realizado
en cepas liofilizadas de S. mutans mencionan que el consumo del 5%
(0.15g) de Xilitol redujo el número de S. mutans, coincidiendo con los
resultados obtenidos por Marttinen et al, 2012 (46).
Honkala, et al., 2006 (14), concluyen en su estudio realizado en 105
estudiantes a los cuales les administraron caramelos con xilitol tres
veces al día por 18 meses, que el xilitol tiene un fuerte efecto
remineralizador y preventivo de caries.
Nakai et al., 2010 (47) realizaron un estudio en 107 mujeres
embarazadas quienes masticaron goma de mascar con xilitol durante
13 meses, desde el sexto mes de embarazo, concluyendo que los
niños del grupo de control adquirieron 8.8 meses antes S. mutans,
siendo más propensos a la caries que aquellos cuyas madres
recibieron xilitol.
Seki et al., 2011(42) comprobaron que el uso de la goma de mascar
con xilitol es eficaz para disminuir el número de S. mutans en la placa
bacteriana en niños pequeños.
8
Zhan et al., 2012 (48) realizaron un estudio con 44 madres con caries
activa y sus hijos de entre 6 - 36 meses de edad, los niños fueron
seleccionados al azar a la utilización de toallitas de limpieza bucal con
xilitol 4.2g y sin xilitol, se concluyó que el uso diario de toallitas con
xilitol redujo significativamente la presencia de caries en niños
pequeños, siendo un complemento útil para controlar las caries en los
bebés.
ElSalhy et al., 2012 (18) demostraron que el uso de un enjuague bucal
con xilitol al 20% redujo significativamente el número de S. mutans en
la saliva en el 76 % de los niños.
Cobos et al., 2013 (49) realizó un estudio en 40 dientes temporales sin
caries y próximos a exfoliar que fueron sometidos a un enjuague con
Xilitol al 1% durante 60 días, observando un efecto remineralizante
sobre la superficie y subsuperficie del esmalte.
Portilla et al., 2010 (40), realizó un estudio en alumnos voluntarios de la
facultad de odontología de la UNAM, que dejaron el cepillado durante 7
días y utilizaron goma de mascar con xilitol, se concluye que el empleo
del xilitol en goma de mascar, disminuyó los sitios de sangrado gingival
al sondeo y redujo la placa bacteriana, mencionando que la goma de
mascar con xilitol es un auxiliar en la prevención de caries, lo que
coincide con los resultados obtenidos por Velásquez y Narváez., 2013
(50) en su estudio realizado en 15 adolescentes chilenos en los cuales
también se observó un aumento del flujo salival y la capacidad buffer
de la saliva.
2.3.4. METODOLOGÍA UTILIZADA EN DIVERSOS ESTUDIOS
En los estudios in vitro se han empleado varios métodos para medir la
inhibición bacteriana en presencia de distintas sustancias
especialmente en la búsqueda de nuevos antimicrobianos. (49).
9
Es así que en odontología se ha utilizado en investigaciones in vitro
distintas metodologías, que han permitido observar el efecto inhibitorio
de diversas sustancias sobre microorganismos presentes en cavidad
bucal, como se observa en el estudio de Yates y Duane, 2015 (51)
quienes evalúan diferentes estudios publicados desde el año 2000 al
2012, en los cuales se han empleado diferentes medios de cultivo de
acuerdo a la metodología planteada y a los resultados que se desearon
obtener.
Por otra parte podemos identificar a los investigadores de la República
de Corea, Lee et al., 2012 (52) quienes miden la inhibición del S.
mutans por medio de un lector de placas de ELISA a 660 nm, el cual
evaluó la densidad óptica inicial del medio BHI con 4% de xilitol
después de 24 h. Encontrándose una reducción en la densidad óptica
en presencia del xilitol al 4%.
Schegel H, 1997(53), describe que la inhibición en el crecimiento
bacteriano puede efectuarse por medio de diferentes sustancias
químicas, provocándose un crecimiento lento o una destrucción a nivel
bacteriano, dándose así el efecto bacteriostático o bactericida.
El espectrofotómetro fue utilizado en la investigación realizada por
Marttinen et al., 2012 (46) en el cual cepas de S. mutans resistente y
sensible al xilitol fueron sometidas a xilitol al 5%; a las 8 y 24 horas se
realizaron recuento de S. mutans sensible incubado en el medio de
cultivo BHI y se observó una disminución del 10% en la densidad óptica
a las 8 horas sin embargo no hubo cambios a las 24 horas.
Otros investigadores como Bahador et al., 2012(54) efectúan un conteo
de las unidades formadoras de colonias de S. mutans utilizando
muestras de saliva sembradas en el medio de cultivo Agar Mitis
Salivarius valinomicina (MS-MUTV) inicial y posterior al consumo de
chicles con un 70% de xilitol, obteniendo como resultado una
disminución del 73% de colonias de S. mutans; Tulsani et al., 2014 (55)
utilizan el mismo método de conteo de unidades formadoras de colonia
10
de S. mutans en un medio de cultivo diferente el Agar Mitis salivarius
Bacitracina aislando la saliva de 100 niños de 8-11 años a los 15 min y
1 hora posterior a la masticación de un chicle con xilitol al 15%,
observándose una reducción significativa en el número de S. mutans.
Emamieh et al., 2015 (56) quienes eligieron a 60 jóvenes de 20-25
años, los cuales masticaron gomas de mascar con xilitol al 55,36 % y
Recaldent 10% CPP-ACP, 3 veces al día, 20 min por 3 semanas, se
tomaron muestras de saliva no estimulada antes y después del
período, se realizaron el recuento de las colonias de S mutans en Agar
Mitis Salivarius en base a su morfología y con la ayuda de un
microscopio electrónico, obteniendo una reducción en el número de S.
mutans.
2.4. ESPECTROFOTÓMETRO
El espectrofotómetro determinará la densidad de bacterias a través de
la medición de la turbiedad del medio de cultivo siendo la absorbancia
directamente proporcional a la concentración, en la actualidad los
equipos de laboratorio transforman mediante cálculo matemático la
transmitancia en valores de absorbancia, para iniciar las mediciones en
el espectrofotómetro se debe utilizar un blanco que en el caso de este
estudio es el medio con el xilitol en diferentes concentraciones sin la
bacteria (57).
11
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El xilitol ha sido ampliamente investigado en la reducción de caries dental,
sin embargo existen pocos estudios sobre la concentración ideal del xilitol,
en la prevención de la caries dental. (12), (13), (28), (46).
Se han realizado estudios en los que se empleo goma de mascar con
xilitol o sorbitol y se evidencia como resultado una disminución significativa
del 26% al 37% en la incidencia de caries en escolares. (21), (58). La
sustitución del azúcar con edulcorantes artificiales es una herramienta
importante en la reducción de la caries dental, que debe ser utilizada para
mejorar los programas de prevención de caries. (45), (59).
Söderling, et al., 1989 (44) utiliza el espectrofotómetro en su estudio in vitro
en el cual S. mutans fue expuesto a un 6% de xilitol produciendo una
inhibición del 50%, posterior a esto Söderling, et al., 2008 (24) en su
investigación con cepas liofilizadas y tres aislados clínicos concluyeron que
concentraciones del 0,1% de xilitol, podría inhibir al S. mutans.
Radmerikhi et al., 2013 (14), miden la densidad óptica mediante el
espectrofotómetro en cepas liofilizadas de S. mutans concluyendo que el
5% (0.15g) de Xilitol reduce el número de S. mutans, estos resultados
concuerdan con los obtenidos por Marttinen et al., 2012 (15).
Por lo tanto se formula el siguiente problema de investigación:
¿Cuáles serán las concentraciones de xilitol que produzcan un efecto
inhibitorio y que porcentaje de inhibición producirán a las 24 y 48 horas,
sobre el crecimiento del Streptococcus mutans, aislado de la saliva de
niños (as) de 6 a 7 años?
12
4. OBJETIVOS
a. OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto inhibitorio del xilitol en diferentes concentraciones y en
dos períodos diferentes de tiempo de exposición, sobre el crecimiento
del Streptococcus mutans aislado de la saliva de niños de 6 a 7 años.
b. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
i. Determinar desde que concentración se observa un efecto inhibitorio
sobre S. mutans a las 24 horas.
ii. Determinar desde que concentración se observa un efecto inhibitorio
sobre S. mutans a las 48 horas.
iii. Establecer en que concentraciones se tiene el mayor efecto inhibitorio a
las 24 horas.
iv. Establecer en que concentraciones se tiene el mayor efecto inhibitorio a
las 48 horas.
v. Comparar cual fue el mejor efecto inhibitorio a las 24 y 48 horas
13
5. HIPÓTESIS
H1. A mayor concentración del xilitol mayor efecto inhibitorio en el crecimiento
de S. mutans
H0. A mayor concentración del xilitol no se muestra un mayor efecto inhibitorio
en la reducción de S. mutans
.
14
6. JUSTIFICACIÓN
Existe una alta prevalencia de caries en la población infantil en el Ecuador,
según las Estadística de causas de morbilidad por consulta externa 2013 -
2014 del MSP del Ecuador del total de pacientes atendidos el 91,49 %
corresponde atenciones en niños; de los cuales el 12,63% son niños de 1
a 4 años, un 57,79% niños de 5-9 años y un 21,07% niños de 10-14 años.
(41), (60).
Estudios clínicos que compararon la cariogenicidad del xilitol con la
fructosa y sacarosa, muestran una disminución notable de la caries dental,
por lo que sugieren que el uso de xilitol en madres embarazadas retarda la
transmisión del Streptococcus mutans a sus hijos, reduce o previenen la
caída del pH, incrementa el flujo y la capacidad buffer de la saliva, y al
mismo tiempo disminuye la cantidad de Streptococcus mutans. (61), (62).
Se ha demostrado en investigaciones que el Xilitol al 5% es eficaz para
inhibir el crecimiento del S. mutans, sin embargo existen pocos trabajos no
siendo concluyentes si a menores concentraciones de xilitol encontraremos
un efecto preventivo contra la caries dental. (15), (46).
Los estudios no nos proporcionan claridad sobre las concentraciones en
las cuales el xilitol actúa con un mayor efecto inhibitorio, estudios in vivo
utilizan productos con diferentes porcentajes de xilitol; ElSalhy et al., 2012
(18) observo el efecto de un enjuague bucal con 20% de xilitol, sobre S
mutans, encontrándose una reducción significativa en el recuento de S.
mutans en saliva, Zhan et al., 2012 (18), utiliza el xilitol al 20% en toallitas
para limpiar los dientes en niños pequeños, reduciendo el número de S.
mutans, Emamieh et al., 2015 (56), utilizo gomas de mascar con xilitol al
40% en estudiantes universitarios observando una reducción en el número
de S. mutans en saliva.
Por lo cual se hace relevante la presente investigación para saber cuál es
la menor concentración de xilitol que tiene un efecto inhibitorio sobre S.
mutans.
15
7. METODOLOGÍA
a) DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
Esta es una investigación de tipo experimental, en la cual se manipulo de
manera intencional las variables independientes para observar y medir el efecto
provocado sobre la variable dependiente.
Este estudio se realizó in vitro en el Laboratorio de Microbiología del Instituto
Nacional de Investigación en Salud Pública (INSPI), donde se evaluó la
inhibición del crecimiento del Streptococcus mutans, ante un agente inhibidor
las soluciones de xilitol en diferentes concentraciones durante 24 y 48 horas.
b) POBLACIÓN DE ESTUDIO Y MUESTRA
POBLACIÓN:
Esta investigación se realizo en la Unidad Educativa Municipal “San Francisco
de Quito”, ubicada en la parroquia rural de Guayllabamba perteneciente al
cantón Quito en la provincia de Pichincha, de la cual se eligió el segmento
etario formado por niños/as de 6 y 7 años.
La Unidad Educativa fue creada en 1961 como “San Francisco de Quito”, y en
el año 1.962 como resultado de un compromiso entre las autoridades civiles y
eclesiásticas de la zona y el Municipio de Quito, toma el nombre definitivo de
“San Francisco de Quito”, desde entonces viene sirviendo a la comunidad, para
lo cual ha ido incrementando su cobertura.
TAMAÑO DE MUESTRA: Se utilizo el muestreo por conveniencia para lo cual
se seleccionaron 30 niñas/os que cumplieron con los criterios de inclusión, que
tenía como único requisito, el “consentimiento firmado” de sus padres y el
asentimiento de los niños. De las 30 muestras de saliva de acuerdo al protocolo
de investigación se establecieron 630 probetas de análisis, considerando 6
concentraciones de xilitol a más de la concentración inicial y a su vez dos
tiempos de exposición.
16
c) CRITERIOS DE INCLUSIÓN, Y EXCLUSIÓN
CRITERIOS DE INCLUSIÓN
Niños de 6 a 7 años que aceptaron participar en el estudio y cuyos
padres firmaron la recolección de la saliva de sus hijos. (Anexo 1)
CRITERIOS DE EXCLUSIÓN
Niños (as) con enfermedades sistémicas, que estén en tratamiento
médico o tomando algún tipo de medicación.
CRITERIOS DE ELIMINACIÓN
Muestras que hayan sido contaminadas
d) DEFINICIÓN OPERACIONAL DE LAS VARIABLES
CONCEPTUALIZACIÓN DE LAS VARIABLES
VARIABLES INDEPENDIENTES
Concentraciones de Xilitol
En esta investigación se utilizo el edulcorante no calórico xilitol en
diferentes concentraciones (G1: Xilitol al 0,1%, G2: Xilitol al 0,5%, G3:
Xilitol al 1%, G4: Xilitol al 5%, G5: Xilitol al 12%, G6: Xilitol al 18%) como
un inhibidor del crecimiento del S. mutans debido a su efecto
bacteriostático, que ejerce al degradar la célula, sus vacuolas
intracelulares entre otros daños a la célula bacteriana (13).
Tiempo de exposición
Entendiendo en este estudio él tiempo de exposición como el periodo
que transcurre desde que el S. mutans es sometido a diferentes
concentraciones de xilitol hasta la medición de la absorbancia con el
espectrofotómetro siendo este periodo de 24 y 48 horas.
17
VARIABLE DEPENDIENTE
Inhibición del Streptococcus Mutans aislado de la saliva de
niños(as).
Entendiéndose en este estudio que la inhibición del crecimiento del
Streptococcus mutans, está en directa asociación a una disminución en
la absorbancia inicial medida con el espectrofotómetro, esto se dio por
efecto de por lo menos dos factores independientes: las diferentes
concentraciones de xilitol y el tiempo de exposición del S. Mutans al
xilitol.
La definición anterior se reafirma en el estudio realizado Portilla et al.,
2010 (40), en el cual se confirma que, el xilitol inhibe el crecimiento y
metabolismo del S. Mutans.
e) ESTANDARIZACIÓN
Se realizó pruebas de validez de los equipos, instrumentos, medios y
metodología a emplearse en el estudio.
Previo al estudio se realizó una prueba piloto con cinco muestras de
saliva de los niños (as) de la Escuela Municipal San Francisco de Quito,
y se comprobó en el laboratorio de microbiología la correcta técnica
descrita en la metodología, a ser ejecutada en el Instituto Nacional de
Investigación en Salud Pública (INSPI-Q), de acuerdo a los protocolos
existentes, y con el personal especializado: Dr. Jorge Reyes Jefe de la
red de resistencia a los antimicrobianos, Bq. Clínica Carolina Satán
Técnica de laboratorio, Msc. Eduardo Villacis Jefe de Bacteriología.
Las muestras se efectuaron por triplicado y cada muestra fue sometida
al xilitol en sus seis concentraciones y a la lectura de valores iniciales
con el Espectrofotómetro y en los dos periodos de tiempo de 24 y 48
horas.
18
f) MANEJO Y MÉTODO DE RECOLECCIÓN DE DATOS
Autorización para la ejecución de la investigación.
Lo primero que se realizó fue una reunión con el rector de la Unidad
Educativa Municipal “San Francisco de Quito”, para darle a conocer la
investigación que se llevaría a cabo y se obtuvo la autorización para su
ejecución (Anexo nº 2). Después de eso se socializó la investigación con
las autoridades del centro médico (Figura N° 1) de mencionada escuela
y con las maestras de los niños participantes en el estudio.
Figura No. 1. Socialización de la investigación con el personal de salud.
Consentimiento informado
Se solicitó a las autoridades de la Unidad Educativa Municipal “San
Francisco de Quito”, una reunión con los padres de familia de los niños
(as) de 6 a 7 años, de los segundos años de educación básica y se
envió en el cuaderno de tareas la convocatoria de reunión con la fecha y
hora establecidas, y de acuerdo a la conveniencia del horario ˳de los
padre (07:00am) para lograr la mayor asistencia, y se especificó el traer
copia de cédula del representante del niño
19
En la reunión (Figura No 2) se informó a los padres de familia de que se
trataba la investigación y se solicito la autorización por medio del
consentimiento informado (Anexo1), para la participación del niño en la
investigación. Además, se aplicaron los criterios de exclusión; niños (as)
con enfermedades sistémicas, que estén en tratamiento médico o
tomando algún tipo de medicación.
Figura No. 2. Reunión con los padres de familia de los niños de la muestra
Una vez que se obtuvo el consentimiento informado de los padres de los
niños (as) que constituyen la población de la investigación, se procedió a
seleccionar la muestra.
Finalmente se solicitó a las maestras de los niños (as) permiso un día en la
mañana (07:00am) para la recolección de la muestra.
Preparación Agar Mitis Salivarius mas Bacitracina, Telurito y sacarosa.
Para la preparación del Agar Mitis Salivarius (AMS) se utilizó la presentación
comercial del agar BD DIFCOTM Mitis Salivarius Agar Lot: 5033694
20
Se partió disolviendo la solución en 1000 ml de agua destilada (Figura N° 3)
y se esterilizó a 121ºC durante 15 minutos (Figuro N° 4), posterior a ello, se
añadió 1ml de solución de Bacitracina con una concentración de 200U/ul,
además se agregó solución de telurito de potasio al 1%.
Con el objeto de que el medio sea más selectivo se agregó 150 g de
sacarosa. La validez del medio se comprobó mediante el uso de la cepa de
S. mutans ATCC 25175.
En la tabla 1 se puede observar que todos los volúmenes presentados están
ajustados para la preparación de 1 Litro de Agar Mitis Salivarius.
Tabla No.1. Fórmula para la preparación de 1 litro de medio de cultivo
Componente Peso (g)
Agar Mitis Salivarius 90g
Sacarosa 150g
Solución Volumen (ul)
Bacitracina (200U/ul) 1000
Telurito de potasio 1% 1000
Figura No. 3. Preparación del agar Mitis Salivarius (AMS)
21
Figura No. 4. Esterilización a 121ºC durante 15 minutos
Una vez preparado el medio se colocó en cajas Petri como podemos
observar en la Figura No 5.
Figura No. 5. Colocación del medio en las Cajas Petri
22
Almacenamiento de las cepas de S. mutans aislado de la saliva.
Para la preparación del medio de preservación del S. mutans se utilizó caldo
cerebro-corazón (BHI) (Figura No 6), y se le adicionó el glicerol con una
concentración final del 20%, siguiendo la fórmula de la Tabla N°2:
Tabla No.2. Preparación del caldo cerebro-corazón (BHI) + Glicerol
Componente Peso (g)
Agar cerebro- corazón (BHI) 80g
Solución Volumen (ml)
Glicerol 20ml
Figura No. 6. Preparación del caldo cerebro-corazón (BHI) + Glicerol
El medio de preservación se colocó en tubos de ensayo para la siembra de
las cepas de S. mutans aislados de los niños (Figura No 7).
23
Figura No. 7. Colocación del BHI + Glicerol en los tubos de ensayo
Recolección de la Muestra de Saliva
De acuerdo a la fecha señalada por el Instituto Nacional de Investigación en
Salud Pública (INSPI-Q) se envió en la agenda de tareas de los niños, una
esquela de información para los padres con las indicaciones para la toma de
muestras de saliva de los niños (as), con la siguiente información.
El niño debe acudir a la escuela en ayunas, sin previo cepillado, ni enjuague
bucal.
Se dio estas indicaciones debido a que se obtiene un mayor número de
microorganismos en la mañana antes del cepillado dental. (15).
Se entrego a los niños un refrigerio luego de la recolección de la muestra de
saliva.
Para la recolección de la muestra de saliva se acudió a la escuela a las
06h30 am correctamente uniformada y con el equipo de bioseguridad
(gorra, mascarilla, guantes, mandil) para iniciar la jornada a las 7h00am.
24
Se recolectó aproximadamente 2 ml de muestra de saliva no estimulada en
frascos estériles (Figura N° 8-9) para esto se utilizó todos los medios de
bioseguridad y el sillón odontológico del centro médico de la escuela.
Se recolectó aproximadamente 2ml debido a que se necesitaba tan solo 1ml
para poder realizar la siembra de saliva en el laboratorio, las muestras
recolectadas se colocaron en un cooler para ser transportadas hasta los
laboratorios de microbiología del INSPI-Q.(66).
Figura No. 8. Toma de muestras de saliva de los niños (as)
Figura No. 9. Muestra de saliva recolectada
25
Para el embalaje, se comprobó que el frasco se encuentre bien cerrado
(Figura N°10), y las muestra fueron envueltas en material absorbente (63),
su transporte se realizó a temperatura ambiental hasta un rango de tiempo
de 4±1h.
El análisis microbiológico fue realizado personal técnico del INSPI-Q: Dr.
Reyes Jorge Jefe de la red de resistencia a los antimicrobianos, Bq. Clínica
Carolina Satán Técnica de laboratorio, Msc. Eduardo Villacis Jefe de
Bacteriología.
Figura No. 10. Transporte de las muestras en un cooler
Aislamiento del Streptococcus mutans
Una vez receptadas las muestras de saliva en el laboratorio de microbiología
del INSPI-Q, se procedió a la rotulación de las cajas Petri de acuerdo al
número de muestra (Figuras N°11-12)
Con una pipeta se sembró 1ml de la muestra de saliva en Agar Mitis
Salivarius enriquecido (Bacitracina + Telurito.+ Sacarosa) (Figuras N°13-14-
15).
Luego se incubaron las muestras en una atmósfera de CO2 a 37º C, durante
48 horas. (Figura N°16)
26
Figura No. 11. Rotulado del medio
Figura No. 12. Medios rotulados para cada una de las muestras
Figura No. 13. Absorción de 1ml de saliva con la pipeta.
27
Figura No. 14. Siembra de un 1ml de saliva en el Agar Mitis Salivarius Enriquecido.
Figura No. 15. Siembra de un 1ml de saliva en el Agar Mitis Salivarius enriquecido.
Figura No. 16. Incubación de las muestras en una atmósfera de CO2 a 37º C, durante 48 horas
28
Identificación del S. mutans
Se procedió a la identificación del S. mutans por observación directa,
basándose en la morfología de las colonias (Figura N°17), observándose
colonias convexas, azules, opacas con un centro de color oscuro y muy
adherentes al medio de cultivo (4).
Una vez identificadas se realizó la confirmación mediante tinción GRAM para
la identificación morfológica, y se observaron cocos GRAM positivos en
cadena, la prueba de la catalasa resultó negativa en las 30 muestras.
Se procedió con las pruebas de fermentación de manitol y sorbitol, las
cuales dieron resultado positivo, mediante una reacción colorimétrica.
Figura No. 17. Colonias de S. mutans
29
Almacenamiento del S. mutans
Una vez identificadas las cepas de S. mutans fueron almacenadas en el
caldo de preservación (BHI+GLICEROL) a una temperatura de -80ºC para
los análisis posteriores como se muestra en la Figura N° 18.
Figura No. 18. Preservación del S. mutans en (BHI+GLICEROL)
Preparación de solución de xilitol
La solución de xilitol de 30,43% o 2M, se preparó disolviendo 30,43g de
xilitol en 100 ml de agua destilada (Figura N° 19). La solución se esterilizo en
autoclave a 121°C durante 15min (45).
Figura No. 19. Solución de xilitol de 30,43% o 2M
30
Transferencia bacteriana
En cada uno de los tubos de ensayo se colocó la muestra de S. mutans la
cual se sembró en el xilitol a distintas concentraciones (Figuras N° 20, 21,
22) siguiendo el procedimiento utilizado por Radmerikhi et al. (2013). Se
tomaron 2.99ml, 2.96 ml, 2.91ml, 2.51ml, 1.83ml, 1.23ml del caldo de S.
Mutans y se añadirán 0.009 ml, 0.04 ml, 0.09 ml, 0.49ml, 1.17ml, 1.77ml de
solución de Xilitol 2M, la mezcla proporcionará 3 ml de crecimiento
bacteriano al 0.1% (0,003g), 0.5% (0,015g), 1% (0,03g), 5%(0,15g), 12%
(0,36g), 18% (0.54g) (Tabla N° 3). Este procedimiento se realizó por
triplicado en cada una de las muestras.
Tabla No.3. Tabla de procedimiento para la transferencia bacteriana
Grupo Muestra de S.
Mutans en BHI
Solución de Xilitol
30,43 % o 2M
La mezcla proporciono
3 ml de crecimiento
bacteriano al:
1 2,99ml 0,009 ml 0.1%
2 2,96 ml 0,04 ml 0.5%
3 2,91ml 0,09 ml 1%
4 2,51ml 0,49ml 5%
5 1,83ml 1,17ml 12%
6 1,23ml 1,77ml 18%
Figura No. 20. Colocación del S. mutans
31
Figura No. 21. Colocación del Xilitol en diferentes concentraciones
Figura No. 22. Mezcla de 3 ml de crecimiento bacteriano
Ensayo de los antimicrobianos mediante espectrofotómetro
Se incubó a 37º en condiciones de anaerobiosis, realizándose mediciones
con el espectrofotómetro Eppendorf BioPhotometer® D30 (Figura N° 23)
con una longitud de onda de 600nm dando un valor de absorbancia inicial y
luego de 24 y 48 horas.
32
Figura No. 23. Mediciones de la absorbancia con el espectrofotómetro Eppendorf BioPhotometer® D30
Figura No. 24. Observación a simple vista del grado de turbidez del medio que contiene S. mutans en diferentes porcentajes de xilitol
Eliminación de las muestras
Los residuos tanto líquidos como sólidos generados durante la
experimentación en los laboratorios deberán descontaminarse antes de su
eliminación.
33
Los residuos líquidos de cultivos celulares se depositarán en contenedores
con lejía o hipoclorito sódico al 5% por lo menos 2h para la inactivación de
los agentes biológicos contaminantes.
El tratamiento de los desechos infecciosos consistió en la inactivación de la
carga bacteriana de los frascos recolectores de las muestras de saliva de los
niños y de todos aquellos materiales que fueron utilizados durante la fase de
laboratorio que se encontraban contaminados, para este fin las muestras
fueron sometidas a esterilización mediante autoclave, al ser material no
reutilizable se colocó en fundas rojas para que posteriormente el gestor
ambiental, avalado por el Ministerio del Ambiente, contratado por el INSPI
procediera a llevarse los desechos para su disposición final (Anexo 3).
El material reutilizable que estaba contaminado fue esterilizado en autoclave,
para luego ser lavado y nuevamente esterilizado para ser reutilizado.
g) ASPECTOS BIOÉTICOS
Este trabajo investigativo fue aprobado por el Comité de Bioética de la
Facultad de Odontología y de la Universidad Central del Ecuador.
Se informó a las autoridades, al personal de salud de la institución, a los
padres de familia y a los niños (as) sobre los beneficios, los riegos conocidos
o inconvenientes que pueden presentarse durante la investigación.
Se realizó una descripción precisa de la investigación, en forma verbal y por
escrito, y fue entregada a las autoridades y responsables de los niños (as).
En dicha información se incluyó: los objetivos, el propósito del estudio así
como la duración del mismo.
En la reunión con los padres de familia de los niños (as), se informó sobre la
investigación y se solicitó a los padres, el respectivo consentimiento libre e
informado el cual fue elaborado para este fin y los datos fueron utilizados
únicamente para este estudio, además se solicitó copia de cédula del
representante.
34
Se obtuvo el asentimiento de los niños de la muestra, para
participar en la investigación.
La información obtenida en la ficha clínica y los resultados de
laboratorio se mantuvieron bajo absoluta confidencialidad y se
manejaron únicamente códigos asignados a cada uno de los niños (as).
Normas de bioseguridad en el laboratorio
En este estudio se utilizó las normas del Manual de Bioseguridad en el
Laboratorio (Anexo 4) de la Organización Mundial de la Salud que es un
documento guía (63).
h) ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los datos de la absorbancia, fueron trasladados a una hoja da cálculo de
Microsoft Excel 2010 (Anexo N° 5) permitiendo así la configuración de una
base de datos que luego fue exportada al paquete estadístico SPSS en su
versión 23 en español de la casa IBM ®.
Se utilizo la prueba de Shapiro Wilks con el propósito de verificar si los datos
cumplían con el criterio de normalidad, esto con el fin de direccionar el
análisis estadístico no paramétrico, y se empleo los test de U Mann Whitney,
Kruskal Wallis, y Wilcoxon, con un nivel de significancia del 5%.
35
8. RESULTADOS
Los datos de la absorbancia han sido empleados como indicador directo de
la capacidad inhibitoria del xilitol en sus distintas concentraciones y en dos
tiempos de exposición, 24horas y 48 horas. Es importante señalar que
cuando el valor de la absorbancia se aproxima al valor de uno (1) o es
mayor que 1, indicaría mayor concentración de S. mutans, en tanto que
mientras más se acerque a cero (0) es más efectivo porque la
concentración de microorganismos es menor, dejando pasar una mayor
fracción de luz. En este sentido el cálculo del valor promedio de
absorbancia para cada grupo (considerando las 30 muestras) permitió
identificar la concentracion más efectiva en la inhibición de S. mutans.
Precisamente estos resultados se aprecian en la tabla 4 en la que se
observa el valor medio de la absorbancia así como la deviación estándar
de esta medida. La concentración inicial se refiere al valor medio de la
absorbancia de las 30 muestras de saliva extraídas de los niños/as, antes
de cualquier inoculación siendo este el grupo control.
En este caso el valor de 0,73 indica un alto nivel de concentración de
microorganismos, en este caso de S. mutans.
Tabla No.4. Media y desviación estándar del índice de absorbancia por
grupo a las 24 horas de exposición
Solución Media Desviación estándar
VALOR INICIAL 0,73 0,20
XILITOL 0,1% 0,45 0,16
XILITOL 0,5% 0,41 0,15
XILITOL 1% 0,35 0,13
XILITOL 5 % 0,20 0,10
XILITOL 12 % 0,12 0,10
XILITOL 18 % 0,06 0,03
36
En el Grafico N°1 podemos observar que con todas las soluciones se logró
disminuir la concentración de S. mutans luego de las 24 horas de
exposición, resultó evidente la tendencia de disminución de
microorganismos a medida que aumentaba la concentración, así se
observa que con el xilitol al 0,1% la absorbancia fue de 0,45, en tanto que
con el Xilitol al 18% la absorbancia fue de apenas 0,06.
Es importante señalar que la desviación estándar es indirecta mente
proporcional a la concentración, por lo que podemos mensionar que la
concentración del Xilitol en un factor de inhibición evidente.
Lo expresado queda claramente reflejado en la figura siguiente:
Gráfico 1 Media del índice de absorbancia por grupo a las 24horas de exposición
37
En la tabla N°5 se observa el valor medio y la desviación estándar de la
absorbancia estimada con el espectrofotómetro luego de 48 horas de
exposición.
Tabla No.5. Media y desviación estándar del índice de absorbancia por
grupo a las 48 horas de exposición
Solución Media Desviación estándar
VALOR INICIAL 0,73 0,20
XILITOL 0,1% 0,24 0,20
XILITOL 0,5% 0,17 0,19
XILITOL 1% 0,13 0,20
XILITOL 5 % 0,08 0,15
XILITOL 12 % 0,07 0,17
XILITOL 18 % 0,03 0,10
En el Grafico 2 en términos generales se observó una disminución de la
absorbancia y por ende de la concentración de Streptococcus mutans con
el aumento de la concentración del xilitol, así con la solución de xilitol al 0,1
% la absorbancia fue de 0,24 y con la solución de xilitol al 18 % la
absorbancia fue de 0,03. Es importante además recalcar que la
disminución de la concentración de Streptococcus mutans es de menor
variabilidad cuando se aumenta la concentración por sobre el 5%.
Gráfico 2 Media del índice de absorbancia por grupo a las 48 horas de
exposición
38
Dado que los datos no cumplieron con el criterio de normalidad, se empleó
la prueba de Kruskal Wallis con el propósito de determinar si existieron
diferencias significativas en los valores medios de absorbancia encontrados
para estos siete grupos. Mediante el SPSS 23 se determinó una
significancia p <0,001 que permitió confirmar que la capacidad de inhibición
guarda relación con la concentración de xilitol a las 24 y 48 horas, esto lo
podemos observar en la tabla N°6
La prueba de Kruskal Wallis es muy útil cuando se desea comprobar si los
valores medios de los distintos grupos son de diferencia estadísticamente
significativa.
Tabla No.6. Resultados de la prueba de Kruskal Wallis
Estadístico ABSORBANCIA
24 horas
ABSORBANCIA
48 horas
Chi-cuadrado 51,23 36,13
Gl 6 6
P 0,000 0,000
En ambos casos no se consideró el valor de la concentración inicial, con lo
que pudo concluirse que si existió una diferencia en la concentración de S.
mutans medida en forma indirecta a través de la absorbancia para cada
solución (concentración) de xilitol empleada, determinando que hay
diferencias signifcativas en el poder bactericida de cada solución tanto a las
24 como a las 48 horas.
Frente a esta evidencia se desarrolló la prueba U Mann Whitney para
realizar una comparación entre cada uno de los pares que pudieron
formarse con las soluciones de estudio tanto a las 24 como a las 48 horas.
La Prueba U Mann Whitney permite establecer si existe diferencia
significativa en los valores medios de dos grupos, por lo que se estableció
la comparación de las diferentes muestras de S. mutans en las diferentes
concentraciones de xilitol en los dos tiempos de exposición.
39
Los resultados se observan en la tabla N° 7 que presenta el valor de la
significancia estimada para referir el hecho de que se halló diferencia
significativa.
Se observa que casi en todos los casos la significancia fue menor que 0,05
(p<0,05) lo que indica diferencia significativa entre los pares
correspondientes. Solo el caso de xilitol al 12% con el de xilitol al 18%
hacia las 48 horas de exposición no presentaría diferencia significativa
dado que p = 0.13, lo que puede interpretarse como similar eficiencia en la
inhibición de Streptococcus mutans al emplear xilitol al 12% o al 18%.
Tabla No.7. Resultados de la prueba U Mann Whitney
XIL
ITO
L 0
,1%
24H
XIL
ITO
L 0
,5%
24H
XIL
ITO
L 1
% 2
4H
XIL
ITO
L 5
% 2
4H
XIL
ITO
L 1
2 %
24H
XIL
ITO
L 1
8 %
24H
XIL
ITO
L 0
,1%
48H
XIL
ITO
L 0
,5%
48H
XIL
ITO
L 1
% 4
8H
XIL
ITO
L 5
% 4
8H
XIL
ITO
L 1
2 %
48H
XIL
ITO
L 1
8 %
48H
XILITOL 0,1% 24H
p=0,07 p=0,0 p=0,0 p=0,0 p=0,0
XILITOL 0,5% 24H
p=0,0 p=0,0 p=0,0 p=0,0
XILITOL 1% 24H
p=0,0 p=0,0 p=0,0
XILITOL 5 % 24H
p=0,0 p=0,0
XILITOL 12 % 24H
p=0,04
XILITOL 18 % 24H
XILITOL 0,1% 48H
p=0,03 p=0,0 p=0,0 p=0,0 p=0,0
XILITOL 0,5% 48H
p=0,04 p=0,0 p=0,0 p=0,0
XILITOL 1 % 48H
p=0,0 p=0,0 p=0,0
XILITOL 5 % 48H
p=0,0 p=0,0
XILITOL 12 % 48H
p=0,13
XILITOL 18 % 48H
De acuerdo a que una de nuestras variables independientes es el tiempo
de exposición es necesario establecer estadísticamente cual es la
influencia que tiene el tiempo, sobre el porcentaje de inhibición del
40
crecimiento del S. mutans por lo que se realizó una comparación en los
valores medios de absorbancia tanto a las 24 horas como a las 48 horas.
En forma general se observa que la absorbancia disminuyó en forma
progresiva con el tiempo (de 24h a 48h) y con la concentración (de 0,1% a
18%), prueba inequívoca que el xilitol puede emplearse como inhibidor del
crecimiento del S. mutans.
Con la intencionalidad de comprobar la influencia del tiempo en la tabla
N°8 se han propuesto los estadísticos de prueba y sus significancia de
acuerdo a la prueba de Wilcoxon, prueba no paramétrica útil cuando se
desea comparar los valores medios de dos grupos cuyas muestras se
encuentran emparejadas.Los resultados determinaron que el tiempo fue
influyente en concentraciones bajas, es decir al dejar 48 horas la inhibición
es mucho mayor que cuando se deja únicamente 24 horas, para las
concentraciones de 0,1%, 0,5%, 1% y 5%, no así para las concentraciones
de 12% y 18% en los que la significancia según la prueba de Wilcoxon fue
p=0,08 y p=0,22 respectivamente.
Tabla No.8. Prueba de Wilcoxon comparando el valor medio del índice de
absorbancia por grupo a las 24 y 48 horas de exposición
Tiempo 24 horas 48 horas Estadístico de prueba
Concentración Media Media Z(*) P
XILITOL 0,1% 0,45 0,24 -2,17 0,03
XILITOL 0,5% 0,41 0,17 -2,27 0,02
XILITOL 1% 0,35 0,13 -2,31 0,02
XILITOL 5 % 0,20 0,08 -2,58 0,01
XILITOL 12 % 0,12 0,07 -1,75 0,08
XILITOL 18 % 0,06 0,03 -1,24 0,22
41
Gráfico 3 Media del índice de absorbancia por grupo
Resulta importante mencionar que en algunas muestras en las que se
empleó xilitol al 12% y se valoró a las 24 h, la absorbancia fue 0, es decir
se inhibió completamente al S. mutans, esta cantidad de muestras aumentó
hacia las 48h y fue aún de mayor frecuencia frente a la solución de xilitol
del 18%.
En el Grafico N°4 se observa la relación entre la absorbancia y la
concentración de Xilitol, además se han proyectado las rectas de regresión,
que en este caso se ajustan a un modelo logarítmico, permitiendo
comprender que la inhibición se dificulta cada vez más cuando la solución
de prueba va disminuyendo su concentración de Streptococcus mutans.
Adicionalmente se observan muy buenos coeficientes de determinación
para las 24 horas r2= 0,9593 y para las 48 horas r2= 0,9743 que indican
que la concentración de S. mutans disminuye en forma logarítmica con la
concentración de la solución de xilitol.
42
Gráfico 4. Relación de la concentración de Xilitol con el índice medio de absorbancia a las 24 h y 48 h
Con fines comparativos se procedió a estimar la reducción porcentual de la
carga de S. mutans como indicador de la eficiencia, para lo cual se dividió
la diferencia de la absorbancia de una concentración y tiempo determinado,
para la absorbancia inicial, y se la expresó en base cien. Estos resultados
se presentan en la tabla N°9
Tabla No.9. Reducción en porcentaje de las diferentes concentraciones
de xilitol a las 24 y 48 horas.
Grupo 24h 48h
Absorbancia Eficiencia % Absorbancia Eficiencia% XILITOL 0,1% 0,45 38,1 0,24 66,9
XILITOL 0,5% 0,41 44,5 0,17 76,8
XILITOL 1% 0,35 52,5 0,13 82,3 XILITOL 5 % 0,20 72,7 0,08 89,7 XILITOL 12 % 0,12 83,6 0,07 90,5
XILITOL 18 % 0,06 92,2 0,03 96,0
43
En primer lugar se observa que a mayor concentración, mayor eficiencia,
así con el xilitol al 0,1% se logró disminuir la carga inicial en un 38,1% y
con el xilitol al 18% en un 92,2% (dentro de las 24 h de exposición).
En segundo lugar se observa que a mayor tiempo de exposición se logra
mayor eficiencia, así pues mientras con xilitol al 0,5% se logró una
reducción de 44,5% de la carga inicial dentro de las 24h, para la misma
concentración pero para un tiempo de exposición de 48h se logró disminuir
en un 76,8%.
Si se toma como criterio de eficacia (cumplimiento con el objetivo) el
parámetro de que el agente inhibitorio debe reducir al menos el 70% de la
concentración de S. mutans, este criterio se lograría con una solución de
xilitol al 5% para un tiempo de 24 h y con una solución de 0,5% para una
exposición de 48 h.
44
9. DISCUSIÓN
Los sustitutos del azúcar son ampliamente utilizados en odontologia en la
prevención de caries dental, no siendo metabolizados por las bacterias,
inhibiendo su crecimiento, disminuyendo la formacion de ácidos y
reduciendo la prevalencia de caries dental. (64), (65).
Los estudios muestran que el consumo de xilitol al 5% es eficaz en la
reduccion de la caries dental (15), (46), sin embargo en una revisión
sistematica en el 2015 se menciona que existen pocos estudios del xilitol,
que sean concluyentes sobre su eficacia en la reduccion de caries dental,
porque en su mayoria son muy baja calidad y poseen una pobre
metodologia, este es el motivo por el que se investigo al xilitol en
diferentes concentraciones con el fin de determinar la concentración más
eficaz en la inhibición del S. mutans (65).
En este sentido el presente estudio ha demostrado que el xilitol produjo
inhibición del S. mutas en todas sus concentraciones, manifestando su
efecto bactericida, esto concuerda con los resultados obtenidos por
Radmerikhi et al., 2013 (14), ElSalhy et al., 2012 (18), quienes afirman que
el xilitol tiene efecto antibacteriano, esto se debe a la capacidad del xilitol
de ser transportado al interior de las bacterias cariogénicas como el S.
mutans, inhibiendo la fermentación y metabolismo (13), (39), (40).
Existen pocos trabajos que mencionan que en concentraciones menores de
xilitol encontramos un efecto preventivo contra la caries dental, nuestros
resultados muestran que el xilitol aún en las más bajas concentraciones
0,1%, 0,5 %,1% presentó un efecto inhibidor lo que concuerda con los
resultados obtenidos por Soderlinget al., 2008 (24). Para las
concentraciones menores se sugiere ensayos clinicos controlados para
corroborar los resultados de la presente investigación.
No existe en la literatura una escala definida sobre el potencial limitorio de
la absorvancia usando el espectrofotómetro, por lo que se sugiere estudios
que comparen los presentes resultados con otros tipos de efectos
inhibitorios reportados en la literatura (discos de inhibicion y unidades
45
formadoras de colonias) y que permitan identificar el potencial del efecto
inhibitorio del xilitol, utilizando un control positivo y un control negativo.
El estudio de Radmerikhi et al., 2013 (14) en cepas liofilizadas de S.
mutans muestra eficacia en el consumo del xilitol a partir del 5% lo que
concuerda con los resultados encontrados en la presente investigacion en
la cual el 5% de xilitol ha demostrado ejercer un efecto inhibitorio eficiente
en el crecimiento del S. mutans
Marttinen et al., 2012 (15) en su estudio somete cepas de S. mutans al
xilitol al 5%; a las 8 y 24 horas se realizaron recuento de S. mutans, en sus
resultados se observó una disminución del 10% en la densidad óptica a las
8 horas sin embargo no hubo cambios a las 24 horas lo que difiere de los
resultados obtenidos en este estudio en el que se obtuvo un porcentaje de
inhibición del 72,7% a las 24 horas.
Radmerikhi et al., 2013 (14) en su estudio en cepas liofilizadas encontro un
mayor efecto inhibitorio del xilitol sobre S. mutans al 18 % a las 48 horas, lo
que difiere con los resultados de esta investigación en la que el xilitol al
18% no presentaría diferencia significativa con el xilitol al 12%, lo que
puede interpretarse como similar eficiencia en la inhibición de
Streptococcus mutans al emplear xilitol al 12% o al 18% a 48 horas, este
resultado puede diferir por que la presente investigacion utilizó cepas de
niños, por lo cual se sugiere mayores investigaciones del xilitol al 12 y 18 %
considerando como variable la prevalencia y severidad de la caries dental
de los niños y estudios con cepas ATCC.
Este estudio ha demostrado que el xilitol a concentraciones mayores al
12% no produce un efecto inhibitorio significante lo que difiere de la
afirmación de que a mayor concentracion mayor efecto inhibitorio (46), de
igual manera el factor tiempo no es influyente a partir del 12 % a las 24
horas.
Los resultados muestran eficacia a partir del 5 % con un porcentaje de
inhibicion a las 24 horas del 72.7% lo que permitirá ver a través de estudios
de cohortes la eficacia del xilitol en la prevalencia y severidad de caries
46
dental. Se sugiere ensayos clinicos controlados asociados al uso del xilitol,
frecuencia de cepillado y uso de fluoruros en la reduccion de caries dental.
Las limitaciones existentes en este estudio fueron la falta de un padrón oro
como la clorhexidina, y la comparacion de los valores de la absorvancia del
xilitol con soluciones como enjuagues bucales que se comercializan en
Ecuador, para de esta manera saber si existe una diferencia significativa en
los valores de inhibición del crecimiento del S. mutans al comparar el Xilitol
con otras sustancias.
47
10. CONCLUSIONES
i. En todas las concentraciones de xilitol se observo un efecto
inhibitorio sobre el S. mutans a las 24 horas.
ii. Todas las concentraciones de xilitol demostraron tener un efecto
inhibitorio sobre S. mutans a las 48 horas.
iii. El xilitol al 18% demostró tener el mayor efecto inhibitorio a las 24
horas.
iv. El mayor efecto inhibitorio a las 48 horas se observó en el xilitol al
12% sin tener diferencia significativa con la concentración de xilitol al
18%.
v. Al comparar el efecto inhibitorio del xilitol a las 24 y 48 horas se
observó que era más eficiente en la concentración del 5%.
48
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53
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54
ANEXOS
55
Anexo No. 1. Formulario de Consentimiento Informado y Explicativo
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
ESPECIALIDAD DE ODONTOPEDIATRÍA
Investigador responsable: Dra. Corina Orellana.
PROPÓSITO DEL ESTUDIO: en nuestro país muchos niños presentan caries
dental, esta es una enfermedad que es producida principalmente por una bacteria
“Streptococcus Mutans”, que se transmite de padres a hijos durante su infancia y que
aumenta cuando no existe una buena técnica de cepillado dental y se consume alimentos
con alto contenido de azúcar como dulces, galletas, colas, jugos. Para los odontólogos la
caries es su principal preocupación, por esta razón es necesario realizar investigaciones
más profundas con respecto a nuevas formas de prevenirla. Se considera importante
investigar sobre los beneficios y aplicaciones del Xilitol, un edulcorante con efecto anti
caries y que es utilizado en el Ecuador en pastas dentales, enjuagues para niños y
chicles, con el objetivo de inhibir el crecimiento del Streptococcus Mutans.
PROCEDIMIENTO A SEGUIR: Se realizará las siguientes actividades:
1. Un diagnóstico actual de caries, registrado en la Ficha clínica y comunicado al
representante.
2. Le pediremos al niño que escupa en un frasco plástico estéril para tener una
muestra de saliva, la misma que será analizada en el laboratorio de
microbiología del INSPI-Q para observar el “EFECTO INHIBITORIO DEL
XILITOL A DIFERENTES CONCENTRACIONES SOBRE EL
STREPTOCOCCUS MUTANS AISLADO DE LA SALIVA DE NIÑOS (AS)
DE 6 A 7 AÑOS DE LA UNIDAD EDUCATIVA MUNICIPAL “SAN
FRANCISCO DE QUITO” EN EL AÑO LECTIVO 2015: ESTUDIO IN
VITRO”.
RIESGOS: No existen riesgos debido a que los niños escupirán en frascos plásticos
estériles.
56
BENEFICIOS:
Se obtendrá un diagnóstico de salud bucal y presencia de caries en el niño
participante.
Es un proceso fácil que no causará molestias y será llevado a cabo en la escuela.
ALTERNATIVAS: Tengo el derecho de anular este consentimiento informado en
el momento que yo lo considere necesario sin repercusión alguna.
COSTOS: Todo lo que se va a hacer será gratis para el niño/a, por tanto usted no
debe pagar.
CONFIDENCIALIDAD: Se mantendrá en secreto el nombre de cada uno de los
niños, a los que se les asignará un código. Por tanto, usted no debe preocuparse sobre si
otras personas podrán conocer datos de su hijo/a.
NÚMERO DE TELÉFONO DEL INVESTIGADOR RESPONSABLES:
Yo comprendo que si tengo alguna pregunta o problema con este estudio, puedo
llamar a la Dra. Corina Orellana. Número celular: …………………..
NOMBRE COMPLETO DEL NIÑO
NOMBRE COMPLETO DEL
REPRESENTANTE
FIRMA DEL REPRESENTANTE
NÚMERO DE CÉDULA DEL
REPRESENTANTE
PARENTESCO
Adjuntar copia de cedula del representante
57
Anexo No. 2. Permiso de la Unidad Educativa Municipal “San Francisco de
Quito”
58
Anexo No. 3. Manejo y eliminación de muestras.
59
60
61
62
63
64
65
Anexo No. 4. Normas del Manual de Bioseguridad en el Laboratorio de la
Organización Mundial de la Salud (Organización Mundial de la salud, 2005)
Grupo de riesgo 1 (riesgo individual y poblacional escaso o nulo)
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar
enfermedades en el ser humano o los animales.
Acceso
1. El símbolo y signo internacional de peligro biológico deberá colocarse en
las puertas de los locales donde se manipulen microorganismos.
2. Sólo podrá entrar en las zonas de trabajo del laboratorio el personal
autorizado.
3. Las puertas del laboratorio se mantendrán cerradas.
4. No se autoriza la entrada de niños en las zonas de trabajo del
laboratorio.
Protección personal
1. Se usarán en todo momento, batas o uniformes especiales para el
trabajo en el laboratorio. De preferencia, serán de manga larga y
abertura trasera. Los delantales desechables pueden llevarse por
encima de las batas cuando se necesite mayor protección contra el
derrame de sustancias químicas o material biológico como sangre o
líquidos de cultivo.
2. Se usarán guantes protectores apropiados para todos los
procedimientos que puedan entrañar contacto directo o accidental con
sangre, líquidos corporales y otros materiales potencialmente infecciosos
o animales infectados. Una vez utilizados, los guantes se retirarán de
forma aséptica y a continuación se lavarán las manos. Los guantes
desechables usados deben eliminarse junto con los residuos de
laboratorio infectados.
66
3. El personal deberá lavarse las manos después de manipular materiales
infecciosos, así como antes de abandonar las zonas de trabajo del
laboratorio.
4. Se usarán gafas de seguridad, viseras u otros dispositivos de protección
cuando sea necesario proteger los ojos y el rostro de salpicaduras,
impactos y fuentes de radiación ultravioleta artificial.
5. Estará prohibido usar las prendas protectoras fuera del laboratorio, por
ejemplo en cantinas, cafeterías, oficinas, bibliotecas, salas para el
personal y baños.
6. No se usará calzado sin puntera.
7. En las zonas de trabajo estará prohibido comer, beber, fumar, aplicar
cosméticos o manipular lentes de contacto.
8. Estará prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano
en las zonas de trabajo del laboratorio.
9. La ropa protectora de laboratorio no se guardará en los mismos armarios
que la ropa de calle.
Procedimientos
1. Estará estrictamente prohibido pipetear con la boca.
2. No se colocará ningún material en la boca ni se pasará la lengua por las
etiquetas.
3. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se
reduzca al mínimo la formación de aerosoles y gotículas.
4. Se limitará el uso de jeringuillas y agujas hipodérmicas, que no se
utilizarán en lugar de dispositivos de pipeteo ni con ningún fin distinto de
las inyecciones por vía parenteral.
5. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a
materiales infecciosos se comunicarán al supervisor del laboratorio. Se
mantendrá un registro escrito de esos accidentes e incidentes.
6. Se elaborará y seguirá un procedimiento escrito para la limpieza de
todos los derrames.
7. Los líquidos contaminados deberán descontaminarse (por medios
químicos o físicos) antes de eliminarlos por el colector de saneamiento.
67
8. Los documentos escritos que hayan de salir del laboratorio se
protegerán de la contaminación mientras se encuentren en éste.
Zonas de trabajo del laboratorio
1. El laboratorio se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales no
relacionados con el trabajo.
2. Las superficies de trabajo se descontaminarán después de todo derrame
de material potencialmente peligroso y al final de cada jornada de
trabajo.
3. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados deberán ser
descontaminados antes de eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a
utilizar.
4. El embalaje y el transporte de material deberán seguir la reglamentación
nacional o internacional aplicable.
5. Las ventanas que puedan abrirse estarán equipadas con rejillas que
impidan el paso de artrópodos.
Manipulación de desechos
Se considera desecho todo aquello que debe descartarse.
En los laboratorios, la descontaminación y la eliminación de desechos son
operaciones estrechamente relacionadas. En el trabajo cotidiano, son pocos los
materiales contaminados que es preciso retirar del laboratorio o destruir. La
mayor parte de la cristalería, los instrumentos y la ropa del laboratorio vuelve a
utilizarse o se recicla.
El principio básico es que todo el material infeccioso ha de ser
descontaminado, esterilizado en autoclave o incinerado en el laboratorio.
Descontaminación
El tratamiento en autoclave de vapor constituye el método de elección para
todos los procesos de descontaminación. El material destinado a la
68
descontaminación y eliminación debe introducirse en recipientes (por ejemplo
en bolsas de plástico resistentes al tratamiento en autoclave) que tengan un
código de color para indicar si el contenido ha de pasar a la autoclave o a la
incineración.
Procedimientos de manipulación y eliminación de material y
desechos contaminados
Deberá adoptarse un sistema de identificación y separación del material
infeccioso y sus recipientes. Se seguirán las normas nacionales e
internacionales y se tendrán en cuenta las siguientes categorías:
1. Desechos no contaminados (no infecciosos) que puedan reutilizarse o
reciclarse o eliminarse como si fueran «basura» en general.
2. Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos): agujas
hipodérmicas, bisturís, cuchillas, vidrio roto; se recogerán siempre en
recipientes a prueba de perforación dotados de tapaderas y serán tratados
como material infeccioso.
3. Material contaminado destinado al tratamiento en autoclave que después
pueda lavarse y volverse a utilizar o reciclarse.
4. Material contaminado destinado al tratamiento en autoclave y a la
eliminación.
5. Material contaminado destinado a la incineración directa.
Objetos cortantes y punzantes
Los recipientes de eliminación de objetos cortantes y punzantes serán
resistentes a la perforación y no se llenarán por completo. Cuando estén llenos
en sus tres cuartas partes se colocarán en un recipiente de «desechos
infecciosos» y se incinerarán, esterilizándolos primero en autoclave. Los
recipientes de eliminación de objetos cortantes y punzantes no se desecharán
en vertederos.
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado
en autoclave y reutilizado
No se efectuará limpieza alguna de ningún material contaminado
(potencialmente infeccioso) que vaya a ser tratado en autoclave y reutilizado.
69
Cualquier limpieza o reparación que se revele necesaria se realizará siempre
después del paso por la autoclave o la desinfección.
Material contaminado para ser eliminado
Aparte de los objetos cortantes y punzantes mencionados más arriba, todo
el material contaminado (potencialmente infeccioso) debe ser introducido en
recipientes impermeables (por ejemplo en bolsas de plástico que resistan el
tratamiento en autoclave marcadas con un código de color) y tratado en
autoclave antes de proceder a su eliminación. Después de pasar por la
autoclave, el material puede colocarse en recipientes apropiados para ser
transportado al incinerador. Si es posible, el material procedente de actividades
relacionadas con la atención sanitaria no debe desecharse en vertederos, ni
siquiera después de haber sido descontaminado. Si se dispone de un
incinerador en el laboratorio, no es necesario el tratamiento en autoclave: el
material contaminado se coloca en recipientes especialmente marcados (por
ejemplo, bolsas con un código de color) y se transporta directamente al
incinerador. Los recipientes de transporte reutilizables deben ser impermeables
y tener tapas que se ajusten debidamente.
Manipulación segura de muestras en el laboratorio
La recogida, transporte y manipulación de muestras en el laboratorio
entrañan un riesgo de infección para el personal.
Recipientes para muestras
Los recipientes para muestras pueden ser de vidrio o, preferiblemente, de
plástico.
Deben ser fuertes y no permitir fugas cuando la tapa o el tapón estén
correctamente colocados. En el exterior del recipiente no debe quedar ningún
material. Los recipientes han de estar correctamente rotulados para facilitar su
identificación.
70
Transporte de muestras dentro de la instalación
Para evitar fugas o derrames accidentales, deben utilizarse
envases/embalajes secundarios equipados con gradillas, de modo que los
recipientes que contienen las muestras se mantengan en posición vertical. Los
envases/embalajes secundarios pueden ser de metal o de plástico, pero deben
poderse tratar en autoclave o ser resistentes a la acción de los desinfectantes
químicos; de preferencia, el cierre debe tener una junta que garantice la
estanqueidad. Deberán descontaminarse periódicamente.
Apertura de los envases/embalajes
El personal que recibe y desempaqueta las muestras debe conocer los
riesgos para la salud que entraña su actividad y debe estar capacitado para
adoptar precauciones normalizadas particularmente cuando manipule
recipientes rotos o con fugas desinfectantes.
Uso de pipetas y dispositivos de pipeteo
1. Todas las pipetas tendrán tapones de algodón para reducir la
contaminación de los dispositivos de pipeteo.
2. Nunca se insuflará aire en un líquido que contenga agentes infecciosos.
3. No se expulsarán a la fuerza los líquidos de una pipeta.
4. Las pipetas contaminadas deben sumergirse completamente en un
desinfectante adecuado contenido en un recipiente irrompible y
permanecer en él durante un tiempo suficiente antes de tirarlas.
5. Para evitar la dispersión del material infeccioso que caiga
accidentalmente de una pipeta, se recubrirá la superficie de trabajo con
material absorbente, que se desechará como residuo infeccioso una vez
utilizado.
Técnicas para evitar la dispersión de material infeccioso
1. Para evitar el riesgo de que se produzcan salpicaduras de material
infeccioso al flamear las asas en el mechero de Bunsen, se utilizará un
71
micro incinerador eléctrico cerrado para esterilizar las asas. Es preferible
utilizar asas desechables.
2. Al secar muestras de esputo debe procederse con cuidado para evitar la
creación de aerosoles.
3. Las muestras y los cultivos desechados destinados a la autoclave o a la
eliminación se colocarán en recipientes impermeables, como las bolsas
de desechos de laboratorio.
Técnicas para evitar la ingestión de material infeccioso y su
contacto con la piel y los ojos
1. Las partículas y gotículas de mayor tamaño (>5mm) que se desprenden
durante las manipulaciones microbiológicas se depositan rápidamente
en la superficie de las mesas y en las manos del trabajador. Éste llevará
guantes desechables. Los trabajadores del laboratorio evitarán tocarse
la boca, los ojos y el rostro.
2. La cara, los ojos y la boca deben estar protegidos con una pantalla o de
algún otro modo durante cualquier operación que pueda provocar
salpicaduras de material potencialmente infeccioso.
72
Anexo No. 5. Resultado de Análisis Microbiológico del tema de investigación.
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L
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%
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L
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%
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H
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L
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%
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H
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L
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%
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H
11
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13
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16
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17
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